Analysis of bacterial community and diversity in gill tissues of bony fishes in adjacent South China Sea
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摘要: 围绕中国南海丰富的渔业资源,采用16S rDNA扩增子测序技术,分析了南海近岸硬骨鱼类鳃组织微生物群落分布特征,并探讨了7个不同站点细菌群落结构的差异。结果显示,测序共获得有效拼接片段 (Clean tags) 2 952 366条,平均每个文库56 776条。分别在门、属水平对其优势类群进行了分析,其中门水平上变形菌门 (Proteobacteria) 最高 (71.3%),属水平上变形菌门的不动杆菌属 (Acinetobacter) 最高 (17.2%)。不同站点的α多样性具有显著差异,其中I9和H8站点的物种丰富度 (Chao1指数) 最高,D3站点的多样性 (Shannon指数) 最高。不同站点来源样品之间的β多样性具有显著差异 (P<0.05),但在宿主分类的目水平上无显著差异 (P>0.05)。中国南海近岸硬骨鱼鳃组织中的细菌群落组成丰富,采样站位相比宿主分类对鳃组织上细菌群落具有更重要的影响,它们可能在辅助宿主营养物质转运及代谢方面发挥积极作用。
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关键词:
- 硬骨鱼鳃 /
- 16S rDNA扩增子 /
- 细菌多样性 /
- 南海
Abstract: Focusing on the abundant fishery resources in the South China Sea, we analyzed the distribution characteristics of the microbial community in the gill tissue of bony fishes in the adjacent South China Sea by using 16S amplicon sequencing technology. In addition, we discussed the differences in the bacterial community structure at different sites. The results show that the sequencing obtained a total of 2 952 366 effective spliced fragments (Clean tags) with an average of 56 776 in each library. The dominant taxa were analyzed at phylum and genus levels. Proteobacteria was the highest (71.3%) at phylum level, and Acinetobacter was the highest at genus level (17.2%). The alpha diversity of different sites was significantly different, and the I9 and H8 sites had the highest species richness (Chao1 index), and the D3 site had the highest diversity (Shannon index). The beta diversity of samples from different sites was significantly different (P<0.05), but there was no significant difference between the host classification (Order level) groups (P>0.05). The composition of bacterial communities in the gill tissues of bony fishes in the South China Sea was abundant. Compared with the classification of the host, the sampling station has more important influence on the community of the bacterial in the gill tissues, and may play an active role in assisting the host's nutrient transport and metabolism.-
Keywords:
- Bony fish gill /
- 16S rDNA amplicon /
- Bacterial diversity /
- South China Sea
