Effect of carbon dioxide anesthesia on physiology and quality of tilapia
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摘要: 采用二氧化碳 (CO2) 对罗非鱼 (Oreochromis niloticus) 进行麻醉处理以减少其由操作过程引起的应激反应，分析了麻醉及复苏过程中罗非鱼生理及鱼肉品质的变化。探索不同处理温度的麻醉效果，确定了罗非鱼CO2麻醉的最佳温度为15 ℃，麻醉用时 (101±18) s，复苏用时 (134±23) s。CO2麻醉引起了罗非鱼血清皮质醇 (COR) 含量、血糖 (GLU) 浓度、谷草转氨酶 (AST) 、谷丙转氨酶 (ALT)和碱性磷酸酶 (ALP) 活性的显著升高，复苏后显著降低。糖原 (GLY) 含量显著降低，肝乳酸 (LD) 含量在麻醉复苏后达到最高点。麻醉使鱼体肌乳酸含量显著升高，胁迫解除后显著下降。麻醉后观察到罗非鱼肝脏丙二醛 (MDA) 含量升高，而超氧化物歧化酶 (SOD) 活性、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 活性、总抗氧化能力 (T-AOC) 降低。鱼片硬度、胶着性、咀嚼性受CO2麻醉影响显著，复苏24 h后可恢复到对照水平，弹性水平基本保持稳定。研究表明，短时饱和CO2处理可以有效快速麻醉罗非鱼，麻醉处理引起了罗非鱼机体的氧化应激反应，胁迫解除后鱼体生理状态可得到恢复。Abstract: We used carbon dioxide (CO2) to anesthetize tilapia (Oreochromis niloticus) to reduce the stress response caused by operation, and analyzed the changes of physiology and meat quality of tilapia during anesthesia and resuscitation. By studying the anesthetic effects of different treatment temperatures, we found that the optimal temperature for CO2 anesthesia of tilapia was 15 ℃; the duration of anesthesia was (101±18) s; the duration of resuscitation was (134±23) s. The serum indexes of hydrocortisone (COR), blood glucose (GLU), aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT) and alkaline phosphatase (ALP) increased significantly after anesthesia, but decreased after resuscitation. The glycogen (GLY) content decreased significantly after anesthesia, while the lactic acid (LD) content in liver reached the maximum value after resuscitation. The LD content in muscle increased during anesthesia but decreased when the stress was relieved. High malondialdehyde (MDA) content but low superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px) and total antioxidant capacity (T-AOC) activity were observed during anesthesia. The hardness, adhesiveness and chewiness of the fillets were significantly affected by anesthesia, but could recover to the control group's level after 24 h, with stable flexibility. In conclusion, tilapia can be anesthetized effectively and quickly after CO2 anesthesia treatment; anesthesia treatment causes oxidative stress response of tilapia; and the physiological state of tilapia can be restored after stress was relieved.
