Effects of dietary alginate oligosaccharide on growth performance, antioxidative capacity and immune function of juvenile Trachinotus ovatus
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摘要: 采用3组实验饲料养殖225尾卵形鲳鲹 (Trachinotus ovatus) 幼鱼58 d，以不添加褐藻寡糖组(TC) 作为对照，研究0.7 g·kg−1 (A1) 和6.0 g·kg−1 (A2) 褐藻寡糖对卵形鲳鲹生长、血浆生化及免疫指标、肝脏抗氧化能力、肠道形态和Nf-κb信号通路相关基因表达的影响。结果显示，A1和A2组增重率和特定生长率显著高于TC组 (P<0.05)，A1组饲料系数显著低于TC组 (P<0.05)；A1和A2组血浆补体C3质量浓度显著高于TC组 (P<0.05)，A2组碱性磷酸酶 (AKP) 活性显著高于TC组 (P<0.05)；与TC组相比，A1和A2组肝脏超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化氢酶 (CAT)、过氧化物酶 (POD) 、谷胱甘肽还原酶 (GR) 活性和总抗氧化能力 (T-AOC) 显著升高，丙二醛 (MDA) 浓度显著降低 (P<0.05)；A1和A2组肠绒毛高度显著高于TC组 (P<0.05)；与TC组相比，A1和A2组ikk、nf-κb、tnf-α和il-8表达量显著降低，tgf-β表达量显著升高 (P<0.05)。综上，添加褐藻寡糖可以改善卵形鲳鲹肠道形态和生长性能，提高血浆免疫指标和肝脏抗氧化能力，抑制肠道Nf-κb和促炎细胞因子mRNA的转录，并促进抗炎细胞因子mRNA的转录，建议卵形鲳鲹幼鱼饲料中褐藻寡糖的添加量为0.7 g·kg−1。Abstract: Trachinotus ovatus juveniles (225 individuals) were fed for 58 d with three diets containing 0 (Control: TC), 0.7 (A1) and 6.0 g·kg−1 (A2) alginate oligosaccharide (AO) to investigate the effects of AO on the growth, plasma biochemical and immune indexes, hepatic antioxidative capacity, intestine morphology and expression of genes involved in Nf-κb signaling pathway of T. ovatus. The results show that the weight gain rate and specific growth rate of T. ovatus of both A1 and A2 group were significantly higher than those of TC group (P<0.05). The feed coefficient of A1 group was significantly lower than that of TC group (P<0.05). Compared with TC group, the mass concentration of plasma C3 increased in both A1 and A2 group significantly (P<0.05), and the activity of alkaline phosphatase increased in A2 group significantly (P<0.05). Compared with TC group, the activities of SOD, CAT, POD and GR and T-AOC increased in both A1 and A2 significantly, while the concentration of MDA decreased significantly (P<0.05). The height of villus in A1 and A2 group were significantly higher than those of TC group (P<0.05). Compared with TC group, the expressions of ikk, nf-κb, tnf-α and il-8 decreased in A1 and A2 group significantly, while the expressions of tgf-β increased significantly (P<0.05). In conclusion, AO supplementation in diet can improve the growth and intestine morphology of T. ovatus, enhance the plasma immune indexes and hepatic antioxidative capacity, inhibit the expression of intestinal Nf-κb and proinflammatory cytokine mRNA, and improve the expression of antiinflammatory cytokine mRNA. The suitable level of AO in diet is 0.7 g·kg−1.