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牡蛎可通过高效的滤食作用去除水体中的浮游生物,从而改善水质,在为人类供给优质食物蛋白的同时提供了生态系统服务功能[1]。近年来,国内外针对牡蛎增养殖与环境生态相互作用的研究逐渐增多[2-3]。Ray和Fulweiler[4]的研究表明,牡蛎通过刺激菌落的反硝化作用降低了环境中的氮 (N) 负荷,有效地促进了海洋生态系统的营养循环;Labrie等[5]也发现牡蛎筏式养殖通过微生物反硝化作用和牡蛎收获可显著提高永久性氮的去除率,并指出反硝化作用的强弱与牡蛎养殖区的氮沉降、底层水体溶解氧含量、营养盐浓度的年际和季节波动显著相关;Pan等[6]通过分析钦州湾牡蛎养殖区营养盐浓度、叶绿素a (Chl a) 和同位素的季节变化特征,揭示其通过增强沉积物中浮游植物同化-牡蛎过滤和反硝化作用的耦合,促进了水体中营养盐的去除;此外,牡蛎的收获也可直接将水体的N、磷 (P) 等生源要素从水体脱离,降低了水体营养盐负荷[7]。
牡蛎筏式养殖是现代化海洋牧场的重要组成部分,然而,其对近岸海洋生态环境的影响尚有争议。Cerco和Noel[8]认为牡蛎对上层水域的修复能力有限,建议将牡蛎修复作为减少营养负荷的补充措施之一,而不是替代措施。随着牡蛎养殖密度的增加,其对周围环境产生了一系列不良影响[9],包括栖息地入侵[10]、改变当地的水文特征[11]和沉积环境特征[12]、溶珊瑚弧菌 (Vibrio coralliilyticus) 交叉感染珊瑚[13]并改变浮游生物群落的结构与功能等[14]。Ray和Fulweiler[4]认为引入或重新引入牡蛎到近岸生态系统可能会带来负面的生态影响,尤其是为了环境或资源修复而使用了非本地土著物种的水生生物。近期研究表明,双壳贝类养殖可能成为二氧化碳 (CO2) 的汇,促使人们探索将其纳入碳排放市场[15]。因此,牡蛎在海洋生态环境中的作用和地位,至今仍是国内的研究热点。
近海牡蛎增养殖业经常受到污水排放、海洋工程建设等人为扰动的影响,且牡蛎病害时有发生[16],这些因素明显改变了牡蛎养殖区微生物的结构与功能。在人类活动密集、营养物质丰富的地区,常出现大量的病原体指示菌,例如粪大肠菌群或肠球菌 (Enterococcus sp.)[17]。环境微生物作为一种有效的监测手段,常用于探索和评估牡蛎养殖对海区生态系统健康状况的影响。但目前环境微生物在半封闭城市海湾内的牡蛎增养殖系统中所起的作用与地位尚不明确,也不清楚牡蛎的高滤食效率是否对水体中的菌落结构和功能产生了长期影响。为此,本研究采用高通量测序技术,对半封闭城市海湾内牡蛎养殖区4个季节的水体菌落功能变化进行分析,并结合海区水体与沉积物的理化特征,探究了牡蛎养殖对海区水体菌落特征的影响,为牡蛎养殖对生态系统潜在影响的评估及海水养殖管理策略的制定提供参考依据。
1. 材料与方法
1.1 研究区域
本研究在深圳市东部的大鹏澳海域进行,研究区域为一个受亚热带季风影响的半封闭海湾,面积约10 km2,每年10月至次年4月受东北季风影响,而5—9月则以西南季风为主,年平均潮差0.49 m,海区的水体流速较低 (2~6 cm·s−1),主要受到2种类型的季节性环流影响,即夏季的气旋环流以及秋、 冬和春季的反气旋环流[18]。大鹏澳3条入海河流流量大小为王母河>龙歧河>南涌河[19]。为探究牡蛎养殖对海区微生物群落的影响,本研究将海区南部有葡萄牙牡蛎 (Crassostrea angulata) 养殖筏架分布的9个调查站位设为牡蛎养殖区,北部其他9个站位设为对照区 (图1)。筏式养殖区面积约2 km2,每年分2个周期进行筏式吊绳增养殖,分别在夏、冬季进行投苗与收获,每个牡蛎壳体上约附着10~20个蚝卵,每根绳子上约20个牡蛎壳,每条吊绳长3 m,绳间隔约30 cm,近年年产量约为6.6×104 t,牡蛎养殖区约占调查海湾面积的1/5。
1.2 样品采集
本研究从2020年11月持续至2021年8月,在春季 (5月)、夏季 (8月)、秋季 (11月) 和冬季 (2月),进行了4个航次的调查。调查站位均匀覆盖了整个大鹏澳海域,合计18个采样点,每个采样点间距约为600 m。使用尼斯金采样器收集水样。由于海湾内水深小于10 m (平均5.2 m),在每个采样点采取表层水样。水样采集后,通过预酸清洗和预燃烧 (500 ℃, 5 h) 的0.22 μm孔径Whatman GF/F过滤器,过滤约1 000 mL水样。滤膜立即放入液氮罐中保存,待进一步进行高通量测序。将滤液收集在500 mL经过酸预清洗过的聚乙烯瓶中,低温保存,24 h内运回实验室并立即进行水体营养盐分析。
使用便携式叶绿素a 荧光测试仪 (Aquafluor,Turner Designs,美国) 测定叶绿素a浓度,使用便携式CTD (CastAway,YSI,美国) 测量海水表面温度 (Sea surface temperature, SST)、海水底温 (Bottom sea temperature, BST)、盐度 与深度,使用便携式浊度计 (WZB-175,雷磁) 分析海水的浊度 (Tur),使用便携式水质分析仪 (6600EDS,YSI,美国) 测定pH与溶解氧 (DO)。按照《海洋监测规范第4部分:海水分析》 (GB 17378.4—2007) 与《海洋调查规范第4部分:海水化学要素调查》 (GB/T 12763.4—2007) ,使用分光光度计测定铵态氮 (${\mathrm{NH}}_4^+ $)、硝态氮 (${\mathrm{NO}}_3^- $)、亚硝态氮 (${\mathrm{NO}}_2^- $)、硅酸盐 (${\mathrm{SiO}}_3^{2-} $)、化学需氧量 (Chemical oxygen demand, COD) 和可溶性活性磷酸盐 (Soluble reactive phosphate, SRP),检出限分别为
