无乳链球菌 (Streptococcus agalactiae) 属于B族链球菌 (GBS)，宿主范围广泛，能感染人类、哺乳动物、爬行动物和鱼类等，对全球公共卫生和人体健康造成了严重的安全隐患^[1-2]。中国是罗非鱼 (Oreochromis sp.) 养殖大国，也是链球菌病高流行地区，其发病率和死亡率居高不下，居罗非鱼传染病之首，因抗生素滥用或过量添加，造成耐药率也越来越高^[3-5]。

近年来研究发现，在放线杆菌门和厚壁菌门等革兰氏阳性细菌中存在一种新型分泌系统，即VII型分泌系统 (Type 7 secretion system, T7SS)^[6-8]。VII型分泌系统由多种组分构成，分泌早期分泌性抗原靶6 (Early secretory antigenic target 6, ESAT6) 和培养滤液蛋白10 (Culture filtrate protein 10, CFP10)两种免疫原性胞外蛋白。VII型分泌系统具有改变细胞信号转导、促进细菌从巨噬细胞吞噬体逃逸、抑制吞噬体溶酶体融合、影响细胞凋亡及裂解细胞等生物学功能，与致病性密切相关^[9-10]。分枝杆菌VII型分泌系统与菌株毒力密切相关，正是由于ESAT6蛋白的缺失，才使得牛型结核菌毒力缺失，成为卡介苗。目前为止，众多研究聚焦结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis) VII型分泌系统，ESAT-6基因的缺失会导致结核分枝杆菌丧失分泌其他ESX-1分泌蛋白的能力，甚至丧失结核分枝杆菌致病性^[9]。金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)缺失ESAT6和CFP-10编码基因，造成金黄色葡萄球菌毒力下降，影响了该菌的持续感染^[11]。

无乳链球菌研究显示，ESAT6蛋白以同源二聚体形式发挥作用^[12-13]。VII型分泌系统单个基因各自编码具有特定功能的蛋白质，决定着ESAT6/CFP10及其毒力蛋白分泌转运，并与细菌的毒力和致病机制存在重要联系^[8,14-17]，因此对VII型分泌系统的研究有助于了解无乳链球菌毒力蛋白分泌机制，有助于阐明无乳链球菌的生存、增殖和扩散的分子基础，更可为寻找抗无乳链球菌基因蛋白药物的作用靶点提供关键性线索，进而为从根本上控制无乳链球菌病提供可能性。前期研究对无乳链球菌的基因组检索发现了与VII型/ESAT-6分泌系统同源性较高的基因簇，由11个基因组成的基因簇构成 (esaABCDEF、essABC、 esxAB)^[18-20]。分子生物学显示essA 、essB、essC基因编码膜蛋白，但是其功能研究还未见文献报道。

笔者课题组前期扩增到了罗非鱼无乳链球菌essA、essB、essC全长基因，生物信息学分析显示essA、essB基因编码膜蛋白，essC基因编码蛋白含有典型的FtsL-Spo III E结构，前期研究重组表达了essA、essB、essC蛋白，免疫罗非鱼后，对无乳链球菌的相对免疫保护率分别为82.57%、85.29%、91.60%，是良好的免疫原性蛋白^[21]。在此基础上，本研究以罗非鱼源无乳链球菌致病株GDZX1为研究对象，利用热敏性自杀载体pSET4S构建基因缺失突变株ΔessA、ΔessB、ΔessC，并对其生物学特性进行分析, 以揭示无乳链球菌essA、essB、essC对ESAT6蛋白mRNA表达水平、对菌株致病性的影响，以期为无乳链球菌VII型分泌系统编码基因功能研究提供理论数据。

