Identification of key amino acid sites for pH stability of GH46 family chitosanase
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摘要: 壳寡糖具有多种生物活性，是目前仅知的唯一碱性寡糖，在食品、农业和生物医药领域应用广泛。壳聚糖酶可以特异性切割壳聚糖中的β-1,4糖苷键，形成不同聚合度的壳寡糖，因此，获得具有良好稳定性的壳聚糖酶是大规模酶法制备壳寡糖的关键。为了鉴定影响糖苷水解酶 (Glycoside hydrolase, GH) 46家族壳聚糖酶酸碱耐受性的相关氨基酸位点，选取来自芽孢杆菌 (Bacillus sp.) DAU101 (最适pH为7.5) 的壳聚糖酶为模板，以来自芽孢杆菌的壳聚糖酶Csn-BAC为研究对象，综合同源建模和序列比对的方法，选取了4个候选位点并构建了4个突变体 (V1: P68A; V2: A137G; V3: A203M; V4: H234E)。结果显示，与Csn-BAC相比，4个突变体的热稳定性均出现了不同程度的下降，而酸碱耐受性有了明显的提升。结果表明，选取的氨基酸位点对酸碱耐受性均产生了显著的影响，同时表明该策略在改造壳聚糖酶稳定性方面是一种有效的方法。Abstract: Chitooligosaccharides, which have a variety of biological activities, are the only known basic oligosaccharide widely used in food, agriculture and biomedicine. Chitosanases can cleave the β-1,4 glycosidic bonds in chitosan specifically to form chitooligosaccharides with different degrees of polymerization. Therefore, obtaining chitosanases with good stability is the key for the large-scale enzymatic preparation of chitooligosaccharides. In order to identify the amino acid sites affecting the pH stability of GH46 family chitosanases, the chitosanase from Bacillus sp. DAU101 (optimal pH 7.5) was selected as template and the chitosanase Csn-BAC from Bacillus sp. MD-5 as the research object. By combining homology modeling and sequence alignments, four candidate sites were selected, and the corresponding mutants were obtained (V1: P68A; V2: A137G; V3: A203M; V4: H234E). Compared with Csn-BAC, the thermal stabilities of four mutants showed varying degrees of reduction, while the pH stability was significantly improved. These results indicate that the selected amino acid sites have an obvious effect on pH tolerance, and this strategy is an effective way to modify the stability of chitosanase.
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Keywords:
- Chitosanase /
- Key amino acids /
- Sequence alignment /
- pH tolerance /
- Homology modeling
