Analysis of solid-state anaerobic fermentation process of mackerel processing by-products by high-throughput sequencing
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摘要: 为了实现易产组胺的鲭鱼 (Pneumatophorus japonicus) 加工副产物综合利用产业化技术开发，对鲭鱼加工副产物进行了不灭菌的乳杆菌固态厌氧发酵，尝试生产饲料用新型活性蛋白源。系统监测了发酵过程中组胺、酸溶蛋白、挥发性盐基氮 (Total volatile basic nitrogen, TVB-N)、pH的变化，通过高通量测序技术分析了发酵过程微生物群落的变化，对比分析了发酵前后抗原蛋白、游离氨基酸、脂肪酸成分的变化，以全面评价发酵过程中营养、活性成分和安全性的变迁。结果显示，植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum) HSCC-LP121在提高酸溶蛋白含量、降低组胺积累、减少挥发性盐基氮产生方面综合效果最好。发酵30 d时组胺降低到0.629 g·kg−1。这一数据和高通量测序结果表明，HSCC-LP121具有组胺降解能力，同时可抑制嗜冷杆菌属 (Psychrobacter) 和假单胞菌属 (Pseudomonas) 等潜在产组胺微生物的生长。该菌种还可抑制曲霉菌属 (Aspergillus) 等潜在危害真菌的生长，同时诱使一些生香酵母的生长。Abstract: In order to develop commercial technology for the comprehensive utilization of mackerel (Pneumatophorus japonicus) processing by-product, we carried out the non sterilized solid-state anaerobic fermentation of mackerel by-products to produce a novel protein source for feed with bioactivity. In addition, we monitored the content of histamine, acid-soluble protein and other indexes such as pH, total volatile basic nitrogen and antigenic protein; and investigated the evolution of microbial community during the fermentation by high-throughput sequencing technology, comparing the free amino acids and fatty acids before and after the fermentation. The results show that Lactobacillus plantarum HSCC-LP121 had the best comprehensive effect in increasing acid soluble protein content, reducing histamine accumulation and reducing volatile base nitrogen production. After 30 d of fermentation, the histamine content decreased to 0.629 g·kg−1, which indicates that HSCC-LP121 had the ability to degrade histamine. Moreover, HSCC-LP121 inhibited the growth of potential histamine-producing microorganisms such as Psychrobacter and Pseudomonas. Besides, the strain could also inhibit the growth of potentially harmful fungi such as Aspergillus, and induce the growth of some aroma-producing yeasts.
