Mutation and selection of high squalene production yeast Pseudozyma sp. induced by carbon-ions beam irradiation and its electrotransfor-mation
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摘要: 为进一步提高角鲨烯产量，以海洋产角鲨烯类酵母 (Pseudozyma sp.) SD301为出发菌株，采用碳离子 (12C6+) 束诱变技术选育高产角鲨烯的突变菌株，并对突变菌株的电转化条件进行优化。利用100 μmol·L−1过氧化氢 (H2O2) 作为筛选压力，在12C6+束辐照剂量为120 Gy时，获得了比出发菌株具有更高角鲨烯产量的突变株PS120，该突变株在培养3 d后，角鲨烯产量达到1.33 g·L−1，角鲨烯质量 (细胞质量) 达到41.31 mg·g−1。利用绿色荧光蛋白EGFP作为表征标记，对PS120进行电转化条件优化，酶切、电泳和测序研究结果表明900 V电压条件下可成功将编码EGFP的基因转入到PS120细胞中，通过激光共聚焦显微镜进一步证实EGFP蛋白在该细胞中高水平表达。Abstract: In order to improve the yield of squalene, using Pseudozyma sp. SD301 as the starting strain, we selected the mutant strain with high squalene yield by carbon-ions (12C6+) beam irradiation technology, and optimized the electrotransformation conditions of the mutant strain. We used 100 μmol·L−1 H2O2 as the screening pressure. When the carbon heavy ion beam irradiation dose was 120 Gy, the mutant PS120 was obtained with higher squalene yield than the original strain. After 3 days of culture, the squalene yield of the mutant reached 1.33 g·L−1 and the squalene mass reached 41.31 mg·g−1. The green fluorescent protein EGFP was used as the characterization marker to optimize the electrotransformation conditions of PS120. The results of enzyme digestion, electrophoresis and sequencing show that the gene encoding EGFP could be successfully transferred into PS120 cells under 900 V voltage. The high-level expression of EGFP protein in PS120 cells was further confirmed by laser confocal microscope.
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Keywords:
- Squalene /
- Pseudozyma /
- Carbon-ions beam /
- Mutagenesis /
- Electrotransformation
