Analysis of solid-state anaerobic fermentation process of mackerel processing by-products by high-throughput sequencing
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摘要: 为了实现易产组胺的鲭鱼 (Pneumatophorus japonicus) 加工副产物综合利用产业化技术开发，对鲭鱼加工副产物进行了不灭菌的乳杆菌固态厌氧发酵，尝试生产饲料用新型活性蛋白源。系统监测了发酵过程中组胺、酸溶蛋白、挥发性盐基氮 (Total volatile basic nitrogen, TVB-N)、pH的变化，通过高通量测序技术分析了发酵过程微生物群落的变化，对比分析了发酵前后抗原蛋白、游离氨基酸、脂肪酸成分的变化，以全面评价发酵过程中营养、活性成分和安全性的变迁。结果显示，植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum) HSCC-LP121在提高酸溶蛋白含量、降低组胺积累、减少挥发性盐基氮产生方面综合效果最好。发酵30 d时组胺降低到0.629 g·kg−1。这一数据和高通量测序结果表明，HSCC-LP121具有组胺降解能力，同时可抑制嗜冷杆菌属 (Psychrobacter) 和假单胞菌属 (Pseudomonas) 等潜在产组胺微生物的生长。该菌种还可抑制曲霉菌属 (Aspergillus) 等潜在危害真菌的生长，同时诱使一些生香酵母的生长。Abstract: In order to develop commercial technology for the comprehensive utilization of mackerel (Pneumatophorus japonicus) processing by-product, we carried out the non sterilized solid-state anaerobic fermentation of mackerel by-products to produce a novel protein source for feed with bioactivity. In addition, we monitored the content of histamine, acid-soluble protein and other indexes such as pH, total volatile basic nitrogen and antigenic protein; and investigated the evolution of microbial community during the fermentation by high-throughput sequencing technology, comparing the free amino acids and fatty acids before and after the fermentation. The results show that Lactobacillus plantarum HSCC-LP121 had the best comprehensive effect in increasing acid soluble protein content, reducing histamine accumulation and reducing volatile base nitrogen production. After 30 d of fermentation, the histamine content decreased to 0.629 g·kg−1, which indicates that HSCC-LP121 had the ability to degrade histamine. Moreover, HSCC-LP121 inhibited the growth of potential histamine-producing microorganisms such as Psychrobacter and Pseudomonas. Besides, the strain could also inhibit the growth of potentially harmful fungi such as Aspergillus, and induce the growth of some aroma-producing yeasts.
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刀额新对虾(Metapenaeus ensis)隶属于节肢动物门、甲壳纲、十足目、对虾科、新对虾属[1-2]。新对虾属是南海海域经济虾类中最重要的属，既是捕捞种类，也是养殖品种[3]。刀额新对虾是南海海域新对虾属中重要的经济种，资源量丰富、分布广、繁殖期长[2]，是南海海域虾拖网的主要捕捞对象，渔汛旺期其产量占虾拖网虾类总产量的50%以上[4-5]。由于虾拖网网囊网目尺寸小、选择性差，导致捕获的刀额新对虾幼虾比例较高，有时甚至高达90%[5]，严重影响虾资源的合理利用。因此，有必要对南海海域虾拖网的网囊进行优化设计，以降低对刀额新对虾幼虾的捕捞比例，减少捕捞作业对渔业资源补充群体的不良影响。
