Differential analysis of microRNAs in zebrafish gills under hypoxic stress
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摘要: 为研究microRNAs (miRNAs) 应对低氧胁迫的生物学功能，对低氧胁迫和常氧条件下斑马鱼 (Danio rerio) 鳃组织进行高通量miRNAs测序，分析了低氧胁迫与常氧条件下斑马鱼鳃中miRNAs的表达差异。结果表明，低氧胁迫和常氧条件下，斑马鱼鳃中共有15个miRNAs呈显著差异表达，其中13个miRNAs在低氧胁迫斑马鱼鳃中的表达量显著上调，2个miRNAs表达量显著下调。对miRNAs测序和斑马鱼鳃转录组进行关联分析，针对前期筛选获得的低氧胁迫与常氧条件下显著差异表达的28个热休克蛋白基因进行靶基因预测，结果显示，低氧胁迫下显著低表达的miR-455-3p同时靶向提高热休克蛋白基因hspa14和dnajb6b的表达，以增强对低氧的适应能力。另外，低氧胁迫下显著高表达的miR-194a和miR-155可以分别靶向5个热休克蛋白基因 (hspa12a, dnajc5aa, hspb7, hsp70.3, dnajb2) 和4个热休克蛋白基因 (hspa12a, hspg2, hspa13, dnajb2) 来调控斑马鱼对低氧环境的适应。Abstract: In order to study the biological function of microRNAs (miRNAs) in response to hypoxic stress, we perfomed high-throughput miRNAs sequencing in the gill tissues of zebrafish (Danio rerio) under hypoxic stress and normoxic condition, and analyzed the differences in miRNAs expression in the gill tissues of zebrafish. The results show that a total of 15 miRNAs are significantly differentially expressed in the gills of zebrafish under hypoxic stress and normoxic condition, among which 13 miRNAs were up-regulated significantly and 2 miRNAs were down-regulated significantly. Moreover, we performed a correlation analysis on miRNAs sequencing and zebrafish gill transcriptome, and predicted the target genes for 28 heat shock protein genes that were significantly differentially expressed under hypoxic stress and normoxic condition screened in the previous stage. The result shows that miR-455-3p, which was expressed significantly low under hypoxic stress, targeted to increase the expression of hspa14 and dnajb6b and enhance the adaptability to hypoxic stress. In addition, miR-194a and miR-155, which were highly expressed under hypoxic stress, targeted five heat shock protein genes (hspa12a, dnajc5aa, hspb7, hsp70.3, dnajb2) and four heat shock protein genes (hspa12a, hspg2, hspa13, dnajb2) to regulate zebrafish's adaptation to hypoxic condition.
