两种养殖模式中草鱼土腥味特征性物质累积变化

闫莉, 李慷, KAMALAGharti Chetri, 鲁强, 徐岩, 刘如聪, 王桂香, ABDOULGadiri Sow, 刘利平

闫莉, 李慷, KAMALAGharti Chetri, 鲁强, 徐岩, 刘如聪, 王桂香, ABDOULGadiri Sow, 刘利平. 两种养殖模式中草鱼土腥味特征性物质累积变化[J]. 南方水产科学, 2022, 18(3): 147-154. DOI: 10.12131/20210167
引用本文: 闫莉, 李慷, KAMALAGharti Chetri, 鲁强, 徐岩, 刘如聪, 王桂香, ABDOULGadiri Sow, 刘利平. 两种养殖模式中草鱼土腥味特征性物质累积变化[J]. 南方水产科学, 2022, 18(3): 147-154. DOI: 10.12131/20210167
YAN Li, LI Kang, KAMALA Gharti Chetri, LU Qiang, XU Yan, LIU Rucong, WANG Guixiang, ABDOUL Gadiri Sow, LIU Liping. Cumulative changes of off-flavor compounds of grass carp in two culture systems[J]. South China Fisheries Science, 2022, 18(3): 147-154. DOI: 10.12131/20210167
Citation: YAN Li, LI Kang, KAMALA Gharti Chetri, LU Qiang, XU Yan, LIU Rucong, WANG Guixiang, ABDOUL Gadiri Sow, LIU Liping. Cumulative changes of off-flavor compounds of grass carp in two culture systems[J]. South China Fisheries Science, 2022, 18(3): 147-154. DOI: 10.12131/20210167

两种养殖模式中草鱼土腥味特征性物质累积变化

基金项目: 国家重点研发计划项目 (2019YFD0900303);上海市科技兴农技术创新项目 (沪农科创字〔2021〕第3-1号);上海市科技兴农重点攻关项目 (沪农科创字〔2018〕第2-12号)
详细信息
    作者简介:

    闫 莉 (1992—),女,硕士研究生,研究方向为生态养殖。E-mail: 2035670387@qq.com

    通讯作者:

    李 慷 (1985—),男,讲师,博士,从事水产品品质提升和鱼类繁殖生物学研究。E-mail: kli@shou.edu.cn

    刘利平 (1977—),男,教授,博士,从事池塘生态养殖与工程和鱼类繁殖生物学研究。E-mail: lp-liu@shou.edu.cn

  • 中图分类号: S 967.4

Cumulative changes of off-flavor compounds of grass carp in two culture systems

  • 摘要: 为探究养殖模式对草鱼 (Ctenopharyngodon idella) 养殖水体和肌肉中土腥味物质含量的影响,研究了池塘内循环跑道养殖系统 (In-pond raceway system, IPRS) 与传统养殖模式对草鱼中土腥味特征性物质土臭素 (Geosmin, GSM) 和二甲基异莰醇 (2-methylisoborneol, 2-MIB) 累积的影响。通过对不同养殖模式中水体和草鱼肌肉中2-MIB、GSM的动态检测,探究养殖过程中影响土腥味物质累积的因素。结果表明,IPRS水体和鱼肉的2-MIB随养殖时间的延长显著上升,GSM呈现相同的逐步累积趋势,且鱼肉中这2种特征性土腥味物质的变化趋势与水体一致。传统养殖模式下,水体中2-MIB含量逐渐增加,鱼肉中的2-MIB含量在实验末期显著高于实验初期和中期;水体中GSM的变化差异不显著,鱼肉与水体的GSM含量变化趋势一致,但不同时期鱼肉中的GSM含量差异显著 (P<0.05),且实验末期达最大值。相关性分析表明,土腥味物质的累积量与草鱼体质量、体长呈正相关。综上,养殖水体和草鱼肌肉中土腥味物质的累积受养殖模式影响,规格为0.42~1.23 kg的草鱼的土腥味特征性物质累积速率更快。
    Abstract: In order to investigate the influence of culture systems on the accumulation of off-flavor substances in the aquaculture water and grass carp (Ctenopharyngodon idella), we studied the accumulation of geosmin (GSM) and 2-methylisoborneol (2-MIB) in the fish in the in-pond raceway system (IPRS) and the traditional culture system. We dynamicaclly detected the contents of the two compounds in the water and fish muscles in different culture systems and applied the Pearson analysis. The results show that the 2-MIB concentration in the water and fish muscle in the IPRS system increased significantly with the extension of aquaculture time. The GSM concentration also showed a gradual accumulation trend, and the changes in the concentrations of the two compounds in the muscle remained consistent with those in the water. In the traditional pond system, the concentration of 2-MIB gradually increased without significant difference, and the fish muscle had significantly higher concentration at the end of the experiment than at previous stages. The GSM concentration of both pond water and fish muscle first decreased and then increased. Correlation analysis shows that the accumulation of both GSM and 2-MIB was positively correlated with fish body mass and length. In conclusion, the accumulation of off-flavor compounds in pond water and fish muscle is affected by the culture system. Grass carp with body mass of 0.42–1.23 kg accumulates off-flavor compounds faster.
  • 蜈蚣藻属隶属于红藻门、杉藻目、海膜科,主要包括舌状蜈蚣藻 (Grateloupia livida)、带形蜈蚣藻 (G. turuturu)、繁枝蜈蚣藻 (G. filicina)、披针形蜈蚣藻 (G. lanceolata)、对枝蜈蚣藻 (G. didymecladia) 等。研究表明,蜈蚣藻中含有氨基酸、蛋白质、糖类、萜类等多种生物活性成分[1-3]。近年来,关于蜈蚣藻来源的糖类研究较多,已被证明具有抗菌[4]、抗氧化和抗凝血[5]等多种功能活性,但对蜈蚣藻蛋白质的研究较少。舌状蜈蚣藻中氨基酸组成比例均衡,必需氨基酸含量 (EAA) 占总氨基酸含量 (TAA) 的42.58%,必需氨基酸与非必需氨基酸的比值 (EAA/NEAA) 为74.15%,符合WHO/FAO推荐的理想蛋白质模式[6];繁枝蜈蚣藻的藻红蛋白可有效增强大鼠原代星形胶质细胞的抗氧化损伤能力[7],以上研究结果均表明蜈蚣藻来源的蛋白质为优质蛋白质。

