罗非鱼无乳链球菌ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除菌株的构建及其特性分析

马艳平, 郝乐, 冯国清, 梁志凌, 马江耀, 柯浩, 刘振兴

马艳平, 郝乐, 冯国清, 梁志凌, 马江耀, 柯浩, 刘振兴. 罗非鱼无乳链球菌ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除菌株的构建及其特性分析[J]. 南方水产科学, 2022, 18(4): 76-86. DOI: 10.12131/20210246
引用本文: 马艳平, 郝乐, 冯国清, 梁志凌, 马江耀, 柯浩, 刘振兴. 罗非鱼无乳链球菌ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除菌株的构建及其特性分析[J]. 南方水产科学, 2022, 18(4): 76-86. DOI: 10.12131/20210246
MA Yanping, HAO Le, FENG Guoqing, LIANG Zhiling, MA Jiangyao, KE Hao, LIU Zhenxing. Construction and characterization research of essA, essB and essC-deleted mutants in Streptococcus agalactiae from tilapia[J]. South China Fisheries Science, 2022, 18(4): 76-86. DOI: 10.12131/20210246
Citation: MA Yanping, HAO Le, FENG Guoqing, LIANG Zhiling, MA Jiangyao, KE Hao, LIU Zhenxing. Construction and characterization research of essA, essB and essC-deleted mutants in Streptococcus agalactiae from tilapia[J]. South China Fisheries Science, 2022, 18(4): 76-86. DOI: 10.12131/20210246

罗非鱼无乳链球菌ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除菌株的构建及其特性分析

基金项目: 广东省自然科学基金项目 (2021A1515010498);广东省农业科学院水产研究中心课题 (XT202232);佛山市财政专项资金—2021年度共建广东农业科技示范市项目
详细信息
    作者简介:

    马艳平  (1984—),女,副研究员,博士,从事水产病害与防控研究。 E-mail: mayanping@gdaas.cn

    通讯作者:

    刘振兴 (1981—),男,副研究员,博士,从事水产病害与防控研究。 E-mail: liuzhenxing@gdaas.cn

  • 中图分类号: S 943.116.42

Construction and characterization research of essA, essB and essC-deleted mutants in Streptococcus agalactiae from tilapia

  • 摘要: VII型分泌系统存在于无乳链球菌 (Streptococcus agalactiae) 中,其组成膜蛋白对底物蛋白的分泌转运至关重要。为此利用热敏型自杀质粒,构建了含氯霉素筛选标签的膜蛋白重组敲除载体pSET4s-ΔessA、pSET4s-ΔessB、pSET4s-ΔessC,经同源重组后,利用PCR技术筛选到了其缺失突变株-无乳链球菌ΔessA、ΔessB、ΔessC。通过菌株生长曲线分析,ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株均较野生株 (WT) 生长过程变慢,其中ΔessA、ΔessB敲除株在生长早期有显著性差异 (P<0.01)。对ESAT6蛋白分泌影响分析显示,与WT株相比,ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株ESAT6的表达量均显著下调 (P<0.01)。结果显示,ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株均较WT株毒力显著降低 (P<0.01)。研究表明,essA、essB、essC为无乳链球菌VII型分泌系统重要的膜蛋白,其基因缺失造成了分泌蛋白ESAT6 mRNA表达水平下降,影响了菌株毒力。
    Abstract: The membrane proteins are critical to substrate protein secretion in VII secretion system existing in Streptococcus agalactiae. In this study, we constructed the membrane proteins knockout vectors with chloramphenicol tag including pSET4s-ΔessA, pSET4s-ΔessB and pSET4s-ΔessC, and after the homologous recombination, we screened the mutant S. agalactiae ΔessA, ΔessB and ΔessC via PCR assays. Based on the growth curve analysis, S. agalactiae ΔessA, ΔessB and ΔessC strains showed significantly slower growth process than the wild type strain (WT). ΔessA and ΔessB strains had significant difference in early stage of growth compared with WT strain (P<0.01). According to the secretion product analysis of ESAT6 protein, S. agalactiae ΔessA, ΔessB and ΔessC strains showed significantly lower ESAT6 product than WT (P<0.01). According to challenge test analysis, the deletion of essA, essB or essC gene significantly reduced virulence of S. agalactiae ΔessA, ΔessB and ΔessC compared with WT (P<0.01). The results suggest that essA, essB and essC proteins are important component membrane proteins of VII secretion system in S. agalactiae, and these genes deletions cause ESAT6 mRNA expression and virulence decline.
  • 刀额新对虾(Metapenaeus ensis)隶属于节肢动物门、甲壳纲、十足目、对虾科、新对虾属[1-2]。新对虾属是南海海域经济虾类中最重要的属,既是捕捞种类,也是养殖品种[3]。刀额新对虾是南海海域新对虾属中重要的经济种,资源量丰富、分布广、繁殖期长[2],是南海海域虾拖网的主要捕捞对象,渔汛旺期其产量占虾拖网虾类总产量的50%以上[4-5]。由于虾拖网网囊网目尺寸小、选择性差,导致捕获的刀额新对虾幼虾比例较高,有时甚至高达90%[5],严重影响虾资源的合理利用。因此,有必要对南海海域虾拖网的网囊进行优化设计,以降低对刀额新对虾幼虾的捕捞比例,减少捕捞作业对渔业资源补充群体的不良影响。

