Transcriptome analysis of Plectropomus leopardus liver under different flow velocity
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摘要: 水流速度是影响鱼类生长的重要环境因子之一。为探究豹纹鳃棘鲈 (Plectropomus leopardus) 在不同流速条件下相关基因的功能和表达情况，利用RNA-Seq技术对差异流速下的豹纹鳃棘鲈肝脏组织进行了转录组分析。挑选相同繁育批次中规格一致的豹纹鳃棘鲈幼苗，分别在正常流速 (0.1 m·s−1, Low flow velocity, LFV) 和高流速 (0.4 m·s−1, High flow velocity, HFV) 实验组中养殖150 d后进行肝脏转录组测序分析，探究豹纹鳃棘鲈在差异流速下个体间的基因表达模式差异。结果显示，经筛选后共获得1 977个LFV-HFV显著性差异表达基因 (Differentially expressed genes, DGE)，其中上调基因999个，下调基因978个。GO功能注释分类发现，共有1 124个DEGs被GO数据库注释到并归属为56个功能类别。KEGG富集分析结果显示，573个DEGs参与了154条KEGG通路，其中富集最显著的为PPAR信号通路。LFV和HFV两组鱼的肝脏组织学观察结果显示，两者之间脂肪含量差异明显，LFV组肝脏中的脂肪含量显著高于HFV组 (P<0.05)。通过转录组分析，筛选了大量豹纹鳃棘鲈差异流速下的DGEs，为深入探讨豹纹鳃棘鲈对流速变化适应性的分子调控机制提供了技术支撑。Abstract: Water flow velocity is one of important eco-environment factors which affects the fish growth. In order to explore the function and expression of related genes of Plectropomus leopardus under different flow velocity, we conducted a transcriptome analysis of liver tissue of P. leopardus under different flow velocity by RNA-seq technology. We selected the fish fry of P. leopardus with identical size from the same breeding batch and cultured them for 150 d with water flow velocity of 0.1 m·s−1 (Low flow velocity, LFV) and 0.4 m·s−1 (High flow velocity, HFV). Then, we conducted a transcriptome analysis on the liver so as to investigate the difference of gene expression patterns with different flow velocity. We had obtained a total of 1 977 differentially expressed genes (DEGs) by transcriptome analysis (999 up-regulated and 978 down-regulated for LFV-HFV, respectively). The GO functional annotation reveals that 1124 DEGs were annotated in Gene Ontology Consortium and assigned to 56 functional terms. KEGG pathway analysis shows that 573 DEGs belonged to 154 pathways, and PPAR signaling pathway was most significantly enriched. Histological observation of livers of the tested fish indicates that the difference in fat contents between LFV and HFV group was significant, and the fat content was obviously higher in LFV than in HFV (P<0.05). According to the transcriptome analysis, we excavated many DEGs under different flow velocity, which provids technical support for further research on the molecular regulation mechanism of adaptability to change in flow velocity of P. leopardus.
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珠江是中国南方第一大河，地处热带、亚热带季风气候区，年径流量高于3.3×1011 m3，水资源总量居全国第二，流域内海拔跨度大于3 000 m，地貌多样，包括高原、山地、丘陵和三角洲平原等。异质多样化的生境，孕育了珠江水系丰富的生物资源，鱼类物种多样性在全球大河流域生态系统中排名第四，特有种类数排名第二[1]。截至2015年7月，珠江水系记录鱼类达650种(亚种，包括河口鱼类)[2]，特有鱼类约126种，国家级水产种质资源保护品种约25种[3]，是中国重要的淡水渔业生产基地和水生生物资源基因库。