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Keywords:
- Oreochromis niloticus /
- Carbon dioxide anesthesia /
- Serum index /
- Metabolic index /
- Oxidative stress
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微藻富含多样性极为丰富的生物活性物质，易于大规模培养，具有广阔的开发前景，是目前海洋生物新资源物种挖掘开发的国际热点方向。
波长介于280~320 nm范围的B波段紫外线 (Ultraviolet radiation B, UV-B)，是影响室外规模化养殖微藻生长、代谢的主要环境因子之一[1]。UV-B可以诱导藻细胞内活性氧 (Reactive oxygen species, ROS) 的形成，通过ROS的氧化作用进而破坏DNA、蛋白质、脂类等重要分子的化学结构，最终导致藻细胞生长、膜通透性、光合作用、CO2同化、酶代谢、氮固定等生理过程的损伤[2-3]。不同种类的微藻对UV-B辐射的响应不尽相同[4]。南极冰藻 (Chlorophyceae L-4) 对UV-B辐射的增强有积极的响应，在UV-B辐射下总蛋白含量减少，但总脂、总糖及脂肪酸含量显著增加[5]；而布朗葡萄藻 (Botryococcus braunii Kutz.) 暴露于5 W·m−2 UV-B辐射时，其生长及总糖、总蛋白、总脂等代谢产物含量急剧降低，但在1 W·m−2 UV-B辐射下仅受到轻微抑制[6]。
虽然UV-B辐射通常会对微藻产生有害影响[4]，但一些微藻经适当的UV-B辐射，可诱导藻细胞内的光保护机制，合成并积累具有紫外吸收能力的化合物，如类菌胞素氨基酸 (Mycosporine-like amino acids, MAAs)、类胡萝卜素 (Carotenoids, Car) 和伪枝藻素等[7]。这些紫外吸收物质同时还具有显著的抗氧化活性，通过紫外吸收和抗氧化保护的双重作用，可显著降低紫外辐射对藻细胞的损伤，维持藻细胞正常生长及生理功能。微藻的紫外吸收物质具有重要的商业开发价值，然而，在常规培养环境中，对UV-B辐射具有抗性的微藻，其紫外吸收物质含量通常较低，这限制了其产业化开发[8]。利用UV-B辐射诱导手段可改善这一问题。因此，筛选生长速度快、紫外适应能力强、综合利用价值高的微藻，采用UV-B辐射策略提高其紫外吸收物质的含量，深入探究藻细胞对UV-B的响应规律和生理机制，对微藻紫外吸收物质的产业开发具有重要研究意义。
在前期研究中，笔者筛选获得了1株隶属于绿藻门、栅藻科、Asterarcys属的单细胞淡水微藻。该属藻类具有生长迅速、耐强光、耐高温、耐烟气以及富含多种高价值生物活性物质等特点，适于室外大规模生产及商业应用[9-12]。经海水驯化，该藻株可在盐度30‰ 的海水中良好生长，其生物量、蛋白质、油脂均高于淡水原株，且更易采收，具有良好的开发潜力[13]。近期笔者还发现该藻株可以高效积累MAAs，具有商业开发MAAs的潜力，目前尚未见有关Asterarcys属藻株产MAAs特性的报道。本研究选取Asterarcys sp. SCSIO-44020海水藻株为研究对象，探讨了该藻株生长及代谢产物对不同人工外源UV-B辐射时间的响应规律，揭示该藻株抗UV-B辐射的生理机制，以期为该藻株紫外吸收物质的开发及其生物质资源的综合利用提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
本实验采用的藻种为Asterarcys sp. SCSIO-44020海水藻株，由中国科学院南海海洋研究所筛选并经海水驯化获得，现保存于广东省经济微藻种质库。
1.2 方法
1.2.1 培养方法
Asterarcys sp. SCSIO-44020海水藻株的保藏、扩种与紫外处理培养实验均采用海水改良1-ZSNT培养基[12]。紫外处理实验中，接种密度OD750 nm为0.50±0.03；紫外处理实验的培养系统为光径6 cm、长度60 cm、有效培养体积1 L的柱式光生物反应器；培养液中持续通入体积分数为1%的二氧化碳 (CO2) 气体；培养温度为 (26±1) ℃，培养光强为14 000 lx，培养光周期为24 L∶0 D。
UV-B光源采用功率为8 W、光谱发射范围为280~320 nm、峰值为308 nm的 UV-B潜水灯 (北京中仪博腾科技有限公司)，其内置的UV-B灯管通过加装石英玻璃管外套进行密封防水处理，石英外套的紫外线透过率为95%，UV-B灯管上包裹乙酸纤维素薄膜，以过滤290 nm以下的UV-C短波辐射 (实测UV-C强度为0)。实验时，将潜水灯置于反应器藻液内，从培养第1天起每间隔48 h对藻液进行UV-B辐射处理1次，每次处理时间分别为0 (对照组)、10、30、50和70 min，其单次处理所对应的辐射剂量分别为0、150、460、770和1 050 mJ·cm−2。UV-B、UV-C剂量使用LS125多探头紫外辐照计 (深圳市林上科技有限公司) 进行测定。培养至20 d后结束，离心收集藻泥并用去离子水清洗，经冷冻干燥后获得藻粉，测定其代谢产物含量。
1.2.2 生长测定