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棕点石斑鱼 (Epinephelus fuscoguttatus) ，也称褐点石斑鱼，是一种暖水性岛礁鱼类，隶属于鲈形目、鮨科、石斑鱼属[1]，在我国主要分布于台湾海峡以及南海海域[2]。棕点石斑鱼味道鲜美、生长快、市场潜力大、养殖前景可观，在南方沿海地区包括海南、广东、广西、福建等均已实现人工养殖[3]。
在现代化高放养密度的水产养殖中，维持各项水质指标的相对稳定是养殖成功的关键，其中氨氮 (NH3-N)是较容易波动的水质指标之一。排除外源污染，养殖鱼类摄食饲料中所含的有机氮化合物经机体代谢释放出氨[4]，水体中的残饵和粪便通过氨化作用也能转化为氨氮[5]。一般在养殖后期，饲料的投喂水平和水体载鱼量均达到极限，一旦环境中的氨氮浓度大幅升高则会抑制鱼本身的氨排泄功能，进而对鱼的组织和器官结构造成损伤，影响鱼类的摄食、生长及免疫功能[6]，从而诱发各种疾病，甚至造成死亡[7]，为养殖从业者带来经济损失。为了降低养殖风险，开发能提升养殖鱼类抗氨氮能力的饲料添加剂尤为重要。
中草药含有黄酮类、生物碱、苷类、多糖类等多种有效的生物活性物质，用作饲料添加剂，既可促进水生动物生长繁殖、提高饲料利用率，又能预防和治疗养殖疾病、增强机体抗应激能力和非特异性免疫功能[8-9]。其作为饲料添加剂，与化学药物和抗生素相比，具有低耐药性、低毒、无残留等优点，因此中草药成为新型饲料添加剂的研究热点[10]。黄芪 (Astragalus membranaceus)及其提取物常作为免疫增强剂，其味甘，性微温，归肺、脾经，具有补气升阳、固表止汗、利水消肿的作用[11]。现代药理研究表明，黄芪具有提高机体免疫功能，以及抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤、抗病毒等作用[12]。黄芪的主要活性成分为多糖类、黄酮类、皂苷类[13]，其中黄芪的提取物黄芪多糖在水产养殖中应用广泛，其能够清除羟自由基、超氧阴离子自由基等，具有增强水产动物抗氧化能力的作用[14]。据报道，饲料中添加适宜比例的黄芪多糖，可以提升黄颡鱼 (Pelteobagrus fulvidraco) 机体抗氧化功能[15]，提高半滑舌鳎 (Cynoglossus semilaevis) 血液免疫因子中的白细胞过氧化物酶活性[16]以及提高斑马鱼 (Danio rerio) 肠道超氧化物歧化酶基因的表达水平[17]。已有研究表明，对黄芪进行益生菌发酵，破坏其细胞壁结构后，可使多糖等活性成分大量释放[18-19]，达到增强药效的目的，因此，黄芪具有作为水产养殖饲料优良免疫刺激剂的潜力。
益生菌发酵中药利用了微生物强大的分解和转化能力，发酵过程中产生了新的代谢产物，同时还提高了中药活性物质含量，在促进生长、改善肠道健康和免疫调节等方面有良好的效果，其制剂具有高效、低毒、低残留的优点，也是养殖行业免疫增强剂筛选研究的焦点[20-21]。已有研究表明，发酵黄芪能调节肉鸡 (Arbor acre) 粪便微生物菌群，改善其抗氧化性能并促进其生长[22]；发酵黄芪水提取物能改善鲤 (Cyprinus carpio) 肠道形态和微环境，增强其免疫功能并促进生长[23]。然而，目前尚缺乏评估发酵黄芪作为鱼类免疫刺激剂的生物学效应的研究。本实验采用现代发酵工艺，拟在基础饲料中添加不同水平的混菌固态发酵后的黄芪，通过养殖和氨氮胁迫实验分析发酵黄芪对棕点石斑鱼生长、消化、免疫及抗氨氮胁迫能力的影响，以期为发酵黄芪在水产功能性饲料中的应用提供理论基础。
1. 材料与方法
1.1 实验用鱼与管理方法
由中国水产科学研究院南海水产研究所热带水产研究开发中心提供实验用棕点石斑鱼和实验场地，正式实验前暂养1周，使其适应养殖环境。选择体质健康、大小均匀的棕点石斑鱼进行实验，分为6组，对照组不添加发酵黄芪 (L0)，实验组分别添加0.25% (L1)、0.5% (L2)、1% (L3)、2% (L4)、4% (L5) 的发酵黄芪，每组3个重复，每个重复30尾鱼，共540尾，初始体质量为 (44.48±2.06) g。养殖实验在室外遮阳棚下进行，养殖器具为圆形玻璃钢桶，养殖水体300 L，实验持续56 d。实验期间自然光照，微流水，流水速率为50 L·h−1，养殖用水为砂滤海水，罗茨鼓风机连续充氧，保持水温25~28 ℃，溶解氧质量浓度≥6 mg·L−1，氨氮质量浓度≤0.1 mg·L−1，亚硝酸盐质量浓度≤0.05 mg·L−1。养殖期间每天分别于 8:30和16:30 进行饱食投喂 (连续投喂 8~10 min)，并观察棕点石斑鱼的健康状况及摄食情况，记录摄食量。每天早上虹吸抽底，清理粪便，每次换水量为30%。