    明确拖网网囊对主要捕捞种类的选择性是渔具管理、渔具优化和资源利用的基础[6-7]。目前,已对南海海域刀额新虾进行过食性、营养级和群体形态学等方面的专题研究[8-9];关于网囊对刀额新对虾的选择性有过少量报道[10-12],但是关于虾拖网网囊网目对刀额新对虾选择性的系统、专题研究尚未见报道。本文在整理和总结南海海域虾拖网网囊系列选择性试验数据的基础上,专题开展网囊对刀额新对虾的选择性研究,为南海海域刀额新对虾资源的合理利用和虾拖网渔具的设计优化提供科学依据。

    试验于2014—2017年分4个航次进行(表1),船名分别为“粤阳东渔12057”(船长16 m、主机功率79 kW)和“粤阳东渔12081”(船长21 m、主机功率98 kW)。试验区域为南海区近海渔场,经纬度范围为112°03'E~112°22′E、21°37'N~21°50′N,水深6~13 m,底质为沙泥。

    表  1  网囊选择性试验基本信息
    Table  1  Basic information of tested codends
    航次
    trial
    时间
    time
    网囊
    codend
    试验渔船
    vessel
    方法
    method
    网目内径/mm
    mesh opening
    网囊规格 (圆周×纵向)
    codend specification
    (circumferernce×vertical)
    有效网次
    valid haul
    12014.08D25粤阳东渔 12057YYDY12057套网法 covered21.10±0.9358×606
    12014.08D30粤阳东渔 12057YYDY12507套网法 covered26.64±0.7348×508
    22015.08S35+D18粤阳东渔 12081YYDY12081套网法 coveredS: 32.70±0.63
    D: 15.07±0.36
    S: 29×43,D: 80×428
    32016.08S25+D25粤阳东渔 12081YYDY12081套网法 coveredS: 21.80±0.42
    D: 21.80±0.42
    S: 40×60,D: 58×3011
    32016.08S30+D25粤阳东渔 12081YYDY12081套网法 coveredS: 27.14±0.45
    D: 21.80±0.42
    S: 35×50,D: 58×3012
    32016.08S35+D25粤阳东渔 12081YYDY12081套网法 coveredS: 32.42±0.18
    D: 21.80±0.42
    S: 29×43,D: 58×3010
    42017.09S35+D25粤阳东渔 12081YYDY12081裤网法 trouserS: 32.42±0.18
    D: 21.80±0.42
    S: 23×29,D: 81×2011
    42017.09S35+D30粤阳东渔 12081YYDY12081裤网法 trouserS: 32.42±0.18
    D: 27.14±0.45
    S: 23×29,D: 67×1710
    42017.09S35+D35粤阳东渔 12081YYDY12081裤网法 trouserS: 32.42±0.18
    D: 32.42±0.18
    S: 23×29,D: 58×148
    合计 total84
     注:S. 方形网目;D. 菱形网目
     Note: S. square mesh; D. diamond mesh
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    试验网具为南海区最常见的双桁杆虾拖网(以下简称虾拖网),其原主尺度为10.50 m×7.15 m(2.2 m)。关于虾拖网的结构特征、渔法特点和渔获组成等信息,可参阅相应的参考文献[5,13-14]

    2014—2017年,采用套网法和裤式拖网法(简称裤网法)依次对2组菱目网囊和6组菱目与方目混合网囊(简称混目网囊)进行了84个有效网次作业试验(表1)。套网法的试验网囊拉直长度约为1.5 m;裤网法试验网囊和对照网囊的拉直长度约为1.2 m。

