地衣芽孢杆菌几丁质酶在枯草芽孢杆菌中的重组表达及其制备氨基寡糖的研究

袁源; 宿玲恰; 张康; 朱昫飏; 夏伟; 吴敬

doi:10.12131/20210297

地衣芽孢杆菌几丁质酶在枯草芽孢杆菌中的重组表达及其制备氨基寡糖的研究

袁源^{1, 2,},
宿玲恰^{1, 2},
张康^{1, 2},
朱昫飏^{1, 2},
夏伟^{1, 2},
吴敬^{1, 2, ,}

1.
江南大学/食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡 214122
2.
江南大学生物工程学院，江苏无锡 214122

基金项目: 国家重点研发计划项目 (2019YFD0901901)

详细信息

作者简介:
袁　源 (1996—)，女，硕士研究生，研究方向为酶工程与技术。E-mail: 6200208066@stu.jiangnan.edu.cn

通讯作者:
吴　敬 (1969—)，女，教授，博士，从事酶工程与技术研究。E-mail: jingwu@jiangnan.edu.cn

中图分类号: Q 556
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出版历程
- 收稿日期: 2021-10-11
- 修回日期: 2022-01-05
- 录用日期: 2022-01-16
- 网络出版日期: 2022-02-06
- 刊出日期: 2022-04-04

Recombinant expression of Bacillus licheniformis chitinase in B. subtilis and preparation of amino-oligosaccharides

YUAN Yuan^{1, 2,},
SU Lingqia^{1, 2},
ZHANG Kang^{1, 2},
ZHU Xuyang^{1, 2},
XIA Wei^{1, 2},
WU Jing^{1, 2, ,}

1.
Jiangnan University/State Key Laboratory of Food Science and Technology, Wuxi 214122, China
2.
School of Bioengineering, Jiangnan University, Wuxi 214122, China

摘要

摘要: 将地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis) 来源的几丁质酶基因blchiA在枯草芽孢杆菌 (B. subtilis) 中进行重组表达，构建了枯草芽孢杆菌工程菌株 (B.subtilis WS9/pHY300PLK-blchiA)，发酵上清液的酶活为0.73 U·mL⁻¹。对重组酶BLCHIA的酶学性质进行表征，其在pH 6.0和60 ℃时表现出最佳活性，比活为3.68 U·mg⁻¹。10 mmol·L⁻¹的铜离子 (Cu²⁺) 和亚铁离子 (Fe²⁺) 对其活性有一定促进作用，在pH 5.0~8.0和50~60 ℃下稳定性较好。此外，研究表明重组酶对脱乙酰度>95%的壳聚糖的催化能力明显优于胶体几丁质，并且水解胶体几丁质和壳聚糖的产物类型具有明显差异，以胶体几丁质为底物主要生成几丁二糖，以壳聚糖为底物可生成聚合度为2~7的壳寡糖。研究获得的重组酶BLCHIA在壳聚糖降黏和制备不同聚合度的低聚糖方面具有良好的应用前景。
- 几丁质酶 /
- 枯草芽孢杆菌 /
- 重组表达 /
- 氨基寡糖
Abstract: In this study, a chitinase blchiA from Bacillus licheniformis was recombinantly expressed in B. subtilis, and the B. subtilis engineering strain (B. subtilis WS9/pHY300PLK-blchiA) was constructed. The enzyme activity in the fermentation supernatant was 0.73 U·mL⁻¹. The enzymatic properties of recombinant enzyme BLCHIA were characterized, and its best activity was obtained at pH 6.0 and 60 ℃, and the specific activity was 3.68 U·mg⁻¹. 10 mmol·L⁻¹ Cu²⁺ and Fe²⁺ could promote its activity, and its stability was good at pH 5.0−8.0 and 50−60 ℃. In addition, the catalytic ability of the recombinant enzyme on chitosan with a degree of deacetylation> 95% was significantly better than that of colloidal chitin, and the types of hydrocolloid chitin and chitosan were significantly different. Using colloidal chitin as substrate, the recombinant enzyme could mainly produce chitobiose, but using chitosan as substrate, it could produce chitosan oligosaccharide with polymerization degree of 2−7. The results have a good application prospect for viscosity reduction of chitosan and preparation of oligosaccharides with different polymerization degrees.
- Chitinase /
- Bacillus subtilis /
- Recombinant expression /
- Amino oligosaccharide