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侧线系统是鱼类感知周边水体环境变化的重要感觉器官，对鱼类摄食、避敌、生殖、集群和洄游等行为具有极为重要的意义[1-4]。侧线系统中机械感受器与下游神经构成的结构整体称为机械感受侧线系统。神经丘 (由支持细胞和感觉毛细胞组成的感受单元) 则是机械感受侧线系统的基本组成单位[5]。侧线系统由两类神经丘组成：表面神经丘 (Superficial neuromast, SN) 和管道神经丘 (Canal neuromast, CN)，其中SN负责感受水体的绝对速度，CN负责感受水体的加速度[5-7]。两类神经丘的大小、结构及数量、排布直接决定了侧线系统的感知能力[3, 5-9]，如深海鱼类两类神经丘结构均有特化，感受毛细胞增多，神经丘感受带面积增大等[10]。侧线系统管道结构，如侧线管宽度、分支程度等决定了CN感知水体信息的功能特点[11]。硬骨鱼类发育之初侧线系统仅具有零星附于体表的SN，随着神经丘的生长和侧线管道的建立，侧线系统形态结构发生了显著变化，并伴随着仔稚鱼体型的增长与游泳、摄食能力的提高[5, 12]。因此，对鱼类侧线系统发育过程与结构特点的研究有助于解读侧线系统在其发育中的功能变化和各类行为中所起的具体作用[5]。
鳜 (Siniperca chuatsi) 是中国特有的淡水经济鱼类[13-16]，具有独特捕食习性。其食性特殊，从开口仔鱼到成体阶段终身只食活鱼，且捕食行为独特，常以跟踪、伏击的方式捕食[17-19]，这种独特的捕食习性与其视觉、侧线感觉紧密联系[17-22]。鳜颅部侧线管道系统中上、下眶线管径较大，感觉灵敏[23]；行为学研究证明鳜主要依靠视觉与侧线感觉进行捕食，颅部侧线系统与捕食行为关联更为紧密[20]。目前，关于鳜侧线系统结构研究较为薄弱，但对鳜侧线系统发育过程的描述可为了解该鱼各个发育阶段侧线系统的作用提供重要的生物学依据。因此，本文详细研究了鳜颅侧线系统的胚后发育过程及其结构特点，首先利用神经丘荧光染色观察了鳜颅部神经丘发育过程、分布特点和颅部侧线管道系统建立过程，同时利用扫描电镜观察了神经丘的超微结构，分析其建立过程与结构特点，以期为解读鳜侧线系统的发育、结构特征及功能提供研究资料。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
鳜鱼苗于2019年5月15日至7月15日采自上海市浦东新区孙农水产养殖场。受精后第6天 (6 dpf, day post fertilization) 开口，投喂团头鲂 (Megalobrama amblycephala) 鱼苗。根据鱼类早期发育主要过程与鳜发育各时期的形态特点[16, 24-25]，将鳜胚后发育分为3个阶段：仔鱼阶段 [3~9 dpf, 标准长 (SL): 3.5~8.0 mm，初孵幼体至仔鱼开口后期，具有卵黄囊、鳍褶，无鳍条，后期体表出现部分褐色斑块]；稚鱼阶段 (10~28 dpf, SL: 9.0~25.0 mm，体表出现黄色斑块与褐色斑点，鳍条发生至各鳍条基本形成)；幼鱼阶段 (28~58 dpf, SL: 30~100 mm，体色、斑纹、身体比例与成鱼相近，鳞片形成)。1~58 dpf期间以天 (d) 为单位均匀采样，每次取15尾活体鳜鱼苗进行神经丘染色，取15尾鳜鱼苗于2.5%戊二醛溶液中固定，供扫描电镜观察使用。
1.2 神经丘扫描电镜观察
取1.1中固定的鳜鱼苗，在1×PBS溶液中漂洗5次 (每次30 min)，后置于梯度乙醇 (30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%) 中脱水，每次20 min，Emitech K850干燥仪临界点干燥，Hitachi E-1010喷金仪喷金，使用HITACHI S-3400N扫描电子显微镜进行观察分析。神经丘形态数据测量方法同Webb和Shirey[26]，神经丘大小以神经丘外围与真皮细胞交界为边界进行长宽测量，感受带大小以毛细胞生长区与神经丘套细胞交界面为边缘进行长宽测量，神经丘感受带中单捆纤毛束记为一个毛细胞。
1.3 神经丘荧光标记染色
使用标记物DASPEI (2-4-dimethylamino styryl-N-ethylpyridinium iodide; AAT Bioquest Inc) 对神经丘毛细胞进行荧光染色。DASPEI染色浓度梯度分别为0.01% (3~12 dpf, SL: 3~10 mm，染色时间10 min)，0.05% (16~30 dpf, SL: 10~30 mm，染色时间15 min)，0.15% (31~58 dpf, SL: 30~100 mm，染色时间30 min)，染色后将鳜苗样本在1×PBS溶液中洗净后利用0.05%的MS-222溶液 (间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐; Sigma Aldrich) 麻醉处理，使用Nikon SMZ25荧光体视镜观察，NIS-Elements成像软件拍照。神经丘命名同Webb和Shirey[26]，CN在所属管道未闭合时记为前体CN (Presumptive canal neuromast, PCN)，管道闭合后内含神经丘记为CN；侧线管道命名同Gibbs[11]与Webb[5]，上眶线 (Supraorbital line, SO)，下眶线 (Infraorbital line, IO)，下颌线 (Mandibular line, MD)，前鳃盖线 (Preopercular line, PR)，耳后线 (Postotic line, PO)，颞上线 (Supratemporal line, ST)，而隶属于特定侧线管道的PCN与CN以管道名称+PCN/N表示。