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Keywords:
- Danio rerio /
- miRNAs /
- High-throughput sequencing /
- Heat shock protein gene /
- Target gene prediction
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紫菜 (Porphyra spp.) 味道鲜美、营养丰富，是我国沿海地区重要的经济藻类，在食用海藻中占比高[1]，但其收获具有季节性，且原料含水量高。新鲜紫菜极易腐败变质，保鲜贮运难度大[2]。目前市场上现有的紫菜产品多以干制品为主，如紫菜圆饼、调味海苔、紫菜片等，存在品种单一、食用后容易口干、黏牙等问题。随着消费升级，单一的紫菜干制品已不能满足消费者对紫菜产品的多样化需求，开发健康美味、开袋即食的湿态紫菜产品对于推动紫菜行业的发展具有重要意义。
杀菌是确保即食产品货架期和食用安全的关键工序。热杀菌技术主要分为高压热杀菌和常压热杀菌，因简易实用、灭菌效果好、技术成熟等优点在食品工业中被广泛应用[3-5]。高压热杀菌适用于低酸性罐头食品，常以耐热性强的肉毒梭状芽孢杆菌 (Clostridium botulinum) 作为杀菌对象，需采用100 ℃以上的温度，对产品的品质破坏较大[6]。对于不宜采用高强度热杀菌的低酸性食品，可结合酸化工艺将产品的平衡pH降至4.6以下来抑制肉毒梭状芽孢杆菌的生长，然后采用较为温和的常压热杀菌 (杀菌温度≤100 ℃) 处理，但产品口味拓展容易受限[7-8]。通过测定产品杀菌过程中的传热曲线并建立相应的传热模型，在满足微生物安全的前提下优化杀菌条件是提高产品品质的有效方法。Majumdar等[9]通过拟合鲤 (Cyprinus carpio) 杀菌过程的温度曲线，在满足商业无菌的前提下，评估了不同杀菌强度对咖喱鱼感官特性的影响。Tribuzi等[10] 通过测定贻贝 (Mytilus edulis) 肉杀菌过程的传热曲线，优化杀菌工艺条件，开发了可常温流通的贻贝肉。Tang等[11]发现在相同杀菌强度下，不同温度会影响糖醋鱼的品质属性。Rsa等[4]从产品质量和生产操作过程、能源消耗等方面综合评价了可变温灭菌釜的实际应用效果。目前，关于即食产品杀菌过程中的品质变化研究有一定的理论基础，但关于热杀菌工艺对于紫菜产品品质的影响尚不明确。
紫菜叶片极薄、质地较软，对加热时间和温度较为敏感。过度杀菌会导致紫菜细胞破裂、质构软烂、色泽劣变，严重降低产品感官和营养价值。为降低紫菜在杀菌过程中的品质劣化程度，本文从工艺角度出发，结合传热曲线的测定和商业保藏实验，探究了即食紫菜的最低杀菌强度。在满足安全杀菌强度的前提下，结合感官和营养品质特性优选热处理温度-时间组合。同时，针对酸化 (酸味) 和低酸性两类即食紫菜产品，比较了常压热杀菌和高压热杀菌两种工艺对紫菜品质的影响，为多口味常温即食紫菜产品的开发提供参考。
1. 材料与方法
1.1 原料与试剂
干紫菜 (坛紫菜P. haitanensis) 由南通丁布儿海苔食品有限公司 (中国江苏省南通市) 提供；食用级柠檬酸 (河南万邦实业有限公司)；碳酸钠 (Na2CO3)、氢氧化钠 (NaOH)、苯酚 (C6H5OH)、硫酸 (H2SO4)、福林酚 (C5H10O5)、乙醇 (C2H6O) 和三氯乙酸 (C2HCl3O2) 等 [国药集团化学试剂有限公司 (上海)] 均为分析级。
1.2 仪器与设备
DZ400/2D型真空包装机 (上海尤溪机械设备有限公司)；700×800双罐式全自动杀菌锅(温州市龙强轻工机械有限公司)；SCIENTZ-10ND冷冻干燥机 (宁波新芝生物科技有限公司)；UltraScan Pro 1166高精度分光测色仪 (美国Hunterlab公司)；TA-XT plus物性分析仪 (英国SMS公司)；4K15冷冻离心机 (美国SIGMA公司)；UV-1800紫外-可见分光光度计 (日本岛津制作所)；THZ-82水浴振荡器 (上海力辰邦西仪器科技有限公司)；FE 28 pH计 [梅特勒-托利多仪器 (上海) 有限公司]；Agilent 1100全自动氨基酸分析仪 (德国赛卡姆Sykam公司)；TrackSense Pro无线温度测定系统 (丹麦ELLAB公司)。
1.3 样品制备