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据联合国粮农组织 (Food and Agriculture Organization of the United Nations, FAO) 报告，预计到2050年世界人口将达到90亿至100亿，全球粮食需求将增长70%~100% [1]，人们对富含蛋白质的水产品需求也随之增加。未来，海水养殖业将成为供给水产品的重要行业[2]，在不断变化的气候条件与环境因素下绘制物种水产养殖的潜在适宜区域，对海水养殖业的可持续发展至关重要。随着“向海经济”等战略思想[3]的提出，以及近岸养殖空间的饱和，海水养殖从近岸向离岸发展；同时，基于我国南海丰富的渔业资源，人们开始探索更多的适养品种尤其是金枪鱼等高端养殖品种。金枪鱼是全球公认的具有高营养价值和经济价值的高端海洋鱼类[4]，其消费市场广阔。世界金枪鱼养殖始于20世纪70年代，自1984年起FAO对全球金枪鱼养殖产量进行统计，当年北美洲首次养殖大西洋蓝鳍金枪鱼 (Thunnus thynnus)，其产量为50 t；2020年全球金枪鱼养殖产量约6.8×104 t，增长了1 368倍。金枪鱼适宜在水深50 m以内的海域养殖，可采用深远海网箱养殖方式[5]。因此，确定适宜的金枪鱼海水养殖区域已成为拓展金枪鱼养殖空间的关键问题。
海水养殖区域范围选址一般采用地理信息系统 (Geographic Information System, GIS)[6]和物种分布模型 (Species Distribution Model, SDM)[7]等方法，其影响因子涵盖物理、经济、社会因素等范畴。例如，基于GIS的多准则评价模型，将物理、环境和社会等多种因素纳入结构化模型，以此来确定日本扇贝水产养殖的潜力区域[8]；SDM基于环境生态理论[9]，利用算法来评估和预测物种在地理空间和时间上的分布，已广泛应用于预测物种海水养殖扩张的潜在区域[10]以及气候变化影响下的海水养殖生产潜力变化趋势[11]等。随着海水养殖面积的不断扩大和水产养殖设施的迭代发展，提前谋划布局中国南海金枪鱼类养殖潜在适宜区域具有一定的现实意义。
本研究选取南海金枪鱼类主要物种—黄鳍金枪鱼 (T. albacares) 和鲣 (Katsuwonus pelamis) 为研究对象，结合其出现的分布点和环境变量数据，运用SDM中使用广泛的最大熵 (Maximum Entropy, MaxEnt) 模型预测其潜在适生区的空间分布，并定量分析物种分布与主要环境因素之间的关系，以期为黄鳍金枪鱼和鲣资源的保护和利用提供参考。
1. 材料与方法
1.1 研究区域概况
中国南海海域是我国渔民历代作业的传统渔场，其南部海域鱼类资源丰富，浮游生物种类繁多[12]，也是我国重要的金枪鱼捕捞场所[13]。研究区域为我国十段线以内海域，105°E—124°E、2°N—25°N (图1)。
1.2 数据来源
1.2.1 物种出现数据
南海金枪鱼类部分出现数据从全球公开数据库Global Biodiversity Information Faculty (GBIF, www.gbif.org) 获取，其不仅包括黄鳍金枪鱼和鲣出现的记录次数，还有分布点位的经纬度。从1950年至今，南海共出现黄鳍金枪鱼30个位点、鲣34个位点。为降低采样偏差的影响并保留最大数量的有用信息，使用ArcGIS 10.8软件对数据集进行空间自相关处理，剔除重复或自相关数据，保留了25个黄鳍金枪鱼位点和29个鲣位点的发生数据和经纬度，并结合2010年3月—2013年2月南海金枪鱼探捕和生产监测到的87个黄鳍金枪鱼位点和39个鲣位点数据，最终共使用112个黄鳍金枪鱼位点和68个鲣位点，建立了相应的物种分布模型。
1.2.2 环境数据
影响鱼类自然种群分布模式的重要变量主要有水温、盐度、食物、溶解氧、叶绿素a和海水流速[14]。目前，国内外学者研究黄鳍金枪鱼和鲣渔场分布的主要环境因子包括表层水温 (Sea surface temperature, SST)、叶绿素a (Chl-a) 和表层盐度 (Sea surface salinity, SSS) 等[15-21]。因此，本研究以表层水温、底层水温 (Sea benthic temperature, SBT)、表层盐度、底层盐度 (Sea benthic salinity, SBS)、表层溶解氧 (Sea surface dissolved oxygen, SSDO)、底层溶解氧 (Sea benthic dissolved oxygen, SBDO) 以及叶绿素 a 7个环境因子为变量，建立南海金枪鱼类养殖潜在适生区物种分布模型。各环境因子数据主要下载于Bio-ORACLE v2.1 (https://www.bio-oracle.org/)，以5'×5' 表示经纬度网格：表层水温、表层溶解氧、表层盐度为目前平均值，底层水温、底层盐度、底层溶解氧为目前平均深度平均值；叶绿素 a浓度数据来自于哥白尼海洋环境监测服务中心 (Copernicus Marine Environment Monitoring Service, CMEMS, https://resources.marine. copernicus.eu)。