1.4 数据分析
神经丘大小、感受带大小和毛细胞数等均以“平均值±标准差 (
$ \overline X \pm {\rm{SD}} $ ) ”表示。对标准长与神经丘形态学数据进行线性回归，使用方差分析 (Analysis of variance, ANOVA) 对回归的显著性进行检验，如回归关系明显则利用协方差分析 (Analysis of Covariance, ANCOVA) 对神经丘各形态学数据进行比较。另外，使用单因素方差分析 (One-way ANOVA) 与最小显著差异法多重比较 (LSD) 对各类神经丘形态学参数进行比较。数据比较使用软件SPSS 22.0 (IBM) 完成，显著性判定标准为P<0.05。2. 结果
2.1 颅部侧线系统发育
2.1.1 仔鱼阶段
3 dpf仔鱼颅部未见神经丘 (图1-a)；4 dpf颅部上眶线出现 (4.5±0.7) 个PCN，下眶线出现 (1.5±0.6) 个PCN (图1-b)；5 dpf上、下眶线的PCN数量增加 (图1-c)；6 dpf前鳃盖线PCN出现，每侧 (4.3±0.8) 个 (图1-d)；7~9 dpf每侧前鳃盖线PCN继续增加 (图1-e, f)；7 dpf每侧下颌线出现 (3.2±0.7) 个PCN。
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图 1 鳜仔稚鱼期颅部侧线系统发育a. 受精后第3天；b. 受精后第4天；c. 受精后第5天，箭头为上眶线前体管道神经丘，箭标为下眶线前体管道神经丘；d. 受精后第6天，箭头为前鳃盖线前体管道神经丘；e. 受精后第7天；f. 受精后第12天；g. 受精后第12天下颌；h. 受精后第16天；i. 受精后第16天颅顶部；j. 受精后第16天下颌；空心点为特定侧线起点，实点为特定侧线终点，箭头为下颌线前体管道神经丘；①. 上眶线；②. 下眶线；③. 下颌线；④. 前鳃盖线；⑤. 耳后线；⑥. 上眶线旁线；⑦. 颞上线Figure 1. Post-embryonic development of cranial lateral line system in larval and juvenile S. chuatsia. 3 dpf; b. 4 dpf; c. 5 dpf, the arrowheads show SO PCN and the arrows show IO PCN; d. 6 dpf, the arrowheads show PR PCN; e. 7 dpf; f. 12 dpf; g. The mandible at 12 dpf; h. 16 dpf; i. Top of the head at 16 dpf; j. The mandible at 16 dpf; the hollow and solid points are the starting and ending points of specific lateral line, respectively, and the arrowheads are the anterior colliculus of mandibular line; ①. SO; ②. IO; ③. MD; ④. PR; ⑤. PO; ⑥. SO side line; ⑦. ST2.1.2 稚鱼阶段
12 dpf单侧下颌线出现 (4.1±0.3) 个PCN (图1-f, g)；16 dpf，头部各侧线管道尚未建立，但每条侧线管道的路径均可通过排布其上的PCN分辨，其中上眶线PCN (9.2±0.4) 个，下眶线 (8.4±0.5) 个，前鳃盖线 (5.3±0.2) 个，下颌线 (7.1±0.2) 个，耳后线 (2.1±0.2) 个 (图1-h)。16 dpf上眶线出现分支旁线，每侧 (4.2±0.6) 个PCN，同时，颞上线已出现了 (5.3±0.7) 个PCN，上眶线旁线、颞上线PCN分布均呈左右对称 (图1-i)，下颌线 (6.3±0.5) 个PCN (图1-j)，此时，颅部已出现部分独立于各侧线分布的SN，19 dpf上眶线轮廓明显，PCN数量稳定在 (10.5±0.4) 个，下眶线PCN为 (8.2±0.8) 个 (图2-a)，SN数量逐渐增多并分布于颅顶各区域 (图2-b)。22 dpf上眶线PCN出现下沉，侧线管道尚未封闭 (图2-c)，而下眶线侧线管道建立尚未开始 (图2-d)。