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苏门答腊金线鱼 (Nemipterus mesoprion) 隶属于鲈形目、金线鱼科、金线鱼属，是热带暖水性底层鱼类，主要分布于泰国湾、印度洋、印度尼西亚海域、莱特湾、西太平洋和圣彼得湾。然而，直至2008 年1 月的北部湾渔业资源调查该鱼种在南海北部的渔获记录才得以确定^[1]。

金线鱼属是南海北部近海的重要经济鱼类，为底拖网、手钓、刺网等作业方式的主要捕捞对象。目前，常见的金线鱼属种类如深水金线鱼 (N. bathybius) 和金线鱼 (N. virgatus) 等已有相关的研究报道。如陈国宝等^[2]指出广东沿海水深60~150 m海区是南海北部海域深水金线鱼产卵场的主要分布区。随着数据积累和研究方法的发展，南海北部的局部海域相继开展了金线鱼属种群生长、死亡参数的生物学研究、资源利用评估^[3-6]和耳石形态特征研究^[7]。金线鱼属种类因形态差异较小，传统形态学法易造成物种鉴定错误或种类混淆问题^[8]，进而影响渔获统计、资源评估的可信度和准确性。目前，分子生物学^[9]、矢耳石^[10-11]等手段被广泛用于物种比较和鉴定分类识别；正是在这一背景下苏门答腊金线鱼才得以被鉴定和证实为中国海域的新记录种。

作为该海域较晚确认的新记录种，有关苏门答腊金线鱼的历史数据较匮乏，当前对此物种的认识极为不足，地理分布不明、资源状况不详、种群生物特征不清等问题突出。本文利用2014—2015年南海北部近海4个季节渔业资源调查，应用空间统计法从资源密度和丰度系统阐述苏门答腊金线鱼在南海北部的时空分布，初步阐释其分布范围。结合采集到的苏门答腊金线鱼样品，分析群体组成状况、体长-体质量关系等生物学特征，为提高对新记录种的认知，促进渔业生物多样性保护和管理提供基础数据和理论基础。

1. 材料与方法

1.1 数据来源与处理

苏门答腊金线鱼数据来源于2014—2015年南部北部近海海域的底拖网渔业资源数据，在此海域开展4个季度的调查，分别是2014年7—8月 (夏季) 和10—11月 (秋季)、2015年1—2月 (冬季)和4—5月 (春季)。资源调查区域东至北部湾，东北方向延伸至广东的汕头海域，南至海南岛近海。每个调查航次均在此区域布设99个站点，具体站位分布见文献[12]。调查船为“北渔60011”单船底拖船，主机功率441 kW，总吨位242 t。调查网具为404目底拖网，规格为80.4 m×60.54 m (37.70 m)，网口和网囊网目分别为200和40 mm。每个站点拖时原则上均为1 h，拖速控制在3~4 nmile·h⁻¹。采用扫海面积法将站点的渔获质量和数量分别换算为资源密度和丰度，用于结果分析。

本调查周期内，共采集苏门答腊金线鱼样品84尾 (表1)，依照《海洋调查规范》(GB 12763.6—2007) 对苏门答腊金线鱼样品进行生物学测定，包括体长、体质量、性别、性成熟期和胃饱满度等生物学数据。同时，采用温盐深探测仪同步测量海洋环境因子，包括水深、水温、盐度、叶绿素浓度。

表 1 苏门答腊金线鱼基本信息

Table 1. Basic information of N. mesoprion

季节 Season	样本量 Sample size	体长范围 Body length range/mm	雌性♀ Female	雄性♂ Male	不分 Not distinguished
春季 Spring	18	66~146	11	2	5
夏季 Summer	50	82~138	39	11	0
秋季 Autumn	16	95~142	3	13	0
冬季 Winter	−	−	−	−	−
合计 Total	84	66~146	53	26	5
注：−. 没有样品 Note: −. No samples