1.3 SDM
SDM是一种预测物种空间分布的模型，主要用于研究物种的地理分布与环境变量间的关系[22]，被广泛应用于区域生物多样性评估、种群变化、物种迁移、全球变化生物学、野生动物管理[23-24]等，以量化潜在海水养殖适宜区域[7]等方面的研究。SDM的计算方法包括回归分析、MaxEnt 模型、支持向量随机模型、生态位模型、决策树模型、随机森林模型等，各种方法在总结响应和预测变量之间的关系上存在差异；如在将物种分布转移到不同地理位置[25]或时间背景时，不同方法的预测结果可能存在显著性差异。而MaxEnt模型作为物种分布模型中的常用方法之一，其本质是一种机器学习技术，可用来预测和分析复杂的数据集；且基于信息论中的最大熵原理，可有效地提取数据中的模式，并可自动学习和更新模型，以适应新的数据。
1.4 模型构建
本研究运用了SDM中的MaxEnt模型，在0.5°×0.5° 网格上预测南海黄鳍金枪鱼和鲣的养殖潜在适宜性指数 (Suitability index, SI)。首先，使用MaxEnt 3.4.4软件分别将黄鳍金枪鱼和鲣的出现点样本随机分为2个数据集，将75%的记录设置为训练集，剩余25%的数据作为测试集。其次，采用Bootstrap抽样方法，重复运行10次，以消除随机性和重复数值。根据Logistic格式输出的结果，得到响应曲线，并运用环境贡献率与Jackknife检验结果分析主要环境因子对金枪鱼养殖适宜区分布的影响程度，促使选址更加合理科学可靠。受试者工作特征曲线下面积 (Area under the receiver operating characteristic curve, AUC) 检验值作为一种用于评估模型性能的指标，可反映模型的准确性和敏感性；因此，模型的准确性可以利用模型预测得出的AUC值来评估[19]。AUC值的取值范围为0~1，值越大则表明模型预测的准确度越高，0.5表示模型的预测能力为随机猜测水平，1表示具有极高的预测能力。最后，根据SI (0~1) 定量评估海水养殖适宜性，SI值越高，养殖地区的潜力就越大。研究将模型预测的概率结果以阈值为0.38、0.5、0.6进行划分，即SI小于0.38的区域被划分为非养殖区；SI介于0.38~0.5的区域被划分为低养殖区；SI介于0.5~0.6的区域被划分为中养殖区；SI大于0.6的区域被划分为高养殖区。
2. 结果
2.1 模型预测能力评价
最大熵模型检验结果如表1所示，两种金枪鱼的平均AUC检验值均大于0.848，表明黄鳍金枪鱼和鲣的物种分布模型具有较好的预测能力。模型预测的适生性模拟结果可用于进一步分析鱼类丰富度分布，如预测结果优异且性能良好，可用于研究南海金枪鱼类养殖适宜区的分布。
表 1 模型检验结果Table 1. Model test results种类
Species训练数据 (AUC 值)
Training data (AUC value)测试数据 (AUC 值)
Test data (AUC value)AUC 值标准差
Standard deviation of AUC value黄鳍金枪鱼 T. albacares 0.872 3 0.848 1 0.022 4 鲣 K. pelamis 0.880 3 0.872 1 0.028 8 2.2 环境变量重要性及响应曲线
2.2.1 环境变量重要性
Jackknife检验可以用来评估模型的准确性，以及探讨环境因子对金枪鱼栖息地分布的影响程度。根据Jackknife检验可知 (图2-a)，黄鳍金枪鱼在不包含某个环境因子得分中，不包含叶绿素 a浓度、底层溶解氧、表层水温的平均得分高于不包含底层盐度、表层溶解氧、表层盐度和底层水温这4项，这表明叶绿素 a浓度、底层溶解氧和表层水温是影响黄鳍金枪鱼栖息地分布的重要环境因子；而底层盐度、表层溶解氧、表层盐度和底层水温这4项对黄鳍金枪鱼栖息地分布的影响较小。鲣在不包含某个环境因子的得分中，不包含叶绿素 a浓度、底层溶解氧、表层水温的平均得分高于不包含表层盐度、底层盐度、底层水温和表层溶解氧，这表明叶绿素 a浓度、底层溶解氧、表层水温是影响鲣栖息地分布的重要环境因子，而表层盐度、底层盐度、底层水温以及表层溶解氧对鲣栖息地分布的影响相对较小。