    试验网囊的网目尺寸分4档:18 mm、25 mm、30 mm和35 mm。其中18 mm是南海海域虾拖网普遍使用的网囊网目尺寸;25 mm为现行虾拖网管理规定中的网囊最小网目尺寸;30 mm和35 mm为试验网网囊尺寸。按照网目尺寸对网囊进行编号,例如D30表示网目尺寸为30 mm的菱目网囊;S30+D25表示方目段网目尺寸为30 mm,菱目段网目尺寸为25 mm的混目网囊。套网法试验中套网的网目尺寸为15 mm,内径为(12.55±0.28) mm,圆周286目,纵向136目。裤网法中对照网囊第一段网目尺寸为24 mm,第二段为22 mm;对照网囊第二段网目内径为(19.49±0.63) mm。试验网具和网囊的具体参数详见表1图1图2

    图  1  套网法网囊选择性试验渔具网衣展开图
    Fig. 1  Schematic diagram of trawl and tested codends with covered codend method
    图  2  裤网法网囊选择性试验渔具网衣展开图
    Fig. 2  Schematic diagram of trawl and tested codends with trouser trawl method

    为了方便操作,将试验网设置于渔船船首方向右舷第一顶网处。试验中不设置站点,也不规定渔船的拖曳速度、时间等作业参数,由船长根据实际情况控制,使试验尽量与传统虾拖网渔船作业保持一致。试验期间渔船拖速2.2~2.7 kn,网次作业时间1.5~3.5 h,平均1.75 h,网次平均拖曳距离9.01 km。

    起网后,分别称量试验网囊和套网(或对照网囊)的渔获总质量,然后进行分类和鉴定,统计每个种类的渔获数量,并进行生物学测量。当刀额新对虾渔获数量≤50尾时,全部测量其长度;当渔获数量>50尾时,随机抽取50尾进行长度测量。在统计渔获种类的体长分布时,对于取样种类按取样比例进行加权处理。为了保证试验数据的准确性,尽量避免渔获物的2次取样。

    以航次为单位统计虾拖网网囊和套网(或对照网囊)的渔获总数和总质量,分别计算各网囊刀额新对虾的数量和质量比例。将每个网次中网囊和套网(或对照网囊)的刀额新对虾体长数据进行排序,以5 mm为单位进行分组,分别统计各体长组刀额新对虾的数量。

    网囊对刀额新对虾的选择性估算按如下2个步骤进行:1)以网次为单位,使用Logistic曲线进行选择性模型拟合,估算网次选择性参数;2)将选择性模型拟合度较好的网次体长数据进行叠加,再次使用Logistic曲线进行选择性模型拟合,估算网囊对刀额新对虾的平均选择性参数,同时考虑网囊网次间差异对选择性的影响。

    选择性参数的估算是在SELECT模型[6,15-18]的框架下,通过比较试验网囊和套网(或对照网囊)的刀额新对虾渔获数量,得到估算结果。在第i网次中,用NTij表示体长为lj的刀额新对虾被试验网囊捕获的数量,用NCij表示套网(或对照网囊)中刀额新对虾(体长亦为lj)的渔获数量,则体长为lj的刀额新对虾被试验网囊捕获的概率(φij)可表示为:

    $${{\textit{φ}} _{ij}} = \frac{{{N_{Tij}}}}{{{N_{Tij}} + {N_{Cij}}}}$$ (1)

    对于套网法试验,使用logistic方程拟合试验网囊对体长为l的刀额新对虾的选择率r(l),其计算公式为:

    $$r(l) = \frac{{\exp(a + bl)}}{{1 + \exp(a + bl)}}$$ (2)

    式中ab为待估参数。

    对于裤网法试验,引入相对作业强度(p),表示1尾刀额新对虾进入试验网囊的概率,则进入对照网囊的概率为1−p。体长为l的刀额新对虾被试验网囊捕获的概率可表示为:

    $$\varphi(l) = \frac{{p\exp(a + bl)}}{{(1 - p) + \exp(a + bl)}}$$ (3)

    根据选择性参数ab,计算试验网囊对刀额新对虾的选择性指标50%选择体长(L50)和选择范围(SR),相应的计算公式为:

    $${L_{50}} = - a/b$$ (4)
    $${\rm SR} = {L_{75}} - {L_{25}} = 2\ln 3/b$$ (5)

    通过极大似然法估算选择性参数abp,其似然方程[7]为:

    $$L(a,b,p) = \sum\limits_i {\sum\limits_j {[{N_{Tij}}\ln \varphi({l_j}) + {N_{Cij}}\ln(1 - \varphi({l_j}))]} } $$ (6)

    式(6)的求解通过MS-Excel的“规划求解”功能实现[19-20]。参数abp和选择性指标L50、SR的标准差通过Delta方法估算[6,17,21]