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1.2 方法

1.2.1 体质量-体长方程

采用幂函数拟合苏门答腊金线鱼的体质量-体长的关系，其通式为：

$$W = a{L^b}$$

式中$W$和$L$分别为体质量 (g) 和体长 (mm)；待估算的参数$a$和$b$分别是生长的条件因子和异速生长因子^[13-14]。b>3说明物种处于正异速生长，体质量的增长超过体长；b=3则表现为等速生长，体质量与体长的增长是等速的；b<3说明物种为负异速生长，此时物种体质量的增长低于体长。

为检验雌雄群体的体长-体质量关系式是否有差异，将苏门答腊金线鱼样本按性别划分为雌性群体和雄性群体，用上述幂函数各自进行拟合，获得两个关系式。根据原始样本的最小和最大体长值，产生一组介于此区间的100个体长数据的随机序列。借助拟合获得的雌性群体和雄性群体的两个体长-体质量关系式，采用上述产生的体长随机序列，分别求算雌性和雄性对应的理论体质量值。应用单因素方差分析法 (One-way ANOVA) 分析这两组体质量值，进而检验雌雄群体的体长-体质量关系式的统计差异性。

1.2.2 标准差椭圆

标准差椭圆是衡量空间要素分布特征的统计方法，可描述中心趋势、离散和方向趋势等特征^[15]。其中椭圆的长轴代表空间要素的最大离散方向；而其短轴则代表空间要素的最小离散方向；标准差椭圆的面积大小反映空间要素的离散程度，面积越小说明空间要素的分布越趋近于重心，表现为集聚；转角是正北方向顺时针旋转到椭圆长轴形成的夹角，即长轴的朝向，反映了空间要素分布的主趋势方向^[16]。此方法已用于渤海湾、地中海的鱼类时空动态分析^[17-18]，本文利用标准差椭圆研究4个季节苏门答腊金线鱼资源的分布格局变化。

2. 结果

2.1 群体大小组成

对4个季节苏门答腊金线鱼样品的体长和体质量进行频率分析，结果显示其体长介于66~146 mm，分布呈明显的单峰型，以90~110 mm为优势体长组 (图1-a)，占比达60.71%；其体质量介于7.7~79 g，体质量频率分布与体长相似，也表现为单峰特征，优势体质量组是10~40 g (图1-b)，约占群体总数量的80.95%。

图 1 2014—2015年苏门答腊金线鱼的体长和体质量的频率分布

Figure 1. Frequency distribution of body length and body mass for N. mesoprion during 2014−2015

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2.2 体长-体质量关系

按雌、雄性群体分别探究苏门答腊金线鱼的体长和体质量关系。拟合结果表明雌、雄群体的体长-体质量均存在显著的幂指数关系，R²均高于0.96 (图2)，且通过95%的显著性水平检验。单因素方差分析法进一步表明苏门答腊金线鱼雌、雄群体生长无统计学差异 (F=0.06<1且P=0.81>0.05)。因此，利用所有样品的实测数据再次回归拟合，获得该鱼种的体长-体质量方程 (图2-c)，同样有较高的拟合度 (R²>0.97, P<0.05)。经单因素方差分析检验得，图2-c中苏门答腊金线鱼的体长-体质量关系式的参数b 与3无显著差异 (F=0.004, P=0.95>0.05)，说明该海域的苏门答腊金线鱼趋近于等速生长。

图 2 苏门答腊金线鱼的体长与体质量关系

Figure 2. Relationship between body length and body mass for N. mesoprion

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2.3 资源时空变化

春季，在12个站位捕获到苏门答腊金线鱼，其出现率偏低，聚集于北部湾海域，春季分布范围为全年最广，资源量却处于全年最低水平，资源密度为0.29~5.52 kg·km⁻²，平均仅为1.6 kg·km⁻² (图3)。夏季，该鱼的出现率、分布范围较春季均有一定的减少，仅出现于7个站点，但其资源密度达到全年峰值，在0.44~23.56 kg·km⁻²间波动，平均为5.63 kg·km⁻²。苏门答腊金线鱼在秋季的出现率略高于夏季，8个站点有渔获，资源密度仅次于夏季，平均值为2.29 kg·km⁻²，站点渔获量介于0.13~7.93 kg·km⁻²，主要聚集于北部湾北部。冬季的渔获资源密度低于秋季，为0.23~8.18 kg·km⁻²，平均为1.98 kg·km⁻²，其出现率与秋季相当。

