Identification of key amino acid sites for pH stability of GH46 family chitosanase
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摘要: 壳寡糖具有多种生物活性，是目前仅知的唯一碱性寡糖，在食品、农业和生物医药领域应用广泛。壳聚糖酶可以特异性切割壳聚糖中的β-1,4糖苷键，形成不同聚合度的壳寡糖，因此，获得具有良好稳定性的壳聚糖酶是大规模酶法制备壳寡糖的关键。为了鉴定影响糖苷水解酶 (Glycoside hydrolase, GH) 46家族壳聚糖酶酸碱耐受性的相关氨基酸位点，选取来自芽孢杆菌 (Bacillus sp.) DAU101 (最适pH为7.5) 的壳聚糖酶为模板，以来自芽孢杆菌的壳聚糖酶Csn-BAC为研究对象，综合同源建模和序列比对的方法，选取了4个候选位点并构建了4个突变体 (V1: P68A; V2: A137G; V3: A203M; V4: H234E)。结果显示，与Csn-BAC相比，4个突变体的热稳定性均出现了不同程度的下降，而酸碱耐受性有了明显的提升。结果表明，选取的氨基酸位点对酸碱耐受性均产生了显著的影响，同时表明该策略在改造壳聚糖酶稳定性方面是一种有效的方法。Abstract: Chitooligosaccharides, which have a variety of biological activities, are the only known basic oligosaccharide widely used in food, agriculture and biomedicine. Chitosanases can cleave the β-1,4 glycosidic bonds in chitosan specifically to form chitooligosaccharides with different degrees of polymerization. Therefore, obtaining chitosanases with good stability is the key for the large-scale enzymatic preparation of chitooligosaccharides. In order to identify the amino acid sites affecting the pH stability of GH46 family chitosanases, the chitosanase from Bacillus sp. DAU101 (optimal pH 7.5) was selected as template and the chitosanase Csn-BAC from Bacillus sp. MD-5 as the research object. By combining homology modeling and sequence alignments, four candidate sites were selected, and the corresponding mutants were obtained (V1: P68A; V2: A137G; V3: A203M; V4: H234E). Compared with Csn-BAC, the thermal stabilities of four mutants showed varying degrees of reduction, while the pH stability was significantly improved. These results indicate that the selected amino acid sites have an obvious effect on pH tolerance, and this strategy is an effective way to modify the stability of chitosanase.
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Keywords:
- Chitosanase /
- Key amino acids /
