豹纹鳃棘鲈差异流速下肝脏转录组分析

高进; 王永波; 刘金叶; 郭一兰; 符书源

doi:10.12131/20210125

豹纹鳃棘鲈差异流速下肝脏转录组分析

高进^{1, 2,},
王永波^{1, 2},
刘金叶^{2, 3},
郭一兰^{1, 2},
符书源^{1, 2, 3, ,}

1.
海南热带海洋学院/热带海洋生物资源利用与保护教育部重点实验室，海南三亚 572022
2.
海南省海洋与渔业科学院，海南海口 571126
3.
海南省热带海水养殖工程技术研究中心，海南海口 571126

基金项目: 海南省重点研发计划项目 (ZDYF2019074, ZDYF2020093)；2021海南省科研院所开发专项

详细信息

作者简介:
高　进 (1991—)，男，助理研究员，博士，从事水产动物基因组与数量遗传育种研究。E-mial: gaojin@hntou.edu.cn

通讯作者:
符书源 (1981—)，男，副研究员，硕士，从事海水鱼类繁育与健康养殖技术研究。E-mail: fulank23@sohu.com

中图分类号: S 917.4
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出版历程
- 收稿日期: 2021-04-21
- 修回日期: 2021-07-18
- 录用日期: 2021-07-28
- 网络出版日期: 2021-08-10
- 刊出日期: 2022-02-04

Transcriptome analysis of Plectropomus leopardus liver under different flow velocity

GAO Jin^{1, 2,},
WANG Yongbo^{1, 2},
LIU Jinye^{2, 3},
GUO Yilan^{1, 2},
FU Shuyuan^{1, 2, 3, ,}

1.
Hainan Tropical Ocean University/Key Laboratory of Utilization and Conservation for Tropical Marine Bioresources, Ministry of Education, Sanya 572022, China
2.
Hainan Academy of Ocean and Fisheries Sciences, Haikou 571126, China
3.
Hainan Provincial Engineering Research Center for Tropical Sea-Farming, Haikou 571126, China

摘要

摘要: 水流速度是影响鱼类生长的重要环境因子之一。为探究豹纹鳃棘鲈 (Plectropomus leopardus) 在不同流速条件下相关基因的功能和表达情况，利用RNA-Seq技术对差异流速下的豹纹鳃棘鲈肝脏组织进行了转录组分析。挑选相同繁育批次中规格一致的豹纹鳃棘鲈幼苗，分别在正常流速 (0.1 m·s⁻¹, Low flow velocity, LFV) 和高流速 (0.4 m·s⁻¹, High flow velocity, HFV) 实验组中养殖150 d后进行肝脏转录组测序分析，探究豹纹鳃棘鲈在差异流速下个体间的基因表达模式差异。结果显示，经筛选后共获得1 977个LFV-HFV显著性差异表达基因 (Differentially expressed genes, DGE)，其中上调基因999个，下调基因978个。GO功能注释分类发现，共有1 124个DEGs被GO数据库注释到并归属为56个功能类别。KEGG富集分析结果显示，573个DEGs参与了154条KEGG通路，其中富集最显著的为PPAR信号通路。LFV和HFV两组鱼的肝脏组织学观察结果显示，两者之间脂肪含量差异明显，LFV组肝脏中的脂肪含量显著高于HFV组 (P<0.05)。通过转录组分析，筛选了大量豹纹鳃棘鲈差异流速下的DGEs，为深入探讨豹纹鳃棘鲈对流速变化适应性的分子调控机制提供了技术支撑。
- 豹纹鳃棘鲈 /
- 差异流速 /
- 转录组分析
Abstract: Water flow velocity is one of important eco-environment factors which affects the fish growth. In order to explore the function and expression of related genes of Plectropomus leopardus under different flow velocity, we conducted a transcriptome analysis of liver tissue of P. leopardus under different flow velocity by RNA-seq technology. We selected the fish fry of P. leopardus with identical size from the same breeding batch and cultured them for 150 d with water flow velocity of 0.1 m·s⁻¹ (Low flow velocity, LFV) and 0.4 m·s⁻¹ (High flow velocity, HFV). Then, we conducted a transcriptome analysis on the liver so as to investigate the difference of gene expression patterns with different flow velocity. We had obtained a total of 1 977 differentially expressed genes (DEGs) by transcriptome analysis (999 up-regulated and 978 down-regulated for LFV-HFV, respectively). The GO functional annotation reveals that 1124 DEGs were annotated in Gene Ontology Consortium and assigned to 56 functional terms. KEGG pathway analysis shows that 573 DEGs belonged to 154 pathways, and PPAR signaling pathway was most significantly enriched. Histological observation of livers of the tested fish indicates that the difference in fat contents between LFV and HFV group was significant, and the fat content was obviously higher in LFV than in HFV (P<0.05). According to the transcriptome analysis, we excavated many DEGs under different flow velocity, which provids technical support for further research on the molecular regulation mechanism of adaptability to change in flow velocity of P. leopardus.
- Plectropomus leopardus /
- Different flow velocity /
- Transcriptome analysis

