贝莱斯芽孢杆菌LG37全基因组测序分析及无机氮代谢相关候选基因的筛选

刘广鑫, 董晏君, 赵丽娟, 邓益琴, 程长洪, 马红玲, 江建军, 冯娟, 郭志勋, 林蠡

刘广鑫, 董晏君, 赵丽娟, 邓益琴, 程长洪, 马红玲, 江建军, 冯娟, 郭志勋, 林蠡. 贝莱斯芽孢杆菌LG37全基因组测序分析及无机氮代谢相关候选基因的筛选[J]. 南方水产科学, 2022, 18(3): 57-67. DOI: 10.12131/20210149
引用本文: 刘广鑫, 董晏君, 赵丽娟, 邓益琴, 程长洪, 马红玲, 江建军, 冯娟, 郭志勋, 林蠡. 贝莱斯芽孢杆菌LG37全基因组测序分析及无机氮代谢相关候选基因的筛选[J]. 南方水产科学, 2022, 18(3): 57-67. DOI: 10.12131/20210149
LIU Guangxin, DONG Yanjun, ZHAO Lijuan, DENG Yiqin, CHENG Changhong, MA Hongling, JIANG Jianjun, FENG Juan, GUO Zhixun, LIN Li. Sequencing of whole genome of Bacillus velezensis LG37 and screening of inorganic nitrogen metabolism candidate genes[J]. South China Fisheries Science, 2022, 18(3): 57-67. DOI: 10.12131/20210149
Citation: LIU Guangxin, DONG Yanjun, ZHAO Lijuan, DENG Yiqin, CHENG Changhong, MA Hongling, JIANG Jianjun, FENG Juan, GUO Zhixun, LIN Li. Sequencing of whole genome of Bacillus velezensis LG37 and screening of inorganic nitrogen metabolism candidate genes[J]. South China Fisheries Science, 2022, 18(3): 57-67. DOI: 10.12131/20210149

贝莱斯芽孢杆菌LG37全基因组测序分析及无机氮代谢相关候选基因的筛选

基金项目: 中国水产科学研究院南海水产研究所中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助 (2020TS04);广东省重点领域研发计划项目 (2019B020215001);中国-东盟海上合作基金 (CAMC-2018F);广东省海洋与渔业厅项目 (D21822202);财政部和农业农村部国家现代农业产业技术体系资助 (CARS-48)
详细信息
    作者简介:

    刘广鑫 (1988—),男,助理研究员,博士,从事渔业生物病害防治研究。E-mail: Guangxin_liu1988@163.com

    通讯作者:

    郭志勋 (1970—),男,研究员,博士,从事渔业生物病害防治研究。E-mail: guozhixun1@163.com

    林 蠡 (1970—),男,教授,博士,从事渔业生物病害防治研究。E-mail: linli@zhku.edu.cn

  • 中图分类号: S 949

Sequencing of whole genome of Bacillus velezensis LG37 and screening of inorganic nitrogen metabolism candidate genes

  • 摘要: 前期研究发现贝莱斯芽孢杆菌 (Bacillus velezensis) LG37可高效同化无机氮,但其机理尚不清楚。为解读其高效同化无机氮的机理,结合三代PacBio RS II 和二代Illumina HiSeq 2000 测序技术对贝莱斯芽孢杆菌LG37进行全基因组测序,在此基础上利用NR、KEGG、eggNOG、GO和CARD数据库进行序列注释、分析,并通过本地Blast+对无机氮代谢相关基因进行挖掘。测序结果表明:1) 贝莱斯芽孢杆菌LG37的基因组为3 929 697 bp的环状染色体,GC含量为46.5%,包含3 854个蛋白质编码基因、86个tRNA 基因和27个rRNA基因。2) 共筛选出无机氮代谢相关候选基因94个,主要涉及编码感应蛋白、转录调控因子、转运蛋白、氧化还原酶和同化酶等,并对这些基因的GO功能进行了注释分析。综上,LG37 全基因组测序及无机氮代谢相关基因的分析为芽孢杆菌降低养殖水体中无机氮的研究提供了基因水平数据,为芽孢杆菌微生态制剂降低水体中无机氮的应用研究提供了理论依据。
    Abstract: It has been found that Bacillus velezensis can assimilate inorganic nitrogen efficiently. However, the underlying mechanism of inorganic nitrogen assimilation remains enigmatic. In order to elucidate the mechanism, we sequenced the complete genome of LG37 by PacBio RS II and Illumina HiSeq 2000, and then annotated and analyzed the sequence by the database of NR, KEGG, eggNOG, GO and CARD. Finally, we screened the genes related to inorganic nitrogen metabolism by local Blast+. The results show that: 1) The genome contained one circular chromosomal with a size of 3 929 697 bp and a GC-content of 46.5%. Gene prediction and annotation was performed to acquire a total of 3 854 protein-coding genes, 86 tRNA genes and 27 rRNA genes. 2) A total of 94 inorganic nitrogen metabolism candidate genes were screened by local Blast+. These genes were involved into coding sensing protein, transcriptional regulator, transporter, oxidoreductase and assimilator, etc.. In conclusion, the whole genome sequencing and data analysis of LG37 provide data at gene level and theoretical basis for functional study and application of Bacillus in reducing inorganic nitrogen in aquaculture water.
  • 护岸工程、航道整治、水坝建设等虽然给人类生活带来了便利,但也导致了水生生物栖息地减少或丧失、洄游通道阻断、多样性下降、资源衰退等问题[1-2]。为了缓解开发活动对水生态环境的影响,修复受损河流生态系统十分必要[3],而渔业资源增殖和栖息地修复是我国现阶段水生生态修复的重要内容之一。由于产卵类型和繁殖生态习性的差异,最优的资源恢复方式不尽相同。已有研究者针对产漂流性卵鱼类和洄游鱼类开展了大量关于鱼道建设[4-6]、生态水文需求[7-8]以及生态调度[9]等方面的研究以期修复其种群资源,但关于产黏性卵鱼类资源恢复的相关研究还未受到重视。