低酸性组将干紫菜浸泡在10倍质量的蒸馏水中充分复水，剪成长约2 cm的条状，挤压将紫菜水分质量分数调至约85%，真空包装(每袋15 g) 后杀菌。酸化组用柠檬酸溶液(3 g·L−1) 代替蒸馏水复水，控制酸化后紫菜的平衡pH介于4.2~4.4，其他步骤同低酸性组。杀菌后部分样品采用冷冻干燥机冻干后粉碎至40目，于−20 ℃密封保存，用于测定可溶性糖和游离氨基酸；另一部分样品直接用于感官评价、色泽和质构的测定。
1.4 杀菌曲线的测定
将无线温度探头尖端插入紫菜样品袋中冷点处，真空封口后与同批样品一起置于杀菌锅内 (常压热杀菌使用恒温水浴锅；高压热杀菌组使用全自动反压杀菌锅)，紫菜初温控制在(20±2) ℃。通过数据采集器记录杀菌过程产品的冷点温度 (中心温度) 变化，每30 s记录一次。低酸性紫菜分别测定110、115和121 ℃下的温度变化，酸化后的紫菜测定85、90和95 ℃下的温度变化，并计算对应的杀菌强度值。以时间为横坐标、温度和累计杀菌强度为纵坐标绘制即食紫菜的杀菌曲线。
1.5 杀菌强度 (F值) 的计算
1.5.1 高压热杀菌
参考姜启兴等[12]的方法计算。
$$ F={\int }_{0}^{t}{10}^{(T-121.1)/Z}\mathrm{d}t $$ (1) 式中：t为杀菌时间；T为对应时间样品的中心温度，以90 ℃作为起点温度；Z为目标微生物的温度敏感性，对于低酸性食品，取10 ℃。
1.5.2 常压热杀菌
参考高沛等[13]的方法计算。
$$ F={\int }_{0}^{t}{10}^{(T-93.3)/Z}\mathrm{d}t $$ (2) 式中：t 为杀菌时间；T为对应时间样品的中心温度，以70 ℃作为起点温度；Z为目标微生物的温度敏感性，对于酸性食品，取8.89 ℃。
1.6 微生物分析
菌落总数参照GB 4789.2—2016《食品微生物学检验 菌落总数测定》的平板计数法进行测定；大肠菌群参照GB 4789.3—2016《食品微生物学检验 大肠菌群计数》方法测定。
1.7 感官评分
感官评定小组成员由10男10女组成，小组成员均接受过良好的感官培训。分别从色泽、外观、滋味、口感和总体喜爱度等方面进行评价，感官评定标准见表1。
表 1 即食紫菜的感官评分表Table 1 Sensory evaluation of instant laver评分标准
Scoring standard级别 (分值) Type (Point) 一级 First grade 二级 Second grade 三级 Third grade 色泽 Color 紫黑色，光泽明亮 (7~9) 紫绿色，无光泽 (4~6) 黄绿色 (1~3) 外观 Appearance 组织坚实，结构完整 (7~9) 组织松软，结构较完整 (4~6) 组织软烂，结构不完整 (1~3) 滋味 Taste 有紫菜特有鲜香味 (7~9) 稍有其他异味，能接受 (4~6) 有腥味等令人不悦的味道 (1~3) 质地 Texture 有韧性，不黏牙 (7~9) 较有韧性，微黏可接受 (4~6) 软烂或干硬，难以接受 (1~3) 喜爱度 Preference 非常喜欢 (7~9) 较喜欢，整体可接受 (4~6) 不喜欢 (1~3) 1.8 质构测定
使用TA-XT plus物性分析仪对紫菜的韧性、硬度和黏度进行测试。称取1 g紫菜，多层平摊叠放铺于钳口装置 (HDP/VB) 上(堆叠厚度约为7~9 mm)进行剪切测试。测前速度为0.5 mm·s−1；测中速度为0.5 mm·s−1；变形量为70%，触发力为10.0 g。在物性分析系统中对紫菜切割过程的应力-距离进行编程，仪器在下压时自动测试样品高度 (mm)；以最大正峰值时的剪切力除以样品的高度表示硬度 (g·mm−1)；以应力-距离曲线初始点剪切至距离30%时的斜率表示韧性 (g·s−1)；曲线上负峰面积值表示黏度 (g·s)。每组样品测定7次取平均值。
1.9 色泽测定
使用高精度分光测色仪测定色泽，在反射模式下测定L* (明暗度)、a* (红绿度) 和b* (黄蓝度) 等色泽参数，每组样品测定10次取平均值。
1.10 pH测定
pH的测定参考GB 5009.237—2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》。
1.11 可溶性糖测定
参考周浩宇等[14]的方法，略作修改。将0.1 g紫菜冻干粉溶于20 mL去离子水中，置于50 ℃恒温振荡水浴锅中提取1 h，离心取上清液，沉淀物重复提取1次。合并2次上清液，定容至50 mL，采用苯酚-硫酸法测定可溶性糖含量，结果以质量分数计 (mg·g−1)。
1.12 游离氨基酸的定
游离氨基酸参照Hua等[15]的方法，结果以质量分数计。滋味活度值 (Taste activity value, TAV) 的计算及滋味阈值参考温心怡[16]的方法。TAV计算为：