珠江水系鱼类生态学研究基础薄弱，陆奎贤[4]于1981—1983年首次开展了珠江水系渔业资源全面性调查，李捷等[5]分析了2005—2008年西江河段鱼类多样性，帅方敏等[3]分析了2015年珠江水系鱼类空间格局。2015年以来珠江水系渔业管理制度和水利水电工程建设已发生了重大调整，例如珠江水系规划设立自然保护区约30个，国家级水产种质资源保护区20个；自2017年开始延长禁渔期，每年3月1日—6月30日在珠江流域实行全面禁渔[6]；浔江上游的大藤峡水利枢纽工程于2015年9月全面开工。2015年以来珠江水系鱼类群落时空格局尚处于空白状态。
西江作为珠江水系的干流和主体部分，发源于云南曲靖市马雄山，由南盘江、红水河、黔江、浔江和西江等河段组成，全长2 214 km。本研究选取了浔江和西江河段作为珠江水系鱼类群落研究的代表江段。2016—2018年笔者研究团队在西江水域开展了鱼类种群和水环境调查，通过分析鱼类群落时空格局和环境影响，补充更新了西江鱼类群落动态信息，服务珠江水系生态保护。
1. 材料与方法
2016年春季(3月)和夏季(6月)，2017年冬季(2月)、夏季(7月和8月)和秋季(10月)，2018年冬季(1月)、春季(4月)、夏季(7月)和秋季(10月)，在西江桂平、濛江镇、梧州、郁南、德庆和肇庆江段开展了渔获物采样调查(图1)，通过在各站点收集20船次的渔获物，采集渔具为三重刺网和地笼，每种渔具分别收集10船次，作业时间为8~10 h；在采样站点的干流中泓线区域，利用YSI同步监测表层水体的水温、盐度、溶解氧含量、pH、氧化还原电位、溶解性固体总量、电导率等，用透明度盘测定水体透明度，采集表层水体在实验室测定叶绿素a含量；在电子地图上测定采样点至河口距离，从全国水雨情网站(http://xxfb.mwr.cn/)下载采样点的径流量数据。
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图 1 西江鱼类种群采样和水环境监测站点Figure 1. Sites for fish sampling and environment variables monitoring in West River在PRIMER 6.0中计算每次采样渔获鱼类的物种数(S)、香浓威纳指数(H')和均匀度指数(J')。其中
$H' = - \sum {{P_i}\ln {P_i}} $ ，Pi为渔获鱼类中种i的个体数比例；$ J' = H'/\log S $ ，S为物种数。利用方差分析(ANOVA)和非参数检验方法比较分析了不同季节和站点的S、H'和J'的差异，分析过程在R软件中完成。群落间的物种组成表现为物种丢失或物种获得，若仅含1个过程，则物种数少的群落是另一个群落的嵌套子集，群落变化为群落嵌套；若包含2个过程，则群落间存在物种周转，群落变化呈现为物种周转[7-8]。本研究分别分析了不同季节和不同站点间的群落变化过程。通过相对重要性指数(IRI)确定鱼类物种的重要性，IRI=(N%+W%)×F%，其中N%为某物种个体数占渔获鱼类个体总数量的百分比例，W%为某物种质量(生物量)占渔获鱼类总质量的百分比例，F%为物种出现的站点数占调查总站数的百分比例。本研究中将IRI>1 000的物种定为优势种。
为去除稀有种影响，取出现频次≥3的鱼类N%、W%数据，在PRIMER 6中利用置换多因素方差分析(PERMANOVA)比较了不同季节和站点中鱼类群落结构的变化，并利用百分比相似性分析(SIMPER)解析了导致群落结构差异的重要物种。对出现频次≥3的鱼类N%、W%数据，在Hellinger转换后进行DCA排序，最长梯度长度均<3，在环境相关性分析中适合选择冗余分析(Redundancy analysis，RDA)[9]。为分析重要鱼类物种的环境梯度要求，取最大值>10%的鱼类N%、W%数据，进行RDA分析。对环境因子数据进行了log (x+1)转换，为避免环境因子间的共线性，在RDA分析中去除具有最高膨胀因子(VIF=14.88)的电导率环境因子，并使用双终止原则前向选择[10]筛选出对物种分布具有重要影响的环境变量。
2. 结果
2.1 物种组成多样性
2016—2018年在西江桂平至肇庆江段，共采集鱼类12目29科99种(附录，详见http://dx.doi.org/10.12131/20190142的资源附件)，其中鲤形目3科52种，鲤科46种，鳅科4种，条鳅科2种；鲈形目7科16种；鲇形目7科15种；鲱形目2科2种；胡瓜鱼目1科2种；合鳃鱼目2科3种；颌针鱼目1科1种；鳗鲡目1科2种；脂鲤目2科2种；鳉形目1科1种；鲻形目1科2种；鲀形目1科1种；杂交鲟1尾，未定种鱼类2尾。
每次采样鱼类物种数S为10~45 (图2)，时空差异不显著(非参数检验，P>0.05)。H'为0.90~2.93 (图2)，时空差异不显著(方差分析，P>0.05)。J'为0.30~0.89 (图2)，时空差异不显著(非参数检验，P>0.05)。春季共采集鱼类51种，夏季共采集77种，秋季共采集60种，冬季共采集44种，相邻季节间群落变化包含了物种获得和物种丢失两个过程，季节间鱼类群落呈群落周转格局。在桂平江段共采集鱼类61种，在濛江镇共采集51种，在梧州共采集52种，在郁南共采集39种，在德庆共采集40种，在肇庆共采集42种，相邻江段间群落变化包含了物种获得和物种丢失两个过程，西江桂平至肇庆江段鱼类群落呈群落周转格局。
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图 2 西江平均鱼类物种数、香浓威纳指数和均匀度指数空间分布Figure 2. Spatial distribution of average fish species number, Shannon-Wiener index and evenness index in West River2.2 鱼类优势种时空分布