    鲤 (Cyprinus carpio)、鲫 (Carassius auratus) 等产黏性卵的鱼类是江河鱼类的重要类群,在生态系统中的作用不容忽视[10]。自然状况下,繁殖季节鱼类会自深水区集中到近岸浅水植被茂盛的水域进行产卵繁殖[11],产出的鱼卵黏附在水草上孵化出膜。然而,由于环境污染、河道治理与开发等原因导致水草减少,产黏性卵鱼类产卵场面积减小或丧失,因此需要人工干预对其资源进行增殖恢复。人工鱼巢是目前最常见的增殖技术,即人工制作鱼巢投放到自然水体中,为产黏性卵鱼类产卵提供所需的附着介质,实现资源增殖的目的[12]。立体的人工结构投放也可实现为鱼类提供庇护场所、提高多样性的目的[13],达到类似人工鱼礁的功能[14-15]。20世纪80年代,采用人工鱼巢的方式提高天然水域中鲤、鲫的资源量[16-17]已取得了良好的效果,但关于其修复机理方面仍未有深入的研究报道。

    近年来,人工鱼巢在我国江河的资源养护工作中得到推广应用[18-19],但实施效果差异较大。各地用作建造人工鱼巢的材料多种多样,池塘人工繁殖也有使用聚乙烯、锦纶等人工材料的成功经验[20],但是否适合在天然江河中应用推广还不得而知。因此,为探索江河流水生态系统中人工鱼巢修复技术和方法,本研究在西江肇庆江段选择不同的材料制作人工鱼巢,对比实施效果,筛选出最优的修复材料,分析影响实施效果的环境因素,从而为江河人工鱼巢修复提供技术指导。

    人工鱼巢试验在“西江肇庆段国家级水产种质资源保护区”内组织实施 (图1)。该保护区于2009年由农业部划定,重点保护对象为鲤,还包括海南鲌 (Culter recurviceps)、鲇 (Silurus asotus) 等产黏性卵鱼类。保护区上边界自西江禄步镇始,下边界至龟顶山江段结束,全长约10 km,总面积约13 000 hm2。实施地点位于核心区江段,江面宽阔 (宽度900~1 000 m),近岸坡度平缓,植被覆盖率几乎达100%。下游有一较大的沙洲 (桂林沙),沙洲长约600 m、宽70 m,其上芦竹、芒草等植被丛生。在自然状况下,若水位能淹没沙洲周边及近岸植被则可为鲤、鲫等鱼类提供产卵繁殖场所,但多数情况下水位较低、植被裸露,产卵场功能丧失。

    图  1  西江肇庆人工鱼巢实施位置图
    Figure  1.  Location of artificial fish nest at Zhaoqing in West River

    制作人工鱼巢的材料包括天然植物材料 [芦竹 (Arundo donax)、芒草 (Miscanthus sp.)、象草 (Pennisetum purpureum)、蒲葵 (Livistona chinensis)] 和化工材料 (仿真水草和尼龙网布) 等。鱼巢以件为单位,选择绿色无干枯的茎叶,将植物的根部切割整齐,根据叶片数量取 5~10 枝植被为一束,在距植物材料根部10 cm处用绳扎紧,固定在两片竹片中间。在距根部50 cm处将植被尽可能地散开,同样固定在两片竹片之间。其中芦竹、芒草和象草3种鱼巢每件上固定4束同样的植物材料,制成约2 m×2 m的正方形。蒲葵鱼巢以4个叶片为一组制作一件鱼巢。仿真水草材料选用绿色株高约50 cm,每株15小支,每小支约175个叶片 (长20 mm×宽8 mm),每8株制作一件鱼巢。网布材料选用孔径5 mm的绿色尼龙网布布,切割成1.5 m2的网片,扎成束,每3束制成一件鱼巢。各种鱼巢制作件数、叶片数量、材料总面积等见表1,制成之后的鱼巢见图2。人工鱼巢的投放采用边制作边投放的方式进行,投放在水深约2~3 m的近岸。鱼巢之间用绳索连接,分3列平行布置,每60件为一个方阵,用竹竿和船锚固定。