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糖尿病是一种由于机体胰岛素分泌功能异常而引起身体处于高血糖状态的疾病[1]。糖尿病不仅会损害多种机体器官，且在发病后期会产生肥胖、高血压、高胆固醇和肾衰竭等并发症[2]。随着人们生活方式的改变，糖尿病的发病率逐年攀升，预计2045年糖尿病患者将达到约7亿，而II型糖尿病人数占比超90%[3]。α-葡萄糖苷酶 (α-glucosidase) 可将多糖和寡糖等分解为葡萄糖，使血糖水平升高，因此抑制α-葡萄糖苷酶活性对血糖调节具有一定作用[4]。α-葡萄糖苷酶抑制剂通过抑制α-葡萄糖苷酶活性，减缓多糖类物质分解为葡萄糖，减少肠道对葡萄糖的吸收，从而抑制血糖升高，可作为降血糖药物供患者服用[5]。阿卡波糖、米格列醇和伏格列波糖等α-葡萄糖苷酶抑制剂，具有较好的降糖效果，但存在价格高、容易对胃肠道功能产生不良影响等问题[6]。因此，开发来源于食物中安全、天然和高效的α-葡萄糖苷酶抑制剂成为亟需解决的问题。目前，研究人员已从南极磷虾 (Euphausia superba) [7]、华贵栉孔扇贝 (Chlamys nobilis) [8]、杏仁 (Armeniaca sibirica)[9]、藜麦 (Chenopodium quinoa) [5]和条斑紫菜 (Porphyra yezoensis) [10]等多种食源蛋白酶解产物中获得了降血糖功能活性肽。
(Miichthys miiuy) 是广东省饶平县的主要养殖鱼类，年产量超7万吨，占全国产量的71%[11]。随着养殖产量的不断增加，有关及其副产物的加工应用研究成为热点。目前已有提取物的保鲜效果[12]、鱼松加工工艺[13]、多糖的护肝作用[14]和抗氧化肽[15-16]等报道，而关于蛋白酶解物α-葡萄糖苷酶抑制活性的研究报道较少。鱼肉在加工过程中会产生部分碎肉，直接丢弃会造成资源浪费，对碎鱼肉进行深加工可提高水产品资源利用率。Harnedy等[17]利用碱性蛋白酶和风味蛋白酶酶解大西洋鲑 (Salmo salar) 碎肉，发现该鱼肉蛋白酶解物具有较好的体外抗糖尿病作用。Theysgeur等[18]以罗非鱼加工副产物鱼碎肉为原料，通过建立体外模拟胃肠液消化模型，证明了罗非鱼蛋白酶解物可调节葡萄糖代谢作用及抑制二肽基肽酶 (DPP-IV) 活性，利用凝胶过滤层析法 (Gel Filtration Chromatography, GFC) 和反相高效液相色谱 (Reversed-phase High-performance Liquid Chromatography, RP-HPLC) 法分离纯化酶解物后获得了多条可刺激胆囊收缩素 (CCK) 和胰高血糖素样肽1 (GLP-1) 分泌的DPP-IV抑制肽。表明水产品加工副产物碎鱼肉也可作为制备生物活性肽的有效原料。
本研究以加工副产物碎鱼肉为原料，探究了酶法制备鮸α-葡萄糖苷酶抑制肽的最适酶解条件，明确其理化性质，以期为碎肉蛋白的深度开发和高值化利用提供依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
鱼肉 (质量分数：水分7.33%，蛋白质18.82%，粗脂肪3.64%，灰分1.06%) 由饶平万佳水产养殖场提供。木瓜蛋白酶 (>200 U·mg−1) 、胰酶 (≥2 500 U·mg−1) 和中性蛋白酶 (≥100 U·mg−1) (广州都宏生物科技有限公司)；碱性蛋白酶 (200 U·mg−1) 、复合蛋白酶 (100 U·mg−1) 、胃蛋白酶和α-葡萄糖苷酶 (北京Solarbio科技有限公司)；pNPG (4-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷，上海源叶生物科技有限公司)。乙腈、三氟乙酸均为色谱纯，其他试剂均为分析纯。
GB204 电子天平 (瑞士梅特勒-托利多公司)；THZ-82 水浴恒温振荡器 (金坛市精达仪器制造厂)；3K30 台式高速冷冻离心机 (德国Sigma 公司)；Alpha1-4 真空冷冻干燥机 (德国Christ 公司)；Sunrise-basic Tacan SUNRISE 吸光酶标仪 (瑞士TECAN 公司)；LC-20AD 高效液相色谱仪 (日本岛津公司)。
1.2 实验方法
1.2.1 α-葡萄糖苷酶抑制率测定
参考Vilcacunda等[5]的方法略作修改，用pH 6.8、100 mmol·L−1的磷酸盐缓冲液 (Phosphate buffer saline, PBS) 将α-葡萄糖苷酶和pNPG分别配制为0.25 U·mL−1和2 mmol·L−1的溶液。移取100 μL样品溶液和50 μL α-葡萄糖苷酶溶液于96 孔酶标板中，混匀，37 ℃保温15 min后，加入50 μL pNPG溶液，37 ℃反应20 min，最后加入100 μL 碳酸钠 (Na2CO3)溶液 (200 mmol·L−1) 终止反应，酶标仪405 nm波长处测定吸光值As，用缓冲液替代样品溶液测得吸光度Ac，PBS替代α-葡萄糖苷酶测得吸光度An。α-葡萄糖苷酶抑制率 (Rα, %) 按下式计算：
$$ R_{\rm{α}}=\frac{A_{\rm{c}}-\left(A_{\rm{s}}-A_{\rm{n}}\right)}{A_{\rm{c}}} \times 100 {\text{%}}$$ (1) 1.2.2 蛋白酶的筛选
选取5种蛋白酶分别按表1的条件对鱼肉进行酶解，其中加酶量为鱼肉质量的0.5%、酶解时间4 h、料液比1∶2 (m∶V) ，反应结束后沸水浴灭酶15 min，冷却至室温，4 ℃ 、10 000 r·min−1离心20 min，收集上清液并冷冻干燥即为鱼肉酶解物冻干粉，测定其α-葡萄糖苷酶抑制率，并选择最适蛋白酶。
表 1 蛋白酶的酶解条件Table 1. Enzymolysis conditions of protease酶种类
Enzyme type最适温度
Optimal
temperature/℃最适pH
Optimal
pH木瓜蛋白酶 Papain 50 6.5 中性蛋白酶 Neutral protease 50 7.0 碱性蛋白酶 Alkaline protease 50 8.0 复合蛋白酶 Compound protease 50 7.5 胰酶 Trypsin 37 8.0 1.2.3 单因素实验
1) 酶解时间的确定。选用胰酶，酶解时间分别为1、2、3、4、5、6和8 h，在加酶量为碎肉质量的0.2%、温度37 ℃、pH 8.0、料液比1∶2 (m∶V) 条件下，研究酶解时间对酶解产物α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响。
2) 加酶量的确定。选用胰酶，在加酶量分别为碎肉质量的0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%，温度37 ℃，时间4 h，pH 8.0，料液比1∶2 (m∶V) 条件下，研究加酶量对酶解产物α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响。