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鱼类在与外界环境进行物质交换时，环境中的化学元素不断被摄入鱼体，通过鱼类的鳃呼吸等方式进入血液，在鱼体内经过一系列的代谢和循环，最终沉积到耳石。现已发现耳石中含有钙(Ca)、铝(Al)、锶(Sr)、铁(Fe)、钠(Na)、钾(K)、氯(Cl)、氮(N)和硫(S)等多种化学元素^[1-3]。在耳石的组成成分中，碳酸钙(CaCO₃)占96.2%，痕量元素占0.7%，有机质占3.1%。耳石在形成过程中其轮纹形态结构与化学组成相当稳定，记录了鱼类个体生活过程中丰富的生物-物理-化学环境信息，所以，耳石信息分析可以揭示鱼类的生活史及其所经历的环境变化^{[1, 4]}。研究表明，水体盐度、食物中Sr的含量、生长的季节变化和生殖周期等生理因素均可能影响元素在耳石中的沉积^[5-6]。海、淡水洄游性鱼类从海水进入淡水或从淡水进入海水后耳石中Ca、Sr等元素的沉积量也会有明显的变化^[7-9]。许多因素影响着耳石中的锶/钙(Sr/Ca)比率，并且一些因素对耳石中的Sr/Ca比率具有协同影响作用^[10]。一般认为耳石各部分元素沉积量与环境中该元素的可利用率以及水化学特性等有关^[3-4]。此外，耳石中化学元素的沉积是一个生理过程，与环境温度也关系密切^[11]。所以，很多学者认为分析耳石中化学元素的沉积规律有助于鱼类生活史的研究^[12]，甚至通过耳石中化学元素的分析来研究水域的污染度。Ca对动物生理机能有着重要作用，是构成骨、齿、鳞及甲壳的主要成分。Ca在组织中参与肌肉收缩、血液凝固、神经传导、渗透压调节、某些酶的激活以及细胞膜的完整性和通透性的维持等生理作用。水中钙离子(Ca²⁺)质量浓度不同能影响水生生物的产卵孵化^[13]、成活和生长^[14-16]。

褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)，俗称牙片、偏口、比目鱼，是名贵的暖温性、底栖海产经济鱼类，也是中国北方沿海重要的海水增养殖鱼类之一。目前，还未见关于Ca²⁺质量浓度对褐牙鲆鱼体和耳石元素积累方面的研究。文章通过研究Ca²⁺质量浓度对褐牙鲆鱼体组分和耳石成分的影响，探求其影响褐牙鲆生长的化学成分机制。

1. 材料与方法

1.1 试验材料

试验鱼于2008年5月29日购自山东省文登市小观镇养殖场，于室内循环水槽暂养20 d。暂养期间，水温(20±0.5)℃，pH(7.80±0.40)，盐度30，连续充气，每天饱食投喂山东升索牌牙鲆颗粒饲料2次(08: 00和18: 00)。

1.2 试验设计和海水配置

为排除其他离子成分的干扰，试验用水以海水素和自来水配制。海水素为中国海洋大学海水素厂专门设计和生产的无钙海水素。保证其他离子成分和总盐度(30)基本不变，分别由氯化钙(CaCl₂)、硫酸镁(MgSO₄·6H₂O)或氯化镁(MgCl₂·7H₂O)降低和增加Ca、Mg含量，盐度差值部分由无钙海水素补充。Ca²⁺、镁离子(Mg²⁺)质量浓度用EDTA络合滴定法测定。在预试验基础上设置了5个处理组，按ρ(Ca²⁺)不同设为A、B、C、D和E共5组，其中B组(对照)中ρ(Ca²⁺)为正常海水值(表 1)。暂养结束后试验鱼停食24 h，从中选取600尾大小均匀、体质量为(4.06±0.04)g的褐牙鲆幼鱼用作试验。用纱布吸干鱼体表水分，精确称质量到0.01 g。按照每组3个平行，每个水族箱(120 L)放养试验鱼40尾。每天早、晚各投喂1次(8：30和18：00)。试验为期60 d，试验期间投喂规格为P1饵料(山东升索牙鲆颗粒饲料)。

表 1 各处理组人工海水中钙离子浓度(X ±SD)

Table 1. Ca²⁺ concentration in different artificial seawater treatments

	处理组/mg·L^-1 treatments
	200 A	400(对照 control) B	800 C	1 600 D	3 000 E
钙/镁Ca²⁺/Mg²⁺	1/5.80	1/2.82	1/1.41	1/0.71	1/0.37
ρ(钙离子)/mg·L^-1 Ca²⁺	194±15	418±24	780±37	1 567±52	2 935±73
ρ(镁离子)/mg·L^-1 Mg²⁺	1 126±46	1 179±52	1 097±53	1 117±44	1 080±63