    为高效提取大型海藻中的蛋白质,破碎其刚性细胞壁至关重要。常见的破壁技术包括溶胀法、珠磨法、超细剪切法、反复冻融法、超声波法等[8-10]。该试验以舌状蜈蚣藻为原料,考察溶胀法、珠磨法、反复冻融法和超声波辅助水提法等技术对舌状蜈蚣藻蛋白质提取效率的影响,分析舌状蜈蚣藻粗蛋白质的体外抗氧化能力,以期为舌状蜈蚣藻的进一步开发利用提供技术支持和理论参考。

    舌状蜈蚣藻采收于广东省汕头市南澳岛,置于60 ℃烘箱中烘干至恒质量,粉碎至过120目筛的粉末状,−20 ℃密封保存。自动凯氏定氮法测得其蛋白质的质量分数为 (22.34±0.19)% (以干基计)。

    氢氧化钠、浓硫酸、盐酸、硫酸钾、硫酸铜、硫酸铵、无水乙醇、铁氰化钾、三氯乙酸 (TCA)、三氯化铁 (FeCl3·6H2O)、磷酸氢二钠 (Na2HPO4·12H2O)、磷酸二氢钠 (NaH2PO4·2H2O)等试剂均为分析纯;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼 (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH,美国Sigma公司);2,2'-二氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸) [2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic),ABTS,上海麦克林生化科技有限公司];BCA试剂盒 (南京建成生物工程研究所)。

    试验仪器有DHG-9145型电热恒温鼓风干燥箱 (上海一恒科技有限公司);BioTek全自动酶标仪 (美国Bio-Tek公司);JY99-ⅡDN超声波细胞破碎仪 (上海沪析实业有限公司);Delta320精密pH计[梅特勒-托利多仪器 (上海)公司];SPX-3K30高速冷冻离心机 (德国Sigma公司);BS224S型精密电子天平 (德国Sartorius公司)。

    称取适量舌状蜈蚣藻粉末,按一定液料比加水悬浮并搅拌均匀,在一定条件下进行破壁处理,粗提液于6 000 r·min−1、4 ℃下离心15 min,上清液即蛋白提取液,测定其中蛋白质的质量,并计算蛋白质提取率。向其余蛋白提取液中加硫酸铵至饱和度达65%,离心后取沉淀进行透析脱盐,经冷冻干燥得舌状蜈蚣藻粗蛋白质。

    蛋白质提取率的计算见公式 (1),其中舌状蜈蚣藻原料中总蛋白质的质量测定参考GB 5009.5—2016;蛋白提取液中蛋白质的质量使用BCA试剂盒 (比色法)进行测定。

    $$ \begin{array}{c} {\text{蛋白质提取率}}= \\ \dfrac{{{\text{蛋白提取液中蛋白质的质量}}\left( {{\rm{mg}}} \right)}}{{{\text{原料中总蛋白质的质量}}\left( {{\rm{mg}}} \right)}} \times 100 {\text{%}} \end{array} $$ (1)

    1) 溶胀法[11]。控制液料比100 mL·g−1,以蒸馏水作溶剂浸泡蜈蚣藻粉末,于4 ℃冰箱中溶胀,溶胀时间分别为1、2、3、4、5、6 d。2) 反复冻融法[12]。控制液料比100 mL·g−1,取适量蜈蚣藻粉,加蒸馏水悬浮于离心管中,−20 ℃冻结2 h,采用室温流水解冻,冻融次数分别为1、2、3、4、5次。3) 珠磨法。控制液料比100 mL·g−1,称取适量蜈蚣藻粉,加蒸馏水悬浮于离心管中,加入4颗质量规格相同的钢珠 (质量为0.89 g),于超高能量研磨仪中震荡研磨20 min,频率分别为10、20、30、40、50 Hz。4) 超声波辅助水提法[13]。控制液料比100 mL·g−1,称取适量蜈蚣藻粉,加蒸馏水悬浮,提取液pH调至7.0,设置超声发生时间4 s、间隔时间4 s、超声功率900 W,超声全程20 min。

    在一定液料比、pH、功率、时间下,进行超声波辅助水提舌状蜈蚣藻蛋白质的单因素试验,试验过程中超声波发生时间与间隔均为4 s。固定超声功率900 W,pH 7.0,超声全程30 min,考察液料比 (80、100、120、140、160、180、200 mL·g−1) 对蛋白质提取率的影响;固定液料比100 mL·g−1,超声功率900 W,超声全程30 min,考察pH (3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0) 对蛋白质提取率的影响;固定液料比100 mL·g−1,pH 7.0,超声全程30 min,考察超声波功率 (180、360、540、720、900、1 080、1 260、1 440、1 620 W) 对蛋白质提取率的影响;固定液料比100 mL·g−1,超声功率900 W,pH 7.0,考察超声处理全程时间 (10、20、30、40、50、60、70 min) 对蛋白质提取率的影响。每组试验重复3次,取平均值。由于提取过程中仪器变幅杆逐渐发热,提取液局部迅速升温,易引起蛋白质变性,因此,试验过程中采用4 ℃循环水进行水浴,使提取液保持较低温度。