$$ {\rm{TAV}}=C/T $$ (3) 式中：C为游离氨基酸的质量分数[mg·(100 g)−1]；T为游离氨基酸对应的滋味阈值质量分数[mg·(100 g)−1]。
1.13 数据分析
实验结果以“平均值±标准差 (
$ \overline X \pm {\rm{SD}} $ )”表示，除质构和色泽外，所有实验指标重复测定3次。采用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析，采用Duncan's多重分析进行组间显著性检验，显著性水平为P<0.05，采用Origin 2022绘图。2. 结果与分析
2.1 即食紫菜杀菌强度确定
2.1.1 不同温度下传热曲线及累计杀菌强度F值
F值表示在一定温度条件下产品的受热时间，可用于评价热杀菌过程的有效性，是国际通用的热力杀菌强度表述符号[5]。通过测定整个杀菌过程中产品中心温度随时间的变化，可以计算F值并评价杀菌效果，在此基础上通过比较相同杀菌强度F值时的不同杀菌温度-时间组合对产品品质的影响，来确定具体的杀菌参数。
本研究的紫菜采用蒸煮袋包装，产品整体呈薄片状，且含水量较高，有效提高了产品的传热速率。不同温度下紫菜的传热曲线和累计F值见图1。杀菌温度越高，达到相同杀菌强度所需要的恒温时间越短。由于紫菜产品较薄，121 ℃时的热力致死时间 (F0值) 从3 min升至4 min所需延长的恒温时间仅0.6 min，且杀菌温度的波动也较大。因此从设备和生产稳定性的角度考虑，不建议选用过高的温度。
由杀菌曲线知，85、90和95 ℃温度组的冷却阶段积累的
$ {F\,}_{93.3}^{8.89} $ 值分别为0.007、0.07和0.09；110、115和121 ℃温度组冷却阶段积累的F0值分别为0.09、0.28和0.38。通过减除冷却阶段的累计F值，结合各温度下的杀菌曲线可得不同F值所需的恒温加热时间。2.1.2 即食紫菜安全性分析
保温实验参照GB 4789.26—2013《食品安全国家标准 食品微生物学检验 商业无菌检验》进行，杀菌后的样品在37 ℃培养箱中保藏10 d，通过观察产品的感官变化、胀袋情况和微生物实验等确定安全杀菌强度F值。酸化后紫菜的平衡pH约4.2~4.3，根据美国食品药品监督管理局 (Food and Drug Administration, FDA) 建议，产品平衡pH介于4.2~4.4的需满足杀菌强度F值≥5 min[5]。酸化后紫菜选取90 ℃为代表温度，分别对该温度下杀菌强度
$ {F\,}_{93.3}^{8.89} $ 达到5、6、7和8 min的紫菜进行保温实验。未酸化的紫菜选取115 ℃为代表温度，对其温度下杀菌强度F0达到3、4、5和6 min的紫菜进行保温实验，杀菌时间和安全性分析结果见表2。表 2 不同杀菌强度对即食紫菜安全性的影响Table 2 Effect of different sterilization intensity on safety of laver温度
Temperature/℃F值
F-value/mint/min 结果
Result菌落总数
Total plate count大肠菌群
Total coliform90 5 11.5 商业无菌 nd nd 6 12.5 商业无菌 nd nd 7 14 商业无菌 nd nd 8 15.5 商业无菌 nd nd 115 3 10 商业无菌 nd nd 4 13 商业无菌 nd nd 5 16 商业无菌 nd nd 6 19 商业无菌 nd nd 注：nd. 未检测到。 Note: nd. Undetected. 由保温实验结果知，紫菜在
$ {F\,}_{93.3}^{8.89} $ =5 min、F0=3 min时即可达到保藏要求。在此杀菌强度下，常压杀菌组分别选定85、90和95 ℃比较不同杀菌时间处理后紫菜的品质变化，高压杀菌组分别选取110、115和121 ℃探究较优的杀菌参数。减除降温过程所累计的F值再查杀菌曲线得85、90和95 ℃达到杀菌强度$ {F\,}_{93.3}^{8.89} $ =5 min所需时间分别为26、11.5和6.8 min；110、115和121 ℃达到杀菌强度F0=3 min所需时间分别为32、10和2.7 min。为进一步确定杀菌参数，对不同杀菌条件下即食紫菜的感官品质和营养成分进行对比分析。2.2 杀菌条件对即食紫菜感官及理化品质的影响
2.2.1 色差和pH