图 3 苏门答腊金线鱼资源密度空间分布

Figure 3. Spatial distribution of stock density for N. mesoprion

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苏门答腊金线鱼的丰度分布类似于资源密度，也存在季节变化 (图4)。春季的丰度为10.14~196.42尾·km⁻²，平均为44.38尾·km⁻²，为全年最低，高值位于北部湾北部近岸。夏季的丰度大幅度增加，平均值高达147.69 尾·km⁻²，达到全年峰值，最高和最低丰度分别为706.88和13.64 尾·km⁻²，均位于北部湾北部近岸。秋季的丰度为13.02~327.37 尾·km⁻²，区域平均值降至85.43 尾·km⁻²，高值区仍集中于北部湾北部，但稍微南移。冬季的丰度略高于秋季，平均为89.15 尾·km⁻²，总体在12.83~272.81 尾·km⁻²间波动，而高值区进一步南移。

图 4 苏门答腊金线鱼丰度空间分布

Figure 4. Spatial distribution of abundance for N. mesoprion

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2.4 资源分布格局

从2.3节的分析可知北部湾是苏门答腊金线鱼的主要分布区，因此针对该海域开展苏门答腊金线鱼资源空间格局演变分析。4个季节的资源密度标准差椭圆结果呈现苏门答腊金线鱼资源密度分布格局的明显季节性特征 (图5)。此椭圆转角的季节变化较大，总体在2.76°~176.44°间变动，呈现逆时针变化规律，说明资源密度分布格局存在较大的季节变动，主分布方向从准正北-正南向西北-东南再转向至东北-西南。椭圆覆盖面积在季节间同样差异明显，其表现为春季至秋季为减少而冬季增加的趋势。椭圆面积的季节变化反映苏门答腊金线鱼资源密度空间分布格局为先逐渐聚集后分散。资源密度重心轨迹则是先向北移动再转向东南方向迁移，其中以春夏间的移动距离最大 (47.54 km)，而最小移动距离则出现于秋冬季间 (32.01 km)。

图 5 苏门答腊金线鱼资源密度分布格局

Figure 5. Distribution pattern of stock density for N. mesoprion

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丰度标准差椭圆的季节特征总体与资源密度相似。其转角为1.75°~176.73°，同样表现为逆时针变化特点，丰度空间格局的主分布方向从准正北-正南向西北-东南再转向至东北-西南 (图6)。四季的丰度标准差椭圆面积表现为先减小后增加，表明苏门答腊金线鱼丰度从春季至秋季逐渐聚集，冬季重新扩散。丰度重心轨迹与资源密度大体相似，呈现先西北移动再转向东南方向移动。夏秋季间的丰度重心迁移距离最远 (47.75 km)，秋冬季移动距离最小 (24.39 km)。

图 6 苏门答腊金线鱼丰度分布格局

Figure 6. Distribution pattern of abundance for N. mesoprion

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3. 讨论

2014—2015年4个季度的南海北部近海渔业资源调查初步探明了苏门答腊金线鱼的分布区，即该鱼种基本栖息于北部湾，零星分布于海南岛沿岸，而在广东近海海域无渔获 (图7)。尤其值得指出，20°N以北的北部湾海域是苏门答腊金线鱼的主要聚集区，此海域的渔获资源密度和丰度显著高于研究区其余海域 (图3和图4)。北部湾另一重要经济鱼类——二长棘犁齿鲷 (Evynnis cardinalis) 的产卵场同样分布于此区域^[19]。因此，为保护渔业资源种群延续和生物多样性，亟须加强对此重点区的海洋环境监管和捕捞生产限制。

图 7 苏门答腊金线鱼渔获位置的时空分布

Figure 7. Tempo-spatial distribution of catch position for N. mesoprion

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从分布区域、出现率和资源量看，苏门答腊金线鱼与南海北部其余常见金线鱼属种类有较大差异。以金线鱼和深水金线鱼为例，二者均广泛分布于南海北部海域，而苏门答腊金线鱼与这2种金线鱼属种类的空间重叠率极低，基本无共同分布区 (图8)，这可能主要受鱼类生活习性与栖息环境差异影响。就其渔获出现率而言，金线鱼和深水金线鱼的四季平均出现率分别为27.53%和41.92%，远高于苏门答腊金线鱼 (8.84%)。从资源方面看，相比于上述2种常见金线鱼属种类，苏门答腊金线鱼的资源密度总体偏低，且数值分布的离散程度也较低，仅有个别资源密度异常高值 (图9)。然而，苏门答腊金线鱼的丰度水平有一定的提高，其与金线鱼较为接近，却显著低于深水金线鱼。该鱼种丰度的数值分布离散程度同样低于金线鱼和深水金线鱼，后两者在四季均有异常的丰度高值。综上可知，苏门答腊金线鱼在南海北部的分布范围较小且出现率低，资源水平也较低。