    基于单因素试验结果,设定pH (A)、超声功率 (B)、超声全程时间 (C)的变化范围及中心点值,通过L9(34)正交试验优化提取工艺参数,正交试验因素水平见表1

    表  1  正交试验因素水平表
    Table  1.  Table of orthogonal test factors
    水平
    Level
    因素 Factor
    (A) 超声全程时间
    Total ultrasonic time/min
    (B) pH(C) 超声功率
    Ultrasonic power/W
    1506.01 080
    2607.01 260
    3708.01 440
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    1) 还原力的测定。参考王晓慧等[14]的方法并稍作修改。将舌状蜈蚣藻粗蛋白质配制成质量浓度分别为1、2、4、6、8 mg·mL−1的样品溶液。按V (pH 6.6、0.2 mol·L−1的磷酸缓冲盐溶液)∶V (样品)∶V (1%铁氰化钾)=1∶1∶1向1 mL样品溶液中加入试剂,涡旋混匀后于50 ℃水浴20 min,再加入1 mL 10%的三氯乙酸,10 000 r·min−1、4 ℃条件下离心10 min。取1 mL上清液,加1 mL去离子水和0.2 mL 0.1%的三氯化铁,50 ℃水浴10 min,测700 nm处吸光度。空白对照组以去离子水代替样品。2) DPPH自由基清除率的测定。参考Tkaczewska等[15]的方法,并稍作修改。将舌状蜈蚣藻粗蛋白配制成质量浓度分别为1、2、4、6、8 mg·mL−1的样品溶液。向1 mL待测样品溶液中加入1 mL 0.2 mmol·L−1 DPPH溶液 (无水乙醇溶解),充分混匀后,室温条件下避光反应30 min,检测517 nm波长处的吸光度,记为A1。空白组以无水乙醇代替DPPH溶液,吸光度记为A2;对照组以样品溶剂代替待测样品,吸光度记为A0。按公式 (2)计算DPPH自由基清除率。

    $$ {\rm{DPPH}}{\text{自由基清除率}} = \left( {1 - \frac{{{{{A}}_1} - {{{A}}_2}}}{{{{{A}}_0}}}} \right) \times 100{\text{%}} $$ (2)

    3) ABTS自由基清除率的测定。参考de Meneaes peixoto等[16]的方法,并稍作修改。用体积分数为50%的甲醇溶液配制7 mmol·L−1的ABTS溶液,将其与2.45 mmol·L−1的过硫酸钾溶液按体积比1∶1混合,室温避光放置12~16 h后形成ABTS储备液。使用前将该储备液稀释至734 nm波长处吸光度为0.70±0.02,得到ABTS工作液。向1 mL不同浓度的样品中加入4 mL ABTS工作液,混匀后避光反应10 min,在734 nm处测定吸光度A1;空白组以去离子水代替样品,在734 nm处测定吸光度A0;对照组以体积分数为50%的甲醇溶液代替ABTS工作液,在734 nm处测定吸光度A2。按公式 (3)计算ABTS自由基清除率。

    $$ {\rm{ABTS}}{\text{自由基清除率}} = \left( {1 - \frac{{{A_1} - {A_2}}}{{{A_0}}}} \right) \times 100{\text{%}} $$ (3)

    对试验测定所得的数据使用SPSS 22.0软件进行数据分析,选择单因素方差分析法(ANOVA,Turkey检验)进行显著性检验 (P<0.05为差异显著);利用Excel 2016整理试验数据并绘图。各试验均重复3次,试验结果取平均值。

    随溶胀时间延长,蛋白质提取率先上升后下降 (图1-a)。可能是由于溶胀时间逐渐延长,渗透压的存在使藻细胞壁吸水到一定程度时胀破,继续溶胀,其破坏程度增加,蛋白质逐渐溶出,溶胀时间为5 d时蛋白质提取率达到最大值 (29.66±0.86)%。而继续延长溶胀时间,会因溶液过饱和引起蛋白质沉降[17],导致蛋白质提取率下降。

    图  1  不同破壁技术对蛋白质提取率的影响
    Figure  1.  Effect of different wall-breaking techniques on extraction rate of protein

    冻融2 h时,随冻融次数的增加,细胞内反复形成冰粒,引起细胞壁破裂程度增大,蛋白质提取率逐渐增大,冻融次数达到冻融3次时,蛋白质提取率为 (23.38±0.11)%,但冻融3次之后蛋白质提取率增加不明显 (图1-b)。考虑到试验成本及便捷性,反复冻融次数为3次较佳。

    蛋白质提取率随研磨频率加强而增大,但增长幅度较小,频率达到30 Hz时蛋白质提取率已达到 (24.70±0.44)%,频率为50 Hz时蛋白质提取率也仅增大为 (26.52±0.79)% (图1-c)。这表明,钢珠碰撞对细胞壁的破坏作用有限,有限时间内高强度珠磨也无法较大程度地破坏细胞壁,导致蛋白质溶出率低。

    比较表2中4种破壁技术,在各方法的较佳条件下,珠磨法和反复冻融法的蛋白质提取率较低,且反复冻融法操作烦琐,不适合进行大规模试验;细胞溶胀法提取率较高,但时间太长;与其他方法相比,超声波辅助水提法仅处理20 min的蛋白质提取率就可达到 (32.72±0.32)%,且与其他破壁技术存在显著性差异 (P<0.05),具有时间短、效率高等优点[1]。因此,超声波辅助水提法是从舌状蜈蚣藻中提取蛋白质的合适方法。通过进一步优化超声波破碎法的试验条件,能获得较高蛋白质提取率,较大程度地提高对舌状蜈蚣藻原料的利用率。