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图 2 鳜稚幼鱼期颅部侧线系统发育a. 受精后第19天，方框区域为正在形成的上眶线；b. 受精后第19天颅顶部；c. 受精后第22天，箭头为正在包围神经丘的新生骨组织；d. 受精后第22天；e. 受精后第30天，方框区域为为前鳃盖线管道内的6~7个管道神经丘；f. 受精后第30天，大部分侧线管道均开始愈合 (箭头)；g. 受精后第30天，下眶线上相对的扇形新生组织正在愈合 (箭头)；h. 受精后第30天，下颌线部分未愈合管道 (箭头)；i. 受精后第37天，颅部侧线管道全部愈合；j. 受精后第44天；k. 受精后第44天鳃盖处Figure 2. Post-embryonic development of cranial lateral line system in juvenile and young S. chuatsia. 19 dpf, the establishment of SO canal is shown in the box; b. The top of the head at 19 dpf; c. 22 dpf, the canal had not closed up yet, and the advancing bone (arrows) can be easily observed around; d. 22 dpf; e. 30 dpf, the cranial lateral line canal was found to be generally formed, and there were 6–7 PCNs around the PR line which are shown in the box; f. 30 dpf, most parts (arrows) of cranial canals were in the process of closing; g. 30 dpf, the relative fan-shaped new tissue on IO line was healing (arrow); h. 30 dpf, the MD canal had been partially enclosed, and there was only part of the unenclosed canal (arrows) near the front of mandible; i. 37 dpf, the main canals of cranial lateral line were enclosed; j. 44 dpf; k. Operculum at 44 dpf2.1.3 幼鱼阶段
30 dpf颅部各条侧线的CN数量已趋于稳定 (除前鳃盖线，图2-e)，此时颅部主要侧线管道处于封闭或将要封闭的状态 (图2-f—h)；37 dpf，除耳后线与躯干侧线管道相连处未闭合，颅部主要侧线管道均已封闭，并连通成为一整体管道系统，CN与管道孔出现规律的一孔一丘交替排列，SN排布规律趋于明显 (图2-i)。44~58 dpf SN数量不断增加 (图2-j)，其中平均 (13.2±3.5) 个分布于前鳃盖表面且平行于下眶线，(16.2±4.3) 个分布于鳃盖后部 (图2-k)。
2.2 颅部神经丘形态发育
可观察到4 dpf仔鱼轮廓清晰的圆形神经丘，直径为 (8.2±2.4) μm，毛细胞数13.2±2.7 (图3)；7 dpf仔鱼上眶线与下眶线PCN为圆形乳突状，直径为 (8.2±2.9) μm，毛细胞数13.2±2.8，外缘被体表上皮细胞所包围，此时神经丘长度 (LN) 与神经丘宽度 (WN) 比 (LN/WN) 仍维持在1∶1；16 dpf稚鱼颅部上、下眶线PCN已出现感受带，上、下眶线PCN之间形态学参数 [LN/WN, 感受带长度 (LS) /感受带宽度 (WS)] 变化明显 (图3；表1和表2)，下眶线PCN毛细胞增长数慢于上眶线 (P<0.01，表2)；19 dpf稚鱼颅部上眶线PCN下陷，LN/WN已接近1.5∶1，毛细胞数已接近44.3±5.6 (表3)；30 dpf幼鱼上眶线PCN的LN/WN已接近1.8∶1，长度接近 (43.2±4.3) μm (表3，图3)，同时毛细胞数增长至62.3±12.3，下框线毛细胞数增长至43.2±10.2 (表3)，下眶线毛细胞生长速度明显慢于上眶线 (毛细胞生长率，P<0.01，表2)。下颌线PCN的生长速度，如神经丘大小、感受带大小与毛细胞数均明显慢于上、下眶线PCN (LN的生长率，P<0.001；LS的生长率，P<0.001，WN和WS也具有相似结果；毛细胞增长率，P<0.001，表2)。