1.   材料与方法

1.1   菌株与试验用鱼

野生型无乳链球菌强毒力菌株GDZX1 (Wild type，Serotype Ia)，由广东省农业科学院动物卫生研究所水产病害研究室分离并保存。温敏型自杀质粒pSET4S和pSET5S由日本国立动物卫生研究所Daisuke Takamatsu博士惠赠。试验用罗非鱼购自广东省罗非鱼良种场，体质量约为10 g，实验前在室内玻璃缸暂养2周，随机抽检5尾，做病原分离试验，确保试验用鱼不携带无乳链球菌病原。随机分为13组 (12个攻毒组和1个对照组)。保持溶解氧>5.0 mg·L⁻¹，每天换水，保持水质良好。试验前每天饱饲2次。

1.2   引物设计与合成

运用Oligo 7.0和Primer 6.0软件设计引物，试验用引物序列见表1，由北京擎科生物科技有限公司合成。

表  1  试验用引物

Table  1.  Primers in this study

引物名称 Primer name	引物序列 Primer sequence 5'−3'
重组质粒构建用引物 Primers for recombinant plasmid construction
essAup-FBamHI	5'-GCGGATCCGCCGTAGGCACAGTAGCGACT-3' BamHI
essAup-R	5'-GAGTGAGACTTTAGATTGACGG-3'
essAdown-F	5'-ACGTTGAGCCTCGGAACCCATCGAATTAGAATACACATATTAACATTACT-3'
essAdown-REcoRI	5'-GCGAATTCGATAGAGCGTGCGCTTCTGTCTG-3' EcoRI
essBup-FBamHI	5'-GCGGATCCGGACCAGATTTTTGGCAGTTATC-3' BamHI
essBup-R	5'-CAGCCTGAATAGTTTCTGCATGAT-3'
essBdown-F	5'-GACGTTGAGCCTCGGAACCCATCGAATTATAAAGTTGATTATAATCAAGTGA-3'
essBdown-REcoRI	5'-GCGAATTCAGAAGATGTACTTGTTGTAGTAC-3' EcoRI
essCup-FSalI	5'-GCGTCGACAAACGGCAAGTCGCCAATACCAG-3' SalI
essCup-R	5'-TGCTGACTCCAATCATCACTAG-3'
essCdown-F	5'-GACGTTGAGCCTCGGAACCCATCGAATTACAGGAAATGGCTGATACTTATCAC-3'
essCdown-REcoRI	5'-GCGAATTCTTAACTTTTCATCAGTTACAAT-3' EcoRI
Cat(essA)-F	5'-ATGAAAACCGTCAATCTAAAGTCTCACTCCACCGAACTAGAGCTTGATG-3'
Cat(essB)-F	5'-TATCATGCAGAAACTATTCAGGCTGCACCGAACTAGAGCTTGATGAAAA-3'
Cat(essC)-F	5'-CCTCCTCTAGTGATGATTGGAGTCAGCACACCGAACTAGAGCTTGATGAA-3'
Cat-R	5'-TAATTCGATGGGTTCCGAGGCTC-3'
基因缺失突变株筛选所用引物 Primers for gene deletion mutant strains screening
essA验证-F	5'-GCCGTAGGCACAGTAGCGACTG-3'
essA验证-R	5'-ACATTCAAGGCTAATCGTAA-3'
essB验证-F	5'-TGGAAACAGATTCGTTTGTA-3'
essB验证-R	5'-TACCTACTTTTAGTTTTAG-3'
essC验证-F	5'-CGTCCTCGTGGTATCTATATC-3'
essC验证-R	5'-CAATATCATCCTGACCACGTAAG-3'
essA-F	5'-ATGAAGTTGAAACGATTTTTAG-3'
essA-R	5'-TTAATATGTGTATTCATCCT-3'
essB-F	5'-TGGAAACAGATTCGTTTGTA-3'
essB-R	5'-TACCTACTTTTAGTTTTAGA-3'
essC-F	5'-TCGTGGTATCTATATCATTGCAAC-3'
essC-R	5'-GATAAACAATATCATCCTGACCAC-3'
Real-time PCR所用引物 Primers for real-time PCR
ESAT6-F	5'-ATACTGCTGGTTCTCAACAA-3'
ESAT6-R	5'-GTCAATAACTGCTTGCTCTT-3'
16S-rRNA-F	5'-CGACGATACATAGCCGACC-3'
16S-rRNA-R	5'-CCGTCACTTGGTAGATTTTCC-3'
注：下划线为限制性内切酶位点。 Note: The underlined are restriction endonuclease sites.