    表  2  不同破壁技术提取舌状蜈蚣藻蛋白质的效果
    Table  2.  Effects of different wall-breaking techniques on extraction rate of protein from G. livida $\overline {\mathit{\boldsymbol{X}}}{\bf \pm {{SD}}} $
    破壁技术
    Wall-breaking technique
    温度
    Temperature
    时间
    Time
    蛋白质提取率
    Extraction rate of protein/%
    细胞溶胀法 Swelling method 4 ℃ 5 d 29.66±0.86b
    反复冻融法 Freeze-thawing method −20 ℃和室温 2 h,5次 24.52±0.04c
    珠磨法 Bead milling method 室温 20 min 26.52±0.79c
    超声波辅助水提法 Ultrasonic-assisted water extraction 4 ℃循环水浴 20 min 32.72±0.32a
    注:同列中不同字母间存在显著性差异(P<0.05) Note: Values with different letters within the same column indicate significant difference (P<0.05).
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    随液料比增加,舌状蜈蚣藻蛋白质的提取率呈现先上升后下降的变化趋势,但各处理组不存在显著性差异 (P>0.05,图2-a)。液料比较小时溶液黏度大,藻粉在水中不均匀分布,体系中的传质效率低;随液料比逐渐增大,藻粉与水的接触面积增大,溶液黏度逐渐降低,分子扩散效率增大,在此过程中蛋白质溶出率升高,提取率也逐渐增大。当液料比增大至160 mL·g−1时,蛋白质提取率达到最大值 (37.57±0.42)%,而继续增大液料比却导致蛋白质提取率下降。这是由于接近发出空化气泡的变幅杆部位的细胞会被破坏,而距离超声波发出位置较远处的细胞局部能量通量较小[18],细胞未被分解,未能释放蛋白质。因此,选择160 mL·g−1为提取舌状蜈蚣藻蛋白质的最适液料比。

    图  2  不同因素对蛋白质提取率的影响
    Figure  2.  Effect of different factors on protein extraction rate

    单因素方差分析显示各处理组存在显著性差异 (P<0.05,图2-b),pH介于3.00~5.00,蛋白质提取率较低,这是由于提取液中大多数蛋白质的等电点为酸性,此时已溶出的蛋白质之间发生静电排斥作用,向杂质中聚集沉降。pH介于5.00~7.00,蛋白质提取率上升速率较快,提取液pH为7.00时蛋白质提取率已达到较大值 (39.54±0.19)%。而pH继续增大,蛋白质提取率的增幅趋于平缓。考虑到碱性环境中蛋白质可能发生胱赖反应,影响蛋白质性质[19],因此在后续试验中可选择pH 6.00~8.00作为舌状蜈蚣藻蛋白质提取的较佳pH范围。

    随着超声波功率的增大,舌状蜈蚣藻的蛋白质提取率先迅速升高后迅速下降,单因素方差分析显示各处理组存在显著性差异 (P<0.05,图2-c)。超声波功率较低时,无法产生空化效应,对舌状蜈蚣藻细胞壁的破坏作用不足,对蛋白质的促溶效果不佳,故蛋白质提取率较低;随着超声波功率的增大,空化作用愈渐增强,且大功率超声波引起溶液升温,加快了溶液内的分子运动速率,促进分子相互碰撞,使蛋白质提取率升高,并在超声功率增大至1 260 W时达到最大值 (38.71±0.79)%。但功率继续增大时,超声波强度过高,导致溶液内压力过大、温度过高,使藻粉表面张力与溶液的黏度系数降低,同时降低了空化阈值,导致空化气泡不能及时破裂,大量空化气泡的存在削弱了空化效应[20-21],最终引起蛋白质提取率下降。综合选择超声功率介于1 080~1 440 W内较佳。

    随超声全程时间的延长,舌状蜈蚣藻蛋白质提取率先缓慢上升再迅速上升,超声全程时间为60 min时,蛋白质提取率达最大值 (60.58±1.34)%,超声全程时间超过60 min后蛋白质提取率迅速下降 (图2-d)。单因素方差分析显示各处理组存在显著性差异 (P<0.05)。这与于娇等[22]的实验结果接近,其利用超声波破碎法提取坛紫菜 (Porphyra haitanensis)蛋白质的最佳超声处理时间为52 min,超过此时间,蛋白质提取率反而下降。原因在于超声波作用一段时间后藻细胞壁被破碎到一定程度,蛋白质逐渐溶出;继续延长全程时间,超声波产生的机械效应会改变细胞膜的通透性[23],加速蛋白质的溶出,此时蛋白质提取率迅速上升;而超声波处理时间过长时则会引起已溶出的蛋白质发生猝灭、降解,导致蛋白质提取率下降。因此,选择50~70 min为舌状蜈蚣藻提取的较佳破碎时间。

    综合单因素试验结果,按1.3.4方法进行正交试验,以蛋白提取率为评价指标,试验设计及结果见表3。极值R显示,各因素在试验范围内对舌状蜈蚣藻蛋白质提取率的影响主次顺序为A (超声全程时间)>B (超声功率)>C (pH)。方差分析结果表明,因素A (超声全程时间)对蛋白质提取率具有极显著影响,因素B (超声功率)和因素C (pH)对蛋白质提取率具有显著影响 (表4)。各因素的理论最优组合为A2B3C1,该条件与正交试验设计中蛋白质提取率最高的实际最优组合相同。因此,舌状蜈蚣藻蛋白质提取的最佳条件为A2B3C1,即超声全程时间60 min,超声功率1 440 W,pH 6.0,此条件下蛋白质提取率可达58.16%。