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图 3 鳜神经丘建立过程的超微结构观察①. 神经丘长度；②. 神经丘宽度；③. 感受带长度；④. 感受带宽度Figure 3. Establishment process of neuromast of S. chuatsi under ultrastructural observation (SEM)①. Neuromast length; ②. Neuromast width; ③. Sensory strip length; ④. Sensory strip width表 1 鳜不同管道神经丘生长参数线性回归分析Table 1. Regression analysis of neuromast growth parameter of S. chuatsi in different canals测量参数 Parameter 前体管道神经丘 PCN 线性回归 Linear regression R2 F df P 神经丘长度 LN SON (n=86) LN=1.556 7×SL+0.642 8 0.882 2 142.471 5 1, 84 <0.001 ION (n=86) LN=1.222 4×SL+3.060 5 0.816 7 216.380 3 1, 84 <0.001 MDN (n=73) LN=0.920 2×SL+0.085 1 0.866 0 76.431 1 1, 71 <0.001 神经丘宽度 WN SON (n=86) WN=0.906 2×SL+2.400 2 0.837 0 134.567 2 1, 84 <0.001 ION (n=86) WN=0.724 1×SL+4.008 7 0.846 8 83.467 1 1, 84 <0.001 MDN (n=73) WN=0.550 1×SL+1.698 4 0.760 4 113.347 8 1, 71 <0.001 神经丘长宽比 LN/WN SON (n=86) LN/WN=0.022 2×SL+1.049 3 0.627 5 712.308 5 1, 84 <0.001 ION (n=86) LN/WN=0.025 8×SL+1.018 0.753 7 122.321 9 1, 84 <0.001 MDN (n=73) LN/WN=0.018 1×SL+1.094 0.656 3 17.322 1 1, 71 <0.001 感受带长度 LS SON (n=86) LS=0.776 2×SL+1.264 1 0.859 1 674.342 1 1, 84 <0.001 ION (n=86) LS=0.716 8×SL+2.279 4 0.890 1 345.432 1, 84 <0.001 MDN (n=73) LS=0.536 4×SL+1.712 6 0.894 9 737.904 1, 71 <0.001 感受带宽度 WS SON (n=86) WS=0.310 8×SL+2.902 3 0.725 3 48.467 6 1, 84 <0.001 ION (n=86) WS=0.300 4×SL+3.150 6 0.816 3 561.213 3 1, 84 <0.001 MDN (n=73) WS=0.299 5×SL+2.540 4 0.819 8 412.375 4 1, 71 <0.001 感受带长宽比 LS/WS SON (n=86) LS/WS=0.033 8×SL+1.103 0 0.709 4 56.321 1, 84 <0.001 ION (n=86) LS/WS=0.036 5×SL+1.056 9 0.774 5 66.439 1 1, 84 <0.001 MDN (n=73) LS/WS=0.020 9×SL+0.991 6 0.833 9 231.453 2 1, 71 <0.001 毛细胞数 HCn SON (n=86) HCn=1.794 0×SL+10.213 0.773 2 103.942 3 1, 84 <0.001 ION (n=86) HCn=1.376 6×SL+8.374 7 0.747 5 34.572 1 1, 84 <0.001 MDN (n=73) HCn=0.650 0×SL+10.353 0.724 4 65.348 7 1, 71 <0.001 注：SL为标准长 (mm)；所有数据服从正态分布；P<0.05 Note: SL is standard length in mm. All data were normally distributed. 表 2 鳜不同管道神经丘生长参数增长率的协方差分析Table 2. ANCOVA analysis of neuromast growth parameters of S. chuatsi from different canals生长参数 Growth parameter 前体管道神经丘和样本数 PCN and sample size F df P 神经丘长度 LN SON (n=86) vs ION (n=86) 7.347 6 1, 171 <0.01 神经丘长度 LN SON (n=86) vs MDN (n=73) 234.45 1, 158 <0.001 神经丘长度 LN ION (n=86) vs MDN (n=73) 163.874 2 1, 158 <0.001 神经丘宽度 WN SON (n=86) vs ION (n=86) 6.932 2 1, 171 <0.01 神经丘宽度 WN SON (n=86) vs MDN (n=73) 343.653 4 1, 158 <0.001 神经丘宽度 WN ION (n=86) vs MDN (n=73) 78.476 2 1, 158 <0.001 神经丘长宽比 LN/WN SON (n=86) vs ION (n=86) 1.346 6 1, 171 N.S. 