    选择性模型拟合度的优劣可根据残差值(deviance)和自由度(degree of freedom, df )的大小关系判断。通常当残差值小于自由度(P>0.05),则认为模型拟合度为优。但当试验数据呈离散分布时,即使拟合度为优也会出现残差值远大于自由度(P<0.05)的情况。这时需要根据各体长组的实际残差值分布图作进一步判断[6,12,22]

    通过比较联合网次模型拟合的皮尔逊卡方统计量(Q)和自由度(d)的大小来判断网囊选择性是否存在网次间差异。当不存在网次间差异时,Q服从自由度为d的卡方分布(P>0.05),反之则说明存在网次间差异[6,17,21-25]。如果存在网次间差异,计算过度离散叠加估算值(replication estimate of dispersion, REP),并对联合网次估算的选择性参数标准差进行修正,即乘以(REP)1/2Q和REP的计算公式为:

    $$Q = \sum\limits_l {\sum\limits_h {\frac{{{{(n_{lt}^h - n_{l + }^h{y_l})}^2}}}{{n_{l + }^h{y_l}{{(1 - {y_l})}^{}}}}} } $$ (7)

    式中$n_{lt}^h$表示第h网次中试验网囊捕获的体长为l的刀额新对虾数量,$n_{l + }^h$表示第h网次中试验网囊与套网(或对照网囊)捕获的体长为l的刀额新对虾总数量,yl表示h网次中试验网囊捕获的体长为l的刀额新对虾的数量比例。

    $${\rm REP} = \frac{Q}{d}$$ (8)

    式中d=(H−1)×体长组数,H为联网次的总网次数。

    试验渔获质量为294.68 kg,刀额新对虾总渔获质量为100.71 kg,占渔获总质量的34.18%。各试验网囊中的总渔获质量及刀额新对虾所占比例详见表2

    表  2  试验渔获产量基本信息
    Table  2  Basic information of fish catch
    方法
    method
    网囊
    codend
    质量/kg mass质量百分比/%
    ratio of mass
    刀额新对虾
    M. ensis
    总渔获
    total catch
    套网法 coverD258.8027.9231.50
    D3013.4345.0129.83
    S35+D189.5028.5333.28
    S25+D2515.3623.3665.77
    S30+D254.9433.6114.70
    S35+D2520.1337.6053.53
    裤网法 trouserS35+D2518.4732.4756.89
    S35+D307.1842.9116.73
    S35+D352.9223.2712.53
    合计 total100.73294.6834.18
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    试验中刀额新对虾的渔获总数量为14 138尾,各网囊和套网(或对照网囊)的数量、体长范围、众数体长及其比例等数据详见表3,体长分布见图3图4

    表  3  刀额新对虾的渔获数量及体长分布
    Table  3  Number of M. ensis caught by each codend
    网囊
    codend
    渔获尾数
    number of catch
    体长范围/mm
    length range
    众数体长/mm
    modal length
    网囊
    codend
    套网/对照网
    cover/control
    网囊
    codend
    套网/对照网
    cover/control
    网囊
    codend
    套网/对照网
    cover/control
    D25964253~12333~5888~93 (38.38%)
    D301 698353~11353~6383~88 (51.94%)
    S35+D181 8102863~12863~9878~83 (37.07%)73~78 (67.86%)
    S25+D252 30738458~10328~9378~83 (48.63%)43~48 (39.84%)
    S30+D254993363~10363~9883~88 (46.49%)73~78 (42.42%)
    [S35+D25]13 00811758~11828~9878~83 (41.42%)73~78 (42.74%)
    [S35+D25]21 1211 36663~13363~13383~88 (58.25%)83~93 (65.37%)
    S35+D3028327063~13373~13393~103 (55.83%)93~103 (60.00%)
    S35+D3511313263~12868~13393~98 (47.79%)93~98 (46.97%)
    合计 total11 8032 335
     注:[S35+D25]1. 套网法中的S35+D25网囊;[S35+D25]2. 裤网法中的S35+D25网囊
     Note: [S35+D25]1. the S35+D25 codend for the covered codend method; [S35+D25]2. the S35+D25 codend for the trouser trawl method
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    图  3  套网法选择性试验各网囊捕捞刀额新对虾的体长分布
    Fig. 3  Length distribution of M. ensis caught by each codend with covered codend method
    图  4  裤网法选择性试验各网囊捕捞刀额新对虾的体长分布
    Fig. 4  Length distribution of M. ensis caught by each codend with trouser trawl method