0.0007 mg∙L−1、0.0007 mg∙L−1、0.0003 mg∙L−1、0.1 μmol∙L−1、0.15 mg∙L−1和0.02 μmol∙L−1。每个样品进行3次重复测定,重复测定样品的相对标准偏差 (RSD) 小于5%。使用抓斗式沉积物采样器 (Van Veen,OSIL,丹麦) 一式三份采取各站位的表层沉积物 (0~10 cm),用2 mm的网筛分沉积物样品以去除结石和植物根部,然后密封在无菌塑料袋中[20]。沉积物中的总有机碳 (Total organic carbon, TOC) 采用重铬酸钾氧化-还原容量法测定,总氮 (TN) 采用凯氏滴定法测定,总磷 (TP) 采用分光光度法测定,硫化物 (Sul) 采用亚甲基蓝分光光度法测定。通过原子吸收分光光度计 (Z-2010,日立,日本) 法评估沉积物中的重金属[铜(Cu)、铅(Pb)、锌 (Zn)、砷(As)、汞(Hg)和镉 (Cd)]。用原子荧光光度计 (AFS-8520,北京海光) 测定As和Hg。沉积物样品均按照《海洋监测规范第5部分:沉积物分析》 (GB 17378.5—2007) 进行收集、保存、运输和检测,沉积物粒径 (Sediment grain size, SGS) 按照《海洋调查规范第8部分:海洋地质地球物理调查》 (GB/T 12763.8—2007) 采用筛析法进行分析。
1.3 PCR扩增和高通量MiSeq测序
本研究采用改良的CTAB法提取水体样品总基因组DNA[20]。用1% (w) 琼脂糖凝胶检测DNA的浓度和纯度。根据浓度用无菌水将DNA稀释至1 ng∙L−1。使用带有条形码的特异性引物 (338F—806R) 扩增16S rDNA基因的V3—V4可变区[21]。所有PCR反应均使用试剂盒制成20 μL的反应体系 (High-Fidelity PCR Master Mix,英格兰生物实验室,英国),其中包括0.8 μL的上、下游引物和约10 ng的模板DNA。反应条件设置参考Fang 等[21]的研究,反应结束后,在2% (w) 琼脂糖凝胶上进行电泳检测。将PCR产物等比例混合。然后使用凝胶回收试剂盒 (Qiagen,希尔登,德国) 对PCR产物进行纯化[22]。使用Quantus™ 荧光计 (Promega,麦迪逊,美国) 对DNA进行定量。
PCR纯化产物送测序公司,在Illumina MiSeq平台上对文库进行测序,得到250 bp的双端序列。
1.4 数据处理与统计分析
使用QIIME (V1.9.1) 软件分析原始序列读数。去除短于200 bp、质量控制得分低于20以及条形码或引物中不匹配的序列。使用UPARSE 7.0软件对相似度为97%的序列进行聚类 (Operational Taxonomic Unit, OTU),并使用UCHIME识别和删除嵌合序列。使用RDP (V2.13) 基于SILVA (V138) 软件对每个样本的序列进行分类注释。对于下游分析,保留至少在3个样本中的测序序列数≥5的OTU,并去除比对到叶绿体 (Chloroplast) 和线粒体 (Mitochondria) 序列的OTU。
计算样本的Alpha多样性 (Shannon, Simpson, Chao 1, Shannoneven),统计不同季节水体之间的差异。使用置换多元方差分析 (Permutational multivariate analysis of variance, PERMANOVA) 和相似性分析 (Analysis of similarities, ANOSIM) 研究微生物群落结构的时空差异。通过非度量多维尺度分析 (Non-metric multidimensional scaling, NMDS) 可视化分析群落的相似性。使用Kruskal-Wallis (KW) 检验分析统计学差异,事后检验采用Tukey-kramer检验,p<0.05为差异显著。实验数据以“平均值±标准差($ \overline { x}\pm s $)”表示。
使用R (V4.2.1) vegan包中冗余分析 (Redundancy analysis, RDA) 评估菌落与环境因子之间的关系。利用LEfSe (LDA effect size) 基于非参数KW检测不同组间的物种相对丰度差异,进而获得显著差异的标志物种,运用LEfSe (Linear discriminant analysis effect size) 分析估计这些差异物种对组间差异的影响大小。使用Networkx (V3.1) 分别分析水样品中细菌共生网络关系 (Spearman≥0.7, p<0.05)。以上运算主要借助美吉云平台开展计算 (https://www.majorbio.com)。利用FAPROTAX模型预测水体中微生物的生物化学过程 [碳 (C)、N和硫 (S) 循环],并基于Wilcoxon秩和检验统计并绘制差异分析柱形图。
2. 结果
2.1 牡蛎养殖区与对照区理化因子差异特征
t检验的结果表明 (表1),牡蛎养殖区水体环境因子年度均值中,仅浊度显著高于对照区,两区域其他水体环境因子 [SST、盐度、${\mathrm{NH}}_4^+ $ 、${\mathrm{NO}}_3^- $、无机氮 (DIN)、SPR、${\mathrm{SiO}}_3^{2-} $、Chl a和DO] 均无显著性差异;牡蛎养殖区沉积物的TOC、Sul、Cd、Pb、Cu、Zn和Cr均显著高于对照区 (p<0.05,表2),而SGS显著低于对照区。从季节上看,水体春季SST、盐度、Chl a和DO,夏季SRP和硅磷比 (Si/P),秋季Si/P,冬季SST、盐度、Tur有显著性差异 (p<0.05) ;牡蛎养殖区沉积物中的TOC、Pb、Cu、Zn在各个季节均显著高于对照区 (p<0.05)。