- Sequence alignment /
- pH tolerance /
- Homology modeling
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环保酵素起源于泰国，2006年由Rosukon博士利用有机固体废物开发获得。环保酵素是由废弃水果或其果皮、蔬菜、糖 (白糖、红糖或蜜糖) 和水发酵而成[1]，为复杂的多物质混合体系，包含水、发酵菌、蛋白质 (酶)、有机酸和无机盐等[2]。其中，发酵菌种的差异会导致酵素成分的不同，这也是酵素值得深入研究的原因之一。环保酵素具有较高的酶活性和抑菌性，在农业研究中发现，环保酵素可作为有机肥料[3-4]，作物土质改良剂[5]，蔬菜病害[6]、虫害[7]防治剂等。在水产养殖中，具有促进有益藻类生长[3]、降低养殖污泥中有机物含量[8-9]、改善养殖水质[10]、提高水产动物饲料利用率[4]和增强养殖动物免疫力[11]等作用。近年来，环保酵素的应用范围仅局限于马来西亚、日本及中国台湾地区，而中国大陆地区尚未广泛推行，应用方面的报道甚少[12]。对于将环保酵素作为水产病原微生物抑制剂相关方面的研究则更为匮乏。
细菌性疾病一直是制约水产养殖业健康和可持续发展的关键因素之一，许多水生微生物如嗜水气单胞菌 (Aeromonas hydrophila)[13]、维氏气单胞菌 (A. veronii)[14]、坎氏弧菌 (Vibrio campbellii)[15-17]、轮虫弧菌 (V. rotiferianus)[18]、迟缓爱德华氏菌 (Edwardsiella tarda)[19]、副溶血弧菌 (V. parahemolyticus)[20]、哈维氏弧菌 (V. harveyi)[21-22]等均可引起水产动物患病，严重者还可致其死亡。目前，抗生素、化学药物仍然是治疗水产动物细菌病的最有效措施，然而由于养殖经济动物体内的药物残留及病原菌耐药性问题，寻找抗生素及化学药物的安全替代品已成为治疗水产动物细菌病的重要课题。环保酵素中存在大量的酶、益生菌、有机酸等物质，具有抑制水产病原菌的潜力，因此，开展环保酵素对水产病原菌的控制研究十分必要。
本文旨在探讨自制环保酵素对弧菌科4种主要水产病原菌 (坎氏弧菌SP-1、哈维氏弧菌SP-1、轮虫弧菌SP-1及嗜水气单胞菌245) 的体外抑制作用，初步确定所用的自制环保酵素在抑菌过程中发挥抑菌功能的主要物质。用自制环保酵素短时间药浴的方式评估其对嗜水气单胞菌攻毒斑马鱼 (Danio rerio) 的保护效果，分离并鉴定发酵后期自制环保酵素中的优势发酵菌株，为环保酵素的标准化生产及其在水产养殖中的推广应用提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
水产病原菌：坎氏弧菌SP-1、哈维氏弧菌SP-1、轮虫弧菌SP-1、嗜水气单胞菌245均分离自天津地区发病鱼，经过16S rRNA基因序列信息鉴定，保存于天津市水产生态及养殖重点实验室。细菌培养材料：卢里亚·伯塔尼 (Luria-Bertani, LB) 肉汤、LB琼脂、酵母浸出粉胨葡萄糖 (Yeast extract peptone dextrose, YPD) 肉汤、YPD琼脂购自北京陆桥技术股份有限公司。自制环保酵素采用萎蔫枯黄但未腐烂的清洁蔬菜、水果，在可排气发酵桶中自然发酵12个月制成。试验用斑马鱼购自天津市西青区张家窝镇水族市场。
多功能酶标仪 (4MK2，赛默飞世尔科技有限公司Thermofisher)；高速冷冻离心机 (YZB/GER 1841-2014, Thermofisher)。
1.2 试验方法
1.2.1 最小抑菌浓度
取环保酵素的上清液，以0.22 μm无菌滤膜过滤去除酵素中的微生物，制备无菌酵素上清液。采用96孔板比浊法，将4株对数末期病原菌以1%接种量分别接种至LB液体培养基 [ 初始浓度为 (1~3) ×107 CFU·mL−1]。添加不同浓度的无菌酵素上清液使其终体积分数介于2%~14%，以在LB液体培养基中加入与环保酵素同等体积生理盐水的样品作为空白对照组。30 ℃静置培养24 h，以多功能酶标仪测定OD600值，与未接种微生物的培养基 (含相同浓度酵素) 相比，以OD值不增加的最低酵素浓度作为最小抑菌浓度 (MIC)。
1.2.2 最小杀菌浓度