    D25和D30网囊由于套网的刀额新对虾样本量过少,无法进行选择性分析;S35+D18网囊仅1个单网次数据获得有效解,模型的拟合度较好(P>0.05),刀额新对虾的L50和SR分别为51.25 mm和16.48 mm;S25+D25网囊共5个单网次数据获得有效解,网次数据拟合度均较好(P>0.05),联合网次拟合度P<0.05,但模型残差值分布正常,所以认为是由于体长数据的过度离散分布造成,联合网次估算的刀额新对虾平均L50和SR分别为60.84 mm和14.31 mm,存在网次间差异,对估算参数的标准差进行了修正;S30+D25网囊仅2个单网次数据获得有效解,单网次和联合网次拟合度较好(P>0.05),联合网次估算的刀额新对虾平均L50和SR分别为63.21 mm和12.84 mm,不存在网次间差异;S35+D25网囊共5个单网次数据获得有效解,1个单网次和联合网次拟合的P<0.05,但模型残差值分布正常,联合网次估算的刀额新对虾平均L50和SR分别为64.53 mm和9.75 mm,存在网次间差异,对估算参数的标准差进行了修正(表4)。各网囊对刀额新对虾的平均选择性曲线详见图5

    表  4  套网法选择性试验参数估算
    Table  4  Selective parameters of tested codends with covered codend method
    时间
    time
    网囊
    codend
    网次
    NH
    选择性指标
    selective index
    选择性参数
    selective parameter
    拟合度
    goodness of fit
    网次间差异
    estimate of REP
    尾数
    number
    L50/
    mm
    SDSR/
    mm
    SDaSDbSDDdfPQdPREP网囊
    codend
    套网
    cover
    2014D25c-b9642
    2014D30c-b1 6983
    2015S35+D18951.258.9416.487.20–6.834.140.130.064.29580.8320311
    2016S25+D25259.655.8421.517.41–6.092.660.100.045.91970.5513724
    453.8912.6850.4426.94–2.351.790.040.0210.60870.1612044
    653.317.7930.9611.92–3.781.980.070.036.28390.7112731
    960.861.196.051.07–22.124.210.360.0614.094140.4436764
    1060.941.705.181.21–25.846.390.420.102.288141.0027875
    c-b60.841.7414.311.90–9.341.440.150.0251.61714<0.05155.9439<0.054.001 029238
    S30+D25461.487.8911.786.01–11.477.250.190.109.811100.461064
    563.183.4713.933.23–9.972.800.160.048.82260.1823317
    c-b63.212.9712.842.66–10.822.700.170.043.65790.9320.22210.510.9634221
    S35+D25166.161.223.560.89–40.8610.770.620.157.000110.8044316
    568.581.617.761.83–19.424.920.280.079.94660.1318817
    762.433.459.002.31–15.254.700.240.0622.1664<0.0535615
    865.193.1010.642.78–13.464.110.210.0514.34370.0527918
    971.903.5514.865.32–10.634.200.150.055.30360.514012
    c-b64.531.159.751.00–14.541.720.230.0237.4416<0.0572.31710.431.021 30678
     注:NH. 网次;c-b. 联合网次;L50. 50%选择体长;SR. 选择范围;ab. 选择性参数;SD. 标准差;D. 残差值;dof和d. 自由度;Q. 皮尔逊卡方统计量;REP. 过度离散叠加估算值.  Note: NH. number of hauls; c-b. combined hauls; L50. 50% retention length; SR. selection range; a and b are selective parameters; SD. standard error; D. value of model deviance; dof and d indicate the degree of freedom; Q. Pearson chi-square statistic; REP. replication estimation of dispersion
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    图  5  套网法混目网囊对刀额新对虾的平均选择性曲线
    Fig. 5  Mean selective curves of tested codends for M. ensis with covered codend method

    S35+D25网囊共8个单网次数据获得有效解,4个单网次和联合网次拟合的P<0.05,但模型残差值分布正常,联合网次估算的刀额新对虾平均L50、SR和相对作业强度(p)分别为75.43 mm、6.93 mm和0.51,存在网次间差异,对选择性参数的标准差进行了修正;S35+D30网囊共5个单网次数据获得有效解,单网次和联合网次的拟合度较好(P>0.05),联合网次估算的刀额新对虾平均L50、SR和p分别为82.38 mm、6.39 mm和0.52,不存在网次间差异;S35+D35网囊共4个网次获得有效解,所有单网次和联合网次估算的拟合度均较好(P>0.05),联合网次估算的刀额新对虾平均L50、SR和p分别为95.39 mm、20.44 mm和0.64,不存在网次间差异(表5)。各网囊对刀额新对虾的平均选择性曲线详见图6