表 1 大鹏澳牡蛎养殖区与对照区水体与沉积物水环境因子t检验分析Table 1 Analysis of water environment factors by t-test between oyster culture area and control area in Dapeng Cove水环境因子
Water environment factor牡蛎养殖区
Oyster culture area对照区
Control areap值 p-value 年均
Annual mean春
Spring夏
Summer秋
Autumn冬
Winter海水表面温度 SST/℃ 25.94±3.34 26.04±3.45 0.900 0.005** 0.444 0.166 0.009** 盐度 Salinity/‰ 32.96±1.00 33.03±0.97 0.749 0.036* 0.510 0.738 0.003** 铵态氮 ${\mathrm{NH}}_4^{\mathrm{+}} $/(mg∙L−1) 0.10±0.04 0.10±0.04 0.813 0.720 0.113 0.555 0.650 硝态氮 ${\mathrm{NO}}_3^{\text{−}}$/(mg∙L−1) 0.09±0.02 0.09±0.02 0.871 0.523 0.609 0.248 0.330 可溶性无机氮 DIN/(mg∙L−1) 0.19±0.04 0.18±0.04 0.764 0.927 0.25 0.89 0.830 可溶性活性磷酸盐SPR/(μg∙L−1) 6.13±2.34 6.53±2.85 0.521 0.159 0.006** 0.168 0.338 硅酸盐 ${\mathrm{SiO}}_3^{2{\text{−}}} $/(mg∙L−1) 0.12±0.06 0.11±0.06 0.664 0.288 0.313 0.054 0.555 硅磷比 Si/P 25.29±16.89 25.73±18.83 0.916 0.105 0.032* 0.030* 0.478 化学需氧量COD/(mg∙L−1) 0.95±0.43 0.98±0.45 0.827 0.742 0.773 0.520 0.678 叶绿素a Chl a/(μg∙L−1) 0.87±0.55 0.78±0.62 0.529 0.001** 0.826 0.653 0.329 溶解氧DO/(mg∙L−1) 7.51±0.76 7.63±0.57 0.418 0.037* 0.618 0.682 0.914 浊度 Turbitity/NTU 5.37±2.12 4.44±1.65 0.021* 0.066 0.224 0.122 0.040* 注:* 代表存在显著性差异 (*. p<0.05; ** . p<0.01; *** . p<0.001);n=36。 Note: * represents significant differences (*. p<0.05; ** . p<0.01; *** . p<0.001); n=36. 表 2 大鹏澳牡蛎养殖区与对照区沉积物环境因子t检验分析Table 2 Analysis of sediment environment factors by t-test between oyster culture area and control area in Dapeng Cove沉积物环境因子
Sediment environment factor牡蛎养殖区
Oyster culture area对照区
Control areap值 p-value 年均
Annual mean春
Spring夏
Summer秋
Autumn冬
Winter总有机碳 TOC/% 1.15±0.44 0.56±0.25 <0.001*** 0.003** 0.003** 0.006** 0.007** 总氮TN/% 0.13±0.06 0.11±0.05 0.0550 0.413 0.201 0.284 0.073 总磷TP/% 0.21±0.06 0.19±0.08 0.257 0.413 0.08 0.047* 0.983 碳氮比 C/N 12.33±12.33 8.43±9.15 0.133 0.258 0.546 0.007** 0.007** 硫化物Sulfide/(mg∙kg−1) 67.72±70.03 24.99±20.65 <0.001*** 0.220 0.052 0.092 0.109 镉Cd/(mg∙kg−1) 0.04±0.04 0.03±0.02 0.022* 0.213 0.179 0.430 0.100 铅Pb/(mg∙kg−1) 44.54±18.05 19.64±9.08 <0.001*** 0.021* <0.001*** <0.001*** <0.001*** 铜Cu/(mg∙kg−1) 34.81±15.54 8.16±4.98 <0.001*** 0.005** <0.001*** 0.001** <0.001*** 锌Zn/(mg∙kg−1) 83.32±34.79 38.66±20.08 <0.001*** 0.003** 0.001** 0.002** 0.012* 铬Cr/(mg∙kg−1) 63.54±21.41 40.79±21.95 <0.001*** 0.013* 0.633 <0.001*** <0.001*** 沉积物粒径