明确拖网网囊对主要捕捞种类的选择性是渔具管理、渔具优化和资源利用的基础[6-7]。目前，已对南海海域刀额新虾进行过食性、营养级和群体形态学等方面的专题研究[8-9]；关于网囊对刀额新对虾的选择性有过少量报道[10-12]，但是关于虾拖网网囊网目对刀额新对虾选择性的系统、专题研究尚未见报道。本文在整理和总结南海海域虾拖网网囊系列选择性试验数据的基础上，专题开展网囊对刀额新对虾的选择性研究，为南海海域刀额新对虾资源的合理利用和虾拖网渔具的设计优化提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 试验渔船、时间和区域
试验于2014—2017年分4个航次进行(表1)，船名分别为“粤阳东渔12057”(船长16 m、主机功率79 kW)和“粤阳东渔12081”(船长21 m、主机功率98 kW)。试验区域为南海区近海渔场，经纬度范围为112°03'E~112°22′E、21°37'N~21°50′N，水深6~13 m，底质为沙泥。
表 1 网囊选择性试验基本信息Table 1 Basic information of tested codends航次
trial时间
time网囊
codend试验渔船
vessel方法
method网目内径/mm
mesh opening网囊规格 (圆周×纵向)
codend specification
(circumferernce×vertical)有效网次
valid haul1 2014.08 D25 粤阳东渔 12057YYDY12057 套网法 covered 21.10±0.93 58×60 6 1 2014.08 D30 粤阳东渔 12057YYDY12507 套网法 covered 26.64±0.73 48×50 8 2 2015.08 S35+D18 粤阳东渔 12081YYDY12081 套网法 covered S: 32.70±0.63
D: 15.07±0.36S: 29×43，D: 80×42 8 3 2016.08 S25+D25 粤阳东渔 12081YYDY12081 套网法 covered S: 21.80±0.42
D: 21.80±0.42S: 40×60，D: 58×30 11 3 2016.08 S30+D25 粤阳东渔 12081YYDY12081 套网法 covered S: 27.14±0.45
D: 21.80±0.42S: 35×50，D: 58×30 12 3 2016.08 S35+D25 粤阳东渔 12081YYDY12081 套网法 covered S: 32.42±0.18
D: 21.80±0.42S: 29×43，D: 58×30 10 4 2017.09 S35+D25 粤阳东渔 12081YYDY12081 裤网法 trouser S: 32.42±0.18
D: 21.80±0.42S: 23×29，D: 81×20 11 4 2017.09 S35+D30 粤阳东渔 12081YYDY12081 裤网法 trouser S: 32.42±0.18
D: 27.14±0.45S: 23×29，D: 67×17 10 4 2017.09 S35+D35 粤阳东渔 12081YYDY12081 裤网法 trouser S: 32.42±0.18
D: 32.42±0.18S: 23×29，D: 58×14 8 合计 total 84 注：S. 方形网目；D. 菱形网目
Note: S. square mesh; D. diamond mesh1.2 试验网具与网囊
试验网具为南海区最常见的双桁杆虾拖网(以下简称虾拖网)，其原主尺度为10.50 m×7.15 m(2.2 m)。关于虾拖网的结构特征、渔法特点和渔获组成等信息，可参阅相应的参考文献[5,13-14]。
2014—2017年，采用套网法和裤式拖网法(简称裤网法)依次对2组菱目网囊和6组菱目与方目混合网囊(简称混目网囊)进行了84个有效网次作业试验(表1)。套网法的试验网囊拉直长度约为1.5 m；裤网法试验网囊和对照网囊的拉直长度约为1.2 m。
试验网囊的网目尺寸分4档：18 mm、25 mm、30 mm和35 mm。其中18 mm是南海海域虾拖网普遍使用的网囊网目尺寸；25 mm为现行虾拖网管理规定中的网囊最小网目尺寸；30 mm和35 mm为试验网网囊尺寸。按照网目尺寸对网囊进行编号，例如D30表示网目尺寸为30 mm的菱目网囊；S30+D25表示方目段网目尺寸为30 mm，菱目段网目尺寸为25 mm的混目网囊。套网法试验中套网的网目尺寸为15 mm，内径为(12.55±0.28) mm，圆周286目，纵向136目。裤网法中对照网囊第一段网目尺寸为24 mm，第二段为22 mm；对照网囊第二段网目内径为(19.49±0.63) mm。试验网具和网囊的具体参数详见表1和图1、图2。
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图 1 套网法网囊选择性试验渔具网衣展开图Fig. 1 Schematic diagram of trawl and tested codends with covered codend method![]()
图 2 裤网法网囊选择性试验渔具网衣展开图Fig. 2 Schematic diagram of trawl and tested codends with trouser trawl method1.3 试验与取样方法