将4株对数末期病原菌以1%接种量分别接种至LB液体培养基 [ 初始浓度为 (1~3) ×107 CFU·mL−1]。在各病原菌培养液中添加不同体积分数的酵素无菌上清液，使其终体积分数介于10%~17%，加入同等体积生理盐水作为对照组。4 ℃静置培养24 h，吸取10 μL处理液在LB固体平板上划线，培养24 h后观察是否有菌落出现，以没有菌落出现的最低酵素体积分数为最低杀菌浓度 (MBC)。
1.2.3 病原菌攻毒与酵素保护
使用嗜水气单胞菌245对斑马鱼进行浸泡攻毒，以自制酵素对斑马鱼进行攻毒保护。试验分为对照组、攻毒组与酵素处理组，每组3个平行，每个平行组有7尾体型相近的健康斑马鱼[ 体质量 (437±16) mg]。对照组使用无菌水养殖，攻毒组使用嗜水气单胞菌245 (1×109 CFU·mL−1) 浸泡；各组在处理12 h后，均将养殖用水更换为无菌水。酵素处理组在病原菌攻毒12 h后，使用体积分数为8%的酵素无菌上清液对斑马鱼药浴30 min，其余2组在无菌水中处理30 min。药浴结束后，各组均再次更换无菌水，禁食暂养。然后开始记录斑马鱼的存活情况，24 h后统计各组斑马鱼的总体死亡率。
1.2.4 自制环保酵素活性成分的初步判断
温度敏感性试验：将自制酵素无菌上清液分别在60、80、100、121 ℃下加热30 min，冷却至室温；pH敏感性试验：以1 mol·L−1 NaOH和1 mol·L−1 HCl 无菌溶液将自制酵素无菌上清液pH分别调至5.0、6.0、7.0、8.0；蛋白酶敏感性试验：将 2 g·L−1的胃蛋白酶溶液以1∶1比例加入自制酵素无菌上清液，37 ℃静置1 h；以未经任何处理的自制酵素无菌上清液作为对照，以96孔板生长抑制法检测上述处理对自制酵素抑菌活性的影响。
1.2.5 发酵菌株的分离和鉴定
将少量酵素分别在LB固体培养基、YPD固体培养基上均匀涂布，培养24 h后挑取菌落，采用划线法纯化。记录菌落形态并用光学显微镜观察菌体形态。提取菌种DNA，扩增并测定其ITS1-ITS4的DNA序列，构建菌株系统发育树。
1.3 数据处理
试验数据采用Excel 2010软件计算数据的标准偏差；用Origin 8.0软件绘图；通过SPSS 13.0软件进行单因素方差分析 (SNK，α=0.05或0.01)。每项实验重复3次，每次重复包含至少3个平行。
2. 结果
2.1 自制环保酵素对水产病原菌的最低抑制浓度
自制酵素无菌上清液对4种病原菌的生长抑制作用见图1。低浓度酵素对菌体生长无明显的抑制作用，但随着酵素浓度提高，细菌培养液吸光值迅速降低，表明高浓度酵素可明显抑制菌群生长。不同指示菌开始出现生长抑制的酵素浓度不同，轮虫弧菌SP-1对酵素最敏感，哈维氏弧菌SP-1和坎氏弧菌SP-1其次，嗜水气单胞菌245最低。自制酵素无菌上清液对轮虫弧菌SP-1、坎氏弧菌SP-1、嗜水气单胞菌245及哈维氏弧菌SP-1的MIC分别是体积分数为6.2%、11.5%、 11% 和11%的酵素。
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图 1 环保酵素无菌上清液对水产病原菌的生长抑制作用Figure 1. Inhibitory activity of sterile supernatant of garbage enzyme against aquatic pathogens2.2 自制环保酵素对病原菌的最小杀菌浓度
自制酵素无菌上清液对轮虫弧菌SP-1、哈维氏弧菌SP-1、嗜水气单胞菌245及坎氏弧菌SP-1的致死作用见表1。自制酵素对嗜水气单胞菌245的致死作用较强，最小致死浓度是体积分数为12.0%的酵素。酵素对轮虫弧菌SP-1、坎氏弧菌SP-1和哈维氏弧菌SP-1的致死能力稍弱，最小致死浓度是体积分数为16.0%的酵素。
表 1 自制环保酵素无菌上清液对水产病原菌的致死作用Table 1. Lethal effects of sterile supernatant of home-made garbage enzyme against aquatic pathogens病原菌