采用分光光度法测定藻液OD750 nm值作为细胞密度指标，每2 d测定1次。同时利用质量法对微藻生物量进行测定：取适量藻液，用已烘干至恒定质量的0.45 μm的微孔过滤膜 (水系) 进行抽滤，并用去离子水冲洗去除盐分，再将带藻滤膜置于烘箱中烘干至恒定质量，利用差减法测定微藻细胞干质量 (DW)。
1.2.3 总蛋白质提取及测定
称取50 mg藻粉于螺口玻璃离心管内，加入5 mL丙酮 (C3H6O) 进行脱色处理30 min，随后室温下3 500 r·min−1离心10 min去除丙酮；脱色藻粉内加入5 mL 0.50 mol·L−1氢氧化钠 (NaOH)，80 ℃水浴、搅拌提取2 h，离心收集上清至50 mL比色管中，反复抽提3次，合并上清并定容，得到总蛋白质提取液；随后利用Lowry法蛋白浓度测定试剂盒 (生工生物工程股份有限公司，中国) 对总蛋白质含量进行测定。
1.2.4 总脂提取及测定
利用改良的Khozin-Goldberg法提取微藻总脂，通过差减法得到总脂质量并据此计算总脂含量[14]。
1.2.5 总糖提取及测定
称取10 mg藻粉于10 mL塑料离心管内，加入5 mL 0.50 mol·L−1硫酸 (H2SO4)，80 ℃水浴、搅拌提取2 h，5 000 r·min−1离心10 min，收集上清至50 mL比色管中，反复抽提3次，合并上清并定容，得到总糖提取液样品；采用苯酚-硫酸法，测定样品反应后的特征峰光吸收值OD490 nm，并将其代入葡萄糖标准曲线计算总糖含量[15]。
1.2.6 游离氨基酸测定
用氨基酸 (AA) 含量检测试剂盒 (北京索莱宝科技有限公司) 测定游离氨基酸含量。游离氨基酸的α-氨基与水合茚三酮反应生成特征吸收570 nm的蓝紫色化合物，通过测量570 nm处的吸光度计算游离氨基酸含量。
1.2.7 脂肪酸提取及测定
采用卫华宁等[13]的方法提取脂肪酸；随后用GC-2014C气相色谱仪 (岛津，日本) 按李涛等[16]的方法对脂肪酸组成进行测定，根据峰面积法得到各脂肪酸组分的相对百分含量。
1.2.8 色素提取及测定
参照李嘉颖等[17]的方法利用丙酮冰浴提取色素，采用高效液相色谱法测定色素组成；利用分光光度法测定叶绿素和Car特征峰的吸光度，分别代入经验公式计算总叶绿素及总Car含量。
1.2.9 MAAs提取及测定
称取50 mg藻粉于10 mL塑料离心管内，加入5 mL 20% (体积分数) 甲醇 (CH3OH)，于45 ℃水浴搅拌提取2 h，冷却至室温后8 000 r·min−1离心10 min，取上清液，用0.22 μm的水系微孔滤膜过滤即得MAAs粗提液。随后用紫外-可见分光光度计测定250~400 nm范围内上清液的紫外吸收值，在323 nm处发现最大吸收峰，可通过323 nm处的吸光度估算MAAs含量 (DW)，以OD323 nm·g−1 (所有参数归一为单位体积) 表示。为进一步确定MAAs的存在，用吴燕燕等[18]的方法采用固相萃取小柱对粗提液进一步纯化并冻干得到MAAs半纯品，对其进行傅里叶变换红外 (Fourier transform infrared, FT-IR) 扫描。
1.3 数据统计及分析
使用GraphPad Prism 8.0.2软件进行数据统计及单因素方差分析 (One-way ANOVA)，P<0.05为差异显著。
2. 结果
2.1 UV-B辐射对Asterarcys sp. SCSIO-44020生长的影响
不同UV-B辐射时间对Asterarcys sp. 海水藻株生长的影响见图1。培养初期 (0~6 d)，UV-B辐射对Asterarcys sp. 海水藻株生长的影响较小，培养6 d后其生长差异逐渐显现；培养第20天UV-B各处理组的生物量均不同程度低于对照组，其中UV-B辐射处理时间为10~50 min时，各组藻细胞的生长与对照组相比无显著性差异 (P>0.05)，而辐射处理时间增加为70 min时，第20天的生物量为 (4.90±0.35) g·L−1，比对照组 [(6.00±0.14) g·L−1] 减少了18.30%，差异显著 (P<0.05)。
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图 1 UV-B辐射对Asterarcys sp. SCSIO-44020生长的影响Figure 1. Effect of UV-B radiation on growth of Asterarcys sp. SCSIO-440202.2 UV-B辐射对Asterarcys sp. SCSIO-44020总蛋白质、总脂和总糖的影响