    表  3  正交试验设计和结果
    Table  3.  Orthogonal array design and results
    编号
    No.
    (A) 超声全程时间
    Total ultrasonic time/min
    空列
    Null column
    (B) 超声功率率
    Ultrasonic power/W
    (C) pH蛋白质提取率
    Extraction rate of protein/%
    1 1 (50) 1 1 (1 080) 1 (6.0) 55.85
    2 1 2 2 (1 260) 2 (7.0) 53.12
    3 1 3 3 (1 440) 3 (8.0) 56.23
    4 2 (60) 1 2 3 55.41
    5 2 2 3 1 58.16
    6 2 3 1 2 55.91
    7 3 (70) 1 3 2 53.39
    8 3 2 1 3 52.89
    9 3 3 2 1 53.03
    K1 165.2 164.65 164.65 167.04
    K2 169.48 164.17 161.56 162.42
    K3 159.31 165.17 167.78 164.53
    R 10.17 1 6.22 4.62
    因素次序 Order of factors A>B>C
    最优水平 Optimal level A2B3C1
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    表  4  正交试验方差分析结果
    Table  4.  Analysis of variance of orthogonal array design
    方差来源
    Soruces of variation
    偏差平方和
    Sj
    自由度
    df
    均方
    MS
    F临界值
    Critical value
    显著性
    Significance
    A 17.38 2 8.690 104.24 F0.05 (2,2)=19.00 F0.01 (2,2)=99.01 **
    B 6.49 2 3.245 38.18 *
    C 3.57 2 1.785 21 *
    误差 Error 0.17 2 0.085
    总和 Sum 27.61 8
    注:**. 差异极显著 (P<0.01),*. 差异显著 (P<0.05) Note: **. Very significant difference (P<0.01); *. Significant difference (P<0.05)
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    除以上各破壁技术外,目前从海藻中提取蛋白质的方法还有碱溶酸沉法、酶解法等,庞庭才等[24]利用响应面分析法对羊栖菜 (Hizikia fusifarme)蛋白质的碱溶酸沉法进行了优化,结果表明在最佳条件下羊栖菜蛋白质的提取率为28.95%,该方法试验成本低,但耗时长,提取率低,且易引起蛋白质的色泽品质劣变;施瑛等[25]优化复合酶法提取紫菜藻红蛋白的最佳提取工艺为:纤维素酶与果胶酶质量比7∶3、pH 6.8、酶解温度39 ℃、提取时间7.2 h、酶底比0.8%,此条件下蛋白质得率为2.257%,纯度达1.656,此方法可获得高纯度蛋白质,但操作复杂,提取时间长。综上所述,超声波辅助水提法具有高效、省时的优点,且能较大程度地维护蛋白质的原有品质,采用该方法提取舌状蜈蚣藻蛋白质较为合适。

    图3-a显示不同浓度舌状蜈蚣藻粗蛋白质溶液的还原力,以700 nm波长下的吸光度值来表示。结果表明,舌状蜈蚣藻粗蛋白质具有一定的还原力,且随质量浓度增大,其还原力逐渐增强。当舌状蜈蚣藻粗蛋白质的质量浓度为8 mg·mL−1时,吸光度值最大为 (0.43±0.01),此时还原力最强。

    图  3  舌状蜈蚣藻粗蛋白质的还原力、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除率、2,2'-二氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)自由基清除率
    Figure  3.  Reducing power activity, DPPH radical scavenging rate and ABTS radical scavenging rate of crude protein from G. livida

    图3-b显示不同浓度舌状蜈蚣藻粗蛋白质对DPPH自由基的清除率。舌状蜈蚣藻粗蛋白质的质量浓度从1 mg·mL−1增大到8 mg·mL−1,其DPPH自由基清除能力随浓度增大而增强;粗蛋白质的质量浓度达8 mg·mL−1时DPPH自由基清除率最大 (83.01±3.98)%;继续增大质量浓度,DPPH自由基清除率增长速率变缓。经数据分析,舌状蜈蚣藻粗蛋白质对DPPH自由基的半数清除浓度(IC50)为4.00 mg·mL−1。据文献报道,姚兴存等[26]利用凝胶柱层析纯化后的条斑紫菜 (Porphyra yezoensi)蛋白质对DPPH自由基的IC50为0.452 mg·mL−1,表明其DPPH自由基清除能力强于舌状蜈蚣藻粗蛋白质;而红藻 (Portieria hornemannii)来源藻红蛋白质量浓度为1、2、4 mg·mL−1时,对应的DPPH自由基清除率分别为 (11.84±0.2)%、(22.67±0.5)%、(29.81±1.0)%[27],明显低于同质量浓度的舌状蜈蚣藻粗蛋白质的DPPH自由基清除率。

    图3-c显示不同浓度舌状蜈蚣藻粗蛋白质对ABTS自由基的清除率。舌状蜈蚣藻粗蛋白质质量浓度从1 mg·mL−1增大到8 mg·mL−1时,其对ABTS自由基的清除率也持续上升,从 (13.81±2.20)%增大到 (90.30±1.73)%。由此可见,舌状蜈蚣藻蛋白质对ABTS自由基的清除率剂量依赖性强。经分析,舌状蜈蚣藻粗蛋白质对ABTS自由基的IC50为3.96 mg·mL−1。在Hemlata等[28]的研究中,蓝藻 (Michrochaete)来源的藻红蛋白经连续纯化后对ABTS自由基的IC50为0.023 mg·mL−1。以上数据表明舌状蜈蚣藻粗蛋白质具有一定的ABTS自由基清除能力,但由于其中杂质较多,其ABTS自由基清除能力明显弱于纯化后的蓝藻Michrochaete来源藻红蛋白。