Pathogen酵素体积分数 Enzyme volume fraction/% 17.0 16.5 16.0 15.5 15.0 14.5 14.0 13.5 13.0 12.5 12.0 11.0 10.0 嗜水气单胞菌 245 A. hydrophila 245 − − − − − − − − − − − + + 轮虫弧菌 SP-1 V. rotifer SP-1 − − − + + + + + + + + + + 哈维氏弧菌 SP-1 V. harveyi SP-1 − − − + + + + + + + + + + 坎氏弧菌 SP-1 V. candida SP-1 − − − + + + + + + + + + + 注：+. 平板上有菌落生长；−. 无菌落 Note: +. Growth of bacterial colony on agar; −. No colony 2.3 环保酵素对嗜水气单胞菌感染斑马鱼的保护作用
空白对照组斑马鱼在试验期间死亡率为0。嗜水气单胞菌245对斑马鱼的致死率较高，试验鱼用1×109 CFU·mL−1的嗜水气单胞菌浸泡攻毒12 h，换水移除病原菌后24 h内全部死亡 (图2)。使用8%自制酵素药浴30 min能够显著降低嗜水气单胞菌攻毒斑马鱼的死亡率 [(9.5±6.49) %]。与攻毒组相比，酵素药浴使嗜水气单胞菌对斑马鱼的致死率显著降低了[(90.5±6.49)%, P<0.01]。
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图 2 自制环保酵素无菌上清液对嗜水气单胞菌攻毒斑马鱼的保护作用**. 组间数据有显著差异 (P<0.01)Figure 2. Protective effect of sterile supernatant of home-made garbage enzyme on Danio rerio challenged with A. hydrophila**. Very significant difference between different columns (P<0.01).2.4 自制环保酵素的抗菌活性成分敏感性
为分析自制酵素中的有效作用物质，本研究考察了酵素在不同pH、温度下，以及在蛋白酶处理后抑菌效果的变化 (图3)。在不同温度处理下 (图3-a)，酵素对4种病原菌的抑制率无显著变化 (P>0.05)，表明抑菌物质的热稳定性高。蛋白酶处理未影响酵素对4种病原菌的抑菌率 (图3-b)，表明酵素中未含有抑制4种指示菌的蛋白质或肽类物质。将pH从酵素的原始pH (4.0) 调节至接近中性的过程中，抑菌率逐渐下降 (图3-c)；当pH为8时，酵素对哈维氏弧菌SP-1和嗜水气单胞菌245完全失去抑菌活性，但对轮虫弧菌SP-1和坎氏弧菌SP-1仍有部分抑菌活性。结果表明自制酵素对水产病原菌的抑制作用存在低pH依赖性，抑菌活性成分主要为酸性物质或在酸性条件下发挥作用。
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图 3 不同温度 (a)、蛋白酶 (b) 和pH (c) 处理后对酵素的抑菌效果不同字母表示有显著性差异 (P<0.05)Figure 3. Effect of heating (a), protease (b) and pH (c) on inhibitory activity of home-made garbage enzyme against aquatic pathogensDifferent letters indicate significant differences (P<0.05).2.5 环保酵素中发酵菌株的分离和鉴定
为得到抑菌活性物质的产生菌，同时为环保酵素的标准化生产提供发酵菌株，从自制酵素中分离得到1株酵母菌，命名为bj001。菌株bj001在YPD培养基上呈乳白色，菌落大而厚、呈圆形、光滑湿润有黏性，易被挑起 (图4-a)。光学显微镜下观察bj001菌体形态为香肠状，宽度2~3 μm，长度5~10 μm (图4-b)。