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1.3 日常管理

每天补充因收集残饵和粪便流失的水量，每隔5~7 d按水族箱1/3~1/2量换一次水(补水和换水为提前配好的试验用水，保持各试验组ρ(Ca²⁺)、ρ(Mg²⁺)不变，试验期间保持光照[光照(L) : 黑暗(D)]14L : 10D，pH为7.80±0.40，ρ(DO)为(7.30±0.41)mg·L^-1，氨氮(NH₄-N)质量浓度低于0.05 mg·L^-1，温度设定在(20±0.50)℃。

1.4 样品处理和分析

试验结束后用纱布吸干鱼体水分称体质量，用烘箱在70 ℃烘干至恒质量，磨碎。耳石去除包膜和黏液，清洗后60 ℃烘烤24 h，于干燥器中冷却后，用电子天平称质量，精确到0.01 mg。取磨碎的全鱼和耳石样品分别经高氯酸和硝酸消化后^[17]，经电感耦合等离子体原子发射光谱仪(Icp-Oes；Vista-Mpx，Varian)测定样品成分。每个试验组取15尾鱼，每个样品测定3次，取平均值。在解剖镜下观察耳石形态、测量其长和宽(μm)^[18-19]，并拍照(图 1)。

图 1 不同质量浓度钙对牙鲆耳石形态的影响

a~e. 试验组A~E；标尺50 μm

Figure 1. The effects of different calcium concentrations on P.olivaceus otalith morphology

a~e. group A~E; bar is 50 μm

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1.5 数据计算和统计分析

对所有试验数据进行单因子方差分析，如果差异显著，进一步对各处理组进行Duncan′s多重比较，以P < 0.05作为差异显著的标准。数据的统计分析采用SPSS 13.0进行。

2. 结果

2.1 水体Ca²⁺质量浓度对鱼体成分的影响

试验发现鱼体中含有多种元素，其中Ca、磷(P)、Na、镁(Mg)元素质量分数接近或超过1 mg·g^-1，各元素在鱼体中顺序为w(P)>w(Ca)>w(Na)>w(Mg)>w(Sr)(表 2)。w(Ca)在各组中差异不显著(P>0.05)，各组间w(Ca)、w(P)、w(Na)、w(Mg)的差异均显著(P < 0.05)。其中E组w(P)显著低于A和B组，分别为66.24%和65.13%(P < 0.05)；C组w(Na)显著低于A和B组，分别为70.19%和67.85%(P < 0.05)；E组w(Mg)显著低于A和B组，为68.53%和66.67%(P < 0.05)；A和B组w(Sr)显著高于其他各组(P < 0.05)。同时鱼体中含有多种微量元素，在鱼体中顺序为w(Fe)>w(锌)(Zn)>w(锰)(Mn)>w(铜)(Cu)>w(镍)(Ni)，各组间w(Zn)和w(Cu)差异不显著(P>0.05)；A组w(Fe)、w(Mn)和w(Ni)显著高于B、C、D和E组(P < 0.05)，A组w(Mn)显著高于C和E组(P < 0.05)，A组w(Ni)显著高于C、D和E组(P < 0.05)(表 3)。

表 2 不同钙离子质量浓度下褐牙鲆鱼体主要元素成分的变化(X ±SD，n=3)

Table 2. Main element content of P.olivaceus in the artificial seawater with different Ca²⁺ concentrations mg·g^-1

处理组 treatments	w(磷) P	w(钙) Ca	w(钠) Na	w(镁) Mg	w(锶) Sr
A	21.18±0.99^b	12.44±0.56^a	4.63±0.32^bc	1.43±0.06^b	0.27±0.01^c
B	21.54±2.10^b	12.52±0.99^a	4.79±0.34^c	1.47±0.14^b	0.14±0.02^b
C	16.32±2.62^ab	11.58±0.87^a	3.25±0.60^a	1.12±0.16^ab	0.07±0.01^a
D	18.32±1.25^ab	12.91±1.01^a	4.00±0.15^abc	1.25±0.08^ab	0.07±0.01^a
E	14.03±1.48^a	11.50±0.50^a	3.44±0.41^ab	0.98±0.11^a	0.04±0.00^a
注：同一行数字不同上标字母表示差异显著(P < 0.05)；后表同此 Note：Values with different superscripts within the same line are singnificantly different(P < 0.05).The same case in the following tables.

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表 3 不同钙离子质量浓度下褐牙鲆鱼体微量元素成分的变化(X ±SD，n=3)

Table 3. Microelement content of P.olivaceus in the artificial seawater with different Ca²⁺ concentrations μg·g^-1

处理组 treatments	w(铁) Fe	w(锌) Zn	w(锰) Mn	w(铜) Cu	w(镍) Ni
A	60.14±4.54^b	56.97±1.14^a	47.46±4.40^b	9.29±2.47^a	5.41±1.93^b
B	32.11±1.63^a	58.84±0.39^a	41.85±4.64^ab	8.35±1.35^a	2.67±0.11^ab
C	31.13±4.37^a	42.80±4.00^a	30.84±3.60^a	3.99±0.40^a	0.97±0.30^a
D	35.87±5.89^a	48.68±11.42^a	34.64±3.59^ab	6.79±1.94^a	0.73±0.48^a
E	32.09±3.29^a	48.23±3.71^a	32.36±3.54^a	4.19±0.25^a	1.20±0.24^a