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1.3   基因敲除用重组载体的构建

1.3.1   essA基因敲除重组载体的构建

以提取的无乳链球菌GDZX1基因组DNA为模板，essAup-FBamHI/essAup-R引物对扩增essA基因上游同源臂，essAdown-F/essAdown-REcoRI引物对扩增essA基因下游同源臂，反应程序为98 ℃预变性5 min；98 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，35个循环；72 ℃延伸5 min。以pSET5S质粒为模板，Cat (essA)-F/Cat-R引物对扩增氯霉素表达框 (Cat)，反应程序为：98 ℃预变性5 min；98 ℃ 10 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃延伸5 min。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，将扩增的片段切胶纯化，等体积 (8 μL) 混合，进行第1轮融合PCR扩增，反应程序为：98 ℃预变性5 min；98 ℃ 15 s，62 ℃ 15 s，72 ℃ 90 s，16个循环；72 ℃延伸5 min。然后以第1轮融合后的PCR产物为模板，以essAup-FBamHI/essAdown-REcoRI为正、反向引物，进行第2轮融合PCR扩增，反应程序为98 ℃预变性5 min；98 ℃ 15 s，62 ℃ 15 s，72 ℃ 90 s，35个循环；72 ℃延伸5 min，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。

符合预期的片段切胶纯化，BamHI和EcoRI双酶切，与同样双酶切后的线性化载体pSET4s连接，连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，然后将培养物涂布在含有氯霉素 (25 μg·mL⁻¹) 和壮观霉素 (50 μg·mL⁻¹) 的LB固体平板上，37 ℃倒置培养过夜，挑取单克隆，利用essAup-FBamHI/essAdown-REcoRI引物对进行PCR鉴定，反应程序为98 ℃预变性5 min；98 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 90 s，35个循环；72 ℃延伸5 min，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，鉴定后的阳性质粒送北京擎科生物科技有限公司测序。

1.3.2   essB基因敲除重组载体的构建

以提取的无乳链球菌GDZX1基因组DNA为模板，essBup-FBamHI/essBup-R引物对扩增essB基因上游同源臂，essBdown-F/essBdown-REcoRI引物对扩增essB基因下游同源臂，反应程序为：98 ℃预变性5 min；98 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，35个循环；72 ℃延伸5 min。按1.3.1 Cat扩增程序，Cat (essB)-F/Cat-R扩增Cat表达框。按1.3.1融合PCR程序，进行第1轮融合PCR扩增，以essBup-FBamHI/essBdown-REcoRI为正、反向引物，进行第2轮融合PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。并按1.3.1重组载体构建步骤，构建并鉴定重组质粒。

1.3.3   essC基因敲除重组载体的构建

以提取的无乳链球菌GDZX1基因组DNA为模板，essCup-FSalI/essCup-R引物对扩增essC基因上游同源臂，essCdown-F/essCdown-REcoRI引物对扩增essC基因下游同源臂，反应程序为98 ℃预变性5 min；98 ℃ 10 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃延伸5 min。按1.3.1 Cat扩增程序，Cat (essC)-F/Cat-R扩增Cat表达框。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，将扩增的片段切胶纯化，等体积 (8 μL) 混合，进行第1轮融合PCR扩增。反应程序为98 ℃预变性5 min；98 ℃ 15 s，48 ℃ 15 s，72 ℃ 90 s，16个循环；72 ℃延伸5 min。然后以第1轮融合PCR产物为模板，以essCup-FSalI/essCdown-REcoRI为正、反向引物，进行第2轮融合PCR扩增，反应程序为98 ℃预变性5 min；98 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 90 s，35个循环；72 ℃延伸5 min，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。并按1.3.1重组载体构建步骤，构建并鉴定重组质粒。