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图 4 自制环保酵素发酵菌株bj001的菌落和菌体形态a. bj001菌落形态；b. bj001菌体在光学显微镜下的形态 (放大倍数10×100)Figure 4. Colony and cell morphology of fermentation strain bj001 from home-made garbage enzymea. Colony morphology of bj001; b. Morphological characteristics of bj001 cells under light optical microscope (Magnification 10×100)提取bj001酵母的基因组，扩增并测定ITS1~ITS4的DNA序列信息，与美国国家生物信息中心 (NCBI) 数据库中已发表的序列进行同源性比对，并依据ITS1~ITS4序列同源性建立系统发育树。结果表明bj001菌株与毕赤酵母属的库德毕赤酵母 (Pichia kudriavzevii) 菌株AUMC 10709、CY902、GY1同源性最高，与库德毕赤酵母菌株ATCC 6258同源性次之 (图5)。因此鉴定菌株bj001为库德毕赤酵母，并命名为库德毕赤酵母bj001。
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图 5 基于ITS序列构建的库德毕赤酵母bj001系统发育树Figure 5. Phylogenetic tree of P. kurdii bj001 constructed based on ITS sequence3. 讨论
3.1 酵素的抑菌能力
本研究证明了自制酵素对多株水产革兰氏阴性病原菌有良好的抑制和杀灭作用，对坎氏弧菌SP-1、哈维氏弧菌SP-1、轮虫弧菌SP-1和嗜水气单胞菌245的MIC 分别是体积分数为11.5%、11%、6.2%和11%的酵素，MBC分别是体积分数为16%、16%、16%和12%的酵素。酵素的抑菌能力在其他研究中也有报道，如董银卯等[23]研究显示，2%的膏状酵素对大肠杆菌 (Escherichia coli)、铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) 的抑制率分别为19.21%、33.2%、38.01%。红茶菌酵素对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有较强的抑制能力[24]。青梅酵素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) 有良好的抑制效果[25]。Neupane和Khadka[26]利用番木瓜 (Carica papaya)、复合水果以及蔬菜制备的不同酵素，对金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌、志贺氏菌 (Shigella Castellani)、铜绿假单胞菌、伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhi) 以及大肠杆菌均有不同程度的抑制作用；这些均与本研究结果相似，证明酵素对致病菌的广泛抑制潜力。本研究仅考察了自制酵素对水产养殖中4种革兰氏阴性病原菌的抑制效果。由于各研究所用的指示菌不同，因此无法准确比较研究中酵素抑菌性能的高低。
此外，本研究所采用的自制环保酵素还可作为药物通过短暂药浴来发挥抑菌功效，显著降低嗜水气单胞菌攻毒斑马鱼的致死率。嗜水气单胞菌是造成水产动物细菌性疾病的重要病原菌之一，毒性菌株在感染水产动物后往往发病快、死亡率高[27]，且多数嗜水气单胞菌有很强的广谱耐药性[28]，难以控制。本研究采用体积分数为8%自制环保酵素无菌上清液浸泡30 min，可以使嗜水气单胞菌对斑马鱼的致死率降低 (90.5±6.49)%。可见本研究的自制环保酵素有作为药物治疗水产动物嗜水气单胞菌病的潜力。
3.2 酵素的抑菌活性物质
本研究发现自制环保酵素的自然pH约4.0，且抑菌活性主要依赖于低pH，耐热性好且对蛋白酶不敏感，表明其主要抑菌活性成分是非蛋白类酸性物质。根据报道，可以推测自制环保酵素中的有效抑菌成分为混合的有机酸；有机酸对各类微生物具有广谱抑制能力[29]。据报道，以果蔬制备的酵素中含有丰富的有机酸，黑加仑酵素的总酸质量浓度可达26.5 g·L−1，主要为柠檬酸、苹果酸、草酸、奎宁酸和莽草酸[30]。蒋增良[31]测定的以树莓、蓝莓和葡萄为原料制备的天然酵素中有机酸包括酒石酸、莽草酸、乙酸和柠檬酸、丙酮酸等；张梦梅等[32]检测到市售酵素产品中的有机酸为草酸、苹果酸、乳酸和乙酸。这与本研究中自制环保酵素主要抑菌成分敏感性的研究结果相吻合。进一步精细分析环保酵素中有效抑菌成分的特性及各物质含量，有利于优化酵素的发酵工艺，并确定环保酵素在水产养殖中的应用方式。
3.3 酵素的发酵菌株