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2.2 耳石常规指标分析

各组试验鱼体长、体质量差异均不显著(P>0.05)(表 4)。A组耳石长显著低于B组和C组，分别为B组和C组的92.38%和90.77%(P < 0.05)；A组耳石宽也显著低于B组和C组，分别为90.10%和95.71%(P < 0.05)；A组耳石长宽比L/W显著低于D组，为D组的94.77%(P < 0.05)；A组的耳石质量显著低于B组和D组，分别为89.69%和90.16%(P < 0.05)。通过拟合得到各组褐牙鲆耳石长和耳石质量的关系分别为A组y=0.648 2e^{0.005 6x}，R²=0.565 8；B组y=2.275 8e^{0.001 6x}，R²=0.276 6；C组y=1.084 4e^{0.003 9x}，R²=0.281 2；D组y=0.766 8e^{0.004 9x}，R²=0.481 3；E组y=0.523 9e^{0.006 2x}，R²=0.721 8(图 2)。

表 4 不同钙离子质量浓度下褐牙鲆耳石形态特征的变化(X ±SD)

Table 4. The variation of otolith morphology of P.olivaceus in the artificial seawaterwith different Ca²⁺ concentrations

处理组 treatments	体质量/g body weight	体长/cm body length	耳石长/μm otolith length	耳石宽/μm otolith width	耳石长/宽比(L/W) length/width	耳石质量/mg otolith weight
A	23.18±1.28^a	13.78±0.29^a	297.30±4.60^a	205.57±3.02^a	1.45±0.02^a	3.48±0.12^a
B	24.99±1.27^a	14.41±0.21^a	321.83±8.26^bc	216.17±2.41^c	1.49±0.03^ab	3.88±0.10^b
C	22.53±0.86^a	13.73±0.18^a	309.54±3.20^ab	209.25±2.62^abc	1.48±0.02^ab	3.63±0.08^ab
D	25.05±1.01^a	14.24±0.17^a	327.52±3.31^c	214.79±2.28^bc	1.53±0.02^b	3.86±0.09^b
E	22.48±0.84^a	13.80±0.17^a	308.06±4.58^ab	206.88±3.32^ab	1.49±0.01^ab	3.59±0.12^ab

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图 2 不同钙离子质量浓度下褐牙鲆耳石长和耳石质量的关系

Figure 2. Correlation between otolith length and weight of P.olivaceus in the artificial seawater with different Ca²⁺ concentrations

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2.3 水体Ca²⁺质量浓度对耳石元素成分的影响

褐牙鲆耳石中含有多种元素，主要元素在鱼体中顺序为w(Ca)>w(Na)>w(Sr)>w(Mg)>w(Fe)(表 5)。其中各处理组耳石中w(Ca)差异均不显著(P>0.05)，w(Sr)随ρ(Ca²⁺)增加显著下降(P < 0.05)；各处理组耳石w(Na)和w(Fe)差异不显著(P>0.05)；D组w(Mg)显著低于B组和C组，为82.61%和61.29%(P < 0.05)。耳石中存在多种微量元素，w(P)>w(Cu)>w(Mn)>w(铅)(Pb)>w(Ni)，各处理组w(Mn)和w(Ni)差异不显著(P>0.05)，A和C组w(P)和w(Pb)显著高于其他组(P < 0.05)；C组w(Cu)显著高于其他各组(P < 0.05)(表 6)。分析耳石微量成分发现，Sr/Ca、Mg/Ca随水体ρ(Ca²⁺)增加而显著下降；E组Cu/Ca显著低于B组和C组，分别为B、C组的87.5%和87.5%(P < 0.05)；各处理组Fe/Ca差异不显著(P>0.05)(表 7)。

表 5 不同钙离子质量浓度下褐牙鲆耳石主要元素成分的变化(X ±SD)

Table 5. Main element content in otolith of P.olivaceus in the artificial seawater with different Ca²⁺ concentrations mg·g^-1

处理组 treatments	w(钙) Ca	w(钠) Na	w(锶) Sr	w(镁) Mg	w(铁) Fe
A	26.05±0.13^a	3.47±0.05^a	2.54±0.03^d	0.21±0.02^ab	0.08±0.01^a
B	24.25±0.84^a	3.52±0.04^a	1.16±0.01^c	0.23±0.01^b	0.08±0.01^a
C	27.44±0.31^a	3.54±0.03^a	0.88±0.01^b	0.31±0.01^c	0.10±0.01^a
D	24.44±0.41^a	3.60±0.00^a	0.70±0.01^a	0.19±0.01^a	0.08±0.01^a
E	27.77±1.14^a	3.64±0.16^a	0.73±0.03^a	0.21±0.01^ab	0.09±0.01^a