    表  1  各种鱼巢的基本参数
    Table  1.  Parameters of fish nests made of different materials
    材料
    Material
    鱼巢叶片数量
    Number of fish leaf/个
    材料表面积
    Superficial area/m2
    制作鱼巢数量
    Number of fish nests/个
    芦竹 Arundo donax 10 368 26.12 150
    芒草 Miscanthus sp. 672 6.44 40
    象草
    Pennisetum purpureum
    540 7.76 40
    蒲葵 Livistona chinensis 4 1.17 60
    仿真水草
    Simulation aquatic plants
    21 000 3.36 50
    尼龙网 Nylon net 4.5 50
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    图  2  不同材料制作的人工鱼巢
    1. 芦竹;2. 芒草;3. 象草;4. 蒲葵叶;5. 仿真水草;6. 尼龙网
    Figure  2.  Artificial fish nests made of different materials
    1. A. donax; 2. Miscanthus sp.; 3. P. purpureum; 4. L. chinensis; 5. Simulation aquatic plants; 6. Nylon net

    根据谭细畅等[21]的调查,每年2—4月是西江肇庆段鲤的主要繁殖期,故人工鱼巢试验在2019年3—5月开展。实施期间视天然植物材料叶片变黄和枯萎程度进行更新,平均27 d更换一次,共制作3个批次。

    鱼巢投放入水后,由专人负责管护,及时清理黏附在鱼巢上的泥沙及悬浮垃圾。根据实施期间水温情况,自全部鱼巢入水后第2天开始,每隔3~4 d抽样1次,每次抽样为早上和下午各1次。每种鱼巢随机抽取约30件查看是否黏附鱼卵,统计有卵黏附的鱼巢比例;对有鱼卵附着的鱼巢随机抽取部分枝叶进行鱼卵数量统计,每次统计不少于150个叶片。每次仅统计新产鱼卵数量,霉变的鱼卵不作计数。根据每件鱼巢的支数和叶片数量估算每件鱼巢黏附鱼卵的数量。每种材料鱼巢有卵黏附比例 (P) 和平均每件鱼巢黏附鱼卵数量 (N) 用下列公式计算。

    $$P = \frac{{a}}{{b}}$$
    $$N = \dfrac{{\displaystyle\sum\limits_{{{i}} = 1}^n {{A_{{i}}}} }}{n}{\rm{ \times }}M$$

    式中a为抽样中有卵鱼巢件数,b为抽样件数;N为有卵黏附时平均每件鱼巢黏附鱼卵数量 (粒) ;Ai为抽样每个叶片鱼卵数量 (粒) ;n为抽样叶片数量 (个); M为平均每件鱼巢叶片数量 (个)。

    通过方差分析比较不同材料有卵黏附鱼巢比例及平均每件鱼巢黏附数量的差异,确定鱼巢材料的优劣。方差齐性检验显示为非正态分布,故使用Kruskal-Wallis检验进行非参数检验。通过相关分析解析有卵黏附鱼巢比例、鱼巢黏附鱼卵数量与鱼巢入水天数之的关系。所有分析用R软件进行。

    为分析影响芦竹人工鱼巢实施效果的关键环境因素,将最高气温、最低气温、水温、径流量、水位、天气状况 (雨天、阴天、晴天)、鱼巢入水天数等与平均每件鱼巢黏附鱼卵数量、有卵黏附鱼巢比例建立数据集,进行主成分分析。主成分分析使用R软件Vegan包进行。为减小不同变量参数量纲对分析结果的影响,分析时对数据进行了归一化处理。

    实施期间将鱼巢黏附鱼卵置于鱼缸中充氧孵化,孵出的仔鱼利用形态学观察和基因条码两种方法进行种类鉴定。

    整个试验期间芦竹鱼巢有卵次数15次,芒草鱼巢5次,象草鱼巢1次,蒲葵鱼巢1次,仿真水草鱼巢2次,尼龙网布鱼巢0次。对6种材料有卵黏附鱼巢比例的统计分析表明,芦竹鱼巢有卵附着的比例最高,平均为 (45.1±40.7) %,其次为芒草 (2.4±3.6) %,其他依次为仿真水草 (1.4±3.2)%,象草 (0.2±0.9) %,蒲葵 (0.2±0.7) %,尼龙网布0.0%。单因素方差分析表明,芦竹鱼巢有卵黏附比例显著高于其他材料制作的鱼巢 (P<0.05),其他各种材料之间不存在显著性差异 (表2)。根据形态学和分子鉴定结果,鱼巢黏附鱼卵全部为鲤卵。由此可知,鲤对鱼卵附着介质有较高的偏好性,芦竹是最佳的人工鱼巢材料。