酵素的活性物质由发酵剂发酵蔬菜水果原料产生，因此活性成分的含量与发酵剂种类密切相关[24, 33-35]。果蔬酵素的发酵通常由多种微生物参与，是一个随时间不断变化的复杂多菌发酵过程。目前，酵素的制作过程主要依赖于发酵原料中的野生微生物群落和自然环境温度，发酵过程较为随机[36-37]，已从微生物酵素中分离纯化得到的发酵菌主要为酵母菌和醋酸菌[38]。凌空等 [39]发现主要发酵菌株随着发酵时间而变化，发酵初期尚有乳酸菌参与，发酵到18个月时，果蔬酵素中的发酵菌株为毛榛毕赤酵母 (P. mandshurica)。蒋增良[31]发现发酵12个月的葡萄酵素中主要发酵菌株为季也蒙毕赤酵母 (P. guilliermondii)、德巴列汉逊酵母 (Debaryomyces hansenii) 和浅白隐球酵母 (Cryptococcus albidus)。杜丽平等[40]发现参与木瓜酵素发酵的优势微生物有植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)、酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、季也蒙毕赤酵母等。魏东东等[41]在红树莓酵素中分离鉴定到5株主要发酵菌，包括酿酒酵母、库德毕赤酵母、盔形毕赤酵母 (P. manshurica) 及植物乳杆菌。本研究中，在自制环保酵素发酵后期 (12个月) 分离到一株优势发酵菌株，经ITS序列和系统发育树结果鉴定为库德毕赤酵母，证实了酵素发酵后期以酵母菌为优势菌。进一步评估该菌株的特性以及制备酵素的能力，可以为高稳定性和高活性酵素的制备提供理论依据。
4. 结论
自制果蔬环保酵素表现出对水产革兰氏阴性病原微生物较强的体外抑制和致死作用，并能大幅降低由嗜水气单胞菌攻毒所造成的斑马鱼死亡。对自制环保酵素中抑菌活性物质的初步分析表明，其主要抑菌活性依赖于酸性物质或酸性环境，有较好的热稳定性，对蛋白酶不敏感。自制果蔬环保酵素发酵后期主要存活的活性发酵菌为库德毕赤酵母，该菌株有作为酵素发酵剂的潜力。
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表 1 定点突变引物
Table 1 Primers for directed evolution
引物
Primer name序列 (5'—3')
Sequence (5'—3')P68A上游引物
Fw P68AGCCCGTCACCCAATGCCTCGACATATCCATA P68A下游引物
Rv P68ATATGGATATGTCGAGGCATTGGGTGACGGGC A137G上游引物
Fw A137GCGAAATTCCTTATCATTTCCAAGCGACTTCCAGGCA A137G下游引物
Rv A137GTGCCTGGAAGTCGCTTGGAAATGATAAGGAATTTCG A203M上游引物
Fw A203MTTGGTGACCCGCCCATTTTTTTGTTCGTACGTTTAATCAAGGC A203M下游引物
Rv A203MGCCTTGATTAAACGTACGAACAAAAAAATGGGCGGGTCACCAA H234E上游引物
Fw H234EGTCACGGGTGTCCTCATTTGCCGGATTCATCAGATCG H234E下游引物
Rv H234ECGATCTGATGAATCCGGCAAATGAGGACACCCGTGAC 
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表 2 Csn-BAC及其突变体反应动力学参数
Table 2 Reaction kinetic parameters of chitosanase Csn-BAC and its mutants
酶
Enzyme米氏常数
Km/(mg·mL−1)周转率
Kcat/s−1催化效率
Kcat/Km/[mL·(mg·s) −1]野生型 Csn-BAC 7.25 556.00 76.65 突变体 V1 3.68 307.22 83.37 突变体 V2 3.13 409.49 130.66 突变体 V3 7.27 540.88 74.39 突变体 V4 3.16 322.68 102.19
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