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表 6 不同钙离子质量浓度下褐牙鲆耳石微量元素成分的变化(X ±SD)

Table 6. Microelement content in otolith of P.olivaceus in the artificial seawater with different Ca²⁺ concentrations μg·g^-1

处理组 treatments	w(磷) P	w(铜) Cu	w(锰) Mn	w(铅) Pb	w(镍) Ni
A	51.18±2.39^b	29.50±2.11^a	19.09±0.52^a	8.87±1.12^b	1.81±0.40^a
B	44.41±3.37^a	29.19±1.35^a	21.45±3.33^a	4.74±1.04^a	1.02±0.21^a
C	55.44±1.52^b	36.84±1.72^b	18.01±1.02^a	7.69±0.82^b	0.83±0.42^a
D	42.49±0.78^a	27.57±1.31^a	20.27±1.92^a	4.63±0.78^a	1.27±0.33^a
E	38.78±2.31^a	30.46±2.24^a	15.77±2.53^a	4.13±0.62^a	1.01±0.37^a

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表 7 不同钙离子质量浓度下褐牙鲆耳石主要元素比例的变化(X ±SD)

Table 7. Element ratio in otolith of P.olivaceus in the artificial seawater with different Ca²⁺ concentrations

处理组 treatments	锶/钙 Sr/Ca	镁/钙 Mg/Ca	铁/钙 Fe/Ca	铜/钙 Cu/Ca
A	44.68±0.32^e	13.59±1.02^b	2.24±0.25^a	0.72±0.05^ab
B	21.82±0.13^d	15.71±0.11^c	2.40±0.08^a	0.75±0.00^b
C	14.62±0.39^c	18.42±0.27^d	2.60±0.09^a	0.85±0.03^c
D	13.01±0.18^b	12.91±0.10^ab	2.34±0.15^a	0.71±0.01^ab
E	12.11±0.25^a	12.41±0.28^a	2.24±0.09^a	0.66±0.01^a

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3. 讨论

3.1 耳石形态

鱼类耳石的形态、大小、功能和微结构特征随种类而存在差异，因此，鱼类耳石不仅可作为分类鉴别的特征之一，而且可作为鉴定年龄和分析生长的材料^{[18, 20-22]}。研究表明，水温、盐度、离子浓度等均可能影响鱼类耳石的形成^{[2, 23-24]}。叶振江等^[25]研究了2种鲈鱼(Lateolabrax sp.)耳石形态的地理变异，发现鲈(Lateolabrax japonicus)与花鲈(L.maculates)耳石形态、耳石质量-耳石长的关系差异显著；并认为中国近海不同海域的花鲈群体耳石形态存在显著地理差异。STRANSKY^[26]通过耳石形态分析了平鲉(Sebastes marinus)和尖吻平鲉(S.mentella)的地理差异，获得较高的判别率。郭弘艺等^{[19, 27]}研究了中国鲚属鱼类矢耳石的形态特征，发现海水种类或海水生活周期较长种类的矢耳石要明显大于淡水种类或海水生活周期较短的种类，即在海水生活阶段矢耳石元素的沉积速度要明显大于在淡水生活阶段；并且认为耳石形态分析在近缘种判别方面具有良好的应用前景。KATAYAMA和ISSHIKI^[28]研究了褐牙鲆耳石形态特征以区分养殖和野生鱼，发现野生鱼耳石更趋于椭圆，而养殖鱼耳石边缘粗糙不清晰，且水温和投饵条件对耳石形态没有影响。区又君等^[29-31]研究了黄唇鱼(Bahaba flavolabiata)、大黄鱼(Pseudosciaena crocea)和棘头梅童鱼(Collichthys lucidus)耳石的形态特征和微结构，总结了这几种鱼类耳石形态的异同及鉴别特征。

环境中ρ(Ca²⁺)的改变也可能影响鱼类耳石的发育。笔者试验发现，水体ρ(Ca²⁺)变化后鱼体耳石外部形态受到显著影响(图 1)，高ρ(Ca²⁺)组耳石长/耳石宽显著大于低ρ(Ca²⁺)组和对照组。通过拟合发现，各试验组褐牙鲆耳石长和耳石质量的关系式基本符合指数关系，水体ρ(Ca²⁺)对其相关性影响较大。结果说明水体ρ(Ca²⁺)能影响褐牙鲆耳石的形成，使其形态发生显著变化。

3.2 鱼体成分

鱼体中含有多种元素，这些元素在生命活动中发挥重要作用。现已知有26种元素为动物生长所必需，按其含量可分为三大类，碳(C)、氢(H)、氧(O)、N为大量元素，构成机体的有机物质；Ca、P、Mg、Na、K、Cl和S为常量矿物元素，约占体内无机物质的60%~80%；Fe、Cu、Mn、Zn和Ni等在动物体内质量分数不超过50 mg·kg^-1，称为微量元素，还有一些含量极微的称为痕量元素。这些元素在褐牙鲆鱼体中也存在，且含量基本符合上述结论。研究表明，水生生物能够富集水体中重金属离子，可以作为评价水体污染情况的指标^[32-33]。LAROCQUE和RASMUSSEN^[34]报道了Ca、Cu、Fe、Mg、Pb和Zn元素会从水中进入鱼体内，且鱼体内重金属含量远大于水体中含量，证明这些离子可在鱼体中富集。因此，LIAO和LING^[35]建议用莫桑比克罗非鱼(Oreochromis mossambicus)作为监测水体污染的指标。一般肝脏和鳃中的金属含量要高于肌肉中的含量。