色泽是影响消费者选择产品的重要指标[17]。L*表示亮度，值越大颜色越亮。由表3知，在相同杀菌强度F值下两种杀菌方式产品的L*均未发生显著变化，但高压杀菌组的紫菜亮度整体高于常压杀菌组；a*表示紫菜的红绿程度，值越大，红色越明显；b*表示紫菜黄蓝程度，值越大黄色越明显。相同杀菌强度F值下，随着杀菌温度的升高，均表现为a*逐渐升高、b*降低的趋势，即温度越高、杀菌时间越短紫菜的红色越明显，整体色泽维持越好。同一杀菌强度下随温度降低，pH略有下降。推测是低温长时间的热处理对紫菜的组织结构破坏较大，细胞内部酸性物质溶出，降低了产品的pH，这也对叶绿素造成破坏，导致低温杀菌的紫菜黄色明显。此外，高压杀菌组紫菜的a*显著低于常压杀菌组 (P<0.05)。未杀菌时紫菜中的藻红蛋白能反射红光并吸收蓝光使紫菜呈红色，但高压组杀菌温度高，易降解藻红蛋白，使紫菜加热后由红色变成了绿色[18-19]。Miyamoto等[20]发现紫菜在烘烤后也存在类似的变绿现象。
表 3 不同杀菌条件下紫菜的色差和pHTable 3 Color and pH value of laver under different sterilization conditions杀菌方式
Sterilization method组别
Group明暗度
L*红绿度
a*黄蓝度
b*pH 常压 Normal pressure A0 28.98±0.74b 1.04±0.06b 0.27±0.16f 4.29±0.03d 85 ℃, 26 min 28.79±0.49b 0.43±0.07d 0.8±0.15d 4.19±0.01e 90 ℃, 11.5 min 28.71±0.44b 0.58±0.07c 0.75±0.2d 4.21±0.02e 95 ℃, 6.8 min 29.05±0.55b 0.61±0.03c 0.51±0.12e 4.22±0.02e 高压 High pressure H0 30±0.5a 1.48±0.26a 0.86±0.25d 6.36±0.02b 110 ℃, 32 min 29.83±1.08a 0.02±0.06f 2.62±0.24a 6.16±0.06c 115 ℃, 10 min 29.92±0.51a 0.12±0.06ef 2.26±0.23b 6.4±0.04ab 121 ℃, 2.7 min 29.9±0.78a 0.14±0.07e 1.4±0.17c 6.45±0.01a 注：H0指未杀菌样品，A0指酸化后未杀菌样品；同列中不同字母间存在显著性差异 (P<0.05)；下表同此。 Note: H0 refers to non-sterilized sample; A0 refers to the sample not sterilized after acidification. Values with different superscript letters within the same column have significant difference (P<0.05). The same case in the following tables. 2.2.2 质构
质构是评价即食紫菜品质的一项重要指标，一般情况下韧性和硬度越大，表明紫菜的咀嚼口感越好，组织越坚实，结构越完整。表4为不同温度下
$ {F\,}_{93.3}^{8.89} $ =5 min (常压热杀菌)和F0=3 min (高压热杀菌) 的紫菜质构变化。未经杀菌处理的紫菜的初始韧性、硬度和黏度的数值分别为24.99、41.05和0.59，酸化后韧性和硬度降至21.03和37.29，黏度升至1.78，可以明显看出酸化对紫菜的质构具有一定的破坏作用。但常压热杀菌组的质构仍优于高压热杀菌组，说明酸化 (pH<4.6) 与温和的热处理结合可减少杀菌后紫菜质构劣化。表 4 不同杀菌条件对紫菜质构的影响Table 4 Texture of laver under different sterilization conditions杀菌方式
Sterilization method组别
Group韧性
Toughness/(g·s−1)硬度
Hardness/(g·mm−1)黏度