1.2 发酵材料及试剂
中草药黄芪产于甘肃，玉米粉、麦麸、豆粕、糖蜜购于淘宝店铺佳惠饲料企业店，枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) 粉、酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 粉、粪肠球菌 (Enterococcus faecalis) 粉由鹤壁兴旺生物科技有限公司生产，黑曲霉菌 (Aspergillus niger) 孢子粉由山东长泰生物技术产业集团生产，植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum) 粉由山东中科嘉亿生物工程有限公司生产，其余无机盐试剂均为国产分析纯。
1.3 发酵方法
根据谢炎福[24]的方法，并参考前人的研究[20-21,25]进行改进。取黄芪、玉米、豆粕、麦麸，粉碎机粉碎后过100目筛，按照质量比75∶10∶10∶5混合为初始物料，另加入质量分数分别为5%糖蜜、0.2%硫酸铵、0.05%磷酸二氢钾、0.1%磷酸氢二钾、0.07%氯化钠、0.01%七水合硫酸镁 (试剂及发酵原料称量前均于烘箱中55 ℃烘干24 h)，烧杯中混匀后121 ℃高温高压蒸汽灭菌20 min，冷却至室温。加入无菌水调整水分质量分数至50%，制成发酵培养基，调整黑曲霉菌孢子粉 (2×1010 CFU·g−1)、枯草芽孢杆菌粉 (2×1011 CFU·g−1)、酿酒酵母粉 (2×1010 CFU·g−1)、植物乳杆菌粉 (1×1010 CFU·g−1)、粪肠球菌粉 (1×1011 CFU·g−1) 各直投式商品发酵剂添加量，使各菌种的添加量和初始物料的配比为2×107 CFU·g−1。菌种和发酵培养基混匀，恒温培养箱设置35 ℃，3层纱布封口，好氧发酵24 h；保鲜膜橡皮筋扎紧封口，厌氧发酵72 h。发酵结束后烘干24 h，粉碎过100目筛，制成发酵黄芪备用。
1.4 实验饲料
使用海童石斑鱼商品饲料作为基础饲料，饲料营养水平 (质量分数) 为：粗蛋白≥48.0%，粗脂肪≥10.0%，粗灰分≤16.0%，粗纤维≤3.0%，赖氨酸≥2.5%，水分≤10.0%。商品饲料经粉碎后过50目筛，黏合剂海藻酸钠的添加量为1.5%，对照组不添加发酵黄芪，只添加4%微晶纤维素，实验组调整发酵黄芪与微晶纤维素配比 (总添加量为4%)，逐级混匀后加水糅合，重新制粒，55 ℃烘干至恒定质量，制成6种不同添加比例的发酵黄芪饲料，分装后−20 ℃保存。
1.5 氨氮胁迫实验
饲养8周后，每个养殖桶留15尾鱼，进行氨氮胁迫实验，实验前禁食24 h。向自然海水中加入氯化铵 (NH4Cl) 固体，使总氨氮的表观质量浓度达110 mg·L−1，并测定pH为7.5。预实验结果表明，应激24 h恰好未出现鱼的死亡，因此选择此氨氮浓度进行胁迫实验[26-28]。胁迫期间不投饵，每6 h检测一次氨氮质量浓度，并作调整。
1.6 样品采集与处理
养殖实验和氨氮胁迫实验后进行样本采集。将鱼迅速捞起后用150 mg·L−1的丁香酚快速将其麻醉，用质量分数为1%的肝素钠生理盐水溶液润洗过的无菌注射器尾静脉取血，之后剪取器官组织于液氮中。血样静置4 h后，5 000 r·min−1离心10 min制备血清，分装后−20 ℃冻存备用；器官组织保存于−80 ℃冰箱待测。
1.7 指标测定
1.7.1 生长指标测定
测定棕点石斑鱼的体质量增长率 (WGR)、特定生长率 (SGR)、成活率 (SR)、饵料系数 (FCR)、肥满度 (CF) 、脏体比 (VSI) 和肠脂比 (IPF) 等指标，计算公式如下：