    表  5  裤网法选择性试验参数估算
    Table  5  Selective parameters of tested codends with trouser trawl method
    时间
    time
    网囊
    codend
    网次
    NH
    选择性指标
    selective index
    选择性参数
    selective parameter
    拟合度
    goodness of fit
    网次间差异
    estimate of REP
    尾数
    number
    L50/mmSDSR/mmSDaSDbSDPSDDdfPQdPREP网囊
    codend
    对照
    control
    2017S35+D25278.163.153.744.45–45.8853.610.590.700.410.078.26290.512443
    375.353.037.174.69–23.0814.440.310.200.460.078.96860.1855101
    473.521.403.452.58–46.7734.530.640.480.410.0339.62510<0.05149244
    678.467.907.466.76–23.1219.450.290.270.770.1010.982100.362812
    772.795.326.927.07–23.1222.960.320.320.510.069.76680.285457
    875.982.388.553.66–19.527.890.260.110.540.0447.5316<0.05244288
    973.521.474.223.61–38.3232.460.520.450.510.0329.7207<0.05182193
    1185.594.7410.743.67–17.515.220.200.070.730.0825.51710<0.05116108
    c-b75.431.366.932.14–23.937.090.321.000.510.0353.55912<0.05152.0081<0.051.888521046
    S35+D30178.846.407.688.90–22.5725.180.290.330.650.0815.36180.053020
    586.794.966.926.25–27.5624.110.320.290.500.079.579110.573948
    781.183.615.014.56–35.6031.570.440.400.440.0512.484110.336290
    888.475.7011.327.00–17.179.820.190.120.600.0814.706110.206465
    992.098.499.807.41–20.6414.180.220.170.710.145.98680.652319
    c-b82.382.016.392.72–28.3211.680.340.150.520.0314.30880.0744.21500.700.88218242
    S35+D35183.597.528.729.18–21.0621.320.250.270.550.1010.743100.382324
    292.138.379.629.67–21.0319.670.230.230.650.146.20070.522422
    3110.7831.9720.4319.45–11.918.420.110.100.770.296.39790.701719
    5100.5237.5829.7831.29–7.425.580.070.080.650.3010.246110.513647
    c-b95.3910.4320.4410.51–10.254.440.110.060.640.1111.599110.3922.73340.930.67100112
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    图  6  裤网法混目网囊对刀额新对虾的平均选择性曲线
    Fig. 6  Mean selective curves of tested codends for M. ensis with trouser trawl method

    目前,南海海域传统虾拖网均使用菱目网囊作业,且其网目尺寸较小(一般<20 mm)。据相关调查,当虾拖网网囊网目尺寸为18 mm时,刀额新对虾的幼虾比例>70%[5]。本研究2014年对菱目网囊D25和D30进行试验,结果表明对于刀额新对虾而言,网目尺寸增大,网囊选择性未见显著提高。由于套网的样本量太少,上述2种菱目网囊对刀额新对虾的选择性参数也无法估算。

    鉴于菱目网囊选择性差的结论,2015年研究团队首次尝试使用混目网囊(S35+D18)进行试验;该混目网囊菱目段网目尺寸与渔船所用网囊一致(18 mm),方目段网目尺寸为35 mm。结果表明,副渔获物(鱼类)的逃逸率显著提高,但目标种类的逃逸率仍然较低;刀额新对虾的L50太小(53.85 mm),远小于南海区刀额新对虾的首次性成熟体长(80 mm)[26],网囊网目尺寸需要进一步优化[11]。本研究采用的是单网次数据处理方法,得出S35+D18网囊对刀额新对虾的L50仅为51.52 mm,小于联合网次数据处理得到的值。此结论也进一步说明S35+D18网囊的网目尺寸需要进一步放大。

    2016年使用3组混目网囊(S25+D25、S30+D25和S35+D25)进行试验,网囊菱目段网目尺寸均为25 mm,方目段网目尺寸分别为25 mm、30 mm和35 mm。根据前期联合网次分析法的结果,S25+D25和S35+D25网囊对刀额新对虾的L50分别为63.93 mm和67.96 mm; S30+D25网囊的刀额新对虾体长组数据不收敛,无法取得有效解[12]。本研究得出的S25+D25、S30+D25和S35+D25网囊对刀额新对虾的平均L50分别为60.84 mm、63.21 mm和64.53 mm。使用本研究的数据处理方法能够获得S30+D25网囊对刀额新对虾的选择性。这从侧面说明了如果在数据处理时完全忽略网囊的网次间差异,简单地将所有网次的体长组数据进行无条件叠加处理可能会得到错误的结论。本试验采用“2部曲”(two-step procedure)法:先以网次为单位进行数据处理,然后根据模型的拟合结果将一些网次数据剔除,在考虑网囊网次间差异的基础上叠加网次数据,求得平均选择性。这种数据处理方法得出的结论更加准确、客观和科学,国外一些相关研究也普遍采用这种方法进行数据处理[27-29]