Adhesioness/(g·s)常压组 Normal pressure A0 21.03±2.21b 37.29±4.7bc 1.78±0.4b 85 ℃, 26 min 12.36±1.51d 14.97±3.09de 3.75±0.79e 90 ℃, 11.5 min 18.65±3.01bc 27.08±2.81c 2.92±0.4cd 95 ℃, 6.8 min 18.69±3.32bc 30.51±7.75bc 2.39±0.48c 高压组 High pressure H0 24.99±3.85a 41.05±12.93a 0.59±0.16a 110 ℃, 32 min 12.55±1.83d 11.3±3.71e 4.58±0.78f 115 ℃, 10 min 16.07±2.3c 22.38±5.33cd 3.21±0.44de 121 ℃, 2.7 min 16.36±2.16c 25.77±9.04c 2.65±0.62cd 在相同的杀菌强度F值下，随着杀菌温度升高，紫菜的韧性和硬度均增大，同时黏度下降，表现出更好的咀嚼感。这是因为紫菜包装较薄、传热较快，高温短时对紫菜品质的破坏较小，更有利于保持产品口感。
2.2.3 感官评分
感官评价是通过人的感官知觉对被测对象进行综合评价，其结果最接近消费者的判定标准，感官评分的高低直接影响消费者的接受度[21]。不同杀菌温度下紫菜的感官品质见图2。通过不同属性对应的面积判断可知“85 ℃、26 min”和“110 ℃、32 min”时处理的紫菜感官得分，远低于相同杀菌强度F值下的另外两组样品，这与本文的色泽和质构结果一致。随着温度的升高，相同杀菌强度F值下的紫菜在色泽和滋味上的差异不大，但质感、组织状态和整体的感官评分明显升高。这是因为食品质量属性的耐热性远远大于微生物的耐热性，采用更高的温度和更短的时间，维持同样杀菌效果的同时可减少对质量属性的影响[22]，类似的结果在斑点叉尾鮰 (Ictalurus punctatus) 软罐头的研究中也有发现[12]。此外，酸化结合巴氏杀菌的紫菜感官得分明显高于高压热杀菌组，因此通过酸化降低杀菌强度可获得更好的产品品质。
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图 2 不同杀菌温度下紫菜的感官得分Fig. 2 Sensory scores of laver under different sterilization temperatures2.3 杀菌条件对紫菜营养成分的影响
2.3.1 可溶性糖
多糖是构成紫菜细胞壁的主要物质，起着将相邻细胞黏合在一起的作用，是细胞间黏附的主要决定因素[23]。不同温度杀菌后紫菜的可溶性糖含量见图3。未经杀菌时紫菜的可溶性糖质量分数为69.54 mg·g−1，酸化后增至77.85 mg·g−1，由此可知pH<4.2可提高紫菜中糖的溶解性。杀菌后紫菜的可溶性多糖含量比杀菌前均有增加，且相同杀菌强度F值下温度越低紫菜中可溶性糖含量越高，这与质构和感官的结果趋势相反，也进一步表明低温长时间杀菌对紫菜品质的破坏较大。这可能是由于长时间的热处理过程导致紫菜中糖类大分子解聚，细胞壁成分增溶和结构改变，降低了多糖物质的聚合度，提高了多糖的溶解性和可提取性[24]。这一变化与果蔬质构软化的过程相似，果蔬在成熟、加工及储藏过程中，细胞壁会发生弱化和分解，导致果胶溶解性增加，细胞壁强度下降和细胞间黏附减少，进而导致硬度下降[25]。
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图 3 不同杀菌条件下紫菜的可溶性糖质量分数注：不同小写字母表示各样品具有显著差异 (P<0.05)。Fig. 3 Mass fraction of soluble sugar of laver under different sterilization conditionsNote: Different lowercase letters indicate significant differences among the samples (P<0.05).2.3.2 游离氨基酸
游离氨基酸不仅可以提供人体必需的营养，还是紫菜的主要滋味物质，其含量和组成直接影响紫菜的风味。根据氨基酸的呈味特性，可以将其分为鲜味 (天冬氨酸和谷氨酸)、甜味 (丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸) 和苦味 (精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和缬氨酸) 等类型[26]。本文分析了紫菜中17种主要游离氨基酸和牛磺酸，不同杀菌处理后紫菜的游离氨基酸组成相似，占比最高的依次为谷氨酸、牛磺酸、丙氨酸、天冬氨酸 (表5)。其中牛磺酸占氨基酸总量的20%以上，对促进大脑发育、抗氧化有良好功效[27]。谷氨酸、丙氨酸和天冬氨酸是紫菜中主要的鲜味氨基酸，与紫菜的良好风味密切相关[21]。