图 8 3种金线鱼属种类的出现情况的对比

Figure 8. Comparison of occurrence for three Nemipterus species

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图 9 3种金线鱼属种类的资源密度和丰度对比

*为离群值；箱体中黑色线为中位数

Figure 9. Comparison of stock density and abundance for three Nemipterus species

* indicates outliers; the black lines in the box indicate median.

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苏门答腊金线鱼属于热带暖水性底层鱼类，无洄游特征。其为肉食性鱼类，主要摄食以对虾类、糠虾类、虾蛄类、蟹类等构成的甲壳类、以小公鱼属和鲾属组成的小型鱼类以及小部分鱿鱼^[20]。本文结合原位的实测环境数据，分析了苏门答腊金线鱼的栖息环境状况 (图10)。苏门答腊金线鱼栖息区域的底层水温介于18.46~30.37 ℃，其中21~27 ℃底层水温占比最高 (73.33%)。栖息环境的底层盐度范围为31.67~33.79，而在盐度33以上的高盐度区，苏门答腊金线鱼的出现频率最高 (70%)。在南海北部海域，该鱼类的栖息水深范围为16.7~58.22 m，在各水深处的分布总体较为均衡。苏门答腊金线鱼栖息地的叶绿素质量浓度在0.06~1.69 mg·L⁻¹间波动，而该鱼更偏好于叶绿素质量浓度低于0.5 mg·L⁻¹的区域。

图 10 苏门答腊金线鱼资源密度与海洋环境因子关系

Figure 10. Relationship between stock density and marine environmental factors for N. mesoprion

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根据2014—2015年的季度资源调查获取的样品，初步拟合获取苏门答腊金线鱼的体长-体质量关系，从采集的样品分析得雌、雄个体的生长状况无统计学差异，苏门答腊金线鱼群体趋近于等速生长。然而综合先前研究成果可知，苏门答腊金线鱼体长-体质量生长关系式与性别是否相关无统一的结论 (表2)，日本金线鱼 (N. japonicus) ^[21-22]、欧洲鳀 (Engraulis encrasicolus)^[23]等鱼类也有类似情况。体长-体质量关系式在全年内并非固定不变的，因为其参数a和b具高度变异性^[24-26]，其中a是时空变化较大的参数，不同时间段或栖息地的采样结果所得a值有明显差异^[27-28]；b的年内变异虽弱于a，但受鱼类栖息环境变化、饵料供给状况、样本量、性成熟度、性别、捕捞网具的网目选择性等因素影响较大^{[29- 30]}。上述生物与非生物因素共同作用导致苏门答腊金线鱼体长-体质量关系式产生区域和时间差异。当前研究采集的苏门答腊金线鱼样品存在一些局限，如样本数量仍然不足、样本的性成熟个体缺乏，因此开展深入的生长研究有一定困难。在后续的资源调查中，应尽量提高生物学测定的样本数量，且样品应尽可能多地涵盖不同成熟期的大小个体，以改善利用有限的苏门答腊金线鱼样品所得生物学特征结果对其种群的代表性。