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图 2 Jackknife 检验不包含某个环境因子 (a) 或仅包含某个环境因子 (b) 的得分Figure 2. Score of Jackknife test without a certain environmental factor (a) or with only one environmental factor (b)在仅包含某个环境因子的得分中 (图2-b)，黄鳍金枪鱼仅包含表层溶解氧、底层水温和表层水温的平均得分高于仅包含叶绿素 a 浓度、表层盐度、底层溶解氧和底层盐度的得分，表明表层溶解氧、底层水温和表层水温是影响黄鳍金枪鱼栖息地分布的重要环境因子，而其余4种因素对黄鳍金枪鱼栖息地分布的影响较小。鲣中仅包含表层溶解氧、表层水温和表层盐度的平均得分高于仅包含叶绿素 a 浓度、底层水温、底层盐度和底层溶解氧的得分，表明表层溶解氧、表层水温和 表层盐度是影响鲣栖息地分布的重要环境因子，其余4种因素对鲣栖息地分布的影响较小。
结合Jackknife检验结果及7种环境因子的贡献率，分析得出表层溶解氧是影响黄鳍金枪鱼和鲣潜在适宜区分布最重要的环境变量，其环境因子贡献率分别为42.01%和29.87%。由图3可知，黄鳍金枪鱼中环境因子贡献率排名前3的为表层溶解氧、底层盐度、底层水温，累积贡献率占所有环境因子总贡献率的73.02%以上；置换重要值排前3名的分别是底层盐度、底层水温和表层溶解氧，累积贡献率为79.16%。对于鲣而言，环境因子贡献率排名前3的分别是表层溶解氧、底层盐度、表层水温，累积贡献率占所有环境因子总贡献率的69.41%以上；置换重要值排前3名的为底层盐度、表层溶解氧和表层盐度，累积贡献率为73.93%。可以看出，影响黄鳍金枪鱼潜在分布的重要环境变量主要为表层溶解氧、底层水温、底层盐度，而影响鲣潜在分布的重要环境变量主要为表层溶解氧、表层水温、底层盐度。
2.2.2 响应曲线
根据模型预测金枪鱼类潜在分布结果对环境变量的响应情况，黄鳍金枪鱼和鲣对表层溶解氧的响应曲线随算法的不同而变化。如图4-a所示，在表层溶解氧浓度为201.91~205.61 mol·m−3的海域，黄鳍金枪鱼和鲣的出现概率均较高 (大于0.5)。在表层溶解氧浓度大于201.52 mol·m−3时，黄鳍金枪鱼开始出现 (出现概率为0.38) 且随着浓度的增加其出现概率上升，当表层溶解氧浓度为202.30 mol·m−3时出现概率最大 (0.564)，之后随着浓度的增加出现概率呈下降趋势，在浓度为242.68 mol·m−3时达到临界值。因此，适宜黄鳍金枪鱼生长的表层溶解氧浓度介于201.52~242.68 mol·m−3。在表层溶解氧浓度大于200.83 mol·m−3时，鲣开始出现 (出现概率为0.38)且随着浓度的增加其出现概率上升，在浓度为203.07 mol·m−3时出现概率最大 (0.623)，之后随着浓度的增加出现概率呈下降趋势，在浓度为208.35 mol·m−3时达到临界值。由此可知，适宜鲣生长的表层溶解氧浓度介于200.83~208.35 mol·m−3。
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图 4 重要环境因子对金枪鱼适生性指数的响应曲线Figure 4. Response curve of important environmental factors to suitable index of tuna适宜黄鳍金枪鱼生存的底层水温介于1.96~32.61 ℃，在底层水温介于29.80~32.61 ℃时，黄鳍金枪鱼的出现概率最大 (0.904，图4-b)；适宜鲣生存的表层水温介于19.71~28.96 ℃，在表层水温为25.16 ℃时，鲣的出现概率最大 (0.792，图4-c)。
图4-d显示，当底层盐度高于34.37‰ 时，黄鳍金枪鱼开始出现 (出现概率为0.38) ，其出现概率随底层盐度的增加而上升并在34.97‰~35.26‰时最大 (0.665)，因此底层盐度介于34.37‰~35.26‰时适宜黄鳍金枪鱼生长。鲣的底层盐度适宜范围介于34.30‰~35.26‰，在介于34.97‰~35.26‰ 时出现概率最大 (0.782)。
在以上重要环境因子中，黄鳍金枪鱼的最适宜范围分别为：表层溶解氧浓度介于201.52~242.68 mol·m−3，底层水温介于1.96~32.61 ℃，底层盐度介于34.37‰~35.26‰；鲣的最适宜范围为：表层溶解氧浓度介于200.83~208.35 mol·m−3，表层水温介于19.71~28.96 ℃，底层盐度介于34.30‰~35.26‰。