鱼类IRI表明，西江主要优势种为鲮(Cirrhinus molitorella)、广东鲂(Megalobrama terminalis)、赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus)和鲤(Cyprinus carpio)等(图3)。优势种组成具有一定的季节波动性，春季主要优势种为广东鲂、鲤、鲢(Hypophthalmichthys molitrix)和赤眼鳟等，夏季主要优势种为鲮、赤眼鳟和广东鲂等，秋季主要优势种为鲮、赤眼鳟和草鱼(Ctenopharyngodon idella)等，冬季主要优势种为鲮、广东鲂和鲤等。鲮IRI在夏、秋和冬季均为物种间最高值：鲮秋季IRI最高，优势地位最高，春季其IRI降低，低于广东鲂和赤眼鳟。广东鲂在一年四季均为优势种，且在冬季具有最高的IRI。赤眼鳟IRI表现为夏季>冬季>秋季>春季。鲤在冬季具有较高的IRI，春季和夏季次之，但秋季IRI<1 000。草鱼、䱗(Hemiculter leucisculus)、鲢和瓦氏黄颡鱼 (Pelteobagrus vachelli) 的IRI仅在个别季节高于1 000，总体优势度偏低。
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图 3 西江鱼类优势种相对重要性指数季节动态变化Figure 3. Seasonal index of relative importance variation of dominant fish species in West River不同站点的鱼类优势种组成具有一定的差异(图4)。桂平江段主要优势种为鲮、鲤和尼罗罗非鱼；濛江镇的主要优势种为赤眼鳟、鲤和鲮；梧州江段的主要优势种为鲮、广东鲂和赤眼鳟；郁南江段的主要优势种为鲮和广东鲂；德庆江段的主要优势种为赤眼鳟、鲮和瓦氏黄颡鱼；肇庆江段的主要优势种为广东鲂、鲢和鲤。
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图 4 西江鱼类优势种相对重要性指数空间动态变化Figure 4. Spatial index of relative importance variation of dominant fish species in West River优势种的N%和W%体现了时空分布差异(表1)。鲮N%在夏、秋、冬季为种间最高，鲮W%在秋季为种间最高，鲮N%和W%均在秋季达到峰值，夏季次之，春季最低，其中夏、秋、冬季的郁南以及夏、秋季的梧州分布有较高资源量(N%和W%)的鲮。广东鲂W%为冬季>春季>夏季>秋季，其N%季节变化同样是冬季最高，秋季最低。赤眼鳟W%在夏季最高，尤其是德庆江段，春季最低；其N%在冬季最高，春季最低。鲤W%在冬季的濛江镇和肇庆江段最高，其次是春季的濛江镇和肇庆江段以及夏季的桂平江段，秋季W%属季节间最低；其N%在冬季最高，秋季最低。
表 1 西江优势种鱼类的数量百分比、质量百分比、出现站位百分比和相对重要性指数Table 1. N%, W%, F% and relative importance index of dominant fish species in West River物种
Species季节
Season数量百分比
N%质量百分比
W%出现站位百分比
F%相对重要性指数
IRI鲮 C. molitorella 春季 7.54 4.78 83.33 1 026.92 夏季 16.73 18.00 100.00 3 472.68 秋季 25.88 25.53 100.00 5 140.18 冬季 22.76 15.46 100.00 3 822.01 广东鲂 M. terminalis 春季 10.52 20.18 83.33 2 558.13 夏季 10.74 15.80 75.00 1 990.54 秋季 9.32 9.83 62.50 1 197.11 冬季 12.29 24.83 80.00 2 969.70 赤眼鳟 S. curriculus 春季 8.14 6.10 100.00 1 424.15 夏季 10.03 20.40 91.67 2 789.60 秋季 11.14 10.13 100.00 2 126.82 冬季 13.02 9.04 100.00 2 206.35 鲤 C. carpio 春季 7.20 14.00 83.33 1 766.70 夏季 3.62 8.89 91.67 1 146.91 秋季 2.99 7.60 87.50 926.81 冬季 8.96 25.58 100.00 3 453.70 草鱼 C. idella 春季 0.90 7.83 50.00 436.81 夏季 2.05 7.69 75.00 730.31 秋季 4.87 16.04 100.00 2 090.89 冬季 1.46 2.92 80.00 350.15 鲢 H. molitrix 春季 8.43 24.10 50.00 1 626.66 夏季 5.52 16.62 66.67 1 476.20 秋季 1.80 6.43 87.50 720.34 冬季 0.88 7.59 80.00 677.74 䱗 H. leucisculus 春季 12.64 3.52 66.67 1 077.56 夏季 9.82 1.40 58.33 654.81 秋季 12.19 2.04 75.00 1 067.71 冬季 6.22 1.67 80.00 631.27 瓦氏黄颡鱼 P. vachelli 春季 13.35 7.37 66.67 1 381.01 夏季 7.64 5.79 66.67 895.24 秋季 1.99 0.71 87.50 236.14 冬季 7.95 2.08 80.00 802.65 2.3 西江鱼类群落结构分析
PERMANOVA分析表明不同站点间鱼类N%存在显著性差异(表2，P<0.05)，其中桂平与梧州和肇庆江段存在显著差异(PERMANOVA比对分析，P<0.05)。桂平—梧州间鱼类N%的差异主要体现在鲮、银(Squalidus argentatus)、瓦氏黄颡鱼、广东鲂、赤眼鳟、尼罗罗非鱼、银飘鱼(Pseudolaubuca sinensis)、卷口鱼(Ptychidio jordani)、粗唇鮠 (Leiocassis crassilabris)和鳊(Parabramis pekinensis，表3，SIMPER分析)。桂平—肇庆间鱼类N%的差异主要体现广东鲂、银、鲮、鲤、鲢、黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)、花鰶 (Clupanodon thrissa)、尼罗罗非鱼、赤眼鳟、卷口鱼、䱗、银飘鱼和粗唇鮠 (表3，SIMPER分析)。