为了方便操作，将试验网设置于渔船船首方向右舷第一顶网处。试验中不设置站点，也不规定渔船的拖曳速度、时间等作业参数，由船长根据实际情况控制，使试验尽量与传统虾拖网渔船作业保持一致。试验期间渔船拖速2.2~2.7 kn，网次作业时间1.5~3.5 h，平均1.75 h，网次平均拖曳距离9.01 km。
起网后，分别称量试验网囊和套网(或对照网囊)的渔获总质量，然后进行分类和鉴定，统计每个种类的渔获数量，并进行生物学测量。当刀额新对虾渔获数量≤50尾时，全部测量其长度；当渔获数量>50尾时，随机抽取50尾进行长度测量。在统计渔获种类的体长分布时，对于取样种类按取样比例进行加权处理。为了保证试验数据的准确性，尽量避免渔获物的2次取样。
1.4 数据处理的方法
1.4.1 基础数据的统计
以航次为单位统计虾拖网网囊和套网(或对照网囊)的渔获总数和总质量，分别计算各网囊刀额新对虾的数量和质量比例。将每个网次中网囊和套网(或对照网囊)的刀额新对虾体长数据进行排序，以5 mm为单位进行分组，分别统计各体长组刀额新对虾的数量。
1.4.2 选择性参数的估算
网囊对刀额新对虾的选择性估算按如下2个步骤进行：1)以网次为单位，使用Logistic曲线进行选择性模型拟合，估算网次选择性参数；2)将选择性模型拟合度较好的网次体长数据进行叠加，再次使用Logistic曲线进行选择性模型拟合，估算网囊对刀额新对虾的平均选择性参数，同时考虑网囊网次间差异对选择性的影响。
选择性参数的估算是在SELECT模型[6,15-18]的框架下，通过比较试验网囊和套网(或对照网囊)的刀额新对虾渔获数量，得到估算结果。在第i网次中，用NTij表示体长为lj的刀额新对虾被试验网囊捕获的数量，用NCij表示套网(或对照网囊)中刀额新对虾(体长亦为lj)的渔获数量，则体长为lj的刀额新对虾被试验网囊捕获的概率(φij)可表示为：
$${{\textit{φ}} _{ij}} = \frac{{{N_{Tij}}}}{{{N_{Tij}} + {N_{Cij}}}}$$ (1) 对于套网法试验，使用logistic方程拟合试验网囊对体长为l的刀额新对虾的选择率r(l)，其计算公式为：
$$r(l) = \frac{{\exp(a + bl)}}{{1 + \exp(a + bl)}}$$ (2) 式中a、b为待估参数。
对于裤网法试验，引入相对作业强度(p)，表示1尾刀额新对虾进入试验网囊的概率，则进入对照网囊的概率为1−p。体长为l的刀额新对虾被试验网囊捕获的概率可表示为：
$$\varphi(l) = \frac{{p\exp(a + bl)}}{{(1 - p) + \exp(a + bl)}}$$ (3) 根据选择性参数a和b，计算试验网囊对刀额新对虾的选择性指标50%选择体长(L50)和选择范围(SR)，相应的计算公式为：
$${L_{50}} = - a/b$$ (4) $${\rm SR} = {L_{75}} - {L_{25}} = 2\ln 3/b$$ (5) 通过极大似然法估算选择性参数a、b和p，其似然方程[7]为：
$$L(a,b,p) = \sum\limits_i {\sum\limits_j {[{N_{Tij}}\ln \varphi({l_j}) + {N_{Cij}}\ln(1 - \varphi({l_j}))]} } $$ (6) 式(6)的求解通过MS-Excel的“规划求解”功能实现[19-20]。参数a、b、p和选择性指标L50、SR的标准差通过Delta方法估算[6,17,21]。
选择性模型拟合度的优劣可根据残差值(deviance)和自由度(degree of freedom, df )的大小关系判断。通常当残差值小于自由度(P>0.05)，则认为模型拟合度为优。但当试验数据呈离散分布时，即使拟合度为优也会出现残差值远大于自由度(P<0.05)的情况。这时需要根据各体长组的实际残差值分布图作进一步判断[6,12,22]。
通过比较联合网次模型拟合的皮尔逊卡方统计量(Q)和自由度(d)的大小来判断网囊选择性是否存在网次间差异。当不存在网次间差异时，Q服从自由度为d的卡方分布(P>0.05)，反之则说明存在网次间差异[6,17,21-25]。如果存在网次间差异，计算过度离散叠加估算值(replication estimate of dispersion, REP)，并对联合网次估算的选择性参数标准差进行修正，即乘以(REP)1/2。Q和REP的计算公式为：
$$Q = \sum\limits_l {\sum\limits_h {\frac{{{{(n_{lt}^h - n_{l + }^h{y_l})}^2}}}{{n_{l + }^h{y_l}{{(1 - {y_l})}^{}}}}} } $$ (7) 式中
$n_{lt}^h$ 表示第h网次中试验网囊捕获的体长为l的刀额新对虾数量，$n_{l + }^h$ 表示第h网次中试验网囊与套网(或对照网囊)捕获的体长为l的刀额新对虾总数量，yl表示h网次中试验网囊捕获的体长为l的刀额新对虾的数量比例。$${\rm REP} = \frac{Q}{d}$$ (8) 式中d=(H−1)×体长组数，H为联网次的总网次数。
2. 结果
2.1 渔获概述