$$ R_{\mathrm{WGR}}=\left(W_{t}-W_0\right) / W_0 \times 100 {\text{%}} $$ (1) $$ R_{\mathrm{SGR}}=\left(\ln W_t-\ln W_0\right) / t \times 100 {\text{%}} $$ (2) $$ R_{\mathrm{S}}=N_{\rm{f}} / N_{\mathrm{i}} \times 100 {\text{%}} $$ (3) $$ R_{\mathrm{FCR}}=F /\left(W_t-W_0\right) $$ (4) $$ I_{\mathrm{CF}}=W / L^3 \times 100 {\text{%}} $$ (5) $$ R_{\mathrm{VSI}}=W_{\mathrm{v}} / W \times 100 {\text{%}} $$ (6) $$ R_{\mathrm{IPF}}=W_{\mathrm{i}} / W \times 100 {\text{%}} $$ (7) 式中：RWGR为体质量增长率 (%)；RSGR为特定生长率 (%·d−1)；RS为成活率 (%)；ICF为肥满度 (g·cm−3)；RVSI为脏体比 (%)；RIPF为肠脂比 (%)；W0为实验开始时鱼体质量 (g)；Wt为实验结束时鱼体质量 (g)；F 为饲料摄入量 (g)；t为实验时间 (d)；Nf为终末鱼数量 (尾)；Ni为初始鱼数量 (尾)；W为鱼个体质量 (g)；L为鱼体长 (cm)；Wv为鱼内脏团质量 (g)；Wi为鱼肠系膜脂肪质量 (g)。
1.7.2 生化指标测定
胃组织中胃蛋白酶，前肠中胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶，血清中谷丙转氨酶 (GPT)、谷草转氨酶 (GOT)、碱性磷酸酶 (AKP)、葡萄糖 (GLU) 和甘油三酯 (TG)，以及肝脏中总超氧化物歧化酶 (T-SOD)、过氧化氢酶 (CAT)、总抗氧化能力 (T-AOC)、丙二醛 (MDA) 和组织样本上清液中总蛋白均采用南京建成生物工程研究所试剂盒进行测定。
1.8 数据统计分析
实验数据采用Excel 2016软件进行整理和作图，采用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析 (One-way ANOVA)，若存在显著性差异，再用LSD法进行组间多重比较，P<0.05表示差异显著。结果均以“平均值±标准差 (
$ {\overline {X}}$ $ \pm { \rm {SD}}$ ) ”表示。2. 结果
2.1 生长性能
随着饲料中发酵黄芪水平的增加，棕点石斑鱼的体质量增长率和特定生长率均呈先升高后下降的变化趋势 (表1)，均在L4组达到最高，L3组次之，且均显著高于对照组 (P<0.05)。各组饲料系数中，除L2组外，其余各实验组均低于对照组，L3和L4组显著低于其他各组 (P<0.05)；相较于对照组，发酵黄芪各添加水平对棕点石斑鱼脏体比和肠脂比无显著影响 (P>0.05)。
表 1 发酵黄芪对棕点石斑鱼生长性能的影响Table 1. Effects of fermented A. membranaceus on growth performance of E. fuscoguttatus组别Group 成活率SR/% 体质量增长率WGR/% 特定生长率SGR/(%·d−1) 饲料系数FCR 肥满度CF/(g·cm−3) 脏体比VSI/% 肠脂比IPF/% L0 (0%) 98.89±1.92 75.09±6.38c 1.00±0.06c 1.31±0.17a 0.10±0.01ab 8.27±1.55 2.38±0.42 L1 (0.25%) 98.89±1.92 84.27±5.65bc 1.09±0.06bc 1.23±0.18a 0.07±0.05b 9.21±1.75 3.02±1.73 L2 (0.5%) 98.89±1.92 77.76±8.16bc 1.03±0.08bc 1.40±0.18a 0.11±0.05ab 8.73±1.06 2.27±0.87 L3 (1%) 100±0.00 90.18±9.53b 1.15±0.10b 0.93±0.03b 0.09±0.04ab 8.68±1.44 2.17±0.98 L4 (2%) 100±0.00 105.00±7.10a 1.28±0.06a 0.93±0.07b 0.09±0.04ab 8.21±1.49 2.25±0.72 L5 (4%) 100±0.00 79.42±5.13bc 1.04±0.05bc 1.24±0.04a 0.11±0.05a 8.65±2.29 2.56±0.64 注：同列数据不同上标小写字母表示差异显著 (P<0.05)。 Note: Values with different lowercase letters within the same column are significantly different (P<0.05). 2.2 胃肠道消化酶活性
