Enzymatic synthesis and purification of Vitamin A docosahexaenoate
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摘要: 维生素A具有维持正常视力、改善皮肤、抗衰老等多种生理活性，但极不稳定，很容易在光、热、氧的作用下发生分解。选择二十二碳六烯酸乙酯 (Ethyl docosahexaenoate, EDHE) 与维生素A醋酸酯 (Vitamin A acetate, VAAE) 作为底物，在脂肪酶Novozyme435的催化下发生转酯反应，从而合成一种新型的维生素A-DHA酯 (Vitamin A docosahexaenoate, VADHE)。利用液相及质谱对目的产物进行鉴定，在此基础上，利用硅胶柱层析 (C18填料) 对反应体系中的VADHE进行纯化。经液相色谱检测，VADHE的纯度达到90%以上。为了进一步提高目的化合物得率，分别在有机溶剂体系和无溶剂体系中对转酯反应进行了优化。在有机溶剂体系中，反应6 h转化率可达40.61%。在无溶剂体系中，用100 mg脂肪酶催化反应4 h，转化率可达56.39%。该研究首次设计并合成了新型脂质VADHE，实现了该物质的纯化制备，为后期的活性检测实验奠定了基础。Abstract: Vitamin A shows a variety of physiological activities, such as maintaining normal vision, improving skin and anti-aging activity. However, it is extremely unstable and easily decomposed under the action of light, heat and oxygen. In this study, Novozyme435 was used to catalyze the transesterification reaction of Vitamin A acetate (VAAE) and ethyl docosahexaenoate (EDHE). The target product (Vitamin A docosahexaenoate, VADHE) was identified by high performance liquid chromatography (HPLC) and mass spectrometry (MS). On this basis, VADHE in the reaction system was purified by silica gel column chromatography (C18 filler). The result of HPLC shows that the purity of VADHE reached 90%. In order to increase the yield of VADHE, the transesterification reaction was optimized in organic solvent system and solvent-free system, respectively. In the organic solvent system, the conversion rate reached 40.61% after 6 h. In the solvent-free system, when 100 mg Novozyme was used to catalyze the reaction for 4 h, the conversion rate reached 56.39%. VADHE was firstly designed and synthesized in this study, and the purified VADHE can be further used in the physiological activity experiment.
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鱼类皮肤暴露于水环境中，其表面形成的黏膜层对宿主具有重要的物理、化学和生物屏障作用[1]。当鱼体处于健康状态时，皮肤黏膜层微生物与宿主互利共生，维持相对稳定的动态平衡状态[2]。环境胁迫、病原入侵等均会破坏鱼体皮肤黏膜层的微生物稳态，影响宿主健康[3-4]。研究发现，感染了传染性造血器官坏死病毒 (Infectious hematopoietic necrosis virus, IHNV) 的虹鳟 (Oncorhynchus mykiss) 皮肤微生物中变形菌门丰度显著下降，而放线菌门的丰度显著升高[5]。与健康大鲵 (Andrias davidianus) 相比，患溃疡病大鲵皮肤中的金黄杆菌属(Chryseobacterium)、伯克氏菌属 (Burkholderia) 和韩国丛毛单胞菌 (Comamonas koreensis) 的丰度显著升高[6]。