试验渔获质量为294.68 kg，刀额新对虾总渔获质量为100.71 kg，占渔获总质量的34.18%。各试验网囊中的总渔获质量及刀额新对虾所占比例详见表2。
表 2 试验渔获产量基本信息Table 2 Basic information of fish catch方法
method网囊
codend质量/kg mass 质量百分比/%
ratio of mass刀额新对虾
M. ensis总渔获
total catch套网法 cover D25 8.80 27.92 31.50 D30 13.43 45.01 29.83 S35+D18 9.50 28.53 33.28 S25+D25 15.36 23.36 65.77 S30+D25 4.94 33.61 14.70 S35+D25 20.13 37.60 53.53 裤网法 trouser S35+D25 18.47 32.47 56.89 S35+D30 7.18 42.91 16.73 S35+D35 2.92 23.27 12.53 合计 total 100.73 294.68 34.18 2.2 刀额新对虾的渔获数量及体长分布
试验中刀额新对虾的渔获总数量为14 138尾，各网囊和套网(或对照网囊)的数量、体长范围、众数体长及其比例等数据详见表3，体长分布见图3和图4。
表 3 刀额新对虾的渔获数量及体长分布Table 3 Number of M. ensis caught by each codend网囊
codend渔获尾数
number of catch体长范围/mm
length range众数体长/mm
modal length网囊
codend套网/对照网
cover/control网囊
codend套网/对照网
cover/control网囊
codend套网/对照网
cover/controlD25 964 2 53~123 33~58 88~93 (38.38%) D30 1 698 3 53~113 53~63 83~88 (51.94%) S35+D18 1 810 28 63~128 63~98 78~83 (37.07%) 73~78 (67.86%) S25+D25 2 307 384 58~103 28~93 78~83 (48.63%) 43~48 (39.84%) S30+D25 499 33 63~103 63~98 83~88 (46.49%) 73~78 (42.42%) [S35+D25]1 3 008 117 58~118 28~98 78~83 (41.42%) 73~78 (42.74%) [S35+D25]2 1 121 1 366 63~133 63~133 83~88 (58.25%) 83~93 (65.37%) S35+D30 283 270 63~133 73~133 93~103 (55.83%) 93~103 (60.00%) S35+D35 113 132 63~128 68~133 93~98 (47.79%) 93~98 (46.97%) 合计 total 11 803 2 335 注：[S35+D25]1. 套网法中的S35+D25网囊；[S35+D25]2. 裤网法中的S35+D25网囊
Note: [S35+D25]1. the S35+D25 codend for the covered codend method; [S35+D25]2. the S35+D25 codend for the trouser trawl method2.3 网囊对刀额新对虾的选择性
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图 3 套网法选择性试验各网囊捕捞刀额新对虾的体长分布Fig. 3 Length distribution of M. ensis caught by each codend with covered codend method![]()
图 4 裤网法选择性试验各网囊捕捞刀额新对虾的体长分布Fig. 4 Length distribution of M. ensis caught by each codend with trouser trawl method2.3.1 套网法
D25和D30网囊由于套网的刀额新对虾样本量过少，无法进行选择性分析；S35+D18网囊仅1个单网次数据获得有效解，模型的拟合度较好(P>0.05)，刀额新对虾的L50和SR分别为51.25 mm和16.48 mm；S25+D25网囊共5个单网次数据获得有效解，网次数据拟合度均较好(P>0.05)，联合网次拟合度P<0.05，但模型残差值分布正常，所以认为是由于体长数据的过度离散分布造成，联合网次估算的刀额新对虾平均L50和SR分别为60.84 mm和14.31 mm，存在网次间差异，对估算参数的标准差进行了修正；S30+D25网囊仅2个单网次数据获得有效解，单网次和联合网次拟合度较好(P>0.05)，联合网次估算的刀额新对虾平均L50和SR分别为63.21 mm和12.84 mm，不存在网次间差异；S35+D25网囊共5个单网次数据获得有效解，1个单网次和联合网次拟合的P<0.05，但模型残差值分布正常，联合网次估算的刀额新对虾平均L50和SR分别为64.53 mm和9.75 mm，存在网次间差异，对估算参数的标准差进行了修正(表4)。各网囊对刀额新对虾的平均选择性曲线详见图5。