发酵黄芪对棕点石斑鱼消化酶活性均有提升作用 (图1)。胃蛋白酶活性L4组显著高于对照组 (P<0.05)；前肠胰蛋白酶和淀粉酶活性各实验组均高于对照组，L5组最高且显著高于对照组 (P<0.05)；脂肪酶活性在L2和L3组有较高提升，均显著高于对照组 (P<0.05)。
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图 1 发酵黄芪对棕点石斑鱼胃蛋白酶、前肠胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性的影响注：方柱上不同小写字母表示有显著性差异 (P<0.05)。Figure 1. Effects of fermented A. membranaceus on pepsin in stomach and trypsin, amylase and lipase activities in foregut of E. fuscoguttatusNote: Different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05).2.3 氨氮胁迫前后肝脏抗氧化酶活性及丙二醛浓度
发酵黄芪对棕点石斑鱼氨氮胁迫前后肝脏的抗氧化能力和丙二醛浓度均产生了影响 (图2)。胁迫前，随着发酵黄芪添加水平的增加，棕点石斑鱼肝脏CAT活性呈先上升后下降的趋势，L2、L3组CAT活性均较高且显著高于其他各组 (P<0.05)；发酵黄芪对L1—L4组SOD活性和T-AOC均有提升作用，各组SOD活性 (L4组除外) 和T-AOC均显著高于对照组 (P<0.05)，而L5组上述3个指标在各组中均为最低，其中T-AOC和SOD活性显著低于各实验组 (P<0.05)，CAT活性显著低于其他各组 (P<0.05)；MDA浓度则相反，L1—L4组显著低于对照组，L5组最高，但与对照组无显著性差异 (P>0.05)。胁迫后，CAT和SOD活性各实验组与对照组均无显著性差异 (P>0.05)，L5组的T-AOC显著低于其他组 (P<0.05)，其他组间无显著性差异 (P>0.05)； L1—L4组MDA质量摩尔浓度显著低于对照组 (P<0.05)，L5组显著高于其他组 (P<0.05)。
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图 2 发酵黄芪对棕点石斑鱼氨氮胁迫前后肝脏过氧化氢酶活性、总抗氧化能力、超氧化物歧化酶活性和丙二醛浓度的影响注：方柱上不同小写字母表示胁迫前差异显著 (P<0.05)，不同大写字母表示胁迫后差异显著 (P<0.05)，图3同此。Figure 2. Effects of fermented A. membranaceus on CAT activity, T-AOC, SOD activity and MDA concentration in liver of E. fuscoguttatus before and after ammonia nitrogen stressNote: Different lowercase and uppercase letters on the bars indicate significant differences before and after ammonia nitrite stress, respectively (P<0.05). The same case in Fig. 3.2.4 氨氮胁迫前后的血清指标
氨氮胁迫前，随着饲料中发酵黄芪水平的增加，棕点石斑鱼血清GOT活性呈先下降后上升的趋势，对照组和L5组较高，且显著高于其他各组 (P<0.05)；各实验组GPT活性和GLU浓度均显著低于对照组 (P<0.05)，但AKP活性与对照组无显著性差异 (P>0.05)；L3—L5组TG浓度显著低于对照组 (P<0.05)。胁迫后，各实验组血清GPT、GOT活性和TG浓度均显著低于对照组 (P<0.05)，L2、L3组AKP活性显著高于对照组 (P<0.05)，L1—L3组GLU浓度显著低于对照组 (P<0.05，图3)。
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图 3 发酵黄芪对棕点石斑鱼氨氮胁迫前后血清谷草转氨酶、谷丙转氨酶、碱性磷酸酶活性和甘油三酯、葡萄糖浓度的影响Figure 3. Effects of fermented A. membranaceus on GOT, GPT, AKP activity and TG, GLU concentrations in serum of E. fuscoguttatus before and after ammonia nitrogen stress3. 讨论