    2017年,笔者课题组对3组混网囊(S35+D25、S35+D30和S35+D35)进行试验。此次网目尺寸的选择是以2014—2016年试验结论为基础,将方目段网目尺寸保持为35 mm,菱目段网目尺寸分别为25 mm、30 mm和35 mm。同时,为了避免套网法的“覆盖效应”,在试验方法上首次尝试采用目前国际上普遍使用的裤网法。根据试验结果,S35+D25、S35+D30和S35+D35网囊对刀额新对虾的平均L50随菱目段网目尺寸的增大而不断增大,SR则是先减少后增大,p不断增大。根据陈丕茂[26]的研究,南海区刀额新对虾的首次性成熟体长为80 mm。假设将刀额新对虾的可捕规格定为80 mm,所有试验网囊中仅S35+D30和S35+D35网囊的L50大于该可捕标准。但是,S35+D30网囊对刀额新对虾的SR远小于S35+D35的(6.39 mm vs 20.44 mm),说明S35+D30网囊的选择性尖锐度较好。另外,考虑到网目尺寸过大会影响到渔船的生产效益,同时兼顾渔民的心理接受程度,笔者认为将S35+D30网囊作为南海区虾拖网网囊最小网目尺寸标准较为理想。

    本研究中的试验数据均在渔船上即时收集。由于网次间间隔短,测量时间有限,对于渔获数量较多的种类(>50尾),先统计该种类的总数量后,随机抽取50尾渔获进行体长测量。选择性数据处理时,以随机测量的50尾体长数据为基础,按照相应的取样比例进行加权处理,最后得出网次渔获种类的体长分布数据。但有些前期的研究则直接使用实测体长组数据进行选择性参数估算[12,15-16]。使用实测体长组数据和加权处理后的数据进行估算的结果是否存在显著差异?哪个方法计算的结果更加准确和科学?这将是未来的一个研究方向。

    本研究存在的不足之处在于4个航次试验存在一定的时空差异。虽然网囊对刀额新对虾的选择性主要由网囊结构、网目尺寸和刀额新对虾的体型特征决定,但是为了减少时空差异对选择性研究的影响,今后可尝试将所有试验网囊在同一渔场、同一渔船和同一网次进行试验。南海区虾拖网通常是一船拖曳多顶网具。比如,本研究中租用的“粤阳东渔12081”作业中拖曳12顶网,一些大功率渔船甚至最多可拖曳32顶网。利用南海区虾拖网这种独特的作业方式,可将本研究中的所有试验网囊共同进行试验。同时,在试验方法上也可以将套网法、裤网法等进行有机结合,优势互补,相互印证。这样获得的试验数据会更加全面,得出的结论能够更好地为渔具管理和渔业资源的合理利用提供科学依据。

  • 图  1   essAessBessC同源臂融合PCR结果

    Figure  1.   Overlap extension PCR results of essA, essB, essC homologous arms

    图  2   敲除株ΔessA、ΔessB、ΔessC DNA水平PCR鉴定结果

    Figure  2.   PCR identification results of ΔessA, ΔessB, ΔessC knockout strains at DNA level

    图  3   敲除株ΔessA、ΔessB、ΔessC RNA水平PCR鉴定结果

    Figure  3.   PCR identification of ΔessA, ΔessB and ΔessC knockout strains at RNA level

    图  4   敲除菌株ΔessA、ΔessB、ΔessC 生长曲线测定结果

    Figure  4.   Growth curve of ΔessA, ΔessB and ΔessC knockout strains

    图  5   ESAT6 qPCR检测方法的建立

    注:a. 扩增效率分析结果;b. 熔解曲线分析结果; c. 扩增产物琼脂糖凝胶检测结果。

    Figure  5.   qPCR detection method of ESAT6 gene

    Note: a. Amplification efficiency analysis result; b. Melt curve analysis result; c. Amplification product detection result based on agarose gel.

    图  6   敲除株ΔessA、ΔessB、ΔessC 与野生株对底物蛋白ESAT6表达量的影响结果

    注:**. 差异显著 (P<0.01)。

    Figure  6.   Effect of substrate protein ESAT6 expression by knockout strains ΔessA, ΔessB, ΔessC and WT strain

    Note: **. Significant difference (P<0.01).