2.3 金枪鱼类养殖SI
在南海海域黄鳍金枪鱼和鲣的SI具有很强的区域变化。根据适宜SI对南海海域各网格单元的养殖概率进行定量评估，分布概率小于0.38为非适宜养殖区，分布概率大于0.6为潜在高适宜养殖区 (图5)。南海渔场与海域名参照《南海渔场作业图集》
1 。根据模型预测结果，黄鳍金枪鱼潜在适宜养殖区从南海海域中西部延伸至北部以及台湾岛东部海域，主要集中于台湾南部渔场的中西部、东沙渔场、海南岛东南部渔场的东南部、中沙东部渔场的中西部、西沙西部渔场的中东部、西中沙渔场、南沙西北部渔场的中东部、南沙中部渔场以及南沙中西部渔场的东北部，其潜在养殖高SI分布区域主要集中在东沙渔场、南沙中部渔场以及南沙中西部渔场的东北部；鲣潜在适宜养殖区从南沙群岛西北部海域延伸至台湾岛西南部，主要集中于台湾南部渔场的中西部、东沙渔场、海南岛东南部渔场的东南部、中沙东部渔场的中西部、西沙西部渔场的中东部、中沙渔场以及南沙西北部渔场的中东部，其潜在养殖高SI分布区域主要集中在台湾南部渔场的中西部以及东沙渔场。2.4 南海金枪鱼类潜在养殖丰富度分布
预测潜在金枪鱼类海水养殖面积因种类而异。在叠加金枪鱼类养殖潜在SI分布图的基础上，进一步绘制其潜在养殖丰富度分布图 (图6)。总体来说，黄鳍金枪鱼和鲣在我国南海海域养殖潜在区域分布较广，其中，台湾南部渔场的中西部、东沙渔场以及南沙中部渔场是其分布最为集中的区域。黄鳍金枪鱼和鲣在南海海域分布的高SI区域主要集中在台湾南部渔场的中西部海域。相比于黄鳍金枪鱼，鲣的潜在养殖区域面积较小，但处于潜在高适宜养殖区域的面积却更大 (图5)。
3. 讨论
本研究根据物种分布位点以及环境因子数据构建了SDM，对黄鳍金枪鱼和鲣的养殖潜在适宜区域进行了预测。结果表明，表层溶解氧、表层水温、底层水温、底层盐度是影响南海黄鳍金枪鱼和鲣养殖适宜区分布的重要环境变量。黄鳍金枪鱼潜在高适生区为南沙中西部渔场的东北部海域，鲣潜在高适生区为东沙渔场。自然环境因素作为养殖区域划分的基本要素，通过海洋中不同尺度的自然环境异质性来预测得到黄鳍金枪鱼和鲣的养殖潜在适宜区是可行的。
3.1 SDM在预测海水养殖潜力的适用性
当前和未来的海洋环境条件可能会在决定扩大海水养殖区域和物种方面发挥重要作用，温度、盐度、溶解氧作为影响金枪鱼类生长的要素，也是海水养殖能否成功的主要决定因素。研究物种适宜养殖区域是评估海水养殖可能性的第一步，SDM作为预测物种潜在海水养殖区域及分析环境适宜性结构不确定性的可靠工具[26]，已有研究表明，SDM适用于确定适宜养殖黄海鲑科的潜在海水养殖地[27-28]。本研究中，黄鳍金枪鱼和鲣的预测模型结果AUC值分别为0.848和0.872，均大于0.8，说明SDM对选择黄鳍金枪鱼和鲣的适宜养殖区域具有良好的预测能力。
在采用SDM选择金枪鱼类养殖区域时需要考虑以下因素：1) 离岸海水养殖物种通常被限制在一个有限区域内，即网箱养殖相比于近岸养殖而言，其技术与经济成本更高，考虑的因素更多。2) 我国南海不是金枪鱼的产卵海域，需要捕捞野生幼鱼和人工培育苗种进行养殖，其成活率有待考量；此外，养殖海域的环境因素随时间、空间动态变化 (如对养殖成功至关重要的温度、盐度等关键环境变量)，无法控制。3) 由于大多数养殖活动在相对较小的局部区域进行，设计海水养殖的SDM所需分辨率更高。
3.2 南海金枪鱼类潜在养殖区域的可行性
对黄鳍金枪鱼和鲣潜在养殖区域的分析表明，大部分海域在物理上适合其养殖、生长，并有可能扩大为新兴的离岸海水养殖业。本研究以潜在养殖SI为指标，定量评估了黄鳍金枪鱼和鲣的潜在养殖区，结果显示南海黄鳍金枪鱼和鲣的潜在高适生区较为集中，主要位于东沙渔场。目前一些水产养殖区域可能不是最优 (即小于高SI的区域)，但随着这些地区温度的上升，最适宜养殖区域面积将会扩大。而高SI区域面积因在不同海域中变化较大，所以需要密切跟踪其变化以确保准确性。此外，深远海养殖设施的发展、养殖技术的突破和国际市场的需求都是南海金枪鱼类养殖的驱动力。
3.3 限制因素
1) 气候变化。水产养殖对海洋环境和气候变化十分敏感，气候变化对全球渔业和水产养殖产生了直接或间接影响。面对极端气候变化，水产养殖遭遇了温度、pH、海平面上升、台风和海洋酸化的风险[29]。而要在南海东沙渔场海域实现黄鳍金枪鱼和鲣的养殖，台风是养殖过程中必须考虑的主要气候因素。利用可预测未来气候的区域情景方法，SDM可进一步评估未来气候因素的变化对海水养殖的潜在风险。