3.1 发酵黄芪对棕点石斑鱼生长性能的影响
微生物发酵过程中产生的酶类可有效分解植物细胞壁，使有效成分从胞内游离释放，从而提高传统中草药的药用效果[29]。已有大量研究表明，发酵中药可以提高水生动物的生长性能，如鲤[23,30]、黄河鲤 (C. carpio haematopterus)[31]、草鱼 (Ctenopharyngodon idella)[32]。本实验周期处于海南冬季，少数几天受寒流天气影响，棕点石斑鱼的生长表现下降，但实验期间在饲料中添加发酵黄芪，可以提高棕点石斑鱼的体质量增长率和特定生长率，降低饲料系数，其中 L3和L4组综合表现效果较好，表明发酵黄芪可以促进鱼体对营养物质的消化吸收，对鱼的生长有促进作用，这与发酵黄芪应用于山瑞鳖 (Palea steindachneri) 稚鳖[33]和鲤[23]的研究结果相似。黄芪经益生菌发酵之后，多糖得率提升[18-19]，而黄芪多糖作为黄芪的有效活性成分之一，能促进鱼类生长[34-35]；此外，发酵过程中添加的益生菌经活化和生长繁殖后，能分泌多种消化酶，从而改善鱼类的肠道健康，提高其消化吸收能力，且在代谢过程中产生的菌体蛋白、维生素、小肽等营养因子可能对实验鱼的生长有积极作用。此外，有研究将1.5%黄芪直接添加于大黄鱼 (Larimichthys crocea) 饲料中，结果导致一半以上的死亡率[36]，本实验发酵黄芪的添加对棕点石斑鱼的成活率无显著影响，最高剂量的L5组 (4%发酵黄芪) 也未出现死亡，表明对黄芪进行发酵处理可能减弱了高剂量中药给鱼体带来的毒副作用，原因是发酵中的微生物菌群对中药的抗营养成分进行了分解转化或对毒性物质的结构进行了修饰，从而改善了中草药的药理学特性[29,37]，这也是发酵中药的优点之一。鱼类脂肪沉积的主要部位在腹中肠系膜上，因此肠脂率是评价鱼体脂肪代谢和健康的重要指标，反映了鱼体摄入脂肪在腹腔中的沉积率[38]。本实验结果表明发酵黄芪对棕点石斑鱼的肠脂率未造成显著影响，但有下降趋势，可能该指标受饲料能量水平的影响更大。
3.2 发酵黄芪对棕点石斑鱼消化酶的影响
发酵这一生物过程导致发酵底物的营养成分发生了变化[39]，其中添加的益生菌具有很多有益功效，如杀灭或抑制病原菌、影响肠道微生物菌群、促进养分利用[40]等，从而影响了动物的消化能力。本实验通过检测棕点石斑鱼相应组织消化酶活性来评价发酵黄芪对其消化能力的影响，结果表明发酵黄芪对棕点石斑鱼各消化酶活性均有不同程度的提升作用。中草药作为天然生长促进剂的原理可能是其可诱导消化酶的分泌并通过刺激食欲[41]，与发酵添加的益生菌协同作用，共同改善了肠道微环境。本实验添加的发酵黄芪提高了棕点石斑鱼的各消化酶活性，同时又降低了饲料系数，表明饲料中添加发酵黄芪使棕点石斑鱼生长速度加快的原因不是通过增加其摄食量，而是增强了其消化吸收能力。
3.3 发酵黄芪对棕点石斑鱼氨氮胁迫前后肝脏抗氧化酶活性及丙二醛含量的影响
水体中的氨氮是导致鱼产生应激的重要环境因子，其参与到机体的氧化还原反应中，含量过高会对鱼体造成氧化损伤，导致机体脂质过氧化，对鱼类产生严重的毒性作用[42]。为了维持机体自由基的动态平衡，防止其对机体产生损害，生物体形成了一套自身的抗氧化防御机制。含有金属元素的SOD可以催化超氧阴离子自由基转化为过氧化氢和氧气，而CAT可以催化过氧化氢生成水和氧气。T-AOC反映了鱼类机体的抗应激能力，影响着鱼体的正常生长和健康状况，MDA是自由基导致脂质过氧化的产物，与组织细胞的受损程度密切相关[43-44]。胁迫前，除了L5组，发酵黄芪提高了棕点石斑鱼肝脏的CAT、SOD活性和T-AOC，降低了MDA浓度，表明发酵黄芪对提高棕点石斑鱼的抗氧化能力有明显效果。而L5组发酵黄芪的添加剂量相较于其他剂量导致了棕点石斑鱼抗氧化能力有所降低，且脂质过氧化程度上升，表明其对鱼体产生了一定的毒理效应，而摄入的饲料能量用于对抗这种应激，因此可能改变了机体对能量的分配，并对生长产生了不利影响，这也与该组的生长性能相较于其他浓度组下降的结果一致。有研究表明，益生菌[45]和黄芪有效成分黄芪多糖[46]均能提高机体的抗氧化能力，发酵黄芪兼具两者的功效，同样提高了本实验棕点石斑鱼的抗氧化能力，而这种能力的提高也可能会相应提高鱼体的抗氨氮能力。本实验氨氮胁迫后，除L5组外，发酵黄芪对棕点石斑鱼的肝脏SOD、CAT活性及T-AOC无明显提升作用，但降低了棕点石斑鱼肝脏MDA浓度。