Sediment grain size/mm0.01±0.01 0.02±0.02 <0.001*** 0.064 0.734 0.104 0.190 注:* 代表存在显著性差异 (*. p<0.05; **. p<0.01; ***. p<0.001);n=36。 Note: * represents significant differences (*. p<0.05; **. p<0.01; ***. p<0.001); n=36. 2.2 牡蛎养殖区与对照区菌落分类学特征
牡蛎养殖区与对照区的水体中以黄杆菌科、蓝藻科、红杆菌科和γ-变形菌纲的哈里菌科等为优势科 (图2),占水体总科类群的60%以上。牡蛎养殖区与对照区水体OTU分布如图3所示,牡蛎养殖区的水体OTU平均数量 (1 436个) 高于对照区 (1 310个)。两区域共有的OTU数量为1 124个,占总OTU的69.30%。
2.3 牡蛎养殖区与对照区菌落结构特征
基于Wilcoxon秩和检验的统计分析结果表明,牡蛎养殖区与对照区水体的菌落年度整体的α多样性差异不显著 (p>0.05) ;两区域水体仅在冬季有显著性差异 (Shannon和Chao,p<0.05) (表3),牡蛎养殖区的Shannon多样性和Chao丰富度具有显著性差异,但Invsimpson与Shannoneven指数差异不显著。
表 3 冬季牡蛎与对照区水体浮游菌落α多样性Table 3 Alpha diversity of bacterioplankton in water body between oyster culture area and control area in winter多样性指数
Diversity index牡蛎养殖区
Oyster culture area对照区
Control areap值
p-valueShannon 3.14±0.15 2.91±0.12 0.01 Chao 458.65±101.09 344±43.01 0.01 Invsimpson 11.11±1.67 9.77±1.65 0.13 Shannoneven 0.55±0.01 0.53±0.02 0.13 基于Bray-Curtis距离 (OTU水平) 的PCoA分析结果表明,从年度整体来看,牡蛎养殖区和对照区的水体菌落结构无显著性差异,仅在冬季牡蛎养殖区与对照区间水体中的菌落结构 (OTU水平) 存在显著性差异 (ANOSIM, r=0.26, p=0.004) (图4)。
采用Wilcoxon秩和检验进一步分析冬季牡蛎养殖区与对照区浮游菌落的差异特征 (门水平),统计结果表明,冬季两区域平均相对丰度前15的门中,水体的浮游菌落有7个门具有显著性差异 (p<0.05),牡蛎养殖区中的绿弯菌门、脱硫杆菌门和酸杆菌门等显著高于对照区 (图5)。
图 5 冬季牡蛎养殖区与对照区水体浮游菌落差异检验柱状图 (门水平)注:* 代表存在显著性差异 (*. p<0.05; **. p<0.01; ***. p<0.001)。Fig. 5 Wilcoxon rank-sum test bar plot for bacterioplankton in water body between oyster culture area and control area in winter (Phylum level)Note: * represents significant differences (*. p<0.05; **. p<0.01; ***. p<0.001).2.4 牡蛎养殖区与对照区菌落结构差异的环境驱动因子
冗余分析 (RDA) 揭示了冬季水体牡蛎养殖区与对照区菌落特征的关系 (图6),所调查的水环境因子在OTU水平上的前两轴共解释了总方差的47.78%。冬季水体中驱动牡蛎养殖区与对照区菌落结构差异主要的环境因子为 ${\mathrm{SiO}}_3^{2-} $、SST、盐度、pH、$ {\mathrm{NH}}_4^{\mathrm{+}}$ 和DO。
图 6 冬季牡蛎养殖区与对照区水体浮游菌落与环境因子RDA分析 (OTU水平)注:椭圆为95%的置信区间;SST. 海水表面温度;DO. 溶解氧;Chl a. 叶绿素a;NH4 +. 铵态氮;NO3 −. 硝态氮;SiO3 2−. 硅酸盐;COD. 化学需氧量;SRP. 可溶性活性磷酸盐。Fig. 6 RDA analysis of bacterioplankton and environmental factors in water body between oyster culture area and control area in winter (OTU level)Note: Ellipse represents 95% confidence interval; SST. Sea surface temperature; DO. Dissolved oxygen; Chl a. Chlorophyll a; NH4 +. Ammonium nitrogen; NO3 −. Nitrate nitrogen; SiO3 2−. Silicate; COD. Chemical oxygen demand; SRP. Soluble reactive phosphate.2.5 牡蛎养殖区与对照区菌落的生物地球化学功能差异