3) pH的确定。选用胰酶，酶解pH分别为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0，在加酶量为碎肉质量的0.2%、温度37 ℃、时间4 h、料液比1∶2 (m∶V) 条件下，研究酶解pH对酶解产物α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响。
4) 料液比的确定。选用胰酶，料液比分别为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4和1∶5 (m∶V
) ，在加酶量为碎肉质量的0.2%、温度37 ℃、时间4 h、pH 8.5条件下，研究酶解pH对酶解产物α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响。 5) 酶解温度的确定。选用胰酶，酶解温度分别为32、37、42、47、52和57 ℃，在加酶量为碎肉质量的0.2%、时间4 h、pH 8.5、料液比为1∶2 (m∶V) 条件下，研究酶解温度变化对酶解产物α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响。
1.2.4 响应面优化实验
根据Box-Behnken实验设计原理，以α-葡萄糖苷酶抑制率 (Y) 为响应值，酶解时间 (A) 、加酶量 (B) 及酶解温度 (C) 为响应因素，设计三因素三水平实验，实验水平设计见表2。
表 2 响应面实验因素和水平Table 2. Factors and levels in response surface design水平
Level因素 Factor A：酶解时间
Enzymolysis
time/hB：加酶量
Enzyme
dosage/%C：酶解温度
Enzymolysis
temperature/℃−1 2 0.1 42 0 4 0.2 47 1 6 0.3 52 1.2.5 体外模拟胃肠道消化实验
根据Harnedy等[17]的方法略作修改。胃蛋白酶与多肽溶液按1.5% (质量比) 混合均匀，在37 ℃、pH 2.0条件下进行模拟消化90 min后，沸水浴15 min终止反应，4 ℃、10 000 r·min−1离心20 min，测定上清液的α-葡萄糖苷酶抑制率。
胰蛋白酶与上述经胃蛋白酶消化的多肽溶液按1.0% (质量比) 混合均匀，在37 ℃、pH 8.0条件下再进行模拟消化150 min后，沸水浴15 min终止反应，4 ℃、10 000 r·min−1离心20 min，测定上清液的α-葡萄糖苷酶抑制率。
1.2.6 肽分子质量分布的测定
采用高效体积排阻色谱法[19]。色谱柱TSK-GELG2000SWXL (7.8 mm×300 mm)；流动相A为超纯水 (含0.1%体积分数的三氟乙酸) ，流动相B为乙腈 (含0.1%体积分数的三氟乙酸)，洗脱比例V(A)∶V(B)=1∶4；进样量10 μL；流速0.5 mL·min−1；检测波长214 nm，柱温30 ℃。以细胞色素C (12 400 D)、抑肽酶 (6 511.44 D) 、杆菌肽 (1 422.69 D)、氧化型谷胱甘肽 (612.63 D)、还原型谷胱甘肽 (307.32 D) 为标准品，以各标准品的保留时间为横坐标，相对分子质量取对数为纵坐标，绘制得到相对分子质量分布标准曲线y=−0.198 6x+6.664，根据标准曲线计算相对分子质量分布情况。
1.2.7 抑制类型的测定
采用Lineweaver-Burk动力学分析法，测定不同浓度的pNPG溶液在不同浓度抑制剂和不加抑制剂情况下的初始反应速率，判断酶解产物对α-葡萄糖苷酶作用的抑制类型。固定α-葡萄糖苷酶溶液的浓度为0.25 U·mL−1，pNPG浓度梯度为2、4、6、8和10 mmol·L−1，参照1.2.1中的方法测定反应初速率。用PBS代替抑制剂作为空白对照。以底物浓度倒数1/[S]为横坐标，以反应初速率倒数1/v为纵坐标绘制双倒数图，并根据 Lineweaver-Burk双倒数方程 (1/V = Km/vmax×1/[S] + 1/vmax)，得到米氏常数Km和最大初反应速率vmax，分析这两个参数的变化趋势，确定酶解产物的抑制类型。
1.2.8 凝胶过滤层析
Sephadex G-25凝胶经处理后装柱 (11 mm×400 mm) ，利用超纯水平衡、洗脱，将上述酶解物溶于超纯水中并配制质量浓度为30 mg·mL−1，过0.22 μm微孔滤膜，上样体积3 mL，流速2 mL·min−1，根据紫外检测仪在220 nm下洗脱曲线上的峰，分别收集每个组分，并测定α-葡萄糖苷酶抑制活性。
1.2.9 氨基酸组成测定
根据GB/T 5009.124—2016《食品中氨基酸的测定》测定17种基本氨基酸和GB/T 18246—2000《饲料中氨基酸的测定》测定色氨酸。
1.3 数据分析
采用Origin 2021 软件绘图，利用Excel 2019 和SPSS Statistics 22.0 软件进行数据统计分析，响应面实验结果运用Design-Expert 8.0.6.0软件进行相关数据分析。
2. 结果与分析
2.1 蛋白酶的筛选
利用不同蛋白酶对鱼肉进行酶解，各酶解物在20 mg·mL−1质量浓度下对α-葡萄糖苷酶抑制率如图1所示。不同酶解物均可抑制α-葡萄糖苷酶活性，且具有显著性差异 (P<0.05)，其中胰酶酶解产物对α-葡萄糖苷酶的抑制效果最好，抑制率为42.46%。酶具有专一性，每种蛋白酶有其特定的酶切位点，因此使用不同蛋白酶酶解同一原料而获得的多肽，其序列、氨基酸组成和相对分子质量分布情况可能存在较大差异，导致不同酶解物的α-葡萄糖苷酶的抑制活性也存在差异[20]。胰酶由胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和羧肽酶等组成，多种酶的共同作用可高效催化蛋白质水解，释放更多活性基团[21]。陈宏等[22]以牡蛎为原料，利用胰酶酶解牡蛎蛋白制备DPP-IV抑制肽。郑惠娜等[23]利用胰酶酶解马氏珠母贝 (Pinctada martensii) 分离蛋白制备低苯丙氨酸寡肽。综上，选取胰酶作为制备α-葡萄糖苷酶抑制肽最适蛋白酶，继续进行后续的工艺优化实验。
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图 1 最佳蛋白酶的选择注：字母不同表示差异显著 (P<0.05)，后图同此。Figure 1. Selection of best proteaseNote: Different letters indicate significant differences (P<0.05). The same case in the following figures.2.2 单因素试验结果