神经丘长宽比 LN/WN SON (n=86) vs MDN (n=73) 7.125 6 1, 158 <0.01 神经丘长宽比 LN/WN ION (n=86) vs MDN (n=73) 7.273 1, 158 <0.01 感受带长度 LS SON (n=86) vs ION (n=86) 5.674 3 1, 171 <0.05 感受带长度 LS SON (n=86) vs MDN (n=73) 177.321 1, 158 <0.001 感受带长度 LS ION (n=86) vs MDN (n=73) 87.983 3 1, 158 <0.001 感受带宽度 WS SON (n=86) vs ION (n=86) 2.346 2 1, 171 N.S. 感受带宽度 WS SON (n=86) vs MDN (n=73) 4.032 8 1, 158 <0.05 感受带宽度 WS ION (n=86) vs MDN (n=73) 5.432 1 1, 158 <0.05 感受带长宽比 LS/WS SON (n=86) vs ION (n=86) 7.873 2 1, 171 <0.01 感受带长宽比 LS/WS SON (n=86) vs MDN (n=73) 119.434 5 1, 158 <0.001 感受带长宽比 LS/WS ION (n=86) vs MDN (n=73) 347.873 2 1, 158 <0.001 毛细胞数 HCn SON (n=86) vs ION (n=86) 7.548 9 1, 171 <0.01 毛细胞数 HCn SON (n=86) vs MDN (n=73) 248.433 1, 158 <0.001 毛细胞数 HCn ION (n=86) vs MDN (n=73) 276.432 2 1, 158 <0.001 注：N.S.表示没有显著性，不同神经丘生长趋势的回归分析可同时参阅表1 Note: N.S. indicates no significance. Different neuromast growth slopes are shown in regression analysis. See Table 1. 表 3 特定时期不同神经丘生长参数的单因素方差分析Table 3. ANOVA result of growth parameters of neuromast at specific stage$ \overline {\mathit{\boldsymbol{X}}}{\bf \pm {\bf {SD}}}$ 时期
Stage前体管道神经丘
PCN样本数
n神经丘长度
Length神经丘宽度
Width神经丘长宽比
LN/WN毛细胞数
HCn受精后第9天
9 dpfSON 34 9.1±3.2a 7.3±2.1a 1.2±0.2a 17.2±3.4a ION 30 8.2±2.4a 7.1±1.3a 1.1±0.2a 11.2±2.5b MDN 24 4.4±1.1b 3.0±0.6c 1.3±0.3a 10.2±1.8b STN 0 − − − − SN 0 − − − − 受精后第16天
16 dpfSON 42 24.9±3.1a 16.4±2.2a 1.4±0.2a 30.4±4.2a ION 45 21.4±2.5b 14.5±1.3a 1.4±0.2a 26.2±7.3b MDN 36 12.3±2.3c 8.1±1.8bc 1.4±0.3a 19.6±5.3c STN 35 13.8±1.6c 9.4±0.8b 1.2±0.1b 16.4±4.4cd SN 35 7.2±0.9d 7.1±1.1c 1.0±0.3b 13.5±2.5d 受精后第23天
23 dpfSON 45 34.2±4.2a 24.5±2.8a 1.5±0.3a 46.4±7.8a ION 44 31.4±2.6b 21.2±3.1a 1.5±0.2a 30.2±7.2b MDN 32 16.1±3.1c 13.5±2.9b 1.6±0.2a 23.3±6.3c STN 40 29.9±3.5b 19.3±3.2a 1.5±0.3ab 31.0±8.2b SN 38 8.0±1.1d 7.2±0.9c 1.1±0.3b 15.2±6.3d 受精后第30天