表 2 不同季节和站点间的鱼类数量百分比、质量百分比组成的PERMANOVA分析Table 2. PERMANOVA analysis of fish number percentage and weight percentage variation among seasons and sites方程
Function变异源
Source自由度
df平方和
SS均方
MS伪F
Pseudo-FP (蒙特卡罗检验)
P (MC)数量百分比 (季节+站点+季节×站点)
N% (season+site+season×site)季节 3 7 768.8 2 589.6 1.331 5 0.176 站点 5 22 074 4 414.8 2.270 0 0.002 季节×站点 11 23 407 2 127.9 1.094 1 0.321 残差 11 21 393 1 944.8 总和 30 76 267 质量百分比 (季节+站点+季节×站点)
W% (season+site+season×site)季节 3 10 173 3 391.1 2.219 7 0.013 站点 5 18 012 3 602.5 2.358 0 0.004 季节×站点 11 20 862 1 896.5 1.241 4 0.167 残差 11 16 805 1 527.7 总和 30 69 358 表 3 西江鱼类数量百分比空间结构差异源的SIMPER分析Table 3. SIMPER analysis of fish number percentage difference for spatial structure in West River物种
Species桂平—梧州 GP−WZ 物种
Species桂平—肇庆 GP−ZQ 平均相异性
Av. Diss贡献比
Contrib/%平均相异性
Av.Diss贡献比
Contrib/%鲮 C. molitorella 10.09 13.48 广东鲂 M. terminalis 8.47 10.35 银鮈 S. argentatus 5.73 7.65 银鮈 S. argentatus 5.72 6.99 瓦氏黄颡鱼 P. vachelli 5.44 7.28 鲮 C. molitorella 5.63 6.89 广东鲂 M. terminalis 5.37 7.17 鲤 C. carpio 4.40 5.38 赤眼鳟 S. curriculus 4.24 5.66 鲢 H. molitrix 4.27 5.22 尼罗罗非鱼 O. niloticus 4.08 5.45 黄颡鱼 P. fulvidraco 4.17 5.10 银飘鱼 P. sinensis 3.92 5.25 花鰶 C. thrissa 4.09 5.00 卷口鱼 P. jordani 3.01 4.02 尼罗罗非鱼 O. niloticus 4.05 4.96 粗唇鮠 L. crassilabris 2.66 3.56 赤眼鳟 S.curriculus 3.46 4.22 鳊 P. pekinensis 2.49 3.33 卷口鱼 P. jordani 3.09 3.77 鲫 C. auratus 2.26 3.01 䱗 H. leucisculus 2.98 3.64 斑鳠 H. guttatus 2.03 2.72 银飘鱼 P. sinensis 2.97 3.63 䱗 H. leucisculus 2.01 2.69 粗唇鮠 L. crassilabris 2.67 3.27 PERMANOVA分析表明不同季节和不同站点间鱼类W%均存在显著性差异(表2，P<0.05)。PERMANOVA比对分析表明夏—冬季间鱼类W%存在显著差异(P<0.05)，主要源于鲤、鲮、广东鲂、赤眼鳟、鲢、草鱼和尼罗罗非鱼W%的季节差异(表4)。桂平—梧州鱼类W%存在显著差异(PERMANOVA比对分析，P<0.05)，主要源于鲮、广东鲂、鲤、鲢、尼罗罗非鱼、草鱼、鳡(Elopichthys bambusa)和卷口鱼W%的空间差异(表4)。
表 4 西江鱼类质量百分比时空结构差异源的SIMPER分析Table 4. SIMPER analysis of fish weight percentage difference for spatial-temporal structure in West River夏季—冬季 Summer−Winter 桂平—梧州 GP−WZ 物种
Species平均相异性
Av. Diss贡献比
Contrib/%物种
Species平均相异性
Av. Diss贡献比
Contrib/%鲤 C. carpio 11.56 17.79 鲮 C. molitorella 10.26 14.49 鲮 C. molitorella 9.82 15.12 广东鲂 M. terminalis 8.84 12.48 广东鲂 M. terminalis 8.15 12.55 鲤 C. carpio 6.12 8.64 赤眼鳟 S. curriculus 6.54 10.06 鲢 H. molitrix 5.61 7.93 鲢 H. molitrix 5.78 8.89 尼罗罗非鱼 O. niloticus 5.23 7.38 草鱼 C. idella 2.88 4.44 草鱼 C. idella 4.62 6.52 尼罗罗非鱼 O. niloticus 2.71 4.18 鳡 E. bambusa 3.65 5.16 瓦氏黄颡鱼 P. vachelli 2.16 3.32 卷口鱼 P. jordani 2.80 3.95 花鰶 C. thrissa 1.82 2.80 赤眼鳟 S. curriculus 2.51 3.55 银鲴 X. argentea 1.35 2.07 鳙 A. nobilis 2.47 3.49 2.4 群落环境影响分析