    表  2  不同鱼巢有卵黏附比例及黏附鱼卵数量
    Table  2.  Eggs adhesion ratio and number of eggs in different fish nests
    鱼巢材料
    Fish net material
    芦竹
    A. donax
    芒草
    Miscanthus sp.
    象草
    P. purpureum
    蒲葵
    L. chinensis
    仿真水草
    Simulation aquatic plants
    尼龙网
    Nylon net
    有卵黏附鱼巢比例
    Eggs adhesion ratio/%
    45.1±40.7a 2.4±3.6b 0.2±0.9b 0.2±0.7b 1.4±3.2b 0.0b
    每件鱼巢黏附鱼卵数量
    Eggs number in each nest/粒
    12 458±14 788a 896±2 010b 2±9b 0.3±1.1b 3±7b 0b
    注:同一行数据不同字母表示数据间差异显著 (P<0.05) Note: The data with different letters within the same row indicate significant difference (P<0.05).
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    随着人工鱼巢入水天数的延长,鱼卵附着率呈先升高后降低的变化规律。芦竹鱼巢自入水第2天开始有鱼卵附着,产卵高峰期100%的鱼巢上均有鱼卵。第20天是监测到有鱼卵的最长期限,仅20.0%的鱼巢有卵附着。对芦竹鱼巢入水天数和有卵黏附鱼巢比例进行相关分析表明,两者存在负相关关系 (P=0.055)。

    试验期间平均每件芦竹鱼巢黏附鱼卵数量为 (12 458±14 788) 粒,芒草鱼巢为 (896±2 010) 粒;象草、蒲葵、仿真水草、尼龙网布制作的人工鱼巢平均黏附鱼卵数量均小于5粒 (表2)。芦竹鱼巢黏附鱼卵数量极显著高于其他材料制作的鱼巢 (P<0.05),其他各种材料之间不存在显著性差异 (P>0.05)。单件芦竹鱼巢平均黏附鱼卵量最高值达46 915粒。以3 d为间隔统计分析显示,芦竹鱼巢黏附鱼卵数量在鱼巢入水后的一周达到峰值,之后快速下降 (图3)。对芦竹鱼巢黏附鱼卵数量与鱼巢入水天数进行相关分析表明,两者存在极显著负相关关系 (P<0.01)。

    图  3  芦竹鱼巢黏附鱼卵数量随入水天数的变化
    Figure  3.  Change of eggs number in A. donax fish nest with days of entering water

    对芦竹鱼巢有鱼卵附着的15次记录及其环境因子进行主成分分析,各主成分及其特征根、方差和累计贡献率见表3。结果显示,前3个排序轴的累计贡献率为84.27%,说明其能解释大部分的数据结构信息。根据各个环境因子特征向量在排序轴上的位置 (图4) 及解释率可知,鱼巢入水天数是影响鱼巢实施效果的最主要因素。径流量、水位与平均每件鱼巢黏附鱼卵数量、有卵鱼巢比例之间呈正相关关系,但与温度因素 (最高气温、最低气温、水温) 略呈负相关关系,这可能主要是由于鱼巢实施时间处于鲤主要繁殖期至繁殖期尾声阶段,3—5月在实施江段气温、水温都处于一个上升期有关。第三排序轴主要反映天气状况对鱼巢实施效果的影响,其方差解释率仅为13.9%。鱼巢主要实施期多云及阴天比例为38.6%,小雨及阵雨天气为31.6%,中到大雨天气为29.8%,基本无晴天。鱼巢有卵附着的天气38.6%为多云及阴天,61.4%为雨天,基本无晴天,说明天气状况对鱼巢实施效果的影响相对较小。

    表  3  各参数主成分的特征向量及贡献率
    Table  3.  Eigenvector and contribution rate of principal components of each parameter
    环境因子
    Environment factor
    PC1PC2PC3
    入水天数
    Days of entering water
    −0.948 46* −0.184 1 −0.041 62
    最高气温
    Maximum temperature
    −0.727 29 0.722 2 0.347 04
    最低气温
    Minimum temperature
    −0.851 04 0.639 1 0.025 44
    水温
    Water temperature
    −0.797 87 0.639 8 −0.299 04
    天气
    Weather
    −0.070 87 −0.235 4 −1.011 97*
    水位
    Water level
    0.478 28 0.924 7 −0.283 14
    径流量
    Discharge
    0.519 91 0.942 2* −0.188 14
    特征值
    Eigenvalue
    3.641 4 2.691 9 1.251 2
    解释率
    Proportion explained/%
    40.46 29.91 13.90
    累计解释率
    Cumulative proportion explained/%
    40.46 70.37 84.27
    注:*. 某主成分中特征向量最大的因子 Note: *. Factor of the largest eigenvector in principal component
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    图  4  芦竹人工鱼巢实施效果影响因素主成分分析
    Figure  4.  Principal component analysis of influencing factors on A. donax artificial fish nest