2.2.1 酶解时间对α-葡萄糖苷酶抑制率的影响
如图2-a所示，酶解1~4 h，α-葡萄糖苷酶抑制率随酶解时间的延长呈上升趋势，酶解第4小时，α-葡萄糖苷酶抑制率达到最大值 (41.33%)，其后随着酶解时间的延长，α-葡萄糖苷酶抑制率逐渐降低 (P<0.05) ，酶解第8小时降至31.39%。这与郎蒙等[7]利用复合蛋白酶酶解南极磷虾蛋白制备α-葡萄糖苷酶抑制肽的结果一致，说明酶解反应开始的一段时间内，小分子肽及游离氨基酸含量迅速增加，具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的肽含量也随之提高，而随着酶解时间的延长，部分具有较好抑制活性的多肽进一步被分解，活性基团被破坏，导致对α-葡萄糖苷酶的抑制活性降低[24]。因此选择酶解时间4 h作为响应面中心实验点，进一步优化酶解时间。
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图 2 时间、加酶量、pH、料液比和温度对α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响Figure 2. Effects of time, enzyme dosage, pH, liquid-material ratio and temperature on α-glucosidase inhibition activity2.2.2 加酶量对α-葡萄糖苷酶抑制率的影响
如图2-b所示，加酶量为0.1%~0.2%时，抑制率随酶添加量的增加而升高，在加酶量为0.2%时达到最大值 (38.94%)；加酶量高于0.2%时，抑制率显著下降 (P<0.05)。于丽娜等[25]用碱性蛋白酶酶解花生蛋白质制备α-葡萄糖苷酶抑制肽，发现当加酶量小于1.2%时，酶解物的α-葡萄糖苷酶抑制率随酶添加量的增加而升高，当加酶量大于1.2%时，其抑制率逐渐降低。因此，在相同的酶解条件下，适当增加蛋白酶用量可加速底物蛋白质的分解，获得更多小分子肽或游离氨基酸，提高酶解物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性；但继续加大加酶量，部分具有较好抑制活性的多肽可能进一步被酶解，多肽的氨基酸组成及序列发生变化，导致抑制活性降低。因此选择加酶量0.2%作为响应面中心实验点，进一步优化加酶量。
2.2.3 酶解pH对α-葡萄糖苷酶抑制率的影响
溶液pH对酶解反应产生了一定影响。如图2-c所示，pH介于6.5~8.5时，酶解产物的抑制率随pH的增加不断升高，具有显著性差异 (P<0.05) ；pH为8.5时，抑制率达到最大值 (47.52%)；pH增至9.0时，抑制率略降低。这与林海生等[8]报道的利用华贵栉孔扇贝 (Mimachlamys nobilis) 制备α-葡萄糖苷酶抑制肽工艺相一致，说明pH可通过影响胰酶活性中心和空间结构从而影响酶解效果。pH偏高或偏低，导致胰酶活性中心构象发生变化，空间结构会被破坏，从而抑制胰酶活力，导致酶解物的α-葡萄糖苷酶抑制率下降[24]。本研究所用的酶为胰酶，其水解鱼肉时的pH宜为弱碱性8.5，pH超过8.5时会降低酶活力，而且会引起底物蛋白质的聚集和沉淀作用，使其溶解度下降，影响酶与底物蛋白的有效结合与催化，不利于释放α-葡萄糖苷酶抑制活性肽[26]，因此选择pH 8.5作为最佳酶解条件。
2.2.4 料液比对α-葡萄糖苷酶抑制率的影响
如图2-d所示，当料液比为1∶2时，酶解物的α-葡萄糖苷酶抑制活性最高，其抑制率为52.18%；当料液比为1∶1时，反应体系较黏稠，酶的扩散运动受到抑制，无法与底物充分结合，影响了酶解反应的有效进行，导致酶解产物对α-葡萄糖苷酶抑制活性降低[27]；当料液比为1∶3、1∶4和1∶5时，尽管反应体系的黏稠度降低，蛋白酶与底物可充分结合，但由于此时底物的浓度较低，使得在相同的条件下，酶解反应较缓慢，酶解产物的α-葡萄糖苷酶抑制活性显著降低 (P<0.05)。因此选择料液比为1∶2作为最佳酶解条件。
2.2.5 酶解温度对α-葡萄糖苷酶抑制率的影响
温度是影响酶解效果的重要因素，对酶活力有较大影响。商品胰酶标示的最佳水解温度是37 ℃，但因原料不同，其酶解的最佳温度会有相应变化 (图2-e)。酶解温度在32~47 ℃范围内，随着温度的升高，抑制率逐渐增大，并在47 ℃达到最大值 (53.51%)。李艳敏等[28]报道了裙带菜 (Undaria pinnatifida) α-葡萄糖苷酶抑制活性肽的制备工艺，发现酶解物对α-葡萄糖苷酶抑制率也随着酶解温度的升高呈先上升后下降的趋势。表1中37 ℃为胰酶产品标示的最适反应温度，当温度高于37 ℃时，α-葡萄糖苷酶抑制率呈现上升趋势，这可能是因为在一定温度范围内，反应体系温度即使高于胰酶标示的最适反应温度，但胰酶的蛋白空间结构未被破坏，仍具有较高活性，加之温度升高可促进分子间的有效碰撞，加速酶解反应的进行，活性基团不断暴露，进而提高了酶解物的α-葡萄糖苷酶抑制活性；而当温度高于47 ℃时反应体系温度过高，部分胰酶蛋白空间结构被破坏从而变性失活，酶解反应减缓，酶解物的α-葡萄糖苷酶抑制活性降低[29]。因此选择酶解温度47 ℃作为响应面中心实验点，进一步优化酶解时间。
2.3 响应面实验分析
2.3.1 实验设计及结果
表 3 Box-Behnken 实验设计及结果Table 3. Design and results of Box-Behnken experiment序号
No.A：
酶解时间
Enzymolysis
time/hB：
加酶量
Enzyme
dosage/%C：
酶解温度
Enzymolysis
temperature/℃Y：α-葡萄糖苷酶
抑制率
α-glucosidase
inhibition rate/%1 4 0.1 52 51.87 2 6 0.2 42 52.37 3 2 0.1 47 50.39 4 2 0.2 52 53.66 5 4 0.2 47 55.44 6 2 0.2 42 42.33 7 4 0.2 47 54.41 8 4 0.3 52 49.56 9 4 0.3 42 48.45 10 2 0.3 47 46.00 11 6 0.2 52 47.40 12 6 0.1 47 49.04 13 4 0.2 47 53.91 14 6 0.3 47 50.79 15 4 0.2 47 53.08 16 4 0.2 47 53.29 17 4 0.1 42 46.63 2.3.2 响应面优化模型的建立及方差分析