表 4 套网法选择性试验参数估算Table 4 Selective parameters of tested codends with covered codend method时间
time网囊
codend网次
NH选择性指标
selective index选择性参数
selective parameter拟合度
goodness of fit网次间差异
estimate of REP尾数
numberL50/
mmSD SR/
mmSD a SD b SD D df P Q d P REP 网囊
codend套网
cover2014 D25 c-b 964 2 2014 D30 c-b 1 698 3 2015 S35+D18 9 51.25 8.94 16.48 7.20 –6.83 4.14 0.13 0.06 4.295 8 0.83 203 11 2016 S25+D25 2 59.65 5.84 21.51 7.41 –6.09 2.66 0.10 0.04 5.919 7 0.55 137 24 4 53.89 12.68 50.44 26.94 –2.35 1.79 0.04 0.02 10.608 7 0.16 120 44 6 53.31 7.79 30.96 11.92 –3.78 1.98 0.07 0.03 6.283 9 0.71 127 31 9 60.86 1.19 6.05 1.07 –22.12 4.21 0.36 0.06 14.094 14 0.44 367 64 10 60.94 1.70 5.18 1.21 –25.84 6.39 0.42 0.10 2.288 14 1.00 278 75 c-b 60.84 1.74 14.31 1.90 –9.34 1.44 0.15 0.02 51.617 14 <0.05 155.94 39 <0.05 4.00 1 029 238 S30+D25 4 61.48 7.89 11.78 6.01 –11.47 7.25 0.19 0.10 9.811 10 0.46 106 4 5 63.18 3.47 13.93 3.23 –9.97 2.80 0.16 0.04 8.822 6 0.18 233 17 c-b 63.21 2.97 12.84 2.66 –10.82 2.70 0.17 0.04 3.657 9 0.93 20.22 21 0.51 0.96 342 21 S35+D25 1 66.16 1.22 3.56 0.89 –40.86 10.77 0.62 0.15 7.000 11 0.80 443 16 5 68.58 1.61 7.76 1.83 –19.42 4.92 0.28 0.07 9.946 6 0.13 188 17 7 62.43 3.45 9.00 2.31 –15.25 4.70 0.24 0.06 22.166 4 <0.05 356 15 8 65.19 3.10 10.64 2.78 –13.46 4.11 0.21 0.05 14.343 7 0.05 279 18 9 71.90 3.55 14.86 5.32 –10.63 4.20 0.15 0.05 5.303 6 0.51 40 12 c-b 64.53 1.15 9.75 1.00 –14.54 1.72 0.23 0.02 37.441 6 <0.05 72.31 71 0.43 1.02 1 306 78 注：NH. 网次；c-b. 联合网次；L50. 50%选择体长；SR. 选择范围；a、b. 选择性参数；SD. 标准差；D. 残差值；dof和d. 自由度；Q. 皮尔逊卡方统计量；REP. 过度离散叠加估算值. Note: NH. number of hauls; c-b. combined hauls; L50. 50% retention length; SR. selection range; a and b are selective parameters; SD. standard error; D. value of model deviance; dof and d indicate the degree of freedom; Q. Pearson chi-square statistic; REP. replication estimation of dispersion ![]()
图 5 套网法混目网囊对刀额新对虾的平均选择性曲线Fig. 5 Mean selective curves of tested codends for M. ensis with covered codend method2.3.2 裤网法
S35+D25网囊共8个单网次数据获得有效解，4个单网次和联合网次拟合的P<0.05，但模型残差值分布正常，联合网次估算的刀额新对虾平均L50、SR和相对作业强度(p)分别为75.43 mm、6.93 mm和0.51，存在网次间差异，对选择性参数的标准差进行了修正；S35+D30网囊共5个单网次数据获得有效解，单网次和联合网次的拟合度较好(P>0.05)，联合网次估算的刀额新对虾平均L50、SR和p分别为82.38 mm、6.39 mm和0.52，不存在网次间差异；S35+D35网囊共4个网次获得有效解，所有单网次和联合网次估算的拟合度均较好(P>0.05)，联合网次估算的刀额新对虾平均L50、SR和p分别为95.39 mm、20.44 mm和0.64，不存在网次间差异(表5)。各网囊对刀额新对虾的平均选择性曲线详见图6。