    鱼类对产卵栖息地环境有特殊需求,因此开展人工鱼巢增殖产黏性卵鱼类的实施地点选择尤为重要,这在产漂流性卵鱼类、洄游鱼类资源养护方面已经引起了重视,但在定居性、产黏性卵鱼类栖息地生境需求方面的关注仍不够。通常人们认为产黏性卵鱼类的资源量不会因为人为因素造成剧烈波动。然而,由于过度捕捞、河流调控、栖息地丧失或减少等原因,产黏性卵鱼类在我国多数江河和水库呈现资源衰退的趋势[22-23]。因此,人工鱼巢修复技术被广泛用于增殖天然水域中产黏性卵鱼类资源。在天然河流或湖泊中,鲤的产卵场多分布在近岸的浅滩或水草丰茂的水域,近岸陆生的野草、树木、庄稼等都可以在涨水被淹没后成为鲤产卵繁殖的场所[16],说明鲤的产卵场要求近岸、缓流、浅水的环境[11, 24-25],且分布有可作为鲤产卵黏附介质的水生植物和陆生植物。在鲤苗种生产上,人们也模拟自然生境创造出了利用稻田、土坑、池塘和河边浅水区域等作为产卵场进行人工繁殖。在自然江河中开展人工鱼巢增殖工作,最优位置是在原有产卵场江段,本研究选择在西江以鲤为重点保护对象的肇庆段国家级水产种质资源保护区近岸、浅水水域开展人工鱼巢增殖试验,选择了合适的位置,这也是取得良好实施效果的前提。

    鲤产卵对鱼卵附着介质有一定的选择性,但也能根据环境条件做出适应性改变,表现出较强的可塑性。人工繁殖生产中通常选用凤眼莲 (Eichhornia crassipes)、小叶眼子菜 (Potamogeton pusillus)、金鱼藻 (Ceratophyllum demersum)、棕榈皮、柳树须根和蕨类等天然植物材料[26],其诱鱼效果良好,但缺点是材料来源有限、使用寿命短、加工费时且鱼卵易发生水霉病[27];相较之,人工材料可以规模化生产制作,成本低且可重复使用,但黏附鱼卵效果通常没有天然植物材料好[20,28]。本研究选择了4种天然植物材料和2种人工材料制作鱼巢,结果表明天然植物材料芦竹的效果最好,同样是植物材料的芒草、象草和蒲葵诱鱼效果与芦竹相差甚远,黏附鱼卵比例和数量均显著低于芦竹制作的鱼巢;仿真水草和尼龙网布均为绿色,但效果同样较差。许品诚等[20]在池塘环境中使用化学材料制作仿真水草、聚丙烯网状纤维人工鱼巢诱鱼产卵,利用大阪鲫 (C. auratus cuvieri) 和团头鲂 (Megalobrama amblycephala) 进行试验,虽黏附效果不如杨树根,但比苦草好。然而,在天然河流中,使用人工材料获得成功的报道相对较少,且黏附鱼卵量一般较少。赵从钧等[29]研究发现大口黑鲈 (Micropterus salmoides) 对产卵环境的偏好顺序为粗河沙和黑色小石子片>柳树须根>绿色聚乙烯网布>麻袋片,说明其对砂石材料有偏好,但在无最适介质时,柳树须根也可作为产卵介质,且数量同样客观,效果理想。Adamek等[30]研究发现,鲤产卵除了偏好植物以外,在一些石质材料上也能产卵,这说明像大口黑鲈、鲤等产黏性卵鱼类对产卵介质虽有选择性,但仍具有较强的可塑性,会随着环境的变化而做出适应性改变。

    对于天然植物材料制作的鱼巢,不同材料的实施效果也差异显著,说明鲤对植物材料也有选择。这主要可能与附着介质材料的属性有关,如附着介质的颜色、形态、表面结构与质地软硬程度等[31]。本试验选取的芒草、象草叶片表面相对较为粗糙,没有芦竹叶片光滑,这也导致了这两种鱼巢更易吸附水体中的泥沙,从而更不利于鱼卵的黏附;而蒲葵的叶片硬度较大,质地不够柔软,可能不是亲鱼喜欢的介质类型,也有可能是由于不同的植物叶片在水中浸泡后会分泌特殊的物质,引起化感效应导致鱼卵产卵的喜好不同。

    试验期间在4月25—29日有一次涨水过程,水位涨水为1.2 m,近岸和实施地点位置下游沙洲边缘有大量植被被淹没,在沙洲边缘芦竹上发现大量鱼卵附着,但近岸的莎草 (Cyperus sp.)、水马齿 (Callitriche sp.) 等无鱼卵附着,这也说明在自然状况下鲤也存在产卵介质的选择性。