笔者试验发现，褐牙鲆鱼体也含有多种元素，在高ρ(Ca²⁺)组Mg、Sr、Fe、Mn、Ni质量分数较低，说明高ρ(Ca²⁺)降低了一些金属离子在体内的累积。水体较高ρ(Ca²⁺)可以调节其他离子的利用，并控制重金属离子的毒性，主要通过化学竞争、生物学适应或者两者协同作用^[35-36]。PERSCHBACHER和WURTS^[37]报道Ca-Mg硬度增加会降低硫酸铜(CuSO₄)对斑点叉尾(Ictalurus punctatus)的毒性，在1.25 mg·L^-1 CuSO₄溶液中暴露48 h后，10 mg·L^-1 CaCO₃水体中斑点叉尾的死亡率为90%，而400 mg·L^-1 CaCO₃水体中为5%。笔者试验结果也证实高ρ(Ca²⁺)水体可能限制了一些离子在鱼体的积累。但未发现在鱼体内Ca的累积与水体ρ(Ca²⁺)呈正相关，推测Ca在鱼体内累积还受其他因素的影响，需要进一步研究加以验证。

3.3 耳石成分

关于耳石中化学元素的沉积规律，前人作过较多的研究。耳石元素组成受到很多因素的影响，主要包括一些生理因素(生长率、胁迫和再生等)和环境因素(温度、盐度和水中离子含量等)^{[1, 4, 22]}。WRIHGT等^[24]对大西洋鲑(Salmo salar)的研究发现，耳石上Ca的沉积受血浆中Ca含量的调节，血浆中Ca含量增高，耳石生长的速度也加快。通过鱼耳石微化学分析，可以了解远距离迁徙鱼类生活习性的转变。海、淡水洄游性鱼类从海水进入淡水或从淡水进入海水后，耳石中Ca、Sr等元素的沉积量会有变化^[8]，生活在不同水系淡水环境中的红大麻哈鱼(Oncorhychus nerkas)耳石中的Sr含量的变化依赖于水体中该元素含量的变化^[9]。TZENG^[38]发现在海洋生活阶段，日本鳗鲡(Anguilla iaponica)耳石上Sr的含量逐渐增加，约在溯河洄游前1个月达到高峰；进入河口后Sr含量急剧下降并长期维持在较低水平。ARAI等^[39]通过研究远东哲罗鱼(Hucho perryi)耳石的Sr/Ca，探讨其在河流的迁移路径，认为耳石Sr/Ca比可以作为鱼类迁移的路标。王巍令^[40]对中国沿海8个站点斑尾复鰕虎鱼(Synechogobius ommaturus)耳石的10种元素进行了研究，以分析斑尾复鰕虎鱼生活水体的相似度，结果显示Sr、Co、Ba、Pb、K、Mn和Sr/Ca有显著性差异。

笔者试验发现，各组褐牙鲆幼鱼耳石中仅w(Ca)差异不显著。分析认为，Ca在耳石中主要以CaCO₃形式存在，虽然一些微量元素可以替代，但因水体中含量有限，对耳石中w(Ca)影响不大。另一方面，试验水体中ρ(Ca²⁺)很高，远超过鱼类生长发育的需要，因此，各组试验鱼耳石w(Ca)没有显著差异。但其他离子的质量分数有显著差异，一些微量元素的质量分数随着ρ(Ca²⁺)的增加而下降，其中w(Sr)随ρ(Ca²⁺)增加显著下降，且随ρ(Ca²⁺)增加Sr/Ca比、Mg/Ca比显著下降。研究表明，鱼类从海洋进入河口或河流时耳石Sr/Ca比急剧下降^[41]。BROWN^[17]分析了侧枝鲽(Pleuronectes vetulus)和眼点副棘鲆(Citharichthys stigmaeus)耳石元素组成在河口和海岸带的差异，发现与海岸带相比，河口区鱼类耳石中Sr的含量较高，锂(Li)的含量较低，利用耳石多种元素判别鱼类生活类群的准确率在80%。笔者试验高ρ(Ca²⁺)水体中试验鱼耳石Sr/Ca比、Mg/Ca比的下降，说明水体中ρ(Ca²⁺)的改变在耳石中留下明显标记，耳石离子组分可作为养殖水体中离子成分变化的指标。

水体中离子成分的改变，对试验鱼体组分、耳石形状和组分影响显著。由此说明，通过鱼体和耳石组分微量元素的检测分析，对研究鱼类耳石生长、元素累积和评价水环境以及鱼类生活史具有重要意义。

图 1 不同流速下豹纹鳃棘鲈肝脏组织 (H.E染色)

a. HFV低倍镜观察；b. LFV低倍镜观察；c. HFV高倍镜观察；d. LFV高倍镜观察。

Figure 1. Liver tissues (H.E staining) of P. leopardus with different flow velocities

a. Observation of sections with low magnification for HFV; b. Observation of sections with low magnification for LFV; 　　　　　　c. Observation of sections with high magnification for HFV; d. Observation of sections with high magnification for LFV.