1.4   基因缺失突变株的构建

参照Takamatsu等^[22]的方法，制备GDZX1株电转化感受态细胞。分别取5 μL pSET4S-ΔessA、 pSET4S-ΔessB、pSET4S-ΔessC阳性质粒分别加入到100 μL GDZX1电转化感受态细胞中，轻微混匀后将混合物加入0.2 cm电转杯内，冰浴10 min，在2.25 kV·cm⁻¹，200 Ω、25 μF电转参数下电击，迅速加入1 mL SOC培养基，30 ℃，160 rpm振荡摇动3~4 h；随后将300 μL菌液涂布于THB Spc⁺ Cm⁺平板，在30 ℃培养箱内培养48 h。挑取小菌落至Cm⁺ THB培养基上，30 ℃培养6~7 h，转37 ℃培养24 h。转移菌落分别至Cm⁺抗性和Spc⁺抗性的THB培养基中，继续培养。其中在Cm⁺抗性培养基能生长、但在Spc⁺抗性培养基不能生长的为疑似阳性菌落，继续稳定传代，PCR鉴定并测序，菌株保种至−80 ℃冰箱。

1.5   基因缺失突变株ΔessA、ΔessB、ΔessC特性分析

1.5.1   生长曲线分析

划线接种 −80 ℃冻存的无乳链球菌野生株 (WT)、ΔessA、ΔessB、ΔessC株至THB固体培养基，30 ℃培养24 h。挑取单菌落至5 mL THB液体培养基，30 ℃振摇24 h。测定各菌株光密度 (OD₆₀₀)，调整各菌株OD₆₀₀均为1.80，然后以体积比1∶100接种至100 mL THB液体培养基，30 ℃振摇，每隔2 h取样2 mL，测定OD₆₀₀，SPSS软件进行统计学分析。

1.5.2   基因缺失对ESAT6蛋白表达量的研究

1) ESAT6基因qPCR检测方法的建立：利用Primer 6.0软件，设计ESAT6 qPCR检测引物，引物序列见表1。依实验室前期构建的ESAT6-pMD18T载体为模板，测定质粒浓度，10倍梯度稀释7个梯度。分别以原液、10⁻¹、10⁻²、10⁻³、10⁻⁴、10⁻⁵、10⁻⁶稀释质粒为模板，利用Vazyme AceQ qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒，配制20 μL qPCR反应体系，其中2 × AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL，上游引物 (10 μmol·L⁻¹) 1 μL，下游引物 (10 μmol·L⁻¹) 1 μL，模板2 μL，ddH₂O 6 μL。按95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，40个循环进行qPCR反应；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s进行熔解曲线采集。

2) ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除对ESAT6蛋白mRNA表达水平影响分析：划线接种无乳链球菌WT株、ΔessA株、ΔessB株、ΔessC株至THB固体培养基，30 ℃培养24 h。挑取单菌落至5 mL THB培养基，30 ℃振摇24 h，调整OD₆₀₀=1.80后，按1∶100接种至100 mL THB液体培养基，30 ℃振摇，分别于4 、8 、12 和24 h取样5 mL，利用OMEGA RNA提取试剂盒，提取细菌RNA，并反转录成cDNA，稀释10倍，以无乳链球菌16SrRNA基因为内参基因^[23]，按95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s采集荧光，40个循环进行qPCR反应；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s进行熔解曲线的采集。以WT株为对照，2^−ΔΔCT方法计算敲除株ESAT6 mRNA相对表达量，并利用SPSS软件进行统计学分析。