西江桂平至肇庆江段距河口190~520 km，水体盐度0.08~0.18，pH 7.03~8.28，水温17.5~29.7 ℃，溶解氧5.37~9.12 mg·L−1，氧化还原电位10.4~399.4 mv，透明度20~150 cm，溶解性固体总质量浓度0.11~0.22 g·L−1，叶绿素a质量浓度0.28~6.50 mg·L−1，径流量2 033~22 585 m3·s−1。水温、透明度和径流量季节变化显著(P<0.05，Kruskal-Wallis非参数检验，图5-A—C)。Kruskal-Wallis多重比较检验表明，夏季和秋季水温显著高于春季和冬季(P<0.05，图5-A)，夏季透明度显著低于春季和冬季(P<0.05，图5-B)，夏季径流量显著高于春季和冬季(P<0.05，图5-C)。水温、透明度和径流量的空间变化见图5-E—F，t检验表明长洲坝水利枢纽上游(桂平和濛江镇)与下游(梧州、郁南、德庆和肇庆)间的径流量存在显著差异(P<0.05)。而且透明度和径流量数据存在显著的幂函数关系(图6)，两者的log对数存在显著的线性相关关系(P<0.001)。水体透明度的波动变化，受控于水文调度和河流径流量的变化。
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图 5 季节和站点间水温、透明度和径流量的波动变化Figure 5. Variation of water temperature, transparency and runoff among seasons and sites![]()
图 6 透明度和径流量的幂函数关系Figure 6. Power function relationship between transparency and average runoff鱼类N%-环境因子的RDA分析(图7-A)中，所有环境因子共解释物种数据变异的49.92%，其中第一轴解释了13.00%，第二轴解释了11.71%，主要影响环境因子为距河口距离、水温、径流量、透明度和溶解性固体总量，通过前进式筛选的环境因子为距河口距离和透明度(P<0.05)。RDA三序图上物种在环境变量轴上的投影，反映了物种分布的环境梯度；物种和原点的连线与环境变量轴之间的夹角，反映了物种多度和环境梯度间的相关性[11]。重要物种N%-环境因子的RDA分析表明，瓦氏黄颡鱼、卷口鱼、粗唇鮠、尼罗罗非鱼、银飘鱼、银和南方拟䱗 (Pseudohemiculter dispar) N%与距河口距离正相关，与径流量负相关，主要分布在研究河段上游、低径流量、高透明度的低温水域(图7-B)；鲤和黄颡鱼N%与TDS负相关，分布在TDS含量低的水域；花鰶、鲢和广东鲂N%与距河口距离负相关，与径流量正相关，分布在高径流量的下游江段；鳊、黄尾鲴(Xenocypris davidi)、草鱼和舌虾虎鱼(Glossogobius giuris)分布在研究河段偏下游的高径流量的高温水域；鲮N%与TDS及水温正相关，分布在TDS含量高的高温水域；䱗N%与溶解性固体总量及距河口距离正相关，分布在研究河段上游的TDS含量较高的水域；赤眼鳟和翘嘴鲌(Culter alburnus)位于三序图的原点位置，对环境条件具有较弱的选择倾向。
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图 7 西江鱼类数据-环境变量RDA分析图鱼类N% (A、B)和鱼类W% (C、D) (△代表采样点，+代表物种)；黑色箭头代表环境变量: Chl a. 叶绿素a含量；Dis.. 采样点至河口的距离；DO. 溶解氧含量；ORP. 氧化还原电位；Runoff. 采样前一个月内的平均径流量；Sal.. 盐度；Tra.. 透明度；TDS. 溶解性固体总量；Tem.. 水温；红色字母为物种学名缩写，Cluth. 花鰶；Cteid. 草鱼；Eloba. 鳡；Squcu. 赤眼鳟；Psesi. 银飘；Parpe. 鳊；Hemle. 䱗；Psedi. 南方拟䱗；Megte. 广东鲂；Culal. 翘嘴鲌；Culre. 海南鲌；Xenar. 银鲴；Xenda. 黄尾鲴；Arino. 鳙；Hypmo. 鲢；Squar. 银鮈；Ostsa. 纹唇鱼；Cirmo. 鲮；Cirmr. 麦鲮；Ptyjo. 卷口鱼；Cypca. 鲤；Pelfu. 黄颡鱼；Pelva. 瓦氏黄颡鱼；Leicr. 粗唇鮠；Latma. 花鲈；Oreni. 尼罗罗非鱼；Glogi. 舌虾虎鱼；Rhigi. 子陵吻虾虎鱼Figure 7. RDA plot of fish data and environmental variables in West RiverFish N% (A, B) and fish W% (C, D) (△. Sampling site,+. Species); black arrows represent environmental variables: Chl a. Chl a contents; Dis.. Distance between sampling site and the Pearl River estuary; DO. Dissolved oxygen; ORP. Oxidation-reduction potential; Runoff. Mean daily runoff during the month before the sampling day; Sal.. Salinity; Tra.. Water transparency; TDS. Total dissolved solids; Tem.. Water temperature; red letters indicate