根据FAPROTAX的功能注释,冬季牡蛎养殖区与对照区的水体菌落共比对出67个生物地球化学循环相关功能,其中化能异养、需氧化能异养的相对丰度较高,占全部预测功能丰度的85%。67个相关功能中,有11个在两区域间有显著性差异 (Wilcoxon秩和检验,p<0.05) (图7)。对照区的需氧化能异养与暗氢氧化显著高于牡蛎养殖区,而牡蛎养殖区的硝酸盐还原、发酵、硫酸盐呼吸、硫化物的暗氧化和硫代硫酸盐呼吸等显著高于对照区 (p<0.05)。
图 7 冬季牡蛎养殖区与对照区水体中菌落潜在生物地球化学功能差异注:* 代表存在显著性差异 (*. p<0.05; **. p<0.01; ***. p<0.001)。Fig. 7 Analysis of potential biogeochemical functional differences of bacterioplankton in water body between oyster culture area and control area in winterNote: * represents significant differences (*. p<0.05; **. p<0.01; ***. P<0.001).3. 讨论
3.1 牡蛎养殖对海区环境因子的扰动
贝类筏式养殖场通常设在风浪较小、水动力较弱的海域,但高密度、集约化的水产养殖可能会因残饵与排泄物的积累而引起海区环境因子的变化[23]。例如,爱尔兰基拉里港筏式养殖的贻贝 (Mytilus edulis) 每年向海区排放的C与N分别为8.5和1.1 kg·hm−2[24]。中国黄渤海沿岸养殖的贻贝每年向海区排放约101 t的N和15.5 t的P[23]。牡蛎通过直接排泄和生物沉积物矿化作用产生的NH4 +,经过氧化作用,可能会将大量的 ${\mathrm{NO}}_3^- $ 释放到水体中[17]。而本研究发现,4个季节的牡蛎养殖区与对照区水体的 ${\mathrm{NH}}_4^+ $、${\mathrm{NO}}_3^- $、$ {\mathrm{SiO}}_3^{2-}$ 和COD均无显著性差异,表明大鹏澳海域的牡蛎筏式养殖对半封闭海湾水体营养盐浓度的扰动相对较小。本研究还发现,夏季牡蛎养殖区的SPR显著高于对照区。这可能是由于夏季水温高,牡蛎代谢旺盛,生物沉积的矿化作用增强[25],从而提高了水体中的SPR浓度;同时,夏季雨水较多,牡蛎养殖区附近王母河的磷酸盐通量高于对照区的龙歧河[26-27],这也可能是导致SPR浓度差异的原因之一。本研究还表明,除了对水体营养盐的扰动外,牡蛎筏式养殖还可能影响海区的浊度。在春、夏与秋季,由于海区水动力条件较好,牡蛎养殖区与对照区的浊度差异不显著,而在水动力较弱的冬季[28],两区域的浊度差异显著。这可能是因为筏式养殖降低了海区水体流速,导致在冬季水动力条件较差时,水体中的颗粒悬浮物停留时间延长,使水体浊度显著增加[11,29]。
贝类养殖对海区环境影响的主要因素是其生物沉积作用,以及由此导致的养殖水域营养盐滞留[23]。本研究结果显示,牡蛎养殖区沉积物中的TOC显著高于对照区,这很可能是由于牡蛎滤食后的粪便和假粪等生物沉积物,显著增加了沉积物中TOC的含量。这一结果与Xu等[30]在广西茅尾海的研究结果相吻合。此外,牡蛎的生物沉积作用可能对海区的碳循环过程产生了显著性影响。牡蛎养殖区沉积物中的Sul也显著高于对照区,这与多项先前的研究结果一致[31-33]。有研究指出,随着牡蛎养殖区的撤离,酸挥发性硫化物的浓度会迅速下降[34],这主要由于牡蛎的生物沉积作用提高了海区TOC、Sul等含量,促进了沉积物中颗粒有机物中C、N等元素的降解与利用,而硫化物由于不易被微生物利用,因此在沉积物中滞留[35]。此外,本研究发现牡蛎养殖区沉积物中Cd、Zn和Cr等重金属元素含量显著增加,这与Liu等[36]在象山港褶牡蛎 (Crassostrea plicatula) 研究中观察到的生物沉积显著提高了沉积物中重金属含量的结果一致。这可能由于牡蛎对重金属有较强的富集效应,而其组织对重金属的富集能力有限[37],超出这一能力的重金属将随着生物沉积一起沉积在海底;牡蛎的滤食和生物沉积作用,可能改变了沉积物的粒径,导致沉积物中的重金属含量与沉积物粒径呈负相关,而与有机物含量呈正相关[38]。由于假粪等生物沉积物中具有较高的比表面积和有机物含量,这些细颗粒可能会吸收更多的重金属[39]。另一方面,牡蛎养殖区沉积物中的高Sul改变了大型底栖生物和菌落的结构[40-41],减少了沉积物中大型底栖生物和菌落的生物扰动,以及对重金属的富集作用,导致牡蛎养殖区沉积物中重金属含量增加。
3.2 牡蛎养殖对海区浮游菌落结构及其潜在生物地球化学功能的扰动
牡蛎作为滤食性贝类,其选择性滤食行为可能直接影响浮游生物的生物量与群落结构[42]。牡蛎养殖海区的营养盐浓度和比例差异,也会引起浮游生物群落结构的相应改变[43]。在年度尺度上,牡蛎养殖区与对照区的水体菌落优势种之间的差异不显著,这可能与水体的介质属性有关。大鹏澳牡蛎养殖区和对照区水体间的浮游菌落能够通过水体流动实现有效的动态交换。尽管有研究指出,牡蛎代谢排泄的氨氮等无机和有机废物,以及生物沉积物经过矿化后进入水体,会刺激水体营养盐的变化,从而引起局部“上行效应”[44],改变周围海水中的微生物群落[45],但是这种影响可能在时间与空间上均有限。在水动力较强的季节 (春、夏和秋季),大鹏澳海域主要受潮汐作用影响[19],局域波动的菌落可能被流动的海水迅速扩散稀释到邻近海域,因此并未观察到牡蛎养殖区与对照区水体浮游菌落的显著性差异。而在水交换较弱的冬季[28],牡蛎养殖区与对照区水体浮游菌落结构出现显著性差异。细菌群落的结构特征显著受到环境因素影响[46],RDA分析进一步揭示了环境因子在冬季对牡蛎养殖区与对照区水体菌落特征的驱动作用 (图6),其中 ${\mathrm{SiO}}_3^{2-} $、SST、盐度和 $ {\mathrm{NH}}_4^+$ 等是影响菌落结构差异的主要环境因子。本研究表明,在水动力较弱的条件下,牡蛎养殖区的浮游菌落易受到氮负荷如 ${\mathrm{NH}}_4^+ $ 等的影响,进而改变水体菌落的结构。