1.5.3   毒力试验

取−80 ℃冻存的无乳链球菌WT株、ΔessA、ΔessB、ΔessC菌株，划线接种THB固体培养基，30 ℃培养24 h，挑取单菌落，接种THB液体培养基，30 ℃培养24 h后，适度稀释，取100 μL涂布在THB平板上，30 ℃培养24 h，计数。4株菌株均稀释至5×10⁸、5×10⁷、5×10⁶ CFU·mL⁻¹ 3个剂量，0.1 mL·尾⁻¹腹腔注射健康罗非鱼各20尾，对照组设置20尾，注射等量PBS溶液。试验鱼放置于40 cm×30 cm×40 cm的水族箱，连续充气，水温维持在27~30 ℃，每天观察死亡情况并记录，死亡罗非鱼剖解，重新划线接种分离病原菌。利用GraphPad Prism软件绘制生存率曲线，并进行显著性分析。

2.   结果

2.1   敲除载体的构建

以野生型菌株GDZX1基因组DNA为模板，采用表1引物序列，获得essA基因上游435 bp同源臂序列，下游502 bp同源臂序列；获得essB基因上游508 bp同源臂序列，下游508 bp同源臂序列；获得essC基因上游632 bp同源臂序列，下游571 bp同源臂序列。以pSET5S质粒为模板，采用表1引物序列，获得氯霉素表达框1056 bp片段。essAup片段、cat (essA)、essAdown片段，经融合PCR，获得1 993 bp的融合片段 (图1-a)；essBup片段、cat (essB)、essBdown片段，经融合PCR，获得2 072 bp的融合片段 (图1-b)；essCup片段、cat (essC)、essCdown片段，经融合PCR，获得2 259 bp的融合片段 (图1-c)。

图  1  essA、essB、essC同源臂融合PCR结果

Figure  1.  Overlap extension PCR results of essA, essB, essC homologous arms

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以此为基础，将目的片段与酶切后的pSET4S质粒连接，转化E. coli DH5α菌株，37 ℃培养过夜，挑取单克隆菌株，进行PCR鉴定，并测序验证，获得基因敲除载体，分别命名为pSET4S-ΔessA质粒、pSET4S-ΔessB质粒、pSET4S-ΔessC质粒。

2.2   敲除菌株ΔessA、ΔessB、ΔessC的筛选与鉴定

将2.1获得的pSET4S-ΔessA质粒、pSET4S-ΔessB质粒、pSET4S-ΔessC质粒电转化入野生型无乳链球菌电转化感受态中，30 ℃培养48 h，使质粒与野生型菌株发生同源重组，挑取对氯霉素具有抗性的单克隆菌株至cm⁺ THB液体培养基中，30 ℃培养6 h，转至37 ℃继续培养12 h，以此传代培养，对第9代菌株筛选到的对氯霉素具抗性的菌株，提取细菌基因组DNA，分别利用essA验证引物、essB验证引物、essC验证引物进行PCR鉴定，结果见图2。利用essA验证引物，WT株扩增到479 bp的目的片段，而疑似essA敲除株扩增到 1311 bp的目的片段，符合预期，对所获目的片段进行测序验证，essA基因插入了cat基因序列，证明敲除成功，敲除株命名无乳链球菌ΔessA (图2-a)；利用essB验证引物，WT株扩增到740 bp的目的片段，而疑似essB敲除株扩增到1702 bp的目的片段，符合预期，对所获目的片段进行测序验证，essB基因插入了cat基因序列，证明敲除成功，敲除株命名为无乳链球菌ΔessB (图2-b)；利用essC验证引物，WT株扩增到1263 bp的目的片段，而疑似essC敲除株扩增到2077 bp的目的片段，符合预期，对所获目的片段进行测序验证，essC基因插入了cat基因序列，证明敲除成功，敲除株命名为无乳链球菌ΔessC (图2-c)。

图  2  敲除株ΔessA、ΔessB、ΔessC DNA水平PCR鉴定结果

Figure  2.  PCR identification results of ΔessA, ΔessB, ΔessC knockout strains at DNA level