根据上述实验结果进行回归拟合，得到如下回归方程：Y=54.03+0.90A−0.39B+1.59C+1.54AB−4.08AC−1.03BC−2.58A2−2.39B2−2.51C2。由表4可知，该回归模型的F值为36.36，P<0.0001，即建立的模型极显著。该模型失拟项的P=0.878 4>0.05，即失拟项不显著，说明实验结果受到未知因素的干扰较小，该模型较稳定。偏差系数CV=1.53%，表明该模型可信度较高。另外，
$R_{\rm{Adj}}^2 $ =0.952 1，说明该模型可以解释95.2% 多肽α-葡萄糖苷酶抑制率的变化情况，R2=0.979 1，说明该模型拟合较好，实验误差小。以上结果表明模型选择适当。根据回归方程中各因素的系数值可知不同因素对抑制率的影响顺序为：C>A>B。方程的一次项A 和C以及二次项A2、B2和C2 均是显著的；交互项中的AB 、AC和BC也对α-葡萄糖苷酶抑制率有显著影响，说明各因素对响应值的影响是复杂的，呈二次关系。表 4 Box-Behnken实验回归模型方差分析Table 4. AVOVA of Box-Behnken experiment来源
Source平方和
Sum of squares自由度
df均方
Mean squareF P Prob>F 模型 Model 195.83 9 21.76 36.36 < 0.0001 ** A 6.52 1 6.52 10.89 0.0131 * B 1.22 1 1.22 2.05 0.1957 C 20.19 1 20.19 33.74 0.0007 ** AB 9.42 1 9.42 15.75 0.0054 ** AC 66.42 1 66.42 110.99 < 0.0001 ** BC 4.26 1 4.26 7.13 0.0320 * A2 28.01 1 28.01 46.80 0.0002 ** B2 24.09 1 24.09 40.25 0.0004 ** C2 26.46 1 26.46 44.21 0.0003 ** 残差 Residual 4.19 7 0.60 失拟项 Lack of fit 0.59 3 0.20 0.22 0.8784 净误差 Pure error 3.60 4 0.90 总误差 Cor total 200.02 16 注：**. P<0.01；*. P<0.05。 2.3.3 响应曲面图分析
根据响应曲面的陡峭程度分析不同因素间的交互作用对α-葡萄糖苷酶抑制率的影响，曲面形状的走势越陡峭，说明两因素交互作用越显著；其走势越平缓，说明两因素间交互作用不显著[30]。固定酶添加量，抑制率随着酶解时间的延长先上升后下降 (图3-a)，与固定酶解时间条件下加酶量对抑制率的影响趋势一致，两因素的交互作用对抑制率的影响显著。固定酶解温度，抑制率随时间的延长先急速上升后缓慢下降 (图3-b)，与固定酶解时间条件下温度对抑制率的影响趋势一致，两因素的交互作用对抑制率的影响显著。固定酶解温度，增加酶用量，抑制率先上升后下降 (图3-c)，与固定加酶量条件下温度对抑制率的影响趋势一致，两因素的交互作用对抑制率的影响显著。
2.3.4 响应面模型的验证实验
根据实验结果，利用Design-Expert 8.0.6软件得出最优酶解条件为：时间4.85 h、加酶量0.21%、温度45.63 ℃，此条件下预测α-葡萄糖苷酶抑制率为53.83%。考虑实际操作，选取最终优化条件：酶解时间4.8 h、酶添加量0.21%、温度46 ℃、料液比1∶2、pH 8.5，通过3组重复实验得到的α-葡萄糖苷酶抑制率值为53.35%，与预测值的误差小于1%，说明回归方程与实际情况拟合度较高，可应用于实际操作。
2.4 体外模拟胃肠道消化活性变化
酶解物经体外模拟胃肠道消化前后α-葡萄糖苷酶抑制率变化结果如图4所示，经过胃蛋白酶消化后，消化液的α-葡萄糖苷酶抑制活性显著升高，抑制率达到66.56%；该消化液再经胰蛋白酶消化后其α-葡萄糖苷酶抑制活性显著降低 (P<0.05)，抑制率为61.97%。肖婷等[31]体外模拟胃肠道消化α-葡萄糖苷酶抑制肽SGTLLHK，发现消化液经胃蛋白酶消化后其α-葡萄糖苷酶抑制率先显著升高，再经胰蛋白酶消化后其抑制活性显著下降 (P<0.05)，本研究结果与其相似。这可能是由于胃蛋白酶的特定酶切位点对α-葡萄糖苷酶抑制肽进行了切割，促进生成小分子肽，导致更多活性基团暴露，其可与α-葡萄糖苷酶结合从而抑制了消化液的活性；胰蛋白酶的进一步水解，可能会导致肽序列的氨基酸组成发生改变，从而使消化液的抑制活性有所下降，但仍高于未被消化前的抑制率 (53.96%)。这表明利用上述酶解条件获得的α-葡萄糖苷酶抑制肽具有较好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，经体外模拟胃肠液消化后可提高其α-葡萄糖苷酶抑制活性。
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图 4 鮸酶解物消化后的α-葡萄糖苷酶抑制活性Figure 4. α-glucosidase inhibitory activity of M. miiuy enzymatic hydrolysates after digestion2.5 抑制类型
为确定鮸蛋白酶解物对α-葡萄糖苷酶的抑制类型，以 pNPG 浓度倒数 (1/[S]) 为横坐标，反应速率倒数 (1/v) 为纵坐标作Lineweaver-Burk双倒数图，并根据双倒数图的线性拟合结果判断酶抑制类型，拟合后若各直线相交于y轴，则判断为竞争性抑制；相交于x轴，则判断为非竞争性抑制；互相平行判断为反竞争性抑制；相交于二、三象限内，则可判断为混合型抑制[28]。如图5所示，酶解物的Lineweaver-Burk曲线交点相交于第二象限，且随着样品浓度的增加，米氏常数Km增大，说明酶与底物的亲和力减小，即酶与底物和抑制剂间存在竞争作用，由于vmax减小，可判断酶解物抑制α-葡萄糖苷酶的抑制类型为混合型抑制[32]，表明酶解产物不仅可与底物竞争α-葡萄糖苷酶的活性位点，还可与α-葡萄糖苷酶和底物的络合物相结合形成复合物，从而降低α-葡萄糖苷酶的活性。
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图 5 鮸酶解物抑制α-葡萄糖苷酶的Lineweaver-Burk曲线Figure 5. Lineweaver -Burk plots for inhibition of M. miiuy enzymatic hydrolysates on α-glucosidase2.6 胰酶酶解产物的分子质量分布