    水温是影响鱼类产卵繁殖的最主要因素。这是由于必须达到一定的积温条件后鱼类的性腺才能发育成熟,而产卵繁殖又有最低水温要求。因此在开展人工鱼巢增殖鱼类资源时,应选择在增殖对象的繁殖季节进行。关于鲤的繁殖积温需求的报道不多,一般认为水温达15 ℃以上鲤可以产卵,嘉陵江鲤在13 ℃即可产卵繁殖[18]。珠江下游肇庆江段每年最低水温出现在1—2月,多年月平均最低水温为15.7 ℃,鲤的性腺发育状况也表明V期卵巢在每年1—3月出现,早期资源监测在2—4月有鲤苗出现[21]。因此,本研究人工鱼巢试验选择在鲤的繁殖季节进行,但由于实施期间 (3—5月) 刚好是鲤由繁殖盛期到产卵结束的转变阶段,水温则处于一年中快速升高的时期,故呈现鱼巢实施效果与温度略成负相关关系。

    鱼巢入水天数与平均每件鱼巢黏附鱼卵数量、有卵鱼巢比例呈显著的负相关关系。这主要是由于天然植物材料放入水后,植物的叶片黏附水中的泥沙等悬浮物会逐渐枯萎、腐烂,而腐烂的叶片不利于鱼卵的黏附,诱鱼效果也更差。叶片腐烂的速度与水温呈正相关关系,3—5月鱼巢入水后可有效发挥作用的时间逐渐变短。试验过程中还发现,利用芦苇和芒草制作的鱼巢叶片在3—4月有被鱼捕食的现象,但不严重,而5月更新的鱼巢叶片在入水后很快被大量捕食,仅剩余较粗的茎。这可能是由于繁殖季节鲤相对较少进食,而5月基本进入繁殖后的恢复阶段、食量大增造成。另外,春季水温回升,其他草食性鱼类或杂食性鱼类的捕食也更加活跃。故针对鲤增殖的人工鱼巢工作,应当根据水温和鲤繁殖生物学特征,选择在鲤繁殖前期到盛期实施为最优。

    主成分分析显示流量和水位与鱼巢实施效果呈正相关关系,这可能是鲤繁殖对环境适应的一种结果。在自然状况下,近岸的陆生植被会随着流量和水位的上涨而被淹没,进而成为鲤的产卵场,鲤繁殖群体也会在涨水后寻找适宜产卵的水域进行产卵繁殖,但其具体的影响机理还有待进一步研究。天气状况如阴雨、晴天,对鱼巢黏附鱼卵数量和有卵鱼巢数量比例的影响不明显,但晴天表层水温稍高,更有利于鱼巢卵的孵化出膜,对鱼巢的增殖效果可能更有利。

    目前,人工鱼巢在我国黄河及其以南的水域均有推广实施,且多数都取得了良好的效果。然而,鲤在澳大利亚、美国、加拿大等国家作为外来物种成功建群、入侵,给当地的河流和湖泊生态系统造成了较严重的问题[32-33]。鲤密度较高会造成水生植被减少、氨氮浓度增加,进而导致水体由清澈变浑浊,呈现类似富营养化的现象[34]。但这种负面的作用可能与水体类型有关,对于浅水湖泊的影响可能更为明显[35]。因此,在开展人工鱼巢增殖工作时,需先对实施江段资源水体环境状况、资源本底进行初步的了解,才能达到既增殖了渔业资源又实现生态环境修复的双重目标。

    致谢:鲁东大学实习生敖茂川同学在人工鱼巢的维护和数据记录方面给予了帮助,谨此致谢!

  • 图  1   LG37 环状基因组图谱

    Figure  1.   Circular genome map of B. velezensis LG37 strain

    图  2   贝莱斯芽孢杆菌基于16S rDNA 序列构建的系统进化树

    Figure  2.   Neighbor-joining tree of B. velezensis LG37 based on 16S rDNA sequences

    图  3   COG功能分类

    Figure  3.   COG classification

    图  4   LG37基因功能注释KEGG代谢通路

    Figure  4.   Gene KEGG pathway classification map of LG37

    图  5   氮代谢通路 (ko00910)

    Figure  5.   Nitrogen metabolism (ko00910)

    表  1   贝莱斯芽孢杆菌LG37 基因组特性

    Table  1   Genome features of B. velezensis LG37 strain

    特性
    Feature
    数值
    Value
    基因组大小 Genome size/bp 3 929 697
    GC-含量 GC-content 46.5%
    质粒数量 Plasmid number 0
    总基因 Total genes 3 967
    蛋白编码基因 Protein-coding genes 3 854
    转运 RNA tRNA 86
    核糖体 RNA rRNA 27
    编码区域大小 Coding region size/bp 3 495 864
    编码区域GC-含量 GC-content of coding region 47.3%
    编码区域/全基因组 Coding region/Genome length 89.0%
    间隔区域大小 Intergenic region size/bp 433 833
    间隔区域占比 Ratio of intergenic region 11.0%
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    表  2   LG37 基因组氮代谢通路及其相关基因