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在此基础上，对第9代菌株筛选到的对氯霉素具抗性的菌株，提取菌体RNA，并反转录成cDNA，利用RT-PCR技术在RNA水平上验证基因缺失突变株ΔessA、ΔessB、ΔessC。利用essA-F/essA-R引物对对ΔessA敲除菌株进行mRNA水平验证，利用essB-F/essB-R引物对对ΔessB敲除菌株进行mRNA水平验证，利用essC-F/essC-R引物对对ΔessC敲除菌株进行mRNA水平验证，结果均未扩增到目的条带，证明缺失菌株构建成功 (图3)。

图  3  敲除株ΔessA、ΔessB、ΔessC RNA水平PCR鉴定结果

Figure  3.  PCR identification of ΔessA, ΔessB and ΔessC knockout strains at RNA level

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2.3   生长曲线分析

通过测定不同时间菌液OD₆₀₀，比较ΔessA、ΔessB、ΔessC与WT株的生长速度差异，结果见图4。与WT株生长速率相比，ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株前期生长速率明显减慢，WT株在第8 小时OD₆₀₀达到1.282，在第18 小时OD₆₀₀达到1.878；而ΔessA、ΔessB在第8小时OD₆₀₀仅为0.2，在第18小时OD₆₀₀才达到1.4，生长速率明显减慢，经统计学分析，与WT株相比，0~18 h OD₆₀₀具有显著性差异 (P<0.01)；而ΔessC株与WT株相比，OD₆₀₀无显著性差异。

图  4  敲除菌株ΔessA、ΔessB、ΔessC 生长曲线测定结果

Figure  4.  Growth curve of ΔessA, ΔessB and ΔessC knockout strains

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2.4   敲除株对底物蛋白ESAT6表达量的影响结果

2.4.1   ESAT6基因qPCR检测方法的建立

以构建的ESAT6-pMD18T质粒为模板，经10倍梯度稀释，分别以原液、10⁻¹、10⁻²、10⁻³、10⁻⁴、10⁻⁵、10⁻⁶ 7个剂量质粒为模板，配制qPCR反应体系，经三步法qPCR扩增，得到ESAT6基因qPCR扩增曲线，扩增效率为95.1%，符合要求 (图5)；熔解曲线分析得出在75 ℃左右出现单峰，证明扩增产物单一；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，结果得到88 bp的特异性条带。

图  5  ESAT6 qPCR检测方法的建立

注：a. 扩增效率分析结果；b. 熔解曲线分析结果； c. 扩增产物琼脂糖凝胶检测结果。

Figure  5.  qPCR detection method of ESAT6 gene

Note: a. Amplification efficiency analysis result; b. Melt curve analysis result; c. Amplification product detection result based on agarose gel.

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2.4.2   敲除株对ESAT6蛋白mRNA表达水平的影响结果

以无乳链球菌16S rRNA基因为内参基因，在第4 、第8 、第12和第24小时，比较ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株与WT株ESAT6 mRNA表达水平差异，结果见图6。第4 、第8 、第12 小时时，相较于WT株，ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株ESAT6 mRNA表达水平均显著降低 (P<0.01)，但在第24小时，ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株ESAT6表达量与WT株无显著性差异。说明essA、essB、essC基因缺失在生长早期影响了ESAT6表达，导致ESAT6 mRNA表达水平显著性降低。

图  6  敲除株ΔessA、ΔessB、ΔessC 与野生株对底物蛋白ESAT6表达量的影响结果

注：**. 差异显著 (P<0.01)。

Figure  6.  Effect of substrate protein ESAT6 expression by knockout strains ΔessA, ΔessB, ΔessC and WT strain

Note: **. Significant difference (P<0.01).