2) 模型预测能力。目前，生态位因子分析 (Ecological niche factor analysis, ENFA)、非参数概率生态位 (Non parametric probabilistic ecological niche, NPPEN)、随机森林 (Random forest, RF) 已被广泛用于估计水产养殖物种的潜在生产力。相比于采用SDM多集合方法来研究不同预测的变化差异，本文仅使用了SDMs集合中的最大熵模型，研究结果不能评估到所有潜在的适宜养殖区域。
3) 可持续承载能力。水产养殖区域的选取不仅要考虑环境因素的适宜性，还应在更广泛的养殖区域生态系统内考虑可持续承载能力。水产养殖可持续承载能力包括4个部分：物理承载能力，即物理上足以进行某种类型水产养殖的区域；生产承载能力，即从生物量或经济角度评估一个地区水产养殖生产能力的效用；生态承载能力，即在不产生难以接受的生态影响条件下，可能达到的最大生产水平；社会承载能力，即包括上述3种承载能力以及所有利益相关者之间的权衡，以满足人口(社会经济因素，如区域就业和传统渔业等) 和环境的需求[30]。本研究的重点是自然物理环境对物种水产养殖区域的影响，而在现实的水产养殖活动规划中往往需要运用多指标评价方法，充分考虑生产承载能力、生态承载能力和社会承载能力。
4) 养殖管理。水产养殖是一个复杂且长期的过程，养殖管理的便捷性与经济性成为降低生产成本的主要因素之一。随着大数据、物联网、人工智能等现代信息技术的广泛应用，水产养殖的精准化、精细化和智能化全过程生产管理更加普及，养殖管理水平和生产效率全面提升。此外，利用北斗导航系统可以预测养殖区域未来海况、潮流、风向等因子，特别是预防海域台风、赤潮等灾害造成的影响，以减少经济损失。但对生产者而言，前期的设施装备、智能管理系统以及技术研发等投入巨大，需要从技术、市场、资金等角度考虑金枪鱼养殖业发展的可行性。
5) 养殖设施。养殖装备设施作为保障深远海养殖可持续生产的基础要素，必须考虑金枪鱼类在养殖过程中的安全性。目前，根据养殖模式的划分，国内深远海渔业养殖设施装备主要包括自航养殖工船 (船舱养殖) 和网箱型养殖设施 (网箱养殖) 两种类型。自2017年以来，我国深远海养殖装备陆续投入使用，如山东青岛的“深蓝1号”、海南陵水的“5G+海洋牧场”及浙江舟山的“嵊海1号”等。但考虑到南海海域台风、风暴潮等影响和行业标准改进等因素，以及中国深远海养殖设施安全性与国际先进水平还存在一定差距，因此需要创新养殖装备核心技术，将海洋船舶工程装备与工业化养殖相融合，进一步加大对以大型养殖平台为核心的多元化养殖设备系统的研发力度，保障养殖全过程的安全性。
6) 养殖技术。养殖技术是物种水产养殖面积可持续扩大的基础条件。目前，我国已实现在外海养殖区开展黄鳍金枪鱼网箱养殖，建立了黄鳍金枪鱼深水网箱养殖技术体系，并开展了金枪鱼网箱养殖示范区建设[31]。但相较于其他国家，我国黄鳍金枪鱼深水网箱养殖技术仍处于起步阶段，扩大养殖区域需要考虑养殖技术的配套。而对于鲣来说，深水网箱养殖技术还需要更为深入的探索。
3.4 金枪鱼养殖建议
1) 采用SDM得出的金枪鱼潜在分布区域图，可为金枪鱼养殖区域选择提供指导。根据本研究结果，网箱可投放于离海南距离较近的东沙渔场，以减少运输成本。
2) 对养殖区域实施长期环境监测。环境变化对海水养殖业的影响巨大[32]，气候变化增加了水产养殖系统的复杂性和不确定性，如温度[33]、极端气候、溶解氧[34]及洋流[35]等，评估和预测环境因素对水产养殖的影响，并对在面临环境压力时，作出避免或减少损失的决策至关重要。
3) 评估和控制水产养殖对环境的影响。海水养殖对周围海域环境的影响复杂多样[36]。鱼类排出的粪便、饲料中含有的化学物质，甚至死鱼都可能污染环境[37]。例如，中国威海沿海地区长期的海水养殖活动导致pH呈现潜在下降趋势，整个研究区域的水质存在严重污染[38]。因此，研究应将物种养殖与周围环境的潜在影响结合起来。
4) 养殖区域要考虑海域使用权的立体多功能性及有限排他性。海域资源包括矿产资源、生物资源、海水资源等，同一海域空间的资源常以多种组合方式分布，使得海域具有立体开发的潜力。不同用海活动对海域自然属性的影响程度、影响方式和影响区域不同，不同用海活动间存在着兼容性和排他性，而同一海域空间的海域使用权是可以共存的。
5) 南海地理位置的特殊性对深远海养殖有诸多限制。南海作为重要的国际航道之一，拥有超过37条国际交通航线，也是我国极其重要的战略运输生命线，深远海养殖区域的选取要考虑航道通航因素。在国际主要航道分布图中，南海主要位于太平洋航线的东亚—马六甲国际主航道上，途经南沙中、西部渔场以及南沙西北部渔场的东部海域的船舶较多，而这些海域同时也是金枪鱼类的高适宜养殖区域，因此，在选择养殖区域时应充分考虑航区范围。