不同UV-B剂量处理的Asterarcys sp. 海水藻株经过20 d的培养周期后，其主要生化组分变化见图2。随着UV-B辐射时间的增加，Asterarcys sp. 海水藻株总蛋白质含量呈上升趋势，其中UV-B辐射10、30和50 min处理组间无显著性差异 (P>0.05)，但70 min处理组与对照组之间及这两组与10、30和50 min处理组间差异显著 (P<0.05)；70 min处理组总蛋白质质量分数最高 [(14.50±0.20)%]，比对照组高29.09%，但各处理组间蛋白质产量无显著性差异 (P>0.05)。该藻株总脂含量与UV-B辐射时间呈负相关，其中对照组的总脂质量分数 [(45.60±0.57)%] 显著高于其他处理组 (P<0.05)，50和70 min处理组总脂质量分数无显著性差异 (P>0.05)，70 min处理组最低 [(37.60±1.41)%]，较对照组降低17.54%；总脂产量也随着UV-B辐射时间的增加而不断下降，对照组的总脂产量为70 min处理组的1.46倍。随着UV-B辐射时间的增加，该藻株总糖含量呈先上升后下降的趋势，50 min处理组质量分数为 (24.31±1.18)%，显著高于其他各组 (P<0.05)，其他各组之间差异不显著 (P>0.05)；总糖产量变化趋势与总糖含量相似，UV-B辐射50 min处理组的产量最高 [(1.37±0.07) g·L−1]，70 min处理组的产量最低 [(1.01±0.04) g·L−1]。
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图 2 UV-B辐射对Asterarcys sp. SCSIO-44020总蛋白质、总脂和总糖质量分数及产量的影响注：不同字母表示组间差异显著 (P<0.05)，下标数字1和2分别代表质量分数和产量；图4-c同此。Figure 2. Effect of UV-B radiation on mass fractions and yields of protein, total lipid and carbohydrates in Asterarcys sp. SCSIO-44020Note: Different letters indicate significant differences among the groups (P<0.05), and 1 and 2 represent the mass fraction and yield, respectively. The same case in Fig. 4-c.2.3 UV-B辐射对Asterarcys sp. SCSIO-44020游离氨基酸含量的影响
经不同UV-B辐射剂量处理，Asterarcys sp. 海水藻株培养20 d的游离氨基酸变化情况见图3，UV-B辐射70 min时游离氨基酸质量摩尔浓度最高 [(0.27±0.01) μmol·mg−1]，显著高于其他各组 (P<0.05)，其他各组间均无显著性差异 (P>0.05)。70 min处理组游离氨基酸质量摩尔浓度为对照组 [(0.22±0.00) μmol·mg−1] 的1.23倍。
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图 3 UV-B辐射对Asterarcys sp. SCSIO-44020游离氨基酸含量的影响注：不同字母表示差异显著 (P<0.05)。Figure 3. Effect of UV-B radiation on free amino acids molality of Asterarcys sp. SCSIO-44020Note: Different letters indicate significant differences (P<0.05).2.4 UV-B辐射对Asterarcys sp. SCSIO-44020脂肪酸组成的影响
UV-B辐射对Asterarcys sp. 海水藻株藻细胞脂肪酸组成与含量的影响见表1，经不同UV-B辐射剂量处理，该藻株培养20 d的脂肪酸种类均由2种饱和脂肪酸 (棕榈酸C16:0和硬脂酸C18:0)、2种单不饱和脂肪酸 (棕榈油酸C16:1和油酸C18:1) 和2种多不饱和脂肪酸 (亚油酸C18:2和亚麻酸C18:3) 组成。随着UV-B辐射剂量的增加，C18:0含量变化不显著，C16:0和C18:1含量显著降低(P<0.05)，而C18:2和C18:3含量显著升高 (P<0.05)。饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸含量随着UV-B辐射剂量的增加持续下降，而多不饱和脂肪酸变化趋势则与之相反，70 min处理组的多不饱和脂肪酸的总含量比对照组升高了15.52%。
表 1 UV-B辐射对Asterarcys sp. SCSIO-44020脂肪酸组成的影响Table 1. Effect of UV-B radiation on fatty acid composition of Asterarcys sp. SCSIO-44020脂肪酸类型Type of fatty acid 相对百分含量 Relative percentage content/% 0 min 10 min 30 min 50 min 70 min 棕榈酸 C16:0 24.45±0.31a 24.18±0.08ab 23.64±0.14b 23.28±0.06b 22.57±0.00c 棕榈油酸 C16:1 1.79±0.02b 1.69±0.11b 1.87±0.02ab 2.03±0.02a 2.00±0.03a 硬脂酸 C18:0 3.87±0.03b 3.91±0.08b 4.09±0.03a 4.14±0.01a 3.76±0.05b 油酸 C18:1 35.29±0.22a 34.40±0.11b 