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2.5   毒力试验

ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株与WT株分别稀释至5×10⁸、5×10⁷、5×10⁶ CFU·mL⁻¹ 3个剂量，分别对罗非鱼进行毒力试验，比较敲除株与WT株毒力差异 (图7)。各组以5×10⁸ CFU·mL⁻¹剂量0.1 mL·尾⁻¹注射攻毒，ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株累计死亡率分别为90%、90%、70%，而WT株累计死亡率为100%；各组以5×10⁷ CFU·mL⁻¹剂量0.1 mL·尾⁻¹注射攻毒，ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株累计死亡率分别为60%、90%、60%，而WT株累计死亡率为100%；各组以5×10⁶ CFU·mL⁻¹剂量0.1 mL·尾⁻¹注射攻毒，ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株累计死亡率分别为50%、50%、30%，而WT株累计死亡率为100%，经成活率曲线分析，5×10⁶ CFU·mL⁻¹剂量攻毒时，ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株累计死亡率均与WT株存在明显差异 (P<0.01)。死亡罗非鱼剖解，可见鱼体肝脏充血、腹水、眼球突出等无乳链球菌感染典型症状 (图8)，且从脑、肝、脾、肾组织取样，划线接种血琼脂平板，得到呈β溶血、针尖大小的灰白色小菌落，经革兰氏染色和PCR鉴定，为无乳链球菌。PBS组在攻毒试验期内未发现死亡。随后又对回接到各个菌株，以5×10⁸ CFU·mL⁻¹剂量，重复攻毒，结果显示，WT、ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株累计死亡率分别为100%、90%、80%、70%，证明回归试验成功。

图  7  敲除菌株ΔessA、ΔessB、ΔessC 与野生株毒力试验结果

Figure  7.  Virulence test of ΔessA, ΔessB, ΔessC knockout strains and WT strain

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图  8  攻毒死亡鱼解剖及其菌株鉴定结果

注：a. 攻毒死亡鱼解剖症状；b. 攻毒分离菌株革兰氏染色结果；c. 攻毒分离菌株 PCR 鉴定结果。

Figure  8.  Anatomical symptom result and identification of strains of infected dead tilapia

Note: a. Anatomical symptom result of infected dead tilapia; b. Gram staining result of isolated strain after infection; c. PCR identification of isolated strain after infection.

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3.   讨论

VII型分泌系统由多个膜蛋白、胞质蛋白及外分泌蛋白组成，其分泌蛋白的稳定释放依赖于VII型分泌系统不同蛋白的共同作用^[18,24]。对于VII型分泌系统的研究，结核分枝杆菌研究最为清楚地显示出膜蛋白Rv3871识别分泌蛋白ESAT-6/CFP-10复合物，与CFP-10的C端结合，并与Rv3870在细胞内膜上相互作用形成有活性的ATP酶，形成一个具有中央空洞的六环结构，分泌蛋白通过六环分泌通道分泌出胞外。跨膜蛋白可能形成了转位通道，促进分泌蛋白的分泌^[25]。