6) 海水养殖区域的选择，除考虑自然环境适宜度外，还需结合社会经济因素、科技水平及创新条件。金枪鱼养殖需要大规模的养殖工程系统，并依赖于高技术、高成本的陆基设施系统的开发、建设和维护。目前，我国金枪鱼养殖技术取得了新突破，如黄鳍金枪鱼深水网箱养殖示范区水体达6 600 m3，驯化成功率达到75.83%[31]；但同时也要加强养殖技术创新，日本作为全面掌握金枪鱼养殖技术的主要国家，其创新、技术、技能三位一体的基本经验[39]值得借鉴与学习，以促进我国金枪鱼养殖业的进一步发展。
4. 展望
根据南海黄鳍金枪鱼和鲣重要环境因子的最适宜范围，在今后研究中需要进一步分析其潜在高适生区重要环境因子的年际变动规律，从而更科学地分析高适生区的变化状况。SDM作为预测物种养殖适宜栖息地的有效工具，未来的水产养殖除了需要充分考虑中尺度环境异质性与气候变化之外，还需结合社会、经济、科技条件等因素，在理论生态适宜栖息地的基础上，得出南海金枪鱼潜在最佳适生区。在影响因素中不仅要全面考虑物理环境因素，还需要全面研究“生态适宜性”(即可持续承载力角度)，以精准预测适合黄鳍金枪鱼和鲣养殖的区域。此外，由于污染、海域内的人类活动和气候变化等因素，可能会导致目前适宜养殖的区域在未来变得不适宜。因此，未来的研究应考虑包括人类养殖活动对养殖区域环境的影响。
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图 1 类酵母SD301碳离子束辐照诱变后菌落存活情况
Figure 1. Survival colony forming units of yeast-like strain SD301 after carbon-ions mutagenesis
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图 2 不同浓度的过氧化氢对类酵母SD301生长的影响
Figure 2. Effects of H2O2 with different concentrations on growth of yeast-like SD301
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图 4 SD301及其突变株PS120和PS150的角鲨烯生产性能分析
Figure 4. Performance analysis of SD301 and its mutants (PS120 and PS150)
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图 6 激光共聚焦显微镜验证增强型荧光蛋白EGFP在突变株PS120的表达水平
Figure 6. Fluorescence intensity of enhanced fluorescent protein (EGFP) in mutant strain PS120 observed by laser scanning confocal microscopy
表 1 本研究中质粒构建所用引物
Table 1 Oligonucleotides used in vector construction
引物
Primer序列 (5'—3')
Sequence (5'—3')Hph-F CGGGATCCATGAAAAAGCCTGAACTCACCGC Hph-R CCGCTCGAGTTCCTTTGCCCTCGGACGAG P-C-F GGTCGCGTTCCTGAAACGCAG P-C-R CAAGCAAGGTTTTCAGTATAAT P-hph-C-F ATATGTCCTGCGGGTAAATAGC P-hph-C-R ATGCCTCCGCTCGAAGTAGCGCGTC P-egfp-F ACTCGTCCGAGGGCAAAGGAAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG P-egfp-R CCCTCTAGATGCATGCTCGAGCTTGTACAGCTCGTCCATGCC P-egfp-C-F ATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGT 
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