    Table  2   Related genes of nitrogen metabolism pathways of LG37

    通路
    Pathway ID
    KEGG 描述
    KEGG description
    基因
    Gene
    ko00910 氮代谢 Nitrogen metabolism orf00490, orf00539, orf00544, orf00545, orf00546, orf00547, orf00817, orf01213, orf01254, orf01968, orf02226, orf02227, orf02368, orf03807, orf03808, orf03809, orf03810, orf03811
    M00531 同化硝酸盐还原 Assimilatory nitrate reduction orf00539, orf03807, orf03809
    M00530 异化硝酸盐还原 Dissimilatory nitrate reduction orf00544, orf00545, orf00547, orf03808, orf03809, orf03810, orf03811
    M00529 反硝化 Denitrification orf00544, orf00545, orf00547, orf03809
    M00804 完全硝化 Complete nitrification orf03809
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    表  3   无机氮代谢候选基因

    Table  3   Candidate genes of inorganic nitrogen metabolism

    基因
    Gene
    大小
    Size/bp
    蛋白
    Protein
    GO-分子功能
    GO-Molecular function
    orf00084 741 Type III pantothenate kinase YacB 泛酸激酶活性
    orf00106 246 Putative septation protein SpoVG 分子功能的负调控
    orf00148 885 Pyridoxal 5'-phosphate synthase subunit PdxS 谷氨酰胺水解活性
    orf00173 2 004 Nitrate reductase YyaE 硝酸还原酶活性
    orf00246 1 416 Arginine utilization regulatory protein RocR 转录因子结合
    orf00250 1 206 Ornithine aminotransferase RocD 鸟氨酸氧酸转氨酶活性
    orf00316 963 Iron(3+)-hydroxamate-binding protein YxeB 无机离子转运与代谢
    orf00379 1 017 Respiratory nitrate reductase NarI 硝酸还原酶活性
    orf00490 1 287 Glutamate dehydrogenase RocG 谷氨酸脱氢酶 (NAD+) 活性
    orf00535 1 377 Cytochrome cd1-nitrite reductase-like YwhL 亚硝酸盐还原酶活性
    orf00539 1 131 Nitrate transporter NarT 跨膜转运
    orf00544 3 687 Nitrate reductase alpha chain NarG 硝酸还原酶活性
    orf00545 1 464 Nitrate reductase beta chain NarH 硝酸还原酶活性
    orf00546 558 Nitrate reductase NarJ 未折叠蛋白结合
    orf00547 672 Nitrate reductase gamma chain NarI 硝酸还原酶活性
    orf00608 318 Urease subunit gamma 氨基酸转运与代谢
    orf00609 375 Urease subunit beta 氨基酸转运与代谢
    orf00610 1 710 Urease subunit alpha 氨基酸转运与代谢
    orf00623 351 Nitrogen regulatory protein P-II GlnB 酶调节活性
    orf00624 1 212 Ammonium transporter NrgA 铵跨膜转运蛋白活性
    orf00630 282 Stage III sporulation protein D SpoIIID DNA结合转录因子活性
    orf00783 726 Glucosamine-6-phosphate deaminase NagB 葡萄糖胺-6-磷酸脱氨酶活性
    orf00817 582 YvdA 无机离子转运与代谢
    orf00959 2 112 YvgW 阳离子转运ATP酶活性
    orf00966 1 716 Sulfite reductase [NADPH] CysI 亚硫酸盐还原酶 (NADPH) 活性
    orf00998 1 047 ABC transporter permease protein YvrB 转运体活性
    orf01042 357 Uncharacterized protein YusI 氧化还原酶活性
    orf01058 1 398 ABC transporter ATP-binding protein ATP结合
    orf01105 237 Nitrogen-fixing NifU domain-containing protein 铁硫簇结
    orf01175 2 403 Cation:proton antiporter 单价无机阳离子跨膜转运蛋白活性
    orf01213 1 032 Nitronate monooxygenase Ncd2 硝酸单加氧酶活性
    orf01254 549 YtiB 无机离子转运与代谢
    orf01262 813 Nitrate transport system permease protein YtlD 跨膜转运蛋白活性
    orf01263 783 Nitrate ABC transporter permease YtlC 跨膜转运
    orf01264 1 005 Nitrate ABC transporter periplasmic protein YtlA ATP酶活性
    orf01290 753 Quaternary-amine-transporting ATPase 传输ATP酶活性的季铵盐化合物
    orf01357 1 191 Nitric oxide dioxygenase 一氧化氮双加氧酶活性
    orf01435 1 962 Threonine--tRNA ligase 1 ThrS ATP结合
    orf01491 225 Spore germination protein GerE DNA结合
    orf01591 657 GlnP 氨基酸转运与代谢
    orf01592 651 GlnM 氨基酸转运与代谢
    orf01593 828 GlnH 氨基酸转运与代谢
    orf01617 801 Formate/nitrite transporter 跨膜转运蛋白活性