中华鲟 (Acipenser sinensis) 是我国一级重点保护水生动物，被认为是长江水生动物保护的旗舰物种[7]。近年来，中华鲟物种保护研究工作不断取得新突破，人工迁地保护规模日益扩大。然而，随着集约化养殖程度不断加深，中华鲟的病害问题也日趋增多。迄今为止，常见的细菌性病害包括细菌性烂鳃病、细菌性败血症、肠炎病、肿嘴病、腹水病、分枝杆菌病等[8-10]。传统的细菌分离培养方法是目前中华鲟病害研究的主要手段[11-12]。
花斑病是近年来中华鲟养殖过程中出现的一种新型疾病，该病以体表部分背骨板及周围皮肤褪色形成花斑为主要临床症状。中华鲟体表皮肤裸露，与水环境密切接触，寄生着复杂多样的微生物菌群。细菌培养法在处理皮肤等复杂样本时，大部分微生物难以进行分离纯化培养，具有一定的局限性。近十年来，高通量测序技术快速发展，能够全面解析微生物群落结构的种类和丰度，具有高效、全面、准确等特点，已逐渐应用于揭示人类疾病与微生物的互作关系[13-14]。本研究以健康和患花斑病中华鲟幼鱼为研究对象，利用高通量测序技术比较分析了二者皮肤黏膜层的微生物菌群结构特征，探索用于监测中华鲟健康状况的菌群标志物，以期为中华鲟的健康养殖和疾病防控提供参考依据。
1. 材料与方法
1.1 样品采集
实验样品为中华鲟研究所2023年繁殖的子二代中华鲟，全长 (10.02±0.65) cm，体质量 (3.62±0.32) g。如图1所示，健康中华鲟体色均匀，体表皮肤光滑；患花斑病中华鲟部分背骨板及周围皮肤褪色形成花斑。在无菌条件下，对6尾健康和6尾自然患病的中华鲟皮肤进行取样，分别为健康中华鲟皮肤黏液组 (HM组) 和患病中华鲟皮肤黏液组 (DM组)。具体方法如下：用无菌水冲洗鱼体3遍，用无菌镊刮取背骨板及周围皮肤黏液0.5 g，分装置2 mL离心管中，液氮速冻后置于 –80 ℃冰箱保存备测。
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图 1 健康和患病中华鲟的特征和病症Figure 1. Features and symptoms of healthy and diseased A. sinensis1.2 DNA提取、PCR扩增和高通量测序
采用Fast DNA®Spin Kit for Soil (MP Biomedicals，美国) 试剂盒提取皮肤总DNA。提取到的DNA经1% (w)琼脂糖凝胶电泳检测其合格性。使用338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3') 和806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') 通用引物对16S rRNA基因的V3—V4变异区进行PCR扩增。PCR反应程序为：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s；53 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，29个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经回收、纯化等处理后，通过上海美吉生物医药科技有限公司Illumina Miseq PE300平台进行高通量测序。
1.3 数据处理和生物信息学分析
在美吉生物云平台完成数据处理及生物信息学分析工作。测序获得的原始数据使用fastp (Version 0.19.6) 和Fasth (Version 1.2.11) 进行质控和拼接，再采用Uparse (Version 11) 软件进行处理，根据97%的相似度对序列进行OTU聚类。采用PDR Classifier (Version 2.13) 软件对每条序列进行物种注释分类，基于Silva (Version 138) 数据库进行比对注释。按照最小样本序列数对数据抽平处理后，利用R语言 (Version 3.3.1) 工具制作韦恩图、群落柱形图和PCoA图；采用Mothur (Version 1.30.2) 软件计算α多样性；通过Wilcoxon秩和检验开展健康和患病中华鲟皮肤黏膜层优势菌属的差异分析。
2. 结果
2.1 物种组成分析
12个中华鲟皮肤样品经高通量测序和序列优化后，共获得675 884条高质量序列，序列的平均长度为424 bp。所有样品的覆盖率均超过99.5%，表明其测序深度能够全面反映出各样品的细菌菌群结构。韦恩图 (图2) 显示，健康和患病中华鲟皮肤黏膜层共有OTUs数量为453个，健康中华鲟皮肤黏膜层特有OTUs数量为1 823个，患病中华鲟皮肤黏膜层特有OTUs数量为126个。二者间的OTUs数量相差较大，健康中华鲟皮肤黏膜层总OTUs数量为2 276个，患病中华鲟皮肤黏膜层总OTUs数量为579个，相比健康中华鲟减少了1 697个(74.56%)。
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图 2 健康和患病中华鲟皮肤黏膜层OTUs数量分布韦恩图Figure 2. Venn diagram of quantity distribution of OTUs among skin mucosa from healthy and diseased A. sinensis在门水平上 (图3-a)，健康中华鲟皮肤黏膜层的优势菌门为厚壁菌门 (45.26%)、变形菌门 (31.65%)和拟杆菌门 (15.02%)。患病中华鲟皮肤黏膜层的优势菌门转变为拟杆菌门和变形菌门，尤其是拟杆菌门的丰度由15.02%升至78.83%，成为第一优势菌门。