而L5组T-AOC急剧降低，比对照组降低了32.54%，MDA浓度急剧上升，比对照组升高了117.08%，表明高剂量的发酵黄芪和氨氮的毒理效应叠加对鱼体肝脏造成了严重损伤。有研究指出，氨氮胁迫对机体抗氧化防御能力的影响随时间变化而呈动态变化过程，初期会诱导抗氧化酶活性升高和抗氧化物质合成以清除过多的自由基，但超过机体的调节阈值后，抗氧化能力被削弱，抗氧化酶活性呈下降趋势，脂质过氧化物开始积累[47]；而本实验对棕点石斑鱼进行氨氮胁迫24 h可能接近这一阈值点，导致24 h这一时间节点各组的抗氧化酶活性与对照组无显著性差异，只有部分实验组略高于对照组；从24 h氨氮胁迫这一持续过程来看，除了最高剂量组，其余各组均有效减轻了氨氮胁迫给鱼体带来的脂质过氧化损伤程度，表明发酵黄芪的饲料添加比例在2%以下可以提高棕点石斑鱼的抗氨氮能力，而不会对鱼体机能造成伤害。
3.4 发酵黄芪对棕点石斑鱼氨氮胁迫前后血清指标的影响
水生动物血液代谢受食物、生长、健康、环境因子等诸多因素影响，因此血液指标被广泛用于评估水生动物生理代谢和健康营养状况[48-49]。GOT和GPT主要存在于肝脏中，当肝细胞受损时才会大量释放进入血液中，因此以上两种转氨酶常用来评估肝脏的健康状态[50]。胁迫前后各实验组的两种转氨酶均显著低于对照组，表明发酵黄芪改善了棕点石斑鱼肝脏的日常新陈代谢状况，减轻了氨氮胁迫带来的肝脏损伤，具有保护肝脏的作用。AKP是水生动物体内重要的免疫酶，广泛参与了能量调节、免疫反应、细胞损伤与修复等生命过程[51]；胁迫前后L2组的AKP活性在各组中均最强，其与L3组AKP活性在胁迫后显著高于其余各组，表明发酵黄芪激活了AKP介导的鱼体非特异性免疫系统。血清TG浓度可以反映鱼体脂肪代谢状况，临床上过高的血脂是心血管疾病的重要诱因，还可导致脂肪肝，造成代谢性疾病[52]。发酵黄芪显著降低了棕点石斑鱼血清TG浓度，其中L3组最低，同时最低肠脂比也出现在L3组，说明发酵黄芪可以降低机体脂肪水平，有益于鱼体健康。GLU是生物机体生理代谢的主要能量来源，因而血清中GLU浓度恒定对鱼类的正常生理活动有重要意义[28]，在应激条件下，血清GLU维持较低的水平可以减少组织损伤[53]。胁迫前，发酵黄芪各剂量组均能显著降低棕点石斑鱼的血糖浓度，表明发酵黄芪有降血糖的作用。而胁迫后，各组血清GLU浓度均较胁迫前高，表明鱼体处于氨氮胁迫这种不良环境下，基础代谢增高，随之对GLU的需求增大。胁迫后各组血清TG浓度均下降，表明鱼体发生了糖异生作用[54]，调用脂肪储备能量来满足这种需求，而L1、L2和L3组血清GLU浓度均显著低于对照组，表明发酵黄芪减弱了血糖急剧升高的趋势，抵御了可能带来的组织损伤，进一步说明发酵黄芪可以通过调节能量代谢来提高棕点石斑鱼的抗氨氮能力。前文提到，氨氮胁迫会对鱼体产生氧化应激，而氧化应激会影响组织细胞合成、分泌与代谢[46]，饲料中添加发酵黄芪对实验鱼氨氮胁迫后的相关血清代谢指标均有改善，可能是因为发酵黄芪提高了实验鱼的抗氧化性能，相关机制还有待进一步研究。
4. 结论
饲料中添加适量水平的发酵黄芪可以提高棕点石斑鱼的体质量增长率和特定生长率，对棕点石斑鱼的消化酶活性、抗氧化能力和血清代谢指标有提升作用，可减少氨氮胁迫带来的氧化损伤，提高鱼的抗氨氮能力。综合本实验各项指标考虑，棕点石斑鱼饲料中发酵黄芪的适宜添加量为1%~2%。
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图 1 不同乳杆菌菌株发酵对鲭鱼加工副产物理化指标的影响
注：L0、L1、L2和L3分别为无任何处理的对照组、接种嗜酸乳杆菌、接种植物乳杆菌和接种贝氏乳杆菌的实验组；不同字母之间表示存在显著性差异 (P<0.05)，图 2 同此。
Figure 1. Effects of different lactic acid bacteria fermentation on physicochemical indexe of processed by-products of mackerel
Note: L0, L1, L2 and L3 are the control group without any treatment, groups inoculated with L. acidophilus, L. plantarum and L. beijerinck, respectively. Different letters indicate significant difference (P<0.05). The same case in Fig. 2.