33.53±0.06c 33.02±0.20c 30.99±0.24d 亚油酸 C18:2 16.42±0.01e 16.17±0.00d 17.24±0.02c 17.84±0.14b 19.43±0.03a 亚麻酸 C18:3 15.99±0.21bc 16.31±0.06b 16.24±0.01b 15.90±0.01c 18.01±0.17a 其他 Other 2.20±0.11b 3.34±0.06a 3.39±0.07a 3.78±0.41a 3.24±0.12a 饱和脂肪酸 SFAs 29.90±0.24a 29.77±0.02a 29.44±0.08a 29.06±0.05b 28.14±0.03c 单不饱和脂肪酸 MUFAs 37.68±0.21a 37.75±0.08a 37.08±0.09b 37.20±0.17ab 34.42±0.11c 多不饱和脂肪酸 PUFAs 32.41±0.03c 32.48±0.06c 33.48±0.01b 33.74±0.12b 37.44±0.15a 注：同行不同上标字母表示差异显著 (P<0.05)。 Note: Different superscript letters within the same line indicate significant differences (P<0.05). 2.5 UV-B辐射对Asterarcys sp. SCSIO-44020 MAAs积累的影响
对不同UV-B辐射剂量处理、培养20 d的实验藻株进行20% (体积分数) 甲醇溶液提取，获得MAAs粗提物，图4-a为各处理组MAAs粗提物的紫外扫描光谱。结果显示，该藻株甲醇提取液在紫外光波长310~360 nm范围内有MAAs特征吸收峰，其最大吸收波长为323 nm；在不同时间UV-B辐射影响下并未出现新的MAAs特征吸收峰，但其OD323 nm随着UV-B辐射时间的增加而持续上升。将其甲醇提取物经固相萃取小柱处理的半纯品冻干样进行FTIR分析，Asterarcys sp. 海水藻株的MAAs半纯品在500~4 000 cm−1范围内的红外吸收光谱见图4-b，波数3 200~3 600 cm−1处存在吸收峰说明O-H官能团的存在[19]；2 928.35 cm−1处吸收峰是由C-H伸缩振动产生的，表明NH2+的存在[20]；1 576.72 cm−1处出现吸收证明存在C=C伸缩振动[19]；1 417.45 cm−1处有吸收说明可能有羧基的存在[21]；1 250~1 020 cm−1处吸收峰表明C-N的伸缩振动[19]。此红外光谱得到的结果与MAAs基本官能团相似。
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图 4 UV-B辐射对Asterarcys sp. SCSIO-44020中MAAs的影响注：a. UV-B辐射对Asterarcys sp. SCSIO-44020甲醇提取物紫外光谱的影响；b. Asterarcys sp. SCSIO-44020甲醇提取物傅里叶变换红外扫描图谱；c. UV-B辐射对Asterarcys sp. SCSIO-44020 MAAs相对含量及相对产量的影响。Figure 4. Effect of UV-B radiation on MAAs in Asterarcys sp. SCSIO-44020Note: a. Effect of UV-B radiation on UV scan spectrum analysis of methanol extract of Asterarcys sp. SCSIO-44020; b. FTIR spectrum of methanol extract of methanol extract of Asterarcys sp. SCSIO-44020; c. Effects of UV-B radiation on relative MAAs content and yield of Asterarcys sp. SCSIO-44020.在相同的提取体系和紫外吸收测定体系下，以单位质量藻粉的甲醇粗提物紫外吸收值 (OD323 nm·g−1) 作为MAAs的相对含量指标，进一步分析不同UV-B辐射时间对Asterarcys sp. 海水藻株MAAs积累的影响 (图4-c)。结果显示，MAAs的相对含量随着UV-B辐射时间的增加而不断上升，10 min处理组与对照组相比差异不显著 (P>0.05)，其他处理组之间差异显著 (P<0.05)。70 min处理组的MAAs相对含量最大，比对照组提高75.25%。UV-B辐射处理组的MAAs相对产量均高于对照组，随处理时间的增加呈先上升后下降的趋势，在UV-B辐射50 min时达到最高，为对照组的1.58倍。
2.6 UV-B辐射对Asterarcys sp. SCSIO-44020光合色素的影响