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图 3 健康和患病中华鲟皮肤黏膜层微生物结构组成分析Figure 3. Dominant species of bacteria in skin mucosa from healthy and diseased A. sinensis在属水平上 (图3-b)，健康中华鲟皮肤黏膜层优势菌属为乳杆菌属 (Lactobacillus, 26.73%)、不动杆菌属 (Acinetobacter, 19.64%)、norank_f_Muribaculaceae (6.23%)、明串珠菌属 (Leuconostoc, 5.92%) 和假单胞菌属 (Pseudomonas, 2.84%)，其他各菌属不足2%。患病中华鲟皮肤黏膜层优势菌属为黄杆菌属 (Flavobacterium, 78.38%) 和不动杆菌属 (17.62%)，其他菌属不足2%。不动杆菌属是健康和患病中华鲟皮肤中的共同优势菌属。除不动杆菌属外，二者间的其他优势菌属均不同，患病中华鲟皮肤黏膜层的优势菌属种类明显少于健康中华鲟，且黄杆菌属高度富集，相对丰度由0.99%升至78.38%。
2.2 多样性分析
选取α多样性指数比较健康和患病中华鲟皮肤微生物的物种丰富度和多样性。Chao指数和Ace指数均显示，患病中华鲟皮肤黏膜层微生物物种丰富度显著低于健康中华鲟 (p<0.001，图4-a—4-b)。Shannon指数和Simpson指数均显示，患病中华鲟皮肤黏膜层微生物物种多样性均显著低于健康中华鲟 (p<0.001，图4-c—4-d)。由PCoA图 (图5) 可见，健康中华鲟皮肤中的全部样品落在第二和第四象限并形成一个组群，而患病中华鲟皮肤中的全部样品均落在第一和第三象限并形成另外一个组群，表明两者间的菌群结构具有明显差异。
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图 4 健康和患病中华鲟皮肤黏膜层微生物α多样性分析注：*. p<0.05；**. p<0.01；***. p<0.001。Figure 4. Alpha diversity analysis of skin mucosa from healthy and diseased A. sinensisNote: *. p<0.05; **. p<0.01; ***. p<0.001.![]()
图 5 健康和患病中华鲟皮肤黏膜层微生物PCoA图Figure 5. PCoA of skin mucosa from healthy and diseased A. sinensis2.3 差异性分析
为进一步解析健康和患病中华鲟皮肤在属水平微生物群落结构上的差异性，对2组样品采用Wilcoxon秩和检验进行优势菌属的显著性差异分析。结果显示，与健康中华鲟皮肤相比，患病中华鲟皮肤黄杆菌属显著升高 (图6-a，p<0.01)，不动杆菌属无显著性差异 (图6-b，p>0.05)，乳杆菌属 (图6-c)、norank_f_Muribaculaceae(图6-d)、明串珠菌属 (图6-e)、假单胞菌属 (图6-f)、戴尔福特菌属(Delftia，图6-g)、Lachnospiraceae_NK4A136_group (图6-h)、普雷沃氏菌属 (Prevotella，图6-i) 显著下降 (p<0.01)。黄杆菌属在患病中华鲟皮肤中丰度较高，乳杆菌属、norank_f_Muribaculaceae、明串珠菌属、假单胞菌属在健康组丰度较高，以上5种菌属可能是反映中华鲟健康状态的敏感菌群。
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图 6 健康和患病中华鲟皮肤黏膜层微生物优势菌属差异分析注：*. p<0.05；**. p<0.01；***. p<0.001。Figure 6. Differentinal dominant bacterium community of skin mucosa from healthy and diseased A. sinensisNote: *. p<0.05; **. p<0.01; ***. p<0.001.3. 讨论
3.1 花斑病对中华鲟皮肤黏膜层微生物菌群物种组成及丰度的影响
已有研究发现健康状态可以影响鱼类皮肤黏膜层微生物菌群结构的变化[15]。许峻旗等[6]发现大鲵在感染溃疡病后，拟杆菌门和变形菌门显著升高 (p<0.05)，而厚壁菌门和放线菌门显著降低 (p<0.05)。张雪萍等[16]采用高通量测序技术对患烂皮病棘胸蛙 (Quasipaa spinosa) 的健康和溃烂皮肤样本进行比较研究，结果显示其健康皮肤的优势菌门为蓝细菌门/叶绿体、变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门，而溃烂皮肤的优势菌门为变形菌门。本研究结果与上述研究相似，健康中华鲟皮肤黏膜层优势菌门以厚壁菌门 (45.26%)、变形菌门 (31.65%) 和拟杆菌门 (15.02%) 为主，而患病中华鲟皮肤黏膜层优势菌门则以拟杆菌门 (78.83%) 和变形菌门 (20.28%) 为主，厚壁菌门退出优势菌门，相对丰度不足1%。厚壁菌门可以促进皮肤发酵产生活性物质，同时还可以维持皮肤表面酸性环境，帮助宿主抑制病原体的入侵[17-18]。拟杆菌门包括拟杆菌纲、黄杆菌纲和鞘脂杆菌纲等，其中黄杆菌纲中含有多种条件致病菌。因此，推测患病中华鲟皮肤黏膜层厚壁菌门的大幅减少和拟杆菌门的高度富集与中华鲟的感染发病密切相关。