表 2 苏门答腊金线鱼体长-体质量关系研究概况

Table 2. Summary on body length-mass relationship for N. mesoprion

采样时间 Sampling time	采样区域 Sampling area	样本量 Sample size	体长 Body length/mm	体质量 Body mass/g	a	b	文献 Reference	体长-体质量关系是否差异显著 Significant or insignificant difference in body length-mass relationship between sexes
1982	Kasimedu, Madras	167 (♂)	93~195	−	1.61×10⁻⁵	2.969	[31]	是
1982	Kasimedu, Madras	245 (♀)	97~185	−	8.71×10⁻⁵	2.157	[31]	是
1989—1998	Mangalore, Malpe	288 (♂)	87~255	−	2.28×10⁻⁵	2.895	[32]	是
1989—1998	Mangalore, Malpe	289 (♀)	82~230	−	1.65×10⁻⁵	2.963	[32]	是
2000—2003	Saurashtra	311 (♂)	95~230	15~200	2.81×10⁻⁵	2.895	[33]	是
2000—2003	Saurashtra	534 (♀)	95~250	15~235	2.77×10⁻⁵	2.898	[33]	是
2007—2008	Chennai	620 (♂)	−	−	1.68×10⁻⁵	2.955	[22]	是
2007—2008	Chennai	552 (♀)	−	−	0.89×10⁻⁵	3.082	[22]	是
1976—1980	Kakiniada	606	83~197	8~106	2.23×10⁻⁵	2.877	[34]	否
−	Cochin	742	−	−	3.00×10⁻⁵	2.816	[21]	否
1983—1987	Veraval	740	67~225	4.4~158.5	1.93×10⁻¹¹	2.912	[35]	否
1998—2002	Cochin	315	40~270	−	1.99×10⁻⁵	2.927	[20]	否
1998—2005	Malappuram, Calicut, Kannur and Kasaragod	606	52~251	7~580	1.09×10⁻⁴	2.830	[36]	否
注：−. 无数据 Note: −. No data

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图 1 pHY300PLK-blchiA表达载体的鉴定

Figure 1. Identification of pHY300PLK-blchiA expression vector

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图 2 重组几丁质酶BLCHIA摇瓶发酵过程的酶活

Figure 2. Enzyme activity of recombinant chitinase BLCHIA in shake flask fermentation

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图 3 重组几丁质酶BLCHIA的分离纯化

Figure 3. Separation and purification of recombinant BLCHIA

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图 4 重组几丁质酶BLCHIA的最适pH (a) 和pH稳定性 (b)

Figure 4. Optimal pH (a) and pH stability (b) of recombinant chitinase BLCHIA

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图 5 重组几丁质酶BLCHIA的最适温度 (a) 和热稳定性 (b)

Figure 5. Optimal temperature (a) and thermal stability (b) of recombinant chitinase BLCHIA

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图 6 金属离子对重组几丁质酶BLCHIA酶活的影响

Figure 6. Effect of metal ions on activity of recombinant chitinase BLCHIA

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图 7 BLCHIA水解胶体几丁质的薄层色谱分析

Figure 7. TLC analysis of BLCHIA hydrolyzed colloidal chitin

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图 8 BLCHIA水解壳聚糖的薄层色谱分析

Figure 8. TLC analysis of BLCHIA hydrolyzed chitosan

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表 1 BLCHIA水解壳聚糖的产物峰面积占比

Table 1 Proportion of peak area of BLCHIA 　　　　　　　　　　hydrolyzed chitosan　　　　　　　　　%

产物类型 Product type	反应时间 Reaction time
产物类型 Product type	30 min	1 h	3 h	5 h
氨基葡萄糖 Aminoglucose	0.00	0.42	0.80	0.79
壳二糖 Chitobiose	12.87	17.35	22.65	26.54
壳三糖 Chitotriose	24.37	30.63	36.70	38.44
壳四糖 Chitotetraose	27.73	27.49	26.26	24.94
壳五糖 Chitopentaose	21.27	17.26	7.98	4.21
壳六糖 Chitosan	8.85	4.56	2.99	2.67
壳七糖 Chitoheptaose	3.37	2.28	2.61	2.40

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参考文献(35)

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图(8) / 表(1)

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1. 材料与方法
1.1 数据来源与处理
1.2 方法
1.2.1 体质量-体长方程
1.2.2 标准差椭圆
2. 结果
2.1 群体大小组成
2.2 体长-体质量关系
2.3 资源时空变化
2.4 资源分布格局
3. 讨论

地衣芽孢杆菌几丁质酶在枯草芽孢杆菌中的重组表达及其制备氨基寡糖的研究

作者简介: 袁 源 (1996—)，女，硕士研究生，研究方向为酶工程与技术。E-mail: 6200208066@stu.jiangnan.edu.cn

通讯作者: 吴 敬 (1969—)，女，教授，博士，从事酶工程与技术研究。E-mail: jingwu@jiangnan.edu.cn

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