表 5 裤网法选择性试验参数估算Table 5 Selective parameters of tested codends with trouser trawl method时间
time网囊
codend网次
NH选择性指标
selective index选择性参数
selective parameter拟合度
goodness of fit网次间差异
estimate of REP尾数
numberL50/mm SD SR/mm SD a SD b SD P SD D df P Q d P REP 网囊
codend对照
control2017 S35+D25 2 78.16 3.15 3.74 4.45 –45.88 53.61 0.59 0.70 0.41 0.07 8.262 9 0.51 24 43 3 75.35 3.03 7.17 4.69 –23.08 14.44 0.31 0.20 0.46 0.07 8.968 6 0.18 55 101 4 73.52 1.40 3.45 2.58 –46.77 34.53 0.64 0.48 0.41 0.03 39.625 10 <0.05 149 244 6 78.46 7.90 7.46 6.76 –23.12 19.45 0.29 0.27 0.77 0.10 10.982 10 0.36 28 12 7 72.79 5.32 6.92 7.07 –23.12 22.96 0.32 0.32 0.51 0.06 9.766 8 0.28 54 57 8 75.98 2.38 8.55 3.66 –19.52 7.89 0.26 0.11 0.54 0.04 47.531 6 <0.05 244 288 9 73.52 1.47 4.22 3.61 –38.32 32.46 0.52 0.45 0.51 0.03 29.720 7 <0.05 182 193 11 85.59 4.74 10.74 3.67 –17.51 5.22 0.20 0.07 0.73 0.08 25.517 10 <0.05 116 108 c-b 75.43 1.36 6.93 2.14 –23.93 7.09 0.32 1.00 0.51 0.03 53.559 12 <0.05 152.00 81 <0.05 1.88 852 1046 S35+D30 1 78.84 6.40 7.68 8.90 –22.57 25.18 0.29 0.33 0.65 0.08 15.361 8 0.05 30 20 5 86.79 4.96 6.92 6.25 –27.56 24.11 0.32 0.29 0.50 0.07 9.579 11 0.57 39 48 7 81.18 3.61 5.01 4.56 –35.60 31.57 0.44 0.40 0.44 0.05 12.484 11 0.33 62 90 8 88.47 5.70 11.32 7.00 –17.17 9.82 0.19 0.12 0.60 0.08 14.706 11 0.20 64 65 9 92.09 8.49 9.80 7.41 –20.64 14.18 0.22 0.17 0.71 0.14 5.986 8 0.65 23 19 c-b 82.38 2.01 6.39 2.72 –28.32 11.68 0.34 0.15 0.52 0.03 14.308 8 0.07 44.21 50 0.70 0.88 218 242 S35+D35 1 83.59 7.52 8.72 9.18 –21.06 21.32 0.25 0.27 0.55 0.10 10.743 10 0.38 23 24 2 92.13 8.37 9.62 9.67 –21.03 19.67 0.23 0.23 0.65 0.14 6.200 7 0.52 24 22 3 110.78 31.97 20.43 19.45 –11.91 8.42 0.11 0.10 0.77 0.29 6.397 9 0.70 17 19 5 100.52 37.58 29.78 31.29 –7.42 5.58 0.07 0.08 0.65 0.30 10.246 11 0.51 36 47 c-b 95.39 10.43 20.44 10.51 –10.25 4.44 0.11 0.06 0.64 0.11 11.599 11 0.39 22.73 34 0.93 0.67 100 112 ![]()
图 6 裤网法混目网囊对刀额新对虾的平均选择性曲线Fig. 6 Mean selective curves of tested codends for M. ensis with trouser trawl method3. 讨论
3.1 菱目网囊与混目网囊的选择性比较
目前，南海海域传统虾拖网均使用菱目网囊作业，且其网目尺寸较小(一般<20 mm)。据相关调查，当虾拖网网囊网目尺寸为18 mm时，刀额新对虾的幼虾比例>70%[5]。本研究2014年对菱目网囊D25和D30进行试验，结果表明对于刀额新对虾而言，网目尺寸增大，网囊选择性未见显著提高。由于套网的样本量太少，上述2种菱目网囊对刀额新对虾的选择性参数也无法估算。