采用高效体积排阻色谱法测定了最优酶解条件下获得的酶解物的相对分子质量分布，发现肽的相对分子质量不同，其在凝胶色谱柱中的保留时间也不同。由图6-a可知该酶解物的保留时间大部分集中于12~23 min。酶解物的相对分子质量分布情况如图6-b所示，其中相对分子质量为1~3 kD 的肽段含量最高 (55.65%)，其次为相对分子质量<1 kD的肽段 (36.20%)，表明加工碎肉中的蛋白质经胰酶酶解后基本为相对分子质量<3 kD的多肽、寡肽及游离氨基酸。Gu等[9]利用超滤膜将杏仁蛋白酶解产物分离为4个组分，结果表明相对分子质量更小的组分具有更高的α-葡萄糖苷酶抑制活性，相对分子质量<5 kD的组分的抑制活性明显高于相对分子质量≥5 kD的组分。Liu等[33]对明党参 (Changium smyrnioides) 蛋白酶解产物进行分离后，发现相对分子质量<3 kD的肽段对α-葡萄糖苷酶抑制活性更高。Jin等[32]将大西洋鲑胶原蛋白通过超滤膜后，相对分子质量<3 kD的组分较相对分子质量≥3 kD的组分明显具有更高的DPP-IV抑制活性。因此，蛋白酶解物的α-葡萄糖苷酶抑制活性可能来源于相对分子质量<3 kD的肽段。
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图 6 鮸酶解物HPLC色谱图及分子质量分布图Figure 6. HPLC chromatogram of M. miiuy enzymatic hydrolysates and its relative molecular mass distribution2.7 凝胶过滤层析分离
利用Sephadex G-25分离酶解产物，可得F1、F2、F3和F4共4个组分，色谱图如图7-a所示。分别收集4个组分冻干后测定其α-葡萄糖苷酶抑制活性，结果如图7-b所示。F4比其他3个组分具有更高的α-葡萄糖苷酶抑制活性差异显著 (P<0.05) ，在10 mg·mL−1下抑制率达58.05%。Gu等[9]利用Sephadex G-25将杏仁蛋白α-葡萄糖苷酶抑制肽分离成3个组分，结果显示最后一个组分比其他2个组分有更高的α-葡萄糖苷酶抑制活性。黄钦钦和田亚平[10]利用Sephadex G-10对经超滤、纳滤后的条斑紫菜α-葡萄糖苷酶抑制肽进行二次分离，共获得2个组分，其中后一个组分的抑制活性更高。本实验结果与上述文献结果类似，说明F4可能富集更多的α-葡萄糖苷酶抑制肽，具有更高的α-葡萄糖苷酶抑制活性。
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图 7 Sephadex G-25洗脱组分和α-葡萄糖苷酶活性Figure 7. α-glucosidase activity of Sephadex G-25 eluents2.8 分离各组分的相对分子质量分布
利用高效体积排阻色谱法测定经Sephadex G-25分离后每个组分的相对分子质量分布，各组分的高效分子排阻色谱图如图8-a所示，相对分子质量分布情况如图8-b所示。上述实验结果显示不同组分的α-葡萄糖苷酶抑制活性具有显著性差异，而不同组分的相对分子质量分布也明显不同，表明不同组分的α-葡萄糖苷酶抑制活性与相对分子质量可能存在一定的相关性。F1、F2、F3和F4的小分子肽 (<1 kD)占比分别为20.56%、42.09%、59.16%和78.28%，显然F4含有更多小分子肽或游离氨基酸，且显示出最高的α-葡萄糖苷酶抑制活性。郎蒙等[7]发现在南极磷虾酶解产物中，相对分子质量<1 kD的多肽具有较高的α-葡萄糖苷酶抑制活性。Wei等[34]研究了乳饼奶酪在发酵过程中产生的生物活性肽，发现具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的肽组分的相对分子质量介于500~1 500 D。Zhao等[35]从槟榔江水牛 (Bos bubalus) 酪蛋白酶解物中鉴定获得4条α-葡萄糖苷酶抑制活性肽，其相对分子质量均<1 500 D。说明肽的相对分子质量可作为影响其抑制活性的一个因素，且小分子肽可能具有更强的α-葡萄糖苷酶抑制活性。
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图 8 Sephadex G-25 洗脱各组分的HPLC色谱图及相对分子质量分布图Figure 8. HPLC chromatogram and molecular mass distribution of Sephadex G-25 eluents2.9 氨基酸组成分析
有研究显示，活性肽的降血糖效果不仅与相对分子质量有关，还与氨基酸的组成有关[36]，对酶解物的氨基酸组成进行分析可为α-葡萄糖苷酶抑制肽的构效关系提供参考。α-葡萄糖苷酶的活性部位与活性肽的氨基酸活性基团通过疏水作用、氢键、范德华力等作用力发生竞争性或非竞争性结合，改变α-葡萄糖苷酶活性中心的空间构象，从而抑制其活性[37]。鮸鱼肉及其酶解物的氨基酸组成如表5所示。鱼肉及酶解物天冬氨酸 (Asp)、谷氨酸 (Glu)、精氨酸 (Arg)、酪氨酸 (Tyr)、缬氨酸 (Val)、丙氨酸 (Ala)、亮氨酸 (Leu) 和赖氨酸 (Lys) 等含量比其他氨基酸高，此类氨基酸的活性基团可能与α-葡萄糖苷酶的活性部位产生特异性结合，对α-葡萄糖苷酶抑制肽发挥降血糖功效具有重要作用。粗酶解物经分离后，F4较其他组分具有更高的α-葡萄糖苷酶抑制率，推测可能是由于F4中Arg、Tyr和Lys含量升高，暴露了更多活性基团，并与α-葡萄糖苷酶相结合，从而提高了F4的α-葡萄糖苷酶抑制率。Jiang等[38]从大豆蛋白酶解物中分离鉴定得到具有较高α-葡萄糖苷酶抑制活性的三肽EAK。Wang等[39]从核桃 (Juglans mandshurica) 蛋白酶解物中分离鉴定了新型五肽LPLLR，对α-葡萄糖苷酶有抑制作用，并可降低HepG2细胞的糖异生作用；Ren等[4]从大麻子 (Cannabis sativa) 蛋白中分离鉴定得到新型二肽LR，具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性；Vilcacundo等[5]从藜麦蛋白中获得的六肽DKDYPK可抑制α-葡萄糖苷酶活性；Wang等[40]从大豆 (Glycine max) 蛋白中分离出α-葡萄糖苷酶抑制肽LLPLPVLK、SWLRL和WLRL；吴彤[41]也发现短肽LRYL、LVRL和LPLLR均可抑制α-葡萄糖苷酶活性。尽管上述抑制α-葡萄糖苷酶的多肽序列氨基酸组成各异，但大多由Asp、Glu、Arg、Tyr、Val、Ala、Leu和Lys等氨基酸组成，这些氨基酸的活性基团可与α-葡萄糖苷酶活性部位结合，从而抑制α-葡萄糖苷酶活性，因此，可以认为氨基酸组成是影响α-葡萄糖苷酶抑制肽活性的因素。