进一步细化至属水平，对健康和患病中华鲟皮肤黏膜层微生物菌群组成进行对比分析，发现花斑病导致中华鲟皮肤黏膜层优势菌属减少，优势菌属由5种降至2种。在患病中华鲟皮肤中，相对丰度最高的是黄杆菌属，占比超78%。黄杆菌属隶属于拟杆菌门、黄杆菌纲、黄杆菌目、黄杆菌科，地理分布广泛，为条件致病菌，宿主种类繁多，可感染虹鳟[19]、大西洋鲑 (Salmo salar)[20]、西伯利亚鲟 (A. baerii)[21]、罗非鱼[22]等多种水生动物。有研究发现，黄杆菌属感染后的主要临床症状表现为鳃丝腐烂、体表溃疡、皮肤褪色[23-24]，这与本研究中的患病中华鲟临床症状具有相似之处。综上，拟杆菌门中的黄杆菌属高度富集表明中华鲟皮肤黏膜层的微生物稳态被破坏，黄杆菌属可能是花斑病引起中华鲟皮肤黏膜层菌群改变的特征菌属。
3.2 花斑病对中华鲟皮肤黏膜层微生物菌群多样性的影响
微生物多样性在维持宿主生态功能和健康状态方面具有重要作用，多样性高意味着宿主具有更强的抗性，多样性下降可直接增加宿主患病的风险[25-26]。张雪晨[27]比较分析了健康和感染虾肝肠孢虫 (Enterocytozoon hepatopenaei) 凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 肠道微生物群落的变化，结果显示患病对虾肠道微生物多样性显著低于健康对虾。Wang等[28]利用高通量测序方法研究了健康和患病大西洋鲑肠道菌群的结构特征，发现健康鱼肠道细菌多样性明显高于患病鱼。本研究也得到了相似结果，与健康中华鲟相比，患病中华鲟皮肤黏膜层微生物多样性和丰富度均显著下降 (p<0.001)。此外，本研究还发现在多样性和丰富度显著降低的同时，微生物群落结构呈简单化；健康中华鲟皮肤黏膜层总OTUs数量和特有OTUs数量分别为2 276和1 823个，而患病中华鲟则分别减少至579和126个；这提示微生物多样性和群落结构可间接反映鱼体的健康状态。
3.3 中华鲟健康状态菌群标志物的筛选
通过对健康和患病中华鲟皮肤黏膜层微生物菌群优势菌属进行差异性显著分析，获得5种反映中华鲟健康状态的敏感菌属。其中黄杆菌属在患病中华鲟皮肤中高度富集，而乳杆菌属、norank_f_Muribaculaceae、明串珠菌属、假单胞菌属等4种菌属在健康中华鲟皮肤中具有较高的丰度。黄杆菌属在自然界中广泛存在，是细菌性冷水病[29]、柱形病[30]等疾病的主要致病菌。根据黄杆菌属的富集状态，结合其临床意义；本研究筛选出黄杆菌属作为监测中华鲟花斑病病原的菌群标志物，其相对丰度升高提示鱼体患花斑病风险增加。在实际养殖过程中，可以通过定期检测体表皮肤菌群标志物的丰度来评估中华鲟的健康状态。随着中华鲟集约化养殖程度的不断提高，疾病问题也日趋增多。在面对新型疾病，特别是在病原体难培养或不可培养的情况下，采用高通量测序技术能有效发现病原体线索，有助于深入开展系统性研究。
4. 结论
本研究基于高通量测序技术对健康和患花斑病中华鲟皮肤黏膜层微生物菌群进行比较分析。结果表明，与健康中华鲟相比，花斑病破坏了中华鲟皮肤黏膜层正常的微生态稳态结构，优势菌群由乳杆菌属、不动杆菌属等转变为黄杆菌属，因此黄杆菌属可以作为监测中华鲟花斑病病原的菌群标志物，其相对丰度的高低可用以评估中华鲟的患病风险。
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图 1 维生素A-DHA酯 (VADHE) 的液相 (a) 和质谱 (b) 鉴定
Figure 1. Identification of vitamin A docosahexaenoate (VADHE) by HPLC (a) and MS (b)
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图 2 VADHE的纯化洗脱曲线 (a) 、全波长扫描 (b) 和核磁共振碳谱 (c) 结果
Figure 2. Elution curve (a), full wavelength scanning (b) and 13C NMR (c) of VADHE
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图 3 VADHE在有机溶剂体系中合成反应条件的优化
Figure 3. Optimization of synthetic reaction conditions in organic solvent systems of VADHE
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