species, Cluth. C. thrissa; Cteid. C. idella; Eloba. E. bambusa; Squcu. S. curriculus; Psesi. P. sinensis; Parpe. P. pekinensis; Hemle. H. leucisculus; Psedi. P. dispar; Megte. M. terminalis; Culal. C. alburnus; Culre. C. recurviceps; Xenar. X. argentea; Xenda. X. davidi; Arino. A. nobilis; Hypmo. H. molitrix; Squar. S. argentatus; Ostsa. Osteochilus salsburyi; Cirmo. C. molitorella; Cirmr. C. mrigala; Ptyjo. P. jordani; Cypca. C. carpio; Pelfu. P. fulvidraco; Pelva. P. vachelli; Leicr. L. crassilabris; Latma. Lateolabrax maculatus; Oreni. O. niloticus; Glogi. G. giuris; Rhigi. Rhinogobius giurinus鱼类W%-环境因子的RDA分析(图7-C)中，所有环境因子共解释物种数据变异的49.61%，其中第一轴解释了15.30%，第二轴解释了13.01%，主要环境影响因子为水温、透明度、径流量和距河口距离，通过前进式筛选的环境因子为水温和距河口距离(P<0.05)。重要物种W%-环境因子的RDA分析表明，鲮和草鱼W%与水温和径流量正相关，它们分布在高水温、高径流量、低透明度、叶绿素含量高的水域；广东鲂和鲢W%与距河口距离负相关，倾向于分布在下游江段的高溶氧水域(图7-D)；鲤W%与水温和径流量负相关，倾向于分布在高透明度的低温水域；瓦氏黄颡鱼和赤眼鳟W%与距河口距离正相关，倾向于分布在研究河段的偏上游水域；䱗、麦鲮(Cirrhinus mrigala)和花鰶分布在中等偏高的水温和径流量的环境梯度中；花鲈、鳡、鳙和海南鲌分布在低径流量、低温的下游水域；粗唇鮠、卷口鱼和尼罗罗非鱼分布在中游江段的低温水域。
3. 讨论
3.1 物种多样性呈降低趋势
西江作为珠江水系的干流部分，具有郁江、柳江、北流河、桂江、贺江、罗定江和新兴江等支流汇入，年净流量占珠江总径流量的70%以上，西江水生态系统在很大程度上代表了珠江水生态系统。
在西江桂平至肇庆江段共采集鱼类12目29科99种，鲤科鱼类物种数占46.5%，采集到濒危鱼类花鳗鲡(Anguilla marmorata) 1尾和易危物种花鰶和长臀鮠 (Cranoglanis bouderius)多尾，未采集到鲟形目、赤魟 (Hemitrygon akajei)、鲥(Tenualosa reevesii)和舌鳎(Cynoglossidae)等名贵珍稀物种，确证了其在西江的濒危状态。20世纪80年代西江分布鱼类136种[4-5]，李捷等[5]于2005—2008年在西江梧州至肇庆江段采集鱼类13目29科96种，本研究在上述同一江段采集鱼类11目24科76种，没有采到银鱼科种类和鲽形目种类，西江鱼类物种多样性呈降低趋势。部分种类未被采集到，也反映了渔获物采样调查的随机性，今后应增加调查站点和调查频次。
研究江段外来物种入侵严重，本研究共采集到外来物种5目8科8种，分别为条纹鲮脂鲤(Prochilodus lineatus)、短盖巨脂鲤(Piaractus brachypomus)、麦鲮(C. mrigala)、革胡子鲇(Clarias gariepinus)、斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)、豹纹翼甲鲶(Hypostomus plecostomus)、食蚊鱼(Gambusia affinis)和尼罗罗非鱼(O. niloticus)。在全球范围内，伴随河流生境受干扰程度加剧，例如水坝拦截加强了原分离生态系统的联系，促进了外来物种的成功定殖[12]，生物入侵已成为影响河流生物群落和生态系统的重要因素[13]。入侵种通过食物竞争、捕食关系和栖息地竞争等，导致土著种群生态位萎缩甚至种群灭绝[14]。故西江土著鱼类的保护和管理，一定程度上应从控制外来生物入侵着手。
3.2 鱼类群落的时空结构
西江桂平至肇庆江段鱼类物种组成和群落结构呈现出显著的时空演替。物种组成时空分布变化明显，为季节和空间的群落周转格局，同张东等[15]研究的河流中、下游间的分类群变化趋势一致。优势种组成和群落结构均存在显著季节差异，鱼类优势度的季节更替以鲮最为显著，夏、秋、冬季鲮为第一优势种，而在春季鲮优势度较低；夏—冬季间群落结构的季节差异，主要源于鲤、鲮、广东鲂、赤眼鳟、鲢、草鱼和尼罗罗非鱼W%的差异。
河流生态系统是一个具连续性和异质性特点的线性结构[16-17]，沿着这一线性结构理化环境梯度的改变，鱼类区系组成和群落结构往往发生空间演替[18]。本研究中圆筒体形的鲤科种类银、蛇和卷口鱼是近上游桂平和濛江镇江段的特有优势种，侧扁体形的鲱形目种类花鰶是下游肇庆江段的特有优势种。与本研究类似，欧洲河流上、下游间的鱼类区系和体形特征也发生了有规律的变化：从上游至下游“鲑科—鲤科”的变化[18]，以及从上游圆筒体形至中下游的侧扁体形的变化[8]。桂平江段与梧州、肇庆江段群落结构的显著差异，主要源于鲮、广东鲂、银等物种的空间分布差异。流域内鱼类群落空间变化与环境变化密切相关，连续性变化的环境条件下，群落多呈嵌套式空间格局，但跳跃式变化的环境条件，会导致群落呈周转格局[8]。因此，本研究中桂平江段较高的物种多样性，以及桂平—肇庆江段间鱼类分类群的周转格局，一定程度上由环境条件的非连续性跳跃变化引发。
3.3 影响鱼类群落的主要环境因子
物种组成和群落结构的时空动态主要由环境因子(人类干扰、气候和水文因子等)在时空尺度上的异质性引起[3]。本研究中RDA分析表明影响鱼类分布的主要因子为距河口距离、水温、透明度和径流量。