经不同UV-B辐射剂量处理，Asterarcys sp. 海水藻株的光合色素主要由叶黄素、角黄素、叶绿素a (Chl a)、叶绿素b (Chl b)、叶绿素b酯、β-胡萝卜素、虾青素酯等组成 (培养第20天，图5)。该藻株在不同UV-B处理时间下的Chl a和Car的含量及产量见表2。70 min处理组Chl a含量显著高于其他各组 (P<0.05)，比对照组提高16.67%，但在所有处理组中其产量最低；Car含量随着UV-B辐射时间的增加略有上升 (P>0.05)，在70 min处理组达 (0.53±0.02)%，该组Car产量最低 [(26.19±1.01) mg·L−1]。Car/Chl a在10 min处理组几乎不变，随处理时间延长逐渐上升，在50 min处理组达最高值，当辐射时间继续增加时又下降至10 min处理组水平。
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图 5 UV-B辐射对Asterarcys sp. SCSIO-44020色素组成的影响Figure 5. Effect of UV-B radiation on pigment composition of Asterarcys sp. SCSIO-44020表 2 UV-B辐射对Asterarcys sp. SCSIO-44020色素含量及产量的影响Table 2. Effect of UV-B radiation on pigment content and yield of Asterarcys sp. SCSIO-44020辐射处理时间Radiation time/min 叶绿素a质量分数Chl a/% 叶绿素a产量Chl a yield/(mg·L−1) 类胡萝卜素质量分数Car/% 类胡萝卜素产量Car yield/(mg·L−1) w(Car)/w(Chl a) 0 1.08±0.00b 63.45±0.20a 0.47±0.01a 27.85±0.37a 0.44±0.01ab 10 1.11±0.02b 64.38±1.04a 0.47±0.01a 27.37±0.73a 0.43±0.00b 30 1.13±0.00b 67.83±0.09a 0.49±0.01a 29.47±0.40a 0.43±0.01ab 50 1.11±0.07b 62.38±3.76a 0.52±0.03a 29.01±1.88a 0.46±0.00a 70 1.26±0.01a 61.59±0.44a 0.53±0.02a 26.19±1.01a 0.42±0.01b 注：同列不同上标字母表示差异显著 (P<0.05)。 Note: Different superscript letters within the same column indicate significant differences (P<0.05). 3. 讨论
3.1 Asterarcys sp. SCSIO-44020的UV-B辐射适应能力
研究表明，大多数微藻对UV-B辐射较为敏感，较低剂量的UV-B辐射可显著抑制微藻生长[22-23]，其抑制效果随着UV-B辐射强度的增加而增强[6,23-24]。同时，有报道显示另一些微藻对UV-B辐射并不敏感[25]，适宜剂量的UV-B辐射对其生长没有显著的抑制作用[26-27]。微藻对UV-B辐射的敏感性与微藻种类、UV-B辐射强度及处理时间等多重因素相关，其中藻种自身遗传特性是最为关键的因素。小球藻 (Chlorella vulgaris) 在适宜的UV-B辐射剂量 (20和40 mJ·cm−2) 下生长与对照组基本一致，剂量提高到60 mJ·cm−2时生长出现抑制[25]，其适宜生长的UV-B辐射剂量范围远低于本研究。El-Sheekh等[4]报道浮丝藻 (Planktothrix cryptovaginata)、念珠藻 (Nostoc carneum)、海洋微囊藻 (Microcystis) 、铜绿微囊藻 (M. aeruginosa) 和栅藻 (Scenedesmus acutus) 均有良好的抗紫外辐射特性，但其生物量在UV-B辐射剂量为180 mJ·cm−2时出现了明显下降。本研究中对Asterarcys sp. 海水藻株生长无显著抑制作用的UV-B辐射最高剂量为770 mJ·cm−2 (50 min处理组)，且UV-B辐射剂量高达1 050 mJ·cm−2 (70 min处理组) 时，生物量仍有 (4.90±0.35) g·L−1，仅比对照组低18.30%。因此，Asterarcys sp. 海水藻株具有极强的强UV-B辐射适应能力，远高于前述文献中的各类微藻。
3.2 UV-B辐射对Asterarcys sp. SCSIO-44020代谢产物的影响
本研究显示，随着UV-B辐射的增强，Asterarcys sp. 海水藻株蛋白质含量呈增加趋势。坛紫菜 (Porphyra haitanensis)[28]、栅藻[4]、石莼 (Ulva lactuca)[29]等的蛋白质含量随着UV-B辐射的增强逐渐上升，与本研究结果一致。同时，经10~50 min UV-B处理，Asterarcys sp. 海水藻株的游离氨基酸含量保持稳定，与对照组相比无显著性差异 (P>0.05)，在70 min处理组最高 (图3)。微藻糖类 (主要是多糖) 是光合作用的主要产物，在10~50 min UV-B辐射处理范围内，随着辐射剂量的增加，Asterarcys sp. 海水藻株的总糖含量逐渐增加，50 min处理组总糖含量与产量均达最高，其中总糖产量比对照组提高17.74%，而当辐射处理时间增至70 min时，总糖含量及产量均显著下降。紫球藻 (Porphyridium purpureum)[30]、念珠藻 (Nostoc carneum) 和栅藻[4]等总糖含量变化与本研究结果一致。