    本试验以舌状蜈蚣藻为原料,比较了4种破壁技术的蛋白提取效果,并通过单因素试验、正交试验对超声波辅助水提法进行工艺优化,并测定了粗蛋白质的抗氧化活性。结果表明,与溶胀法、珠磨法和反复冻融法相比,超声波辅助水提法能快速破坏细胞壁,较大程度地促进蛋白质溶出到提取液中,可获得较高蛋白质提取率。经单因素试验及正交试验优化后,超声波辅助水提法提取舌状蜈蚣藻蛋白质的最佳条件为:液料比160 mL·g−1,超声全程时间60 min,超声功率1 440 W,pH 6.0,此条件下蛋白质提取率可达58.16%,可为舌状蜈蚣藻高值化加工提供技术支持。

    舌状蜈蚣藻粗蛋白质的还原力、DPPH自由基清除能力及ABTS自由基清除能力均具有剂量依赖性,舌状蜈蚣藻粗蛋白质的质量浓度为8 mg·mL−1,还原力为0.43±0.01,DPPH自由基清除率为 (83.01±3.98)%,ABTS自由基清除率为 (90.30±1.73)%;舌状蜈蚣藻粗蛋白质对DPPH自由基和ABTS自由基的IC50分别为4.00和3.96 mg·mL−1。在后续试验中,可对舌状蜈蚣藻粗蛋白质进行进一步纯化,分离出高价值的藻胆蛋白,并对纯化后藻胆蛋白的生物活性进行探究,以期为具有良好生物活性的天然蛋白质的开发利用提供参考。

  • 图  1   二甲基异莰醇和土臭素标准曲线

    Figure  1.   Standard curve of 2-MIB and GSM

    图  2   两种养殖模式下水体和鱼肉中二甲基异莰醇、土臭素含量变化

    Figure  2.   Change of concentrations of 2-MIB and GSM in aquaculture water and fish muscle in different culture systems

    图  3   两种养殖模式水体中土臭素和二甲基异莰醇质量浓度比较

    Figure  3.   Comparison of GSM and 2-MIB concentrations in aquaculture water in two culture systems

    表  1   固相微萃取-气相色谱质谱联用方法的参数检验

    Table  1   Parameter verification of SPME-GC-MS method

    分析物
    Analyte
    保留时间
    Retention time/min
    定量离子质荷比
    Quantification ion pair/(m·z−1)
    线性关系
    Linearity (R)
    二甲基异莰醇 2-MIB 12.59 95 0.998 8
    土臭素 GSM 15.99 112 0.999 6
    分析物
    Analyte
    基质加标 Matrix spike/(μg·L−1)
    0.5 2.0 4.0
    回收率
    Recovery rate/%
    相对标准偏差
    RSD/%
    回收率
    Recovery rate/%
    相对标准偏差
    RSD/%
    回收率
    Recovery rate/%
    相对标准偏差
    RSD/%
    二甲基异莰醇 2-MIB 50.05~67.38 2.82 44.05~74.29 5.73 55.19~70.54 2.11
    土臭素 GSM 45.54~50.20 2.42 40.63~66.89 4.71 57.26~69.45 5.90
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    表  2   不同养殖模式中草鱼的生长变化

    Table  2   Growth of C. idella in different culture systems

    采样时间
    Sampling time
    池塘内循环流水养殖系统模式 IPRS system
    体质量
    Body mass/kg
    增重率
    WGR/%
    体长
    Body length/cm
    相对体长增长率
    RSGR/%
    第0天 0thday 0.42±0.02c 0.00±0.00c 27.37±1.10c 44.60±10.69
    第33天 33rdday 0.86±0.03b 117.93±16.79a 34.25±0.50b
    第83天 83rdday 1.23±0.08a 33.13±3.98b 39.25±1.99a
    采样时间
    Sampling time
    传统养殖模式 Traditional pond system
    体质量
    Body mass/kg
    增重率
    WGR/%
    体长
    Body length/cm
    相对体长增长率
    RSGR/%
    第0天 0thday 2.72±0.14c 0.00±0.00c 50.13±1.03b 19.44±3.53
    第33天 33rdday 3.28±0.02b 22.34±4.85a 53.05±3.80ab
    第83天 83rdday 3.61±0.15a 9.38±3.05b 58.75±3.77a
    注:不同字母表示差异显著 (P<0.05)。 Note: different superscripts mean significantly differences (P<0.05).
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    表  3   草鱼体内二甲基异莰醇和土臭素含量与规格的相关性分析

    Table  3   Correlation analysis between concentration of off-flavor compounds and fish sizes

    相关系数
    Correlation coefficient
    池塘内循环流水养殖系统模式
    IPRS system
    传统养殖模式
    Traditional pond aquaculture system
    二甲基异莰醇
    2-MIB
    土臭素
    GSM
    二甲基异莰醇
    2-MIB
    土臭素
    GSM
    体质量 Body mass 0.89** 0.82** 0.42 0.25
    体长 Body length 0.87** 0.71* 0.51 0.32
    注:*. 相关性显著 (P<0.05);**. 相关性极显著 (P<0.01)。 Note: *. Significant correlation (P<0.05); **. Very significant correlation (P<0.01).
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  • [1] 于洪波. 淡水渔业养殖生产现状问题浅析[J]. 南方农业, 2015, 9(36): 167-167,169.
    [2] 梁敏, 章雪琴. 水产品中大环内酯类药物残留检测技术的研究进展[J]. 食品安全质量检测学报, 2021, 12(2): 595-601.
    [3]

    WHITFIELD F B. Biological origins of off-flavours in fish and crustaceans[J]. Water Sci Technol, 1999, 40(6): 265-272. doi: 10.2166/wst.1999.0308

    [4]

    HANSON T R. Economic impact of off-flavor to the U. S. catfish industry[M]//SCHRADER K, RIMANDO A. Off-flavors in aquaculture. Washington, D.C.: American Chemical Society, 2003: 13-29.