表 5 鮸鱼肉及酶解物的氨基酸组成Table 5. Amino acid compositions of minced M. miiuy and its hydrolysates mg·g−1氨基酸
Amino acid鱼碎肉
Minced fish酶解物
Hydrolysate洗脱组分F4
Eluent component F4天冬氨酸 Asp 106.48 116.74 88.47 谷氨酸 Glu 158.78 175.42 118.77 丝氨酸 Ser 38.10 41.17 36.34 甘氨酸 Gly 28.77 32.80 29.87 组氨酸 His 17.39 18.00 28.43 精氨酸 Arg 50.56 56.44 73.54 苏氨酸 Thr 35.80 37.80 30.41 丙氨酸 Ala 49.28 53.03 48.38 脯氨酸 Pro 22.72 25.25 19.57 酪氨酸 Tyr 25.49 24.83 40.42 缬氨酸 Val 38.79 38.20 36.32 蛋氨酸 Met 21.37 13.86 25.15 半胱氨酸 Cys 1.11 1.24 1.06 异亮氨酸 Ile 34.96 33.82 30.40 亮氨酸 Leu 56.67 57.35 54.74 苯丙氨酸 Phe 27.04 25.40 39.72 赖氨酸 Lys 66.91 73.13 118.76 色氨酸 Trp 4.92 3.04 7.56 3. 结论
本研究通过筛选水解酶、单因素和响应面优化实验，获得酶法制备 α-葡萄糖苷酶抑制肽的最佳条件，即以胰酶为水解蛋白酶、料液比1∶2 (m∶V)、pH 8.5、加酶量0.21%、酶解温度46 ℃，酶解时间4.8 h，此条件下获得的酶解产物的α-葡萄糖苷酶抑制率为53.35%，其相对分子质量集中分布在3 kD 以下，酶解物通过与游离酶和酶-底物复合物相结合，抑制α-葡萄糖苷酶活性。蛋白酶解物具有较好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，经体外模拟胃肠液消化后酶解物的α-葡萄糖苷酶抑制率为61.97%，显著高于未经消化的酶解物。经G-25分离，F4组分对α-葡萄糖苷酶抑制率为58.05%，其<1 kD的肽组分占78.28%，为α-葡萄糖苷酶抑制肽的进一步鉴定提供基础。氨基酸分析也表明Asp、Glu、Arg、Tyr、Val、Ala、Leu和Lys等氨基酸对α-葡萄糖苷酶抑制活性的发挥具有一定作用。本研究建立了酶法制备 α-葡萄糖苷酶抑制肽的最佳工艺技术，为加工副产物鱼碎肉的高值化利用提供了新思路。下一步将探明 α-葡萄糖苷酶抑制肽的构效关系，并开发相关功能食品。
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图 1 摄食不同浓度褐藻寡糖饲料的卵形鲳鲹幼鱼的肠道形态 (HE 染色)
Figure 1. Intestine morphology of T. ovatus fed with different levels of dietary AO (HE staining)
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图 2 卵形鲳鲹幼鱼肠道Nf-κb信号通路相关基因的相对表达量
Figure 2. Relative expression of genes involved in Nf-κb signaling pathway in gut of T. ovatus
表 1 卵形鲳鲹幼鱼实验饲料组成与近似成分
Table 1 Ingredients and proximate composition of experimental diets of juvenile T. ovatus g·(100 g)−1
原料
Ingredient饲料组 Diet group TC A1 A2 鱼粉 Fish meal 26.00 26.00 26.00 豆粕 Soybean meal 15.00 15.00 15.00 花生饼 Peanut meal 12.00 12.00 12.00 啤酒酵母 Beer yeast powder 5.00 5.00 5.00 猪肉粉 Swine by-product meal 4.00 4.00 4.00 大豆浓缩蛋白 Soy protein concentrate 8.50 8.50 8.50 小麦面粉 Wheat meal 20.00 19.93 19.40 大豆卵磷脂 Soybean lecithin 1.00 1.00 1.00 鱼油 Fish oil 6.00 6.00 6.00 维生素+矿物质预混料a Vitamin+mineral premix 1.00 1.00 1.00 氯化胆碱 Choline chloride (50%) 0.50 0.50 0.50 磷酸二氢钙 Monocalcium phosphate 0.50 0.50 0.50 褐藻寡糖 Alginate oligosaccharide 0 0.07 0.60 甜菜碱 Betaine 0.50 0.50 0.50 总计 Total 100 100 100 近似成分 Proximate composition/% 干物质 Dry matter 93.89 93.13 92.75 粗蛋白 Crude protein 43.28 42.71 42.48 粗脂肪 Crude lipid 9.38 8.99 9.62 粗灰分 Ash 11.49 11.63 11.71 注：a. 购自无锡华诺威动物保健品有限公司，按照产品说明书，每1 kg饲料中添加10 g 维生素矿物质预混料。 Note: a. Purchased from Wuxi Hanove Animal Health Products Co., Ltd., China. According to the instruction, 10 g vitamin/mineral premix was added into per 1 kg feed. 