鉴于菱目网囊选择性差的结论，2015年研究团队首次尝试使用混目网囊(S35+D18)进行试验；该混目网囊菱目段网目尺寸与渔船所用网囊一致(18 mm)，方目段网目尺寸为35 mm。结果表明，副渔获物(鱼类)的逃逸率显著提高，但目标种类的逃逸率仍然较低；刀额新对虾的L50太小(53.85 mm)，远小于南海区刀额新对虾的首次性成熟体长(80 mm)[26]，网囊网目尺寸需要进一步优化[11]。本研究采用的是单网次数据处理方法，得出S35+D18网囊对刀额新对虾的L50仅为51.52 mm，小于联合网次数据处理得到的值。此结论也进一步说明S35+D18网囊的网目尺寸需要进一步放大。
3.2 混目网囊之间的选择性比较
2016年使用3组混目网囊(S25+D25、S30+D25和S35+D25)进行试验，网囊菱目段网目尺寸均为25 mm，方目段网目尺寸分别为25 mm、30 mm和35 mm。根据前期联合网次分析法的结果，S25+D25和S35+D25网囊对刀额新对虾的L50分别为63.93 mm和67.96 mm； S30+D25网囊的刀额新对虾体长组数据不收敛，无法取得有效解[12]。本研究得出的S25+D25、S30+D25和S35+D25网囊对刀额新对虾的平均L50分别为60.84 mm、63.21 mm和64.53 mm。使用本研究的数据处理方法能够获得S30+D25网囊对刀额新对虾的选择性。这从侧面说明了如果在数据处理时完全忽略网囊的网次间差异，简单地将所有网次的体长组数据进行无条件叠加处理可能会得到错误的结论。本试验采用“2部曲”(two-step procedure)法：先以网次为单位进行数据处理，然后根据模型的拟合结果将一些网次数据剔除，在考虑网囊网次间差异的基础上叠加网次数据，求得平均选择性。这种数据处理方法得出的结论更加准确、客观和科学，国外一些相关研究也普遍采用这种方法进行数据处理[27-29]。
2017年，笔者课题组对3组混网囊(S35+D25、S35+D30和S35+D35)进行试验。此次网目尺寸的选择是以2014—2016年试验结论为基础，将方目段网目尺寸保持为35 mm，菱目段网目尺寸分别为25 mm、30 mm和35 mm。同时，为了避免套网法的“覆盖效应”，在试验方法上首次尝试采用目前国际上普遍使用的裤网法。根据试验结果，S35+D25、S35+D30和S35+D35网囊对刀额新对虾的平均L50随菱目段网目尺寸的增大而不断增大，SR则是先减少后增大，p不断增大。根据陈丕茂[26]的研究，南海区刀额新对虾的首次性成熟体长为80 mm。假设将刀额新对虾的可捕规格定为80 mm，所有试验网囊中仅S35+D30和S35+D35网囊的L50大于该可捕标准。但是，S35+D30网囊对刀额新对虾的SR远小于S35+D35的(6.39 mm vs 20.44 mm)，说明S35+D30网囊的选择性尖锐度较好。另外，考虑到网目尺寸过大会影响到渔船的生产效益，同时兼顾渔民的心理接受程度，笔者认为将S35+D30网囊作为南海区虾拖网网囊最小网目尺寸标准较为理想。
3.3 存在的问题及今后的研究方向
本研究中的试验数据均在渔船上即时收集。由于网次间间隔短，测量时间有限，对于渔获数量较多的种类(>50尾)，先统计该种类的总数量后，随机抽取50尾渔获进行体长测量。选择性数据处理时，以随机测量的50尾体长数据为基础，按照相应的取样比例进行加权处理，最后得出网次渔获种类的体长分布数据。但有些前期的研究则直接使用实测体长组数据进行选择性参数估算[12,15-16]。使用实测体长组数据和加权处理后的数据进行估算的结果是否存在显著差异？哪个方法计算的结果更加准确和科学？这将是未来的一个研究方向。
本研究存在的不足之处在于4个航次试验存在一定的时空差异。虽然网囊对刀额新对虾的选择性主要由网囊结构、网目尺寸和刀额新对虾的体型特征决定，但是为了减少时空差异对选择性研究的影响，今后可尝试将所有试验网囊在同一渔场、同一渔船和同一网次进行试验。南海区虾拖网通常是一船拖曳多顶网具。比如，本研究中租用的“粤阳东渔12081”作业中拖曳12顶网，一些大功率渔船甚至最多可拖曳32顶网。利用南海区虾拖网这种独特的作业方式，可将本研究中的所有试验网囊共同进行试验。同时，在试验方法上也可以将套网法、裤网法等进行有机结合，优势互补，相互印证。这样获得的试验数据会更加全面，得出的结论能够更好地为渔具管理和渔业资源的合理利用提供科学依据。
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图 1 不同乳杆菌菌株发酵对鲭鱼加工副产物理化指标的影响
注：L0、L1、L2和L3分别为无任何处理的对照组、接种嗜酸乳杆菌、接种植物乳杆菌和接种贝氏乳杆菌的实验组；不同字母之间表示存在显著性差异 (P<0.05)，图 2 同此。
Figure 1. Effects of different lactic acid bacteria fermentation on physicochemical indexe of processed by-products of mackerel
Note: L0, L1, L2 and L3 are the control group without any treatment, groups inoculated with L. acidophilus, L. plantarum and L. beijerinck, respectively. Different letters indicate significant difference (P<0.05). The same case in Fig. 2.