    图  7   敲除菌株ΔessA、ΔessB、ΔessC 与野生株毒力试验结果

    Figure  7.   Virulence test of ΔessA, ΔessB, ΔessC knockout strains and WT strain

    图  8   攻毒死亡鱼解剖及其菌株鉴定结果

    注:a. 攻毒死亡鱼解剖症状;b. 攻毒分离菌株革兰氏染色结果;c. 攻毒分离菌株 PCR 鉴定结果。

    Figure  8.   Anatomical symptom result and identification of strains of infected dead tilapia

    Note: a. Anatomical symptom result of infected dead tilapia; b. Gram staining result of isolated strain after infection; c. PCR identification of isolated strain after infection.

    表  1   试验用引物

    Table  1   Primers in this study

    引物名称 Primer name引物序列 Primer sequence 5'−3'
    重组质粒构建用引物 Primers for recombinant plasmid construction
     essAup-FBamHI5'-GCGGATCCGCCGTAGGCACAGTAGCGACT-3' BamHI
     essAup-R5'-GAGTGAGACTTTAGATTGACGG-3'
     essAdown-F5'-ACGTTGAGCCTCGGAACCCATCGAATTAGAATACACATATTAACATTACT-3'
     essAdown-REcoRI5'-GCGAATTCGATAGAGCGTGCGCTTCTGTCTG-3' EcoRI
     essBup-FBamHI5'-GCGGATCCGGACCAGATTTTTGGCAGTTATC-3' BamHI
     essBup-R5'-CAGCCTGAATAGTTTCTGCATGAT-3'
     essBdown-F5'-GACGTTGAGCCTCGGAACCCATCGAATTATAAAGTTGATTATAATCAAGTGA-3'
     essBdown-REcoRI5'-GCGAATTCAGAAGATGTACTTGTTGTAGTAC-3' EcoRI
     essCup-FSalI5'-GCGTCGACAAACGGCAAGTCGCCAATACCAG-3' SalI
     essCup-R5'-TGCTGACTCCAATCATCACTAG-3'
     essCdown-F5'-GACGTTGAGCCTCGGAACCCATCGAATTACAGGAAATGGCTGATACTTATCAC-3'
     essCdown-REcoRI5'-GCGAATTCTTAACTTTTCATCAGTTACAAT-3' EcoRI
     Cat(essA)-F5'-ATGAAAACCGTCAATCTAAAGTCTCACTCCACCGAACTAGAGCTTGATG-3'
     Cat(essB)-F5'-TATCATGCAGAAACTATTCAGGCTGCACCGAACTAGAGCTTGATGAAAA-3'
     Cat(essC)-F5'-CCTCCTCTAGTGATGATTGGAGTCAGCACACCGAACTAGAGCTTGATGAA-3'
     Cat-R5'-TAATTCGATGGGTTCCGAGGCTC-3'
    基因缺失突变株筛选所用引物 Primers for gene deletion mutant strains screening
     essA验证-F5'-GCCGTAGGCACAGTAGCGACTG-3'
     essA验证-R5'-ACATTCAAGGCTAATCGTAA-3'
     essB验证-F5'-TGGAAACAGATTCGTTTGTA-3'
     essB验证-R5'-TACCTACTTTTAGTTTTAG-3'
     essC验证-F5'-CGTCCTCGTGGTATCTATATC-3'
     essC验证-R5'-CAATATCATCCTGACCACGTAAG-3'
     essA-F5'-ATGAAGTTGAAACGATTTTTAG-3'
     essA-R5'-TTAATATGTGTATTCATCCT-3'
     essB-F5'-TGGAAACAGATTCGTTTGTA-3'
     essB-R5'-TACCTACTTTTAGTTTTAGA-3'
     essC-F5'-TCGTGGTATCTATATCATTGCAAC-3'
     essC-R5'-GATAAACAATATCATCCTGACCAC-3'
    Real-time PCR所用引物 Primers for real-time PCR
     ESAT6-F5'-ATACTGCTGGTTCTCAACAA-3'
     ESAT6-R5'-GTCAATAACTGCTTGCTCTT-3'
     16S-rRNA-F5'-CGACGATACATAGCCGACC-3'
     16S-rRNA-R5'-CCGTCACTTGGTAGATTTTCC-3'
    注:下划线为限制性内切酶位点。 Note: The underlined are restriction endonuclease sites.
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  • 收稿日期:  2021-08-25
  • 修回日期:  2021-12-13
  • 录用日期:  2021-12-20
  • 网络出版日期:  2022-02-05
  • 刊出日期:  2022-08-04

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