30 dpfSON 42 43.2±4.3a 27.1±2.0ab 1.7±0.2a 62.3±12.3a ION 35 36.1±3.8b 25.6±1.8b 1.6±0.2a 43.2±10.2c MDN 34 27.3±2.9c 16.3±1.5c 1.6±0.3a 29.2±5.3e STN 33 38.5±3.1b 29.3±2.2a 1.6±0.1a 57.2±11.5b SN 36 11.1±1.1d 10.4±1.0d 1.0±0.2b 17.2±3.1f 注：数据服从正态分布，同列中具有不同上标字母表示差异显著 (P<0.05) Note: All data conform to normal distribution, and values within the same column with different superscripts are significantly different (P<0.05). 7~12 dpf仔稚鱼期间，颅部两侧上眶线出现分支并延伸至颅顶部，同时颞上线分支于耳后线，也延伸至颅顶 (图1-i)，单侧上眶线旁线与颞上线均含有 (5.3±1.4) 个CN，尽管出现较晚 (出现于7 dpf后)，但神经丘大小、毛细胞数增长情况均快于上、下眶线PCN (表3)；至23 dpf稚鱼，颞上线PCN大小已接近下眶线，至31 dpf幼鱼，毛细胞数已介于上、下眶线之间 (表3)。
SN生长速度慢于PCN，同时，鳜各区域SN一直保持圆形乳突状结构，LN/WN一直保持在1∶1，同时，毛细胞生长速度显著慢于PCN (图2，表3)。
3. 讨论
鳜颅部侧线系统胚后发育主要分为4个阶段：初孵仔鱼时期 (3 dpf)，颅部主要侧线系统结构——神经丘、侧线管道尚未出现 (图4)；仔稚鱼时期 (4~16 dpf)，颅部相继出现隶属于上眶线、下眶线、下颌线和前鳃盖线的PCN (图4)；稚鱼期 (16~22 dpf)，上眶线与耳后线上方出现PCN，SN出现 (图4)；稚幼鱼期 (22~37 dpf)，颅部侧线管道逐渐建立、连通，成为颅部侧线管路整体，其中上眶线、耳后线上方的PCN与新生侧线管道形成完整的上眶线旁线与颞上线，此时鳜颅部主要侧线为上眶线、下眶线、下颌线、前鳃盖线，同时耳后线将上、下眶线与前鳃盖线连通，颞上线起始于耳后线背侧与上眶线旁线向颅顶部延伸，37 dpf颅部双侧CN平均数量为102.3±6.5，之后数量维持稳定，而SN数量在随后的发育中持续上升 (图4和图5)。
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图 4 鳜颅部侧线系统发育过程示意图a. 受精后第3天仔鱼；b. 受精后第16天稚鱼；c. 受精后第20天稚鱼；d. 受精后第37天幼鱼；红点代表管道神经丘；蓝点代表表面神经丘；灰线代表管道侧线系统；灰线白点代表管道孔；①. 受精后第上眶线；②. 受精后第下眶线；③. 受精后第下颌线；④. 前鳃盖线；⑤. 耳后线；⑥. 上眶线旁线；⑦. 颞上线Figure 4. Diagram of development of cranial lateral line system in S. chuatsia. 3 dpf larva; b.16 dpf juvenile; c. 20 dpf juvenile; d. 37 dpf young fish; red dots indicate canal neuromasts; blue dots indicate superficial neuromasts; gray lines indicate canal system; white dots on the gray line indicate the pore on the lateral line canals; ①. SO; ②. IO; ③. MD; ④. PR; ⑤. PO; ⑥. SO side line; ⑦. ST![]()
图 5 鳜各发育时期管道神经丘与表面神经丘的数量特点Figure 5. Quantitative characteristics of CN/SN of S. chuatsi at different developmental stages鳜颅部侧线主要发育过程与大部分硬骨鱼类相类似[5, 26-28]，但也具有其独特的发育特征。首先，大部分鲈形目鱼类，颅部主要侧线在建立过程中背侧发育快于腹侧 (上眶线>下眶线>下颌线)，前部快于后部 (前部侧线>前鳃盖线)，而在大部分鲈形目鱼类颅部侧线系统的发育过程中，主要侧线的建立未见明显先后顺序，如丽鱼科 [ 眼斑星丽鱼 (Astronotus ocellatusl)、奥利亚罗非鱼 (Oreochromis aureus)、九间波罗 (Cichlasoma nigrofasciatum)][5, 29]，鲈科 [ 梅花鲈 (Acerina cernua)][30]，狼鲈科 [ 七星鲈 (Lateolabrax japonicus)][30]，天竺鲷科 [ 僻梭竺鲷 (Cercamia eremia)、稻氏天竺鲷 (Ostorhinchus doederleini)]等[30-31]。