本研究利用FAPROTAX模型对冬季调查海区的菌落生物地球化学功能进行了预测,牡蛎养殖区与对照区之间的生物地球化学循环对比结果表明,牡蛎养殖活动增强了冬季水体菌落硝酸盐还原和硫酸盐呼吸等与N、S循环相关的功能过程。Yan等[35]发现牡蛎养殖可显著富集海区中的S和铁 (Fe) 循环相关的微生物,与本研究观察到牡蛎养殖区中的脱硫杆菌门、绿弯菌门、厚壁菌门和Sva0485显著高于对照区的结果相符。这可能是由于牡蛎养殖区为反硝化菌落提供不稳定的碳源,促进了反硝化硝酸作用[47]。同时,菌落生物地球化学功能的显著性差异,较好响应了环境中显著富集的TOC、硫酸盐以及重金属等环境因子的变化。总之,牡蛎养殖可能通过扰动海区水体中的菌落结构特征,影响当地的生物地球化学循环[48],这些结果同时也进一步支持了牡蛎养殖可能影响当地的反硝化、厌氧氨氧化和硝酸盐异化还原成铵过程的观点[5,32]。
4. 结论
本研究通过监测海区浮游菌落结构的动态变化特征,评估了大鹏澳海区在牡蛎养殖影响下水体和沉积物的扰动情况,有助于深入理解牡蛎养殖在海湾环境中的作用和地位。本研究发现,牡蛎养殖改变了水体浊度,通过其生物沉积加剧了海区TOC、Sul和部分重金属的聚集。高通量测序结果进一步显示,牡蛎养殖对海水菌落结构产生了一定影响,但这种影响的程度和范围受到季节性理化因子变化和水文条件等因素的限制。此外,牡蛎养殖通过浮游菌落的介导作用,促进了海区N与S等元素的生物地球化学循环。本研究表明,单个季度的调查难以全面揭示牡蛎养殖区与环境的相互作用,通过不同季节的监测和评估,可更全面地理解牡蛎养殖区对水环境的影响。下一步将结合宏基因组等先进技术,进行月度监测与评估,以更准确地反映牡蛎养殖对海湾环境的影响。
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图 5 Alpha多样性指数箱线图
注:a—e. 基于站点分组的Chao1、ACE、Observed、Simpson、Shannon 多样性指数箱线图,不同颜色代表不同站点的样本;f. 基于样本宿主(目水平) 分类分组的Chao1 指数箱线图。
Figure 5. Boxplot of Alpha diversity index
Note: a–e. Boxplot of diversity indexes of Chao1, ACE, Observed, Simpson and Shannon based on site grouping, and different colors represent samples of different sites; f. Boxplot of Chao1 index based on sample host (Order level) classification.
图 6 基于不同分组方式的NMDS分析 [非参数多元方差分析 (PerMANOVA)]
注:a. 基于站点分组的 NMDS 分析; b. 基于样本的目水平分组。图中两个样本点越接近,表示两个样本物种组成越相似。横纵坐标表示样本间的相对距离,无实际意义。图形中的每一个点代表一个样本,不同颜色代表不同的样本分组信息。NMDS 结果的优劣用胁迫系数 (stress) 来衡量,此值越小越好,当小于 0.2 时表示可以用 NMDS 的二维点图表示组间或组内差异。
Figure 6. NMDS analysis based on different grouping modes [Nonparametric multivariate analysis of variance (PerMANOVA)]
Note: a. NMDS analysis based on site grouping; b. Grouping based on the order level of the sample. The closer the two sample points are,the more similar the composition of the two sample species are. The abscissa and ordinate indicate the relative distance between samples, which is of no practical significance. Each point in the graph represents a sample, and different colors represent different sample grouping information. The advantages and disadvantages of testing NMDS results are measured by stress coefficients, the smaller, the better, and the value less than 0.2 indicates that the two-dimensional dot plot of NMDS can be used to represent differences between or within groups.