    orf01659 726 RNA polymerase sigma factor DNA结合转录因子活性
    orf01864 855 Nitrogen assimilation regulatory protein nac DNA结合转录因子活性
    orf01911 450 Ferric uptake regulation protein DNA结合转录因子活性
    orf01968 1 275 Glutamate dehydrogenase RocG 谷氨酸脱氢酶硝酸还原酶活性
    orf02215 1 983 Nitrate reductase 硝酸还原酶活性
    orf02225 903 HTH-type transcriptional regulator GltC DNA结合转录因子活性
    orf02226 903 Glutamate synthase (NADPH/NADH) GltB 谷氨酸合酶 (NADPH) 活性
    orf02227 4 560 Glutamate synthase (NADPH/ NADH) GltD 谷氨酸合酶 (NADPH) 活性
    orf02368 1 335 Glutamine synthetase GlnA 谷氨酸氨连接酶活性
    orf02369 405 HTH-type transcriptional regulator GlnR DNA结合
    orf02384 315 Ammonium compound efflux SMR transporter 膜的组成部分
    orf02385 354 Ammonium compound efflux SMR transporter 膜的组成部分
    orf02417 261 Stage V sporulation protein S 核酸结合
    orf02418 795 2',3'-cyclic-nucleotide 2'-phosphodiesterase YmdB 2',3'-环核苷酸2'-磷酸二酯酶活性
    orf02465 723 Uridylate kinase PyrH ATP结合
    orf02483 363 Chemotaxis protein CheY 磷脂酶信号转导系统
    orf02588 783 RNA polymerase sigma factor DNA结合转录因子活性
    orf02638 930 Glutaminase 氨基酸转运与代谢
    orf02680 666 Potassium uptake protein KtrA 阳离子跨膜转运蛋白活性
    orf02747 1 914 YkvW 阳离子转运ATP酶活性
    orf02756 342 Putative transcriptional regulator 转录调控,DNA模板
    orf02787 1 353 YkrM 阳离子跨膜转运蛋白活性
    orf02794 783 Uncharacterized membrane protein YkoY 膜的组成部分
    orf02804 742 HTH-type transcriptional regulator TnrA 核心启动子结合
    orf02828 315 Ammonium compound efflux SMR transporter 膜的组成部分
    orf02830 339 Ammonium compound efflux SMR transporter 膜的组成部分
    orf02854 999 Anion permease 无机磷酸盐跨膜转运蛋白活性
    orf03008 396 ArsC family transcriptional regulator SpxA 电子转移活性
    orf03161 1 215 Cation/H (+) antiporter YhaU 溶质:质子逆向转运活性
    orf03186 396 Putative fluoride ion transporter CrcB 无机阴离子跨膜转运蛋白活性
    orf03187 360 Putative fluoride ion transporter CrcB 无机阴离子跨膜转运蛋白活性
    orf03209 435 HTH-type transcriptional regulator NsrR DNA结合
    orf03262 834 ABC-type nitrate transport system 离子跨膜转运
    orf03263 990 Putative binding protein SsuA ATP酶活性
    orf03264 768 Aliphatic sulfonates import protein SsuB 阴离子跨膜转运蛋白活性
    orf03448 720 Probable transcriptional regulatory protein 转录调控,DNA模板
    orf03546 330 Ammonium compound efflux SMR transporter 膜的组成部分
    orf03547 315 Ammonium compound efflux SMR transporter 膜的组成部分
    orf03597 963 Arsenic resistance protein 无机阴离子跨膜转运蛋白活性
    orf03677 822 Probable manganese catalase YdbD 无机离子转运与代谢
    orf03682 366 Ammonium compound efflux SMR transporter 膜的组成部分
    orf03807 1 206 Assimilatory nitrate reductase NasA 硝酸铁氧还蛋白还原酶活性
    orf03808 2 328 Nitrite reductase large subunit NasB 亚硝酸盐还原酶 [NAD(P)H] 活性
    orf03809 2 133 Assimilatory nitrate reductase NasC 硝酸还原酶活性
    orf03810 2 418 Nitrite reductase [NAD(P)H] NasD 亚硝酸盐还原酶 [NAD(P)H] 活性
    orf03811 321 Assimilatory nitrite reductase [NAD(P)H] NasE 亚硝酸盐还原酶 [NAD(P)H] 活性
    orf03812 1 440 NasF 辅酶代谢
    orf03840 1 257 Transport system atp-binding protein opuaa 传输ATP酶活性的季铵盐化合物
    orf03889 984 Glutaminase 1 GlsA1 谷氨酰胺酶活性
    orf03890 1 437 GlnT 假定的钠/谷氨酰胺转运体
    orf03963 1 434 Sodium-independent anion transporter 次级活性硫酸盐跨膜转运蛋白活性
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出版历程
  • 收稿日期:  2021-05-19
  • 修回日期:  2021-07-06
  • 录用日期:  2021-09-28
  • 网络出版日期:  2021-10-18
  • 刊出日期:  2022-06-04

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