距河口距离通过影响鲮、广东鲂、银、鲤、鲢、尼罗罗非鱼等鱼类在不同江段间的分布，导致了桂平江段与梧州和肇庆江段间的群落结构差异。桂平与梧州江段间的长洲水利枢纽被推测为重要影响因素。水坝通过改变河流水文状况和河流连通性等影响鱼类群落[12]。2007年8月长洲水利枢纽开始下闸蓄水[19]，限制了洄游性鱼类广东鲂的生殖洄游，其上溯洄游路线已受到严重干扰，2012年以来，每年的6—7月在梧州江段形成大规模的广东鲂渔汛，而长洲坝上游的桂平和濛江镇江段的广东鲂的分布受到限制。长洲坝也改变了西江水文状况，将部分河段由动态环境转变为静态环境，桂平江段形成了低径流量的缓流库区，由于鲤具有中等水深和缓流静水区的倾向性[20]，吸引了鲤聚集于桂平江段并形成优势种。笔者发现自2004年底长洲水利枢纽初步截流以来，其下游鲤种群资源量显著低于上游江段。长洲水利枢纽阻隔引起的河流水文状况的改变和栖息地的片段化，是导致桂平与梧州、肇庆江段鱼类群落结构差异的重要因素。
水温是决定河流生态环境的重要因子，影响其他环境因子，另外作用于鱼类的分布、生长、繁殖和迁移分布等[21]。河流水温的季节性波动显著影响了水生物种的分布(河流连续性理论[17])，如高温促使鱼类生理需氧量增加同时又降低水体中溶氧饱和度，导致鱼类分布受限或死亡[16]。多数鱼类存在特定的适宜温度范围，适宜温度范围和河流水温共同决定了鱼类的时空分布[22]。鲮的季节性分布与其适温范围密切相关，鲮适宜水温为22~26 ℃[23]，本研究中夏、秋季平均水温分别为(27.86±1.62) ℃和(27.57±1.65) ℃，适宜于鲮繁殖产卵和广泛分布[24]；冬、春季平均水温分别为(18.25±0.87) ℃和(17.92±0.18) ℃，不利于鲮的广泛分布，但冬季郁南江段分布有大量鲮，初步推测郁南江段是鲮的越冬场。冬季鲤优势度较高，源于其较强的耐低温能力，其适宜温度为0~30 ℃，甚至可耐受0~4 ℃达数月之久[25]。RDA分析表明鲤、广东鲂、鲮和赤眼鳟具有不同的水温分布梯度(图7)，鲮分布在较高水温，赤眼鳟和广东鲂次之，鲤在低水温环境中具有较高的N%、W% (图7-B、D)。因此，水温的季节性波动显著影响了鱼类物种的N%、W%和IRI，导致了群落结构的季节性差异。
径流量和流速也是影响鱼类分布和繁殖产卵的重要环境因子。本研究中长洲坝上、下游江段间径流量的显著差异，以及对应站点间鱼类群落结构的显著差异，表明长洲坝已改变了西江水文环境，并作用于了鱼类分布。水坝拦截引起的水位、流速和径流量等水文状况的改变，是水坝影响鱼类群落的最广泛性作用机制[12]。另外，四大家鱼的繁殖产卵对径流量具有一定的水文需求，易雨君[26]模拟的四大家鱼栖息地适合度模型显示，日流量涨幅在800 m3·s−1时具有较高的家鱼产卵场适合度；珠江鳙大量繁殖的基础水文需求为持续2 d以上高于5×103 m3·s−1的径流量[27]。本研究中草鱼、鲢和鳙在夏、秋季具有较高的W%，同时夏、秋季具有持续整月的高于5×103 m3·s−1的径流量(图5-B)，日流量涨幅高于800 m3·s−1的月均天数分别为8.9 d和5 d，该水文条件满足了家鱼产卵需求，适于草鱼、鲢和鳙的分布和繁殖。
透明度与水深、径流量、水体理化因子以及水生植物生物量密切相关[28]，并作用于鱼类的分布、摄食和繁殖活动[3]。与多数江河鱼类群落和湖泊鱼类群落研究一致[3,28-29]，透明度对西江鱼类分布具有重要影响。透明度对鱼类分布的影响，与径流量关系密切，涨水引起营养盐浓度增大，但也会导致水体透明度降低[30]。本研究中水体透明度的波动变化，受控于水文调度和河流径流量的变化，两者协同影响鱼类分布(图6)。
综上，2016—2018年在西江桂平至肇庆江段共采集鱼类12目29科99种，与前期调查比较，鱼类多样性降低，外来种增多。鱼类群落物种组成变化为季节和空间的周转格局；物种优势度时空变化显著，优势种鲮、广东鲂、赤眼鳟和鲤的优势度均具有明显的季节和空间变化(图3、图4)；群落结构时空差异显著，主要表现为夏—冬季间的群落结构差异，以及桂平和梧州、肇庆江段间的群落结构差异；影响物种分布的主要环境因子为距河口距离、水温、透明度和径流量。西江鱼类群落空间断裂显著，一定程度上是长洲水利枢纽的拦截阻隔所致，应加强水坝过鱼通道管理等工作，以提高西江上、下游的连通性。
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图 1 不同流速下豹纹鳃棘鲈肝脏组织 (H.E染色)
a. HFV低倍镜观察；b. LFV低倍镜观察；c. HFV高倍镜观察；d. LFV高倍镜观察。
Figure 1. Liver tissues (H.E staining) of P. leopardus with different flow velocities
a. Observation of sections with low magnification for HFV; b. Observation of sections with low magnification for LFV; c. Observation of sections with high magnification for HFV; d. Observation of sections with high magnification for LFV.
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图 2 不同流速下豹纹鳃棘鲈肝脏组织 (油红O染色)
a. HFV低倍镜观察；b. LFV低倍镜观察；c. HFV高倍镜观察；d. LFV高倍镜观察。
Figure 2. Liver tissues (Oil red O staining) of P. leopardus with different flow velocities
a. Observation of sections with low magnification for HFV; b. Observation of sections with low magnification for LFV; c. Observation of sections with high magnification for HFV; d. Observation of sections with high magnification for LFV.