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表 2 实时荧光定量PCR引物序列
Table 2 Sequences of primers used for real-time PCR
基因 Gene 序列 Sequence κB抑制蛋白 iκb[20] F: 5'-CCTGGAGAACTGCTGTGGAATGAG-3'
R: 3'-ATGGAGGTAGGTCAGAGCCGAAG-5'Iκb激酶 ikk[20] F: 5'-GCTGGTCCATTGCCTCCTGAAC-3'
R: 3'-GTGCCGTCTTCTCGTACAACTGG-5'核因子-κB nf-κb[21] F: 5'-TGCGACAAAGTCCAGAAAGAT-3'
R: 3'-CTGAGGGTGGTAGGTGAAGGG-5'肿瘤坏死因子-α tnf-α[21] F: 5'-CGCAATCGTAAAGAGTCCCA-3'
R: 3'-AAGTCACAGTCGGCGAAATG-5'转化生长因子-β tgf-β[21] F: 5'-TATCCCTCTACAACAGCACCA-3'
R: 3'-GGTCAGCAGGCGGTAATC-5'白细胞介素-8 il-8[21] F: 5'-GAGAAGCCTGGGAATGGA-3'
R: 3'-GAGCCTCAGGGTCTAAGCA-5'β-肌动蛋白 β-actin[21] F: 5'-TGAACCCCAAAGCCAACAGG-3'
R: 3'-CCGCAGGACTCCATACCAAG-5'
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表 3 饲料中添加褐藻寡糖对卵形鲳鲹幼鱼生长性能和饲料利用率的影响
Table 3 Effects of dietary AO on growth performance and feed utilization of juvenile T. ovatus
项目 Item 组别 Group TC A1 A2 初始体质量 Initial body mass/g 6.10±0.09 6.03±0.05 6.06±0.01 终末体质量 Final body mass/g 73.86±1.09a 84.11±1.75b 83.73±2.15b 增重率 Weight gain rate/% 1 111.72±23.29a 1 295.81±38.57b 1 281.88±37.95b 特定生长率 Specific growth rate/(%·d−1) 4.30±0.03a 4.54±0.05b 4.53±0.05b 饲料系数 Feed coefficient 1.55±0.02b 1.46±0.02a 1.51±0.03ab 成活率 Survival rate/% 98.67±1.33 100.00±0.00 92.00±6.11 脏体指数 Viscerosomatic index/% 6.72±0.16 6.46±0.24 6.90±0.23 肝体指数 Hepatosomatic index/% 1.40±0.11 1.17±0.09 1.31±0.01 肥满度 Condition factor /(g·cm−3) 3.83±0.05a 3.85±0.09a 4.10±0.06b 注：同行不同字母表示组间差异显著(P<0.05)，下表同此。 Note: Values with different letters within the same row have significant difference (P<0.05). The same in the following tables.
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表 4 饲料中添加褐藻寡糖对卵形鲳鲹幼鱼全鱼成分和肌肉成分的影响
Table 4 Effects of dietary AO on proximate composition of whole body and muscle of juvenile T. ovatus %
项目 Item 组别 Group TC A1 A2 全鱼 Whole body 水分 Moisture 66.82±1.13 65.99±0.83 65.81±0.46 粗蛋白 Crude protein 17.17±0.18 17.11±0.09 16.78±0.11 粗脂肪 Crude lipid 11.96±1.06 12.78±0.70 12.96±0.45 粗灰分 Ash 3.73±0.02 3.57±0.07 3.62±0.06 肌肉 Muscle 水分 Moisture 25.55±0.52 24.64±0.24 25.66±0.29 粗蛋白 Crude protein 56.44±1.18b 55.63±0.35b 52.02±0.50a 粗脂肪 Crude lipid 8.11±0.34a 8.32±0.86a 10.38±0.37b 粗灰分 Ash 3.74±0.22 3.83±0.09 3.79±0.17
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表 5 饲料中添加褐藻寡糖对卵形鲳鲹血浆生化及免疫指标的影响
Table 5 Effects of dietary AO on plasma biochemical and immune parameters of juvenile T. ovatus
项目 Item 组别 Group TC A1 A2 血糖浓度 Glucose/(mmol·L−1) 14.02±0.58b 12.21±0.51a 13.96±0.21b 甘油三酯浓度 Triglyceride/(mmol·L−1) 1.62±0.01b 1.46±0.01a 1.53±0.06ab 总蛋白质量浓度 Total protein/(g·L−1) 38.30±1.57 39.30±1.65 40.47±1.77 补体C3质量浓度 Complement C3/(mg·L−1) 40.48±1.65a 55.42±0.56b 51.30±4.92b 补体C4质量浓度 Complement C4/(mg·L−1) 54.19±2.38b 52.75±3.37b 42.34±1.46a 碱性磷酸酶活性 Alkaline phosphatase/(U·L−1) 40.00±2.31a 46.33±2.03ab 53.00±2.65b
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表 6 饲料中添加褐藻寡糖对卵形鲳鲹幼鱼肝脏抗氧化能力的影响
Table 6 Effects of dietary AO on hepatic antioxidative capacity of juvenile T. ovatus
项目 Item 组别 Group TC A1 A2 超氧化物歧化酶活性 SOD/(U·mg−1) 176.22±3.23a 211.86±1.39b 211.03±2.58b 过氧化氢酶活性 CAT/(U·mg−1) 92.82±5.07a 112.58±3.53b 141.91±2.02c 过氧化物酶活性 POD/(U·mg−1) 17.53±0.08a 21.66±0.21b 21.92±0.55b 谷胱甘肽还原酶活性 GR/(U·g−1) 2.19±0.21a 4.18±0.10b 3.77±0.15b 谷胱甘肽过氧化物酶活性 GSH-Px/(U·mg−1) 7.66±0.42 8.12±0.17 7.72±0.48 总抗氧化能力 T-AOC/(mmol·g−1) 36.85±0.44a 42.03±0.61b 43.03±0.61b 丙二醛质量摩尔浓度 MDA/(nmol·g−1) 2.27±0.06b 1.81±0.07a 1.88±0.08a
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表 7 饲料中添加褐藻寡糖对卵形鲳鲹幼鱼肠道组织形态学指标的影响
Table 7 Effects of dietary AO on intestine morphological parameters of juvenile T. ovatus
μm 项目 Item 组别 Group TC A1 A2 绒毛高度 Villus height 631.53±8.72a 765.77±14.73c 726.84±2.86b 隐窝深度 Crypt depth 55.41±1.41 55.50±2.04 52.91±0.48 肌层厚度 Muscular layer thickness 243.57±25.16 250.67±6.32 248.10±12.41
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