随着UV-B辐射增强，Asterarcys sp. 海水藻株的脂质含量与产量均持续下降，可能是由于UV-B辐射直接破坏生物膜上的脂质，从而造成细胞损伤，生长速率降低[31]。同时，Asterarcys sp. 海水藻株在最高UV-B剂量处理下饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸含量均有所下降，而多不饱和脂肪酸相对含量从32.41%升高至37.44%。Car是一类重要的抗氧化剂[2]，本研究中Asterarcys sp. 海水藻株Car含量随着UV-B辐射的增强而略有上升，但差异并不显著 (P>0.05)，显示该藻株Car耐受UV-B辐射而保持含量稳定。
MAAs被认为是微藻及其他生物的天然防晒霜，可用于防晒产品开发，商业价值极高[32]。本研究显示，Asterarcys sp. 海水藻株可积累最大吸收波长为323 nm的MAAs成分，目前国内外文献尚无Asterarcys 属藻株产MAAs的报道。适宜剂量的UV-B辐射可以大幅提高藻株MAAs的相对含量与产量，其相对含量与UV-B辐射处理时间正相关，50 min处理组的相对产量达到最高，虽然70 min处理组MAAs的相对含量还在进一步增加，但此条件下生长受到抑制，MAAs相对产量开始下降。已有大量研究表明，多种微藻的MAAs浓度也随UV-B辐射剂量的增大而增加[31,33-36]，与本研究结果一致。
从前文可知，Asterarcys sp. 海水藻株富含MAAs、蛋白、多糖、油脂和色素等天然产物，经UV-B辐射50 min (770 mJ·cm−2) 处理，其生长不受影响，总糖含量和产量以及MAAs产量均达到最高，蛋白质、游离氨基酸及叶绿素的产量与对照组无显著性差异，同时Car、叶绿素和多不饱和脂肪酸含量均略有增加。而UV-B辐射处理时间增加至70 min (1 050 mJ·cm−2) 时，该藻株的生长及产物代谢受到了明显抑制。鉴于半连续培养是微藻规模化培养的最佳生产方式，这种模式培养期间须完全避免由于人为调控环境因子而对藻细胞生长代谢产生抑制或损伤作用，否则随着培养时间的延长，轻微程度的生理抑制或损伤也会快速地强化放大甚至导致培养失败。因此，770 mJ·cm−2的UV-B辐射剂量是本研究培养体系的最佳处理条件，这一参数可为进一步放大培养实验和产业化应用提供重要参考。
3.3 Asterarcys sp. SCSIO-44020海水藻株的抗紫外机制
微藻为应对UV-B辐射的胁迫而进化出不同的适应机制，如紫外躲避行为、DNA修复机制、酶促/非酶促抗氧化系统及合成积累紫外吸收物质等。MAAs吸收紫外具有极高的摩尔消光系数，该产物的合成和积累情况是微藻抵御紫外辐射最为有效的手段之一，也是微藻适应紫外辐射的重要指标[31]。除了高效吸收紫外线，MAAs还可作为抗氧化剂清除因紫外辐射产生的氧化因子，进一步保护细胞器免受辐射影响。由于具有紫外吸收特性和抗氧化活性，MAAs可以阻止蓝藻细胞内胸腺嘧啶二聚体的形成，从而有效避免辐射对DNA的损伤及进一步的代谢紊乱[2,7]。本研究中，UV-B辐射对Asterarcys sp. 海水藻株的MAAs影响最为显著，且其含量可以达到2%以上 (结果未发表)，无疑是该藻株适应UV-B辐射的关键因素。
除积累紫外吸收物质外，微藻还可通过系统性的生理响应以及分子水平上抗性基因的表达调控适应强紫外辐射[22]。本研究中，游离氨基酸及蛋白质含量在70 min辐射处理时显著提高，说明UV-B辐射增强了藻细胞内氨基酸及蛋白质的合成代谢，可能促使芳香氨基酸或抗性蛋白积累，从而提高藻细胞对UV-B辐射的吸收能力和抗氧化保护能力[37]。研究表明，多糖积累可提高微藻对非生物胁迫的耐受性，糖类可能通过提供ATP并清除自由基而提高细胞对辐射胁迫的适应能力[28,38]，而本研究在适宜UV-B辐射条件下，Asterarcys sp. 海水藻株总糖含量增加，当辐射剂量过高产生生长抑制时，多糖含量也显著下降，支持了多糖参与微藻抗紫外辐射作用的假设。据报道，多不饱和脂肪酸可调节细胞膜的脂质流动性[31]；Car能够清除自由基来防止ROS诱导的氧化应激对光合系统造成损害[2]；Chl a对紫外辐射损伤也有良好的保护作用[39]。本研究中，多不饱和脂肪酸、Car和叶绿素在UV-B辐射影响下含量皆有增加，这些产物也可能提高藻细胞在UV-B辐射下的耐受性。此外，Car/Chl a是细胞氧化水平的标志，其比值升高可反映机体在应对UV-B辐射胁迫时产生积极的防御响应[40-41]。Asterarcys sp. 海水藻株在UV-B辐射50 min时Car/Chl a最高，也提示藻细胞抗紫外辐射能力增加。
综上所述，Asterarcys sp. 海水藻株具有极强的UV-B适应能力，高剂量的UV-B辐射大幅促进MAAs的合成与积累，可能是该藻株抵御UV-B辐射损伤的主要生理机制；同时，多糖、蛋白质、游离氨基酸、多不饱和脂肪酸、叶绿素和Car等代谢产物的响应和变化，也可能在藻细胞适应强紫外胁迫的过程中起到系统性的协同作用。这些生理特性显示出良好的商业开发潜能和理论研究价值。该藻株抗紫外辐射的生理机制，特别是其分子水平上的产物诱导与生理调控机制，以及MAAs提取纯化与结构鉴定等有待更深入的研究。