图 7 22个KEGG-L2功能层级相对丰度热图
注:横坐标代表不同的样本,纵坐标代表不同的功能层级,图片上方色条表示不同分组,并按照样本聚类。
Figure 7. Heatmap of relative abundance of 22 KEGG-L2 functional levels
Note: The abscissa represents different samples; the ordinate represents different functional levels; the color bars indicate different groups, which are clustered according to samples.
表 1 样品分类信息
Table 1 Taxonomy information of samples
站点
Sampling station样品编号
Sample ID目
Order物种
SpeciesD3 D3.1S 鲈形目 条纹䱨 Terapon theraps D3 D3.2S 鲈形目 日本金线鱼 Nemipterus japonicus D3 D3C.2S 鲈形目 列牙䱨 Pelates quadrilineatus F3 F3.2S 鲈形目 鹿斑鲾 Leiognathus ruconius F3 F3.4S 鲽形目 少牙斑鲆 Pseudorhombus oligodon F3 F3.5S 鲈形目 带鱼 Trichiurus lepturus D8 D8.1S 鲈形目 蓝圆鲹 Decapterus maruadsi D8 D8.3S 鳗鲡目 网纹裸胸鳝 Gymnothorax reticularis D8 D8.5S 鮟目 黑鮟 Lophiomus setigerus D8 D8.6S 鲉形目 环纹蓑鲥 Pterois lunulata D8 D8.8S 鲈形目 深水金线鱼 Nemipterus bathybius D8 D8.12S 鲉形目 深海红娘鱼 Lepidotrigla abyssalis F8 F8.1S 鲉形目 环纹蓑鲥 Pterois lunulata F8 F8.4S 鲉形目 单棘豹鲂鮄 Daicocus peterseni F8 F8.8S 鲈形目 二长棘鲷 Parargyrops edita F8 F8.11S 鮟目 棘茄鱼 Halieutaea stellata F8 F8.16S 鲉形目 日本红娘鱼 Lepidotrigla japonice F8 F8.17S 鲉形目 拟蓑鲉 Parapterois heterurus F8 F8.18S 海龙鱼目 鳞烟管鱼 Fistularia petimba H3 H3.3S 鲈形目 翼红娘鱼 Lepidotrigla alata H3 H3.4S 鲈形目 中华䲢 Uranoscopus chinensis H3 H3.5S 鳗鲡目 大鳞鳞头鲉 Sebastapistes megalepis H3 H3.7S 鮟目 无备虎鲉 Minous inermis H8 H8.1S 鲉形目 大鳞短额鲆 Engyprosopon grandisquama H8 H8.2S 鲈形目 鳞烟管鱼 Fistularia petimba H8 H8.3S 鲉形目 繁星鲆 Bothus myriaster H8 H8.7S 鲉形目 孔鰕虎鱼 Trypauchen vagina H8 H8.10S 鲉形目 斑鰶 Konosirus punctatus H8 H8.12S 鲈形目 皮氏叫姑鱼 Johnius belangerii H8 H8.15S 鮟目 短吻鲾 Leiognathus brevirostris H8 H8.24S 鲉形目 大头狗母鱼 Trachinocephalus myops H8 H8.25S 鲉形目 大头狗母鱼 Trachinocephalus myops I9 I9.1S 海龙鱼目 大鳞鳞头鲉 Sebastapistes megalepis I9 I9.5S 鲉形目 黄纹拟鲈 Parapercis xanthozona I9 I9.7S 鲈形目 寿鱼 Banjos banjos I9 I9.8S 鲉形目 棕斑宽吻鲀 Amblyrhynchotes rufopunctatus I9 I9.9S 鲉形目 单棘豹鲂鮄 Daicocus peterseni I9 I9.10S 鲽形目 松球鱼 Monocentris japonica I9 I9.11S 海龙鱼目 新平鲉 Neosebastes entaxis I9 I9.12S 鲽形目 二长棘鲷 Parargyrops edita I9 I9.13S 鲈形目 横带眶棘鲈 Scolopsis inermis I9 I9.14S 鲱形目 盔蓑鲉 Ebosia bleekeri I9 I9.15S 鲈形目 冠鲽 Samaris cristatus I9 I9.16S 鲈形目 叉斑狗母鱼 Synodus macrops I9 I9.17S 海龙鱼目 美尾䲗 Calliurichthys japonicus I9 I9.18S 鲉形目 瑞氏红鲂鮄 Satyrichthys rieffeli I9 I9.20S 鲉形目 虻鲉 Erisphex pottii I9 I9.21S 鲉形目 红鲬 Bembras japonicus I9 I9.22S 鲈形目 六带拟鲈 Parapercis sexfasciata I9 I9.23S 鲈形目 黄纹拟鲈 Parapercis xanthozona I9 I9.24S 鲈形目 尖牙鲈 Synagrops japonicus I9 I9.25S 鲈形目 水珍鱼 Argentina kagoshimae -
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