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图 2 灭菌与不灭菌发酵对鲭鱼加工副产物理化指标的影响
注：S0、S1、S2 分别为灭菌不接种乳杆菌、灭菌接种乳杆菌、不灭菌接种乳杆菌；组胺相对含量由每一组组胺实际含量除以第 0 天未发酵的组胺实际含量计算得出。
Figure 2. Effects of sterilization and non-sterilization fermentation on physicochemical indexes of processed by-products of mackerel
Note: S0, S1 and S2 represent sterilization without inoculation of lactic acid bacteria, and non-sterilization with inoculation of lactic acid bacteria, respectively. The relative histamine content is calculated by the actual histamine content of each group by the actual histamine content of the sterilization group on 0th day.
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图 3 不同发酵阶段的细菌群落相对丰度
注：保藏 270 d 指发酵后保存在常温下 270 d；图 4 同此。
Figure 3. Relative abundance of bacterial communities at different fermentation stages
Note: Storage of 270 d means storing at room temperature for 270 d after fermentation; the same case in Fig. 4.
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图 4 不同发酵阶段真菌群落的相对丰度
Figure 4. Relative abundance of fungal communities at different fermentation stages
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图 5 乳杆菌发酵降解抗原蛋白的SDS-PAGE蛋白电泳图谱
Figure 5. SDS-PAGE electrophoretic pattern of lactobacilli protein degraded by fermentation
表 1 植物乳杆菌发酵鲭鱼加工副产物的Alpha多样性指数
Table 1 Alpha diversity index of processed by-products of mackerel fermented by L. plantarum
样品
SampleACE 指数
ACE indexChao1指数
Chao1 index香农指数
Shannon index覆盖率
Goods coverage对照组
Control group第1天 1st day 123.735 123.438 0.905 1 第30天 30th day 151.349 149.636 1.072 1 发酵组
Fermentation group第1天 1st day 128.206 121.5 1.371 1 第30天 30th day 114.553 110.286 1.668 1 第270天 270th day 57.176 56.0 0.634 1 
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表 2 乳杆菌发酵鲭鱼加工副产物游离氨基酸组成的变化
Table 2 Changes of free amino acid composition of processed by-products of mackerel fermented by lactic acid bacteria
mg·g−1 氨基酸名称
Amino acid name发酵前
Before fermentation对照组第30天
Control group on 30th day乳杆菌发酵第30天
Lactic acid bacteria fermentation on 30th day天冬氨酸 Asparagine 3.742 4.674 4.701 苏氨酸 Threonine 1.420 1.565 1.493 丝氨酸 Serine 1.828 2.079 2.152 谷氨酸 Glutamic acid 7.111 8.030 7.897 甘氨酸 Glycine 2.874 2.863 3.034 丙氨酸 Alanine 2.315 2.411 2.567 胱氨酸 Cystine 0.357 0.313 0.410 缬氨酸 Valine 1.814 1.702 1.953 蛋氨酸 Methionine 0.186 0.118 0.184 异亮氨酸 Isoleucine 1.529 1.489 1.881 亮氨酸 Leucine 2.799 3.049 2.358 酪氨酸 Tyrosine 0.971 1.131 1.246 苯丙氨酸 Phenylalanine 1.896 2.036 1.893 赖氨酸 Lysine 1.107 1.197 1.081 组氨酸 Hlstidine 2.182 1.881 2.266 精氨酸 Argnine 2.940 2.898 2.938 脯氨酸 Proline 2.082 2.407 3.275 总和 Total 37.153 40.175 41.331
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表 3 乳杆菌发酵前后脂肪酸组成变化
Table 3 Changes of fatty acid composition before and after lactic acid bacteria fermentation
% 脂肪酸种类
Fatty acid type发酵前占比
Proportion before fermentation乳杆菌发酵第30天占比
Proportion of lactic acid bacteria fermentation on 30th day十三烷酸 C13:0 9.34 7.51 棕榈酸 C16:0 24.13 25.13 棕榈油酸 C16:1 7.32 7.13 油酸 C18:1 2.79 3.02 亚油酸 C18:2 12.95 15.11 亚麻酸 C18:3 2.81 2.96 γ-亚麻酸 C18:3 8.15 9.53 花生酸 C20:0 2.16 2.15 二十碳二烯酸 C20:2 3.74 3.27 二十碳五烯酸 C20:5 8.83 7.75 芥子酸 C22:1 0.56 0.55 二十二碳二烯酸 C22:2 4.28 3.89 木蜡酸 C24:0 9.11 8.33 二十二碳六烯酸 C22:6 3.84 3.67 单不饱和脂肪酸 MUFA 10.67 10.70 多不饱和脂肪酸 PUFA 44.60 46.18 饱和脂肪酸 SFA 44.74 43.12
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