根据已有硬骨鱼类侧线管道系统结构与分支情况[5, 11, 27-28]，鳜颅部侧线管道系统属于狭窄-简易型侧线管道系统，CN排布方式与鲈形目其他鱼类相似[32-35]，但鳜颅顶部侧线管道系统因上眶线旁线与颞上线的存在使其侧线管路结构远比腹侧复杂 (图4)，这也造成了颅顶部较多的CN分布，鳜发育过程中颅部未见大部分硬骨鱼类SN具有的成簇、成行排列，SN数量增长慢，分布少，隶属于鲈形目的常见鱼类，如红花孔雀鱼 (Aulonocara stuartgranti)、三湖慈鲷 (Tramitichromis sp.) 在幼鱼期 (15~30 dpf) 单侧SN数量均达150~200个[36]，而同时期鳜幼鱼颅部SN双侧数量仅73.2±12.5，至58 dpf SN双侧数量也仅达234.3±42.5，但鳜胚后发育过程中颅部SN逐渐形成背侧及颅顶部的密集排布，而下颌未见SN分布。随着硬骨鱼类生活水层与摄食习性变化，侧线管道系统与神经丘排布常出现结构性适应[5, 11]，鳜颅部侧线管道与神经丘排布在顶部区域相对密集，可能加强了鳜对上侧水体波动信息的感受，这与其底栖生活习性相适应。另外，鳜初孵仔鱼颅部侧线系统极为简易，仅4 dpf颅部上、下眶线区域出现 (6.2±1.3) 个PCN，鳜开口仔鱼只食活鱼[17-18]，而鳜仔鱼阶段极为简易的侧线结构可能只起到对周边水体的基本感知，在摄食行为中发挥作用有限。
相较多数鲈形目常见鱼类，如奥利亚罗非鱼、九间波罗、舌齿鲈 (Dicentrarchus labrax) 等[5, 29]，鳜颅部二类神经丘体积小，内含毛细胞数少，并不具有特化的神经丘结构，但鳜颅部二类神经丘有独特的发育模式，首先，颅部CN生长速度为上框线>下眶线>下颌线，同时感受带毛细胞的增长情况也显著不同 (表2)，30 dpf幼鱼以后颅部各侧线管道虽陆续封闭，但根据这三类神经丘增长趋势 (大小、毛细胞数，表1)，后续发育阶段上、下眶线CN在大小与毛细胞数上应明显超过下颌线神经丘；另外，上眶线旁线和颞上线神经丘出现时间较晚，但生长均快于下眶线与下颌线神经丘 (表3)，23 dpf稚鱼颞上线PCN的生长情况已与同一时期上眶线PCN接近 (表3)；SN生长速度与毛细胞增长数明显慢于颅部CN (表3)。神经丘的灵敏度直接由胶质顶形状所决定，因其具有神经丘与水环境的直接接触界面[37]，而胶质顶覆盖于神经丘上，其形状与神经丘形状、感受带形状和毛细胞数直接相关，如尺寸较大的神经丘导致其上覆盖有一较大的胶质顶结构，这增大了神经丘与水体接触的界面，使神经丘的灵敏度得到了增强[38]。鳜上侧PCN (上、下眶线，上眶线旁线、颞上线) 增长速度明显快于腹侧 (下颌线)，基于这些形态学数据，推测鳜颅部侧线系统对头部斜上方方位更为敏感。
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表 1 定点突变引物
Table 1 Primers for directed evolution
引物
Primer name序列 (5'—3')
Sequence (5'—3')P68A上游引物
Fw P68AGCCCGTCACCCAATGCCTCGACATATCCATA P68A下游引物
Rv P68ATATGGATATGTCGAGGCATTGGGTGACGGGC A137G上游引物
Fw A137GCGAAATTCCTTATCATTTCCAAGCGACTTCCAGGCA A137G下游引物
Rv A137GTGCCTGGAAGTCGCTTGGAAATGATAAGGAATTTCG A203M上游引物
Fw A203MTTGGTGACCCGCCCATTTTTTTGTTCGTACGTTTAATCAAGGC A203M下游引物
Rv A203MGCCTTGATTAAACGTACGAACAAAAAAATGGGCGGGTCACCAA H234E上游引物
Fw H234EGTCACGGGTGTCCTCATTTGCCGGATTCATCAGATCG H234E下游引物
Rv H234ECGATCTGATGAATCCGGCAAATGAGGACACCCGTGAC 
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表 2 Csn-BAC及其突变体反应动力学参数
Table 2 Reaction kinetic parameters of chitosanase Csn-BAC and its mutants
酶
Enzyme米氏常数
Km/(mg·mL−1)周转率
Kcat/s−1催化效率
Kcat/Km/[mL·(mg·s) −1]野生型 Csn-BAC 7.25 556.00 76.65 突变体 V1 3.68 307.22 83.37 突变体 V2 3.13 409.49 130.66 突变体 V3 7.27 540.88 74.39 突变体 V4 3.16 322.68 102.19
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