    [5]

    COTSARIS E, BRUCHET A, MALLEVIALLE J, et al. The identification of odorous metabolites produced from algal monocultures[J]. Water Sci Technol, 1995, 31(11): 251-258. doi: 10.2166/wst.1995.0443

    [6] 殷守仁, 徐立蒲. 淡水浮游藻类与鱼体异味关系的初步研究[J]. 大连水产学院学报, 2003, 18(2): 156-157.
    [7]

    HOWGATE P. Tainting of farmed fish by geosmin and 2-methyl-iso-borneol: a review of sensory aspects and of uptake/depuration[J]. Aquaculture, 2004, 234(1/2/3/4): 155-181.

    [8] 王国超, 李来好, 郝淑贤, 等. 水产品腥味物质形成机理及相关检测分析技术的研究进展[J]. 食品工业科技, 2012, 33(5): 401-404,409.
    [9] 杨玉平, 熊光权, 程薇, 等. 水产品异味物质形成机理、检测及去除技术研究进展[J]. 食品科学, 2009, 30(23): 533-538. doi: 10.3321/j.issn:1002-6630.2009.23.119
    [10]

    KIM C, LEE S I, HWANG S, et al. Removal of geosmin and 2-methylisoboneol (2-MIB) by membrane system combined with powdered activated carbon (PAC) for drinking water treatment[J]. J Water Process Engin, 2014, 4: 91-98. doi: 10.1016/j.jwpe.2014.09.006

    [11]

    PERSSON P E. Sensory properties and analysis of two muddy odour compounds, geosmin and 2-methylisoborneol, in water and fish[J]. Water Res, 1980, 14(8): 1113-1118. doi: 10.1016/0043-1354(80)90161-X

    [12]

    ROBERTSON R F, JAUNCEY K, BEVERIDGE M C M, et al. Depuration rates and the sensory threshold concentration of geosmin responsible for earthy-musty taint in rainbow trout, Onchorhynchus mykiss[J]. Aquaculture, 2005, 245(1/2/3/4): 89-99.

    [13] 王赛. 水质、藻类变化对罗非鱼异味产生的影响及异味去除初步探讨[D]. 湛江: 广东海洋大学, 2012: 11-13.
    [14] 周梦海, 李慷, 张文博, 等. 不同养殖模式下罗非鱼养殖水体异味物质的含量及其变化[J]. 上海海洋大学学报, 2016, 25(4): 528-533. doi: 10.12024/jsou.20150401418
    [15] 樊厚瑞. 池塘循环流水养殖模式的发展现状和效益分析[J]. 农村经济与科技, 2019, 30(8): 40-42. doi: 10.3969/j.issn.1007-7103.2019.08.027
    [16] 刘梅, 宓国强, 郭建林, 等. 池塘内循环流水养殖模式对黄颡鱼生长性能、形体指标、血清生化指标及肌肉营养成分的影响[J]. 动物营养学报, 2019, 31(4): 1704-1717.
    [17] 王浩伟. 草鱼池塘循环水养殖系统生态及经济效益分析与评价[D]. 南京: 南京农业大学, 2015: 37-44.
    [18] 王峰, 雷霁霖, 高淳仁, 等. 国内外工厂化循环水养殖研究进展[J]. 中国水产科学, 2013, 20(5): 1100-1111.
    [19] 付湘晋, 党亚丽, 许时婴, 等. 白鲢鱼土霉味物质的检测与脱除[J]. 食品与发酵工业, 2010, 36(8): 152-155.
    [20] 杨玉平, 熊光权, 程薇, 等. 鲢鱼体内挥发性成分测定及其产生机理初探[J]. 农产品加工(创新版), 2010(8): 22-25.
    [21]

    VALLOD D, CRAVEDI J P, HILLENWECK A, et al. Analysis of the off-flavor risk in carp production in ponds in Dombes and Forez (France)[J]. Aquac Int, 2007, 15(3/4): 287-298.

    [22] 顾兆俊, 朱浩, 刘兴国, 等. 去除鱼类土腥昧养殖系统的构建技术研究[J]. 水产养殖, 2014, 35(10): 33-36. doi: 10.3969/j.issn.1004-2091.2014.10.007
    [23] 张凯, 刘利平, 陈桃英, 等. 罗非鱼不同养殖系统对产出效果及异味物质含量的影响[J]. 中国水产科学, 2018, 25(1): 108-115.
    [24] 农业农村部渔业渔政管理局, 全国水产技术推广总站, 中国水产学会. 2019 中国渔业统计年鉴[M]. 北京: 中国农业出版社, 2019: 24-25.
    [25] 国家环保局本书编委会. 水和废水监测分析方法[M]. 北京: 中国环境科学出版社, 1989: 39-40.
    [26] 王国超, 李来好, 郝淑贤, 等. 罗非鱼肉中土臭素和2-甲基异莰醇的测定[J]. 食品科学, 2011, 32(22): 188-191.
    [27]

    IZAGUIRRE G, TAYLOR W D. A guide to geosmin- and MIB-producing cyanobacteria in the United States[J]. Water Sci Technol, 2004, 49(9): 19-24. doi: 10.2166/wst.2004.0524