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图 2 不同流速下豹纹鳃棘鲈肝脏组织 (油红O染色)

a. HFV低倍镜观察；b. LFV低倍镜观察；c. HFV高倍镜观察；d. LFV高倍镜观察。

Figure 2. Liver tissues (Oil red O staining) of P. leopardus with different flow velocities

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图 3 豹纹鳃棘鲈基因GO分类图

Figure 3. Gene ontology (GO) assignment of genes of P. leopardus

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图 4 豹纹鳃棘鲈差异表达基因KEGG富集图

Figure 4. KEGG enrichment of differentially expressed genes of P. leopardus

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图 5 RT-PCR验证RNA-Seq结果

Figure 5. Validation of RNA-Seq data by using RT-qPCR

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图 6 SNP突变类型统计分布图

A. 腺嘌呤；T. 胸腺嘧啶；C. 胞嘧啶；G. 鸟嘌呤。

Figure 6. Statistical distribution of type of SNP mutations

A. Adenosine; T. Thymine; C. Cytosine; G. Guanine.

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表 1 本研究所用引物及其序列

Table 1 Sequences of primers used in this study

基因编号 Gene ID	基因名称 Gene name	引物序列 Primer sequence
utg000043l-1.624	cyp7b1	F: ACTTCATCGCCCTCTACCCTC
utg000043l-1.624	cyp7b1	R: TGAGCCTCTGACCGTCTTTG
utg000067l-2.111	nr1d2	F: CCTCTGGTTTCCATTACGGG
utg000067l-2.111	nr1d2	R: ATCAGGCATTTCTTGAAGCG
utg000067l-3.316	ciart	F: TTCAGTGAGAGCGAGCACAC
utg000067l-3.316	ciart	R: TTGGTTTCTTCAGGGCAGTG
utg000134l-0.116	cpt1a	F: AGCACCTGACTGACCGTAAGC
utg000134l-0.116	cpt1a	R: GCATCTCAAGTTCACTGGGTAAG
utg000150l-1.275	irs2	F: TGACATCAGCGACCCTTGTG
utg000150l-1.275	irs2	R: CGCCACTACTCTCTGTTGACG
utg000157l-1.277	scm2a	F: GCAGCAAAGACTGGAGCAAG
utg000157l-1.277	scm2a	R: TCGGTGAACTCATCTGGCAC
utg000241l-0.137	lat3	F: CAGGAAGAGATGTTGAACCTTGG
utg000241l-0.137	lat3	R: GCGAGGAAGATGAGACCAGAC
utg000253l-0.17	wsb2	F: GCCACAGGTTTGGAGAACAG
utg000253l-0.17	wsb2	R: AACACCAGGTCCCTCACTACAC
utg001131l-0.55	per1	F: CTCAAATACGCACTTCAATGTGTC
utg001131l-0.55	per1	R: TGAGGGTGTACTCTGAGGTGATG
utg000003l-2.243	acod	F: AGCAATGTTCTCCCTGAGGC
utg000003l-2.243	acod	R: CCAAAGCAAGGTCAAAGGATG
utg000129l-0.32	cyp2j2	F: GGCAACTTATTCTCTGTGGATTTC
utg000129l-0.32	cyp2j2	R: GCTGTCTCCCTGATTTACCAGTG
utg000134l-1.177	chka	F: CTTTCACATCACCATCATAAGGG
utg000134l-1.177	chka	R: CTTTGTTTGACTGTCGGGAATC
utg000537l-0.141	acsbg2	F: GCAGCAGAAGAGCCTGACCTAC
utg000537l-0.141	acsbg2	R: TAGATGCCAACAGCAAACCC
utg000714l-0.135	fasn	F: TGAGAAACACTCTGACACGAATG
utg000714l-0.135	fasn	R: TCAAAGCGTAGCCTCGGTAG

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表 2 豹纹鳃棘鲈肝脏文库测序数据量统计

Table 2 Output statistics of P. leopardus liver library sequencing

样品编号 Sample ID	有效读长 Clean reads	GC含量 GC content/%	Q30的碱基数比例 Base ratio of Q30/%	比对效率 Mapping efficiency/%
SP10-1	26861 072	51.42	95.30	93.78
SP10-2	35829 110	51.51	95.05	93.53
SP10-3	23503 733	50.44	94.98	93.65
SP40-1	28594 219	51.54	95.23	93.16
SP40-2	28147 723	51.04	95.20	92.82
SP40-3	24705 424	51.00	94.80	92.77