4. 结论
Asterarcys sp. SCSIO-44020海水藻株具有极强的抗UV-B辐射能力，UV-B辐射50 min (770 mJ·cm−2) 处理对其生长无显著影响，辐射处理进一步增加至70 min (1 050 mJ·cm−2)，对该藻株的生长仅有18.30%的抑制。MAAs含量随着处理剂量增大而大幅增加，在770和1 050 mJ·cm−2处理时分别达到最高的MAAs产量 (183.38 OD323 nm·L−1) 与含量 (34.56 OD323 nm·g−1)，MAAs的增加可能是该藻株抵御UV-B辐射的主要机制。同时，770 mJ·cm−2处理时多糖含量达到最高，而在1 050 mJ·cm−2 UV-B辐射下，蛋白质、游离氨基酸、多不饱和脂肪酸、叶绿素和Car含量均达到最高，但其产量与50 min辐射处理组相比降低或无显著性差异。这些产物也可能是协同藻细胞适应强紫外胁迫的重要生理基础。本研究显示，Asterarcys sp. SCSIO-44020具有良好的MAAs开发及产物综合利用潜力，间隔48 h每次的770 mJ·cm−2剂量是本研究体系下的最佳UV-B处理条件。
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图 2 二氧化碳麻醉对血清皮质醇和血糖浓度的影响
Figure 2. CO2 anesthesia effect on concentration of serum cortisol and blood glucose
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图 3 二氧化碳麻醉对血清谷草转氨酶、谷丙转氨酶和碱性磷酸酶活性的影响
Figure 3. CO2 anesthesia effect on activities of serum aspartate aminotransferase, alanine aminotransferase and alkaline phosphatase
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图 5 二氧化碳麻醉对肝脏丙二醛、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、总抗氧化能力的影响
Figure 5. CO2 anesthesia effect on levels of MDA, SOD, GSH-Px and T-AOC in liver
表 1 罗非鱼在不同麻醉阶段和复苏阶段的行为特征
Table 1 Behavioral characteristics of tilapia at different anesthesia and resuscitation stages
阶段
Stage行为特征
Behavioral characteristicsA1 保持平衡，游动正常，触觉灵敏，鳃盖张合频率正常 A2 保持平衡，不停游动，鱼头探出水面，鳃盖张合的频率下降 A3 平衡困难，尾部间或摆动，触觉大部分丧失，呼吸困难 A4 鱼体完全翻倒，尾部停止摆动，沉在底部，触觉丧失，呼吸停止 R1 呼吸逐渐恢复，鳃盖开始振动，但不能翻身游动 R2 身体部分平衡恢复，鳃盖振动趋于恒定，运动恢复 R3 鱼体平衡完全恢复，触觉恢复 R4 鱼体行为完全恢复正常 
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表 2 不同温度下二氧化碳麻醉罗非鱼的效果
Table 2 CO2 anesthesia effect on tilapia at different temperatures
温度
Temperature/℃麻醉时间
Anesthesia time/s复苏时间
Resuscitation time/s复苏率
Resuscitation rate/%24 h 成活率
24 h survival rate/%48 h 成活率
48 h survival rate/%5 144±25bc 349±27a 100 100 100 10 151±26b 251±24b 100 100 100 15 101±18c 134±23c 100 100 100 20 153±24b 258±24b 100 100 100 25 326±33a 397±36a 100 100 100 注: 同列中标有不同字母者表示组间有显著性差异 (P<0.05)，标有相同字母者表示组间无显著性差异 (P>0.05)，下同。
Note: The values with different letters within the same column are significantly different (P<0.05), and those with the same letter are not (P>0.05). The same below.
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