    [28] 李林. 淡水水体中藻源异味化合物的分布、动态变化与降解研究[D]. 武汉: 中国科学院研究生院 (水生生物研究所), 2005: 50-55.
    [29] 吴添天, 芮明, 朱慧娈, 等. 巢湖蓝藻异味成分分析及影响因素研究[J]. 环境科学与技术, 2015, 38(3): 147-151.
    [30]

    PARINET J, RODRIGUEZ M J, SÉRODES. J Influence of water quality on the presence of off-flavour compounds (geosmin and 2-methylisoborneol)[J]. Water Res, 2010, 44(20): 5847-5856. doi: 10.1016/j.watres.2010.06.070

    [31]

    SCHRADER K K, DAVIDSON J W, SUMMERFELT S T. Evaluation of the impact of nitrate-nitrogen levels in recirculating aquaculture systems on concentrations of the off-flavor compounds geosmin and 2-methylisoborneol in water and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)[J]. Aquac Eng, 2013, 57: 126-130. doi: 10.1016/j.aquaeng.2013.07.002

    [32] 邱东茹, 吴振斌, 况琪军. 不同生活型大型植物对浮游植物群落的影响[J]. 生态学杂志, 1998, 17(6): 22-27. doi: 10.3321/j.issn:1000-4890.1998.06.005
    [33]

    YING P, LEI L, SABINE H, et al. Root exudated algicide of Eichhornia crassipes enhances allelopathic effects of cyanobacteria Microcystis aeruginosa on green algae[J]. Hydrobiologia, 2018, 823(1): 67-77. doi: 10.1007/s10750-018-3696-7

    [34]

    STREIT B. Bioaccumulation of contaminants in fish[J]. Fish Ecotoxicol, 1998, 86(86): 353-387.

    [35]

    SCHRAM E, SCHRAMA J W, KOOTEN T V, et al. Experimental validation of geosmin uptake in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Waldbaum) suggests biotransformation[J]. Aquac Res, 2017, 42(9): 668-675.

    [36]

    KLEINOW K M, MELANCON M J, LECH J J. Biotransformation and induction: implications for toxicity, bioaccumulation and monitoring of environmental xenobiotics in fish[J]. Environ Health Persp, 1987, 71: 105-119. doi: 10.1289/ehp.8771105

    [37] 徐立蒲, 潘勇, 曹欢, 等. 寡盐水鱼池藻菌土腥异味化合物研究[J]. 生态学报, 2008, 28(10): 5173-5178. doi: 10.3321/j.issn:1000-0933.2008.10.066
    [38]

    WESTERHOFF P, RODRIGUEZ-HERNANDEZ M, BAKER L, et al. Seasonal occurrence and degradation of 2-methylisoborneol in water supply reservoirs[J]. Water Res, 2005, 39(20): 4899-4912. doi: 10.1016/j.watres.2005.06.038

    [39] 宋文华. 养殖密度和温度对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)生长和生理生化指标的影响[D]. 青岛: 中国海洋大学, 2012: 28-42.
    [40]

    DIONIGI C P, BETT K L, JOJNSEN P B, et al. Variation in channel catfish Ictalurus punctatus flavor quality and its quality control implications[J]. 1998, 29(2): 140-154.

    [41]

    MARTIN J F. The use of sodium carbonate peroxyhydrate to treat off-flavor in commercial catfish ponds[J]. Water Sci Technol, 1992, 25(2): 315-321. doi: 10.2166/wst.1992.0067

    [42]

    YARNPAKDEE S, BENJAKUL S, PENJAMRAS P, et al. Chemical compositions and muddy flavour/odour of protein hydrolysate from Nile tilapia and broadhead catfish mince and protein isolate[J]. Food Chem, 2014, 142: 210-216. doi: 10.1016/j.foodchem.2013.07.043

    [43] 韩萃, 魏发奕, 李丽, 等. 养殖虹鳟体内土腥味物质分布及其与水质关系的研究[J]. 中国海洋大学学报(自然科学版), 2021, 51(1): 23-30.
  • 期刊类型引用(6)

    1. 刘含,刘晓燕,郭银萍,穆兴燕,石自慧. 刺梨多酚-海藻酸钠-大豆分离蛋白纳米复合物的制备表征及其抗氧化活性. 食品工业科技. 2025(04): 69-79 . 百度学术
    2. 倪雅迪,徐羚欣,朱钰雅,肖平,段金廒. 中药蛋白资源提取分离及产业化路径展望. 中草药. 2024(08): 2828-2842 . 百度学术
    3. 丘仪,杨贤庆,李春生,戚勃,赵永强,潘创,陈胜军. 基于稀酸预处理和库德毕赤酵母发酵的蜈蚣藻多糖利用制备生物乙醇研究. 食品与发酵工业. 2024(22): 159-166 . 百度学术
    4. 邓建朝,荣辉,刘洋帆,戚勃,胡晓,陈胜军,杨贤庆,李来好. 蕨藻红素标准样品的研制. 化学分析计量. 2023(03): 6-11 . 百度学术
    5. 刘晶,胡晓,杨贤庆,陈胜军,吴燕燕,李来好,戚勃,邓建朝. 龙须菜蛋白质的提取及其酶解产物的抗氧化特性. 浙江农业学报. 2022(05): 1061-1072 . 百度学术
    6. 陶凤庭,潘创,戚勃,胡晓,赵永强,杨贤庆,杨莉莉. 坛紫菜分离蛋白的提取与结构解析. 大连海洋大学学报. 2022(05): 850-857 . 百度学术

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出版历程
  • 收稿日期:  2021-06-03
  • 修回日期:  2021-07-13
  • 录用日期:  2021-08-12
  • 网络出版日期:  2021-09-18
  • 刊出日期:  2022-06-04

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