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表 3 豹纹鳃棘鲈不同流速显著差异通路中部分候选基因表达模式

Table 3 Expression pattern of partial candidate genes of P. leopardus in significant pathways with different flow velocity

基因ID Gene ID	log₂ (差异倍数) log₂ (Fold change)	FDR	登录号 Accession No.	基因名 Gene name
utg000134l-0.116	−5.33	1.87×10⁻³¹	XP_008289244.1	cpt1a
utg000043l-1.624	−3.55	9.54×10⁻¹⁶⁶	XP_008291411.1	cyp7b1
utg000150l-1.275	−2.30	1.64×10⁻¹³²	XP_018557299.1	irs2
utg000761l-0.82	−1.78	6.66×10⁻¹²⁵	XP_018522996.1	angptl4
utg000248l-0.27	−1.64	1.10×10⁻¹²	XP_018560228.1	socs3
utg000172l-0.359	−1.59	4.89×10⁻¹⁹⁵	XP_019209058.1	cyp46a1
utg000527l-0.63	−1.42	2.67×10⁻¹³	XP_018558522.1	acsl1
utg000455l_0.134	−1.41	9.36×10⁻³¹	XP_010731808.1	aqp7
utg000250l-2.242	−1.39	6.13×10⁻⁴⁶	XP_019119573.1	adipor2
utg000129l-0.162	−1.21	1.22×10⁻³⁷	XP_018522970.1	rxrgb
utg000097l-1.90	−1.08	1.01×10⁻⁷	XP_019120297.1	traf2
utg000349l-0.213	−1.03	1.05×10⁻⁵	XP_018534038.1	dgke
utg000794l-0.76	−1.02	1.54×10⁻⁶	XP_019126544.1	prkag2
utg000088l-2.212	−1.01	3.89×10⁻⁴⁷	XP_020505581.1	akr1a
utg000841l-0.8	1.01	4.13×10⁻⁸	XP_022072468.1	tradd
utg000329l-0.218	1.03	8.07×10⁻³²	XP_018527840.1	abhd16a
utg001296l-0.11	1.07	7.82×10⁻⁵	XP_018525976.1	slc27a4
utg000225l-0.155	1.11	6.08×10⁻³³	XP_018531738.1	lpin2
utg000681l-0.96	1.12	2.09×10⁻⁶	XP_018530981.1	acsl4
utg000325l-0.118	1.16	5.97×10⁻⁴	XP_005472382.1	hxk2
utg000841l_0.93	1.51	1.23×10⁻²⁴	XP_018522449.1	adpgk
utg000519l-0.406	1.82	1.04×10⁻²⁹	XP_018527726.1	kmt5c
utg000454l-0.43	1.98	3.21×10⁻¹²	XP_018528735.1	psat1
utg000537l-0.141	2.39	2.05×10⁻³³	XP_020511829.1	acsbg2
utg000393l-0.311	10.65	3.25×10⁻¹²⁸	XP_018529751.1	crhbp

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表 4 SNP位点统计表

Table 4 Output statistics of SNP loci

样品编号 Sample ID	SNP位点数 Number of SNP	基因区SNP Genic SNP	基因间区SNP Intergenic SNP	转换类型占比 Transition/%	颠换类型占比 Transversion/%
SP10-1	161 388	121 218	40 170	30.88	93.78
SP10-2	178 270	133 923	44 347	31.22	93.53
SP10-3	171 685	129 389	42 296	31.37	93.65
SP40-1	168 801	126 800	42 001	31.69	93.16
SP40-2	171 772	128 821	42 951	31.79	92.82
SP40-3	165 186	123 814	41 372	31.79	92.77

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1. 材料与方法
1.1 试验材料
1.2 试验设计和海水配置
1.3 日常管理
1.4 样品处理和分析
1.5 数据计算和统计分析
2. 结果
2.1 水体Ca2+质量浓度对鱼体成分的影响
2.2 耳石常规指标分析
2.3 水体Ca2+质量浓度对耳石元素成分的影响
3. 讨论
3.1 耳石形态
3.2 鱼体成分
3.3 耳石成分

1. 材料与方法
1.1 试验材料
1.2 试验设计和海水配置
1.3 日常管理
1.4 样品处理和分析
1.5 数据计算和统计分析
2. 结果
2.1 水体Ca²⁺质量浓度对鱼体成分的影响
2.2 耳石常规指标分析
2.3 水体Ca²⁺质量浓度对耳石元素成分的影响
3. 讨论
3.1 耳石形态
3.2 鱼体成分
3.3 耳石成分

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豹纹鳃棘鲈差异流速下肝脏转录组分析

作者简介: 高 进 (1991—)，男，助理研究员，博士，从事水产动物基因组与数量遗传育种研究。E-mial: gaojin@hntou.edu.cn

通讯作者: 符书源 (1981—)，男，副研究员，硕士，从事海水鱼类繁育与健康养殖技术研究。E-mail: fulank23@sohu.com

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