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图 4 豹纹鳃棘鲈差异表达基因KEGG富集图
Figure 4. KEGG enrichment of differentially expressed genes of P. leopardus
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图 6 SNP突变类型统计分布图
A. 腺嘌呤；T. 胸腺嘧啶；C. 胞嘧啶；G. 鸟嘌呤。
Figure 6. Statistical distribution of type of SNP mutations
A. Adenosine; T. Thymine; C. Cytosine; G. Guanine.
表 1 本研究所用引物及其序列
Table 1 Sequences of primers used in this study
基因编号
Gene ID基因
名称
Gene name引物序列
Primer sequenceutg000043l-1.624 cyp7b1 F: ACTTCATCGCCCTCTACCCTC R: TGAGCCTCTGACCGTCTTTG utg000067l-2.111 nr1d2 F: CCTCTGGTTTCCATTACGGG R: ATCAGGCATTTCTTGAAGCG utg000067l-3.316 ciart F: TTCAGTGAGAGCGAGCACAC R: TTGGTTTCTTCAGGGCAGTG utg000134l-0.116 cpt1a F: AGCACCTGACTGACCGTAAGC R: GCATCTCAAGTTCACTGGGTAAG utg000150l-1.275 irs2 F: TGACATCAGCGACCCTTGTG R: CGCCACTACTCTCTGTTGACG utg000157l-1.277 scm2a F: GCAGCAAAGACTGGAGCAAG R: TCGGTGAACTCATCTGGCAC utg000241l-0.137 lat3 F: CAGGAAGAGATGTTGAACCTTGG R: GCGAGGAAGATGAGACCAGAC utg000253l-0.17 wsb2 F: GCCACAGGTTTGGAGAACAG R: AACACCAGGTCCCTCACTACAC utg001131l-0.55 per1 F: CTCAAATACGCACTTCAATGTGTC R: TGAGGGTGTACTCTGAGGTGATG utg000003l-2.243 acod F: AGCAATGTTCTCCCTGAGGC R: CCAAAGCAAGGTCAAAGGATG utg000129l-0.32 cyp2j2 F: GGCAACTTATTCTCTGTGGATTTC R: GCTGTCTCCCTGATTTACCAGTG utg000134l-1.177 chka F: CTTTCACATCACCATCATAAGGG R: CTTTGTTTGACTGTCGGGAATC utg000537l-0.141 acsbg2 F: GCAGCAGAAGAGCCTGACCTAC R: TAGATGCCAACAGCAAACCC utg000714l-0.135 fasn F: TGAGAAACACTCTGACACGAATG R: TCAAAGCGTAGCCTCGGTAG 
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表 2 豹纹鳃棘鲈肝脏文库测序数据量统计
Table 2 Output statistics of P. leopardus liver library sequencing
样品编号
Sample ID有效读长
Clean readsGC含量
GC content/%Q30的碱基数比例
Base ratio of Q30/%比对效率
Mapping efficiency/%SP10-1 26861 072 51.42 95.30 93.78 SP10-2 35829 110 51.51 95.05 93.53 SP10-3 23503 733 50.44 94.98 93.65 SP40-1 28594 219 51.54 95.23 93.16 SP40-2 28147 723 51.04 95.20 92.82 SP40-3 24705 424 51.00 94.80 92.77
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表 3 豹纹鳃棘鲈不同流速显著差异通路中部分候选基因表达模式
Table 3 Expression pattern of partial candidate genes of P. leopardus in significant pathways with different flow velocity
基因ID
Gene IDlog2 (差异倍数)
log2 (Fold change)FDR 登录号
Accession No.基因名
Gene nameutg000134l-0.116 −5.33 1.87×10−31 XP_008289244.1 cpt1a utg000043l-1.624 −3.55 9.54×10−166 XP_008291411.1 cyp7b1 utg000150l-1.275 −2.30 1.64×10−132 XP_018557299.1 irs2 utg000761l-0.82 −1.78 6.66×10−125 XP_018522996.1 angptl4 utg000248l-0.27 −1.64 1.10×10−12 XP_018560228.1 socs3 utg000172l-0.359 −1.59 4.89×10−195 XP_019209058.1 cyp46a1 utg000527l-0.63 −1.42 2.67×10−13 XP_018558522.1 acsl1 utg000455l_0.134 −1.41 9.36×10−31 XP_010731808.1 aqp7 utg000250l-2.242 −1.39 6.13×10−46 XP_019119573.1 adipor2 utg000129l-0.162 −1.21 1.22×10−37 XP_018522970.1 rxrgb utg000097l-1.90 −1.08 1.01×10−7 XP_019120297.1 traf2 utg000349l-0.213 −1.03 1.05×10−5 XP_018534038.1 dgke utg000794l-0.76 −1.02 1.54×10−6 XP_019126544.1 prkag2 utg000088l-2.212 −1.01 3.89×10−47 XP_020505581.1 akr1a utg000841l-0.8 1.01 4.13×10−8 XP_022072468.1 tradd utg000329l-0.218 1.03 8.07×10−32 XP_018527840.1 abhd16a utg001296l-0.11 1.07 7.82×10−5 XP_018525976.1 slc27a4 utg000225l-0.155 1.11 6.08×10−33 XP_018531738.1 lpin2 utg000681l-0.96 1.12 2.09×10−6 XP_018530981.1 acsl4 utg000325l-0.118 1.16 5.97×10−4 XP_005472382.1 hxk2 utg000841l_0.93 1.51 1.23×10−24 XP_018522449.1 adpgk utg000519l-0.406 1.82 1.04×10−29 XP_018527726.1 kmt5c utg000454l-0.43 1.98 3.21×10−12 XP_018528735.1 psat1 utg000537l-0.141 2.39 2.05×10−33 XP_020511829.1 acsbg2 utg000393l-0.311 10.65 3.25×10−128 XP_018529751.1 crhbp
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表 4 SNP位点统计表
Table 4 Output statistics of SNP loci
样品编号
Sample IDSNP位点数
Number of SNP基因区SNP
Genic SNP基因间区SNP
Intergenic SNP转换类型占比
Transition/%颠换类型占比
Transversion/%SP10-1 161 388 121 218 40 170 30.88 93.78 SP10-2 178 270 133 923 44 347 31.22 93.53 SP10-3 171 685 129 389 42 296 31.37 93.65 SP40-1 168 801 126 800 42 001 31.69 93.16 SP40-2 171 772 128 821 42 951 31.79 92.82 SP40-3 165 186 123 814 41 372 31.79 92.77
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