无乳链球菌感染是危害罗非鱼养殖产业最为严重的细菌性传染病，前期笔者课题组从患病罗非鱼中分离鉴定到一株高毒力菌株GDZX1^[26]，对其毒力特征和致病机制的研究亟待开展。前期研究对无乳链球菌的基因组检索发现了与VII型/ESAT-6分泌系统同源性较高的基因簇^[11-12]，由11个基因组成的基因簇构成 (esaABCDEF、essABC、esxAB)。essA、essB蛋白均为跨膜蛋白，可能对VII型分泌系统正常功能的发挥起着重要作用。essC蛋白含有典型FstK/SpoEIII结构域 (FSD)，分泌蛋白的分泌需要essC调控的ATP水解作用提供能量^[14]。本研究利用同源重组技术，构建了罗非鱼无乳链球菌essA、essB、essC缺失突变株，通过DNA水平和RNA水平鉴定，均证明缺失突变成功。并对敲除菌株的VII型分泌系统可能的编码基因进行了测序分析，均未造成VII型分泌系统其他基因的缺失或突变。对野生株和各基因敲除株进行了生长特性表型分析，证明essA、essB基因缺失明显影响了细菌的生长，证明essA和essB蛋白与细菌生长有关。随后对分泌蛋白ESAT6表达量的研究发现，essA、essB、essC基因缺失均导致了分泌蛋白ESAT6 mRNA表达水平明显下降，说明essA、essB、essC蛋白可以影响ESAT6 mRNA表达水平，对于维持无乳链球菌VII型分泌系统的完整性起着重要作用。众多研究表明，VII型分泌系统单个基因各自编码具有特定功能的蛋白质，而这些基因以单个或多个形式相互作用，使得由它们独立编码的多个蛋白质协同作用，组成一个完整的毒力蛋白分泌系统。该分泌系统决定着ESAT6/CFP10及其毒力蛋白的分泌转运，结核分枝杆菌其组分很有可能形成一个类似于细菌I型-VI型分泌系统的多重跨膜结构，酵母双杂交试验揭示，膜蛋白Rv3871识别分泌蛋白ESAT-6/CFP-10复合物，与CFP-10的C端结合，并与Rv3870在细胞内膜上相互作用形成有活性的ATP酶。分子伴侣Rv3868与Rv3870和Rv3871相互作用促进ESAT-6和CFP-10蛋白的分泌。Rv3870/Rv3871复合物形成具有活性的ATP酶，形成一个具有中央空洞的六环结构，底物分泌蛋白通过六环分泌通道分泌出胞外。膜蛋白Rv3877含有11个跨膜结构域，可能形成了位于内膜上的转位通道^[23]。本研究挖掘到无乳链球菌VII型分泌系统重要的组成蛋白essA、essB、essC，其缺失均造成了ESAT6蛋白分泌障碍，对无乳链球菌VII型分泌系统其他组成蛋白的挖掘，以及组成蛋白的相互协同关系，仍有待进一步研究。

本研究对ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株和WT株，选择3个梯度对罗非鱼进行攻毒试验，essA、essB、essC基因缺失导致了无乳链球菌毒力明显下降，ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株累计死亡率均与WT株存在明显差异 (P<0.01)，影响了菌株毒力，可能与essA、essB、essC基因缺失造成的ESAT6分泌蛋白表达量降低有关。这与金黄色葡萄球菌的报道一致，金黄色葡萄球菌VII型/ESAT6分泌系统分泌蛋白需要essA、essB和essC蛋白的协同作用^[11]，essB蛋白全缺失导致ESS系统不能分泌底物蛋白^[27]，部分缺失导致ESS系统分泌底物蛋白表达量明显降低^[28-29]，证明essB是金黄色葡萄球菌ESS分泌系统的核心组件，继而通过十二烷基麦芽糖苷萃取技术提取了金黄色葡萄球菌essB蛋白，研究发现essB蛋白与esaA、essA、essD和esxA蛋白形成聚合体，同时essC蛋白可为ATP水解作用提供能量，才能使金黄色葡萄球菌ESS分泌功能正常发挥^[15,30]，而esxA/ESAT6蛋白是金黄色葡萄球菌ESS分泌系统的分泌蛋白，与金黄色葡萄球菌毒力与脓肿形成密切相关^[27]。蟾蜍分枝杆菌 (Mycobacterium xenopi) 研究也发现相似的膜蛋白，组成ESX-5 T7SS分泌系统，与毒力密切相关^[31]。

本研究证明无乳链球菌essA、essB、essC蛋白对ESAT6分泌蛋白的分泌至关重要，维持无乳链球菌VII型分泌系统的完整性，可能是无乳链球菌VII型分泌系统的关键膜蛋白，其缺失不仅影响了ESAT6蛋白的表达，而且直接影响了菌株毒力，是潜在的无乳链球菌毒力因子。但是这些膜蛋白是如何控制分泌蛋白分泌的，是否存在蛋白之间的相互作用，膜蛋白仅控制分泌蛋白分泌还是可以自身参与入侵宿主过程，这些问题有待进一步探索研究。