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图 2 灭菌与不灭菌发酵对鲭鱼加工副产物理化指标的影响
注：S0、S1、S2 分别为灭菌不接种乳杆菌、灭菌接种乳杆菌、不灭菌接种乳杆菌；组胺相对含量由每一组组胺实际含量除以第 0 天未发酵的组胺实际含量计算得出。
Figure 2. Effects of sterilization and non-sterilization fermentation on physicochemical indexes of processed by-products of mackerel
Note: S0, S1 and S2 represent sterilization without inoculation of lactic acid bacteria, and non-sterilization with inoculation of lactic acid bacteria, respectively. The relative histamine content is calculated by the actual histamine content of each group by the actual histamine content of the sterilization group on 0th day.
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图 3 不同发酵阶段的细菌群落相对丰度
注：保藏 270 d 指发酵后保存在常温下 270 d；图 4 同此。
Figure 3. Relative abundance of bacterial communities at different fermentation stages
Note: Storage of 270 d means storing at room temperature for 270 d after fermentation; the same case in Fig. 4.
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图 4 不同发酵阶段真菌群落的相对丰度
Figure 4. Relative abundance of fungal communities at different fermentation stages
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图 5 乳杆菌发酵降解抗原蛋白的SDS-PAGE蛋白电泳图谱
Figure 5. SDS-PAGE electrophoretic pattern of lactobacilli protein degraded by fermentation
表 1 植物乳杆菌发酵鲭鱼加工副产物的Alpha多样性指数
Table 1 Alpha diversity index of processed by-products of mackerel fermented by L. plantarum
样品
SampleACE 指数
ACE indexChao1指数
Chao1 index香农指数
Shannon index覆盖率
Goods coverage对照组
Control group第1天 1st day 123.735 123.438 0.905 1 第30天 30th day 151.349 149.636 1.072 1 发酵组
Fermentation group第1天 1st day 128.206 121.5 1.371 1 第30天 30th day 114.553 110.286 1.668 1 第270天 270th day 57.176 56.0 0.634 1 
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表 2 乳杆菌发酵鲭鱼加工副产物游离氨基酸组成的变化
Table 2 Changes of free amino acid composition of processed by-products of mackerel fermented by lactic acid bacteria
mg·g−1 氨基酸名称
Amino acid name发酵前
Before fermentation对照组第30天
Control group on 30th day乳杆菌发酵第30天
Lactic acid bacteria fermentation on 30th day天冬氨酸 Asparagine 3.742 4.674 4.701 苏氨酸 Threonine 1.420 1.565 1.493 丝氨酸 Serine 1.828 2.079 2.152 谷氨酸 Glutamic acid 7.111 8.030 7.897 甘氨酸 Glycine 2.874 2.863 3.034 丙氨酸 Alanine 2.315 2.411 2.567 胱氨酸 Cystine 0.357 0.313 0.410 缬氨酸 Valine 1.814 1.702 1.953 蛋氨酸 Methionine 0.186 0.118 0.184 异亮氨酸 Isoleucine 1.529 1.489 1.881 亮氨酸 Leucine 2.799 3.049 2.358 酪氨酸 Tyrosine 0.971 1.131 1.246 苯丙氨酸 Phenylalanine 1.896 2.036 1.893 赖氨酸 Lysine 1.107 1.197 1.081 组氨酸 Hlstidine 2.182 1.881 2.266 精氨酸 Argnine 2.940 2.898 2.938 脯氨酸 Proline 2.082 2.407 3.275 总和 Total 37.153 40.175 41.331
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表 3 乳杆菌发酵前后脂肪酸组成变化
Table 3 Changes of fatty acid composition before and after lactic acid bacteria fermentation
% 脂肪酸种类
Fatty acid type发酵前占比
Proportion before fermentation乳杆菌发酵第30天占比
Proportion of lactic acid bacteria fermentation on 30th day十三烷酸 C13:0 9.34 7.51 棕榈酸 C16:0 24.13 25.13 棕榈油酸 C16:1 7.32 7.13 油酸 C18:1 2.79 3.02 亚油酸 C18:2 12.95 15.11 亚麻酸 C18:3 2.81 2.96 γ-亚麻酸 C18:3 8.15 9.53 花生酸 C20:0 2.16 2.15 二十碳二烯酸 C20:2 3.74 3.27 二十碳五烯酸 C20:5 8.83 7.75 芥子酸 C22:1 0.56 0.55 二十二碳二烯酸 C22:2 4.28 3.89 木蜡酸 C24:0 9.11 8.33 二十二碳六烯酸 C22:6 3.84 3.67 单不饱和脂肪酸 MUFA 10.67 10.70 多不饱和脂肪酸 PUFA 44.60 46.18 饱和脂肪酸 SFA 44.74 43.12
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