表 5 不同杀菌条件下每100 g紫菜中游离氨基酸的质量Table 5 Mass of free amino acids in per 100 g laver under different sterilization conditionsmg 组别
Group天冬氨酸
Asp谷氨酸
Glu丝氨酸
Ser组氨酸
His苏氨酸
Thr甘氨酸
Gly精氨酸
ArgA0 142.98±3.57c 434.82±4.88ab 7.78±0.34bc 9.79±1.44bc 24.19±0.47cd 64.92±0.45c 27.94±0.86d 85 ℃, 26 min 140.57±1.40c 412.42±6.08c 7.83±1.08bc 7.05±1.62c 23.93±0.80cd 66.5±0.52bc 29.26±1.21cd 90 ℃, 11.5 min 150.58±1.37b 426.15±4.90b 7.76±0.52bc 10.94±1.07b 25.38±0.54c 61.94±0.8d 28.73±0.30d 95 ℃, 6.8 min 140.85±1.55c 400.32±5.24c 6.68±0.58cd 13.82±1.90a 22.95±0.71d 60.9±0.44d 27.33±1.24d H0 141.54±1.20c 440.15±5.82a 9.83±0.22a 13.91±1.69a 27.67±0.77b 68.26±0.45b 32.42±1.81b 110 ℃, 32 min 160.49±5.79a 401.48±9.11c 8.56±0.49b 13.6±0.92a 32.15±2.40a 78.22±1.13a 36.37±2.43a 115 ℃, 10 min 138.77±2.46c 401.04±5.04c 7.04±1.15cd 15.52±1.23a 28.85±1.13b 66.92±2.34bc 32.29±0.93b 121 ℃, 2.7 min 141.04±4.41c 376.50±10.64d 6.27±0.18d 15.82±1.51a 27.63±1.39b 66.25±3.17bc 31.75±2.82bc 组别
Group丙氨酸
Ala酪氨酸
Tyr半胱氨酸
Cys缬氨酸
Val蛋氨酸
Met苯丙氨酸
Phe异亮氨酸
IleA0 255.87±8.85d 16.24±0.53b 2.67±0.04e 24.1±4.27abc 1.69±0.6a 12.72±2.03d 11.88±1.79d 85 ℃, 26 min 246.00±4.10e 16.70±1.41b 4.73±0.09d 22.71±0.28bc 2.92±2.39a 16.01±0.43bc 13.92±1.05c 90 ℃, 11.5 min 267.28±3.86bc 16.13±0.70b 5.71±0.23a 22.98±0.59bc 3.04±0.34a 16.30±0.86bc 15.24±0.22c 95 ℃, 6.8 min 236.80±2.65f 16.19±0.65b 5.00±0.21cd 22.50±0.29c 2.22±0.58a 16.07±0.91bc 15.51±0.71c H0 273.25±3.36b 17.18±0.37b 4.64±0.25d 26.65±0.38a 2.33±0.28a 14.75±1.19c 11.17±0.52d 110 ℃, 32 min 304.07±1.84a 20.03±1.00a 5.29±0.36abc 26.53±0.51a 2.48±0.36a 19.59±0.34a 20.08±0.68a 115 ℃, 10 min 264.33±5.64cd 17.37±0.90b 5.22±0.42bc 25.61±0.96ab 2.55±0.6a 17.88±0.17ab 17.99±1.16b 121 ℃, 2.7 min 260.32±4.38cd 16.86±0.61b 5.55±0.24ab 24.43±0.52abc 2.90±0.58a 17.27±1.07b 17.67±1.89b 组别
Group亮氨酸
Leu赖氨酸
Lys脯氨酸
Pro牛磺酸
Tau总氨基酸
Total amino acidA0 18.01±1.47d 13.93±2.25cd 19.73±2.43bc 343.03±10.91d 1 432.30±37.78cde 85 ℃, 26 min 19.38±0.34cd 14.87±0.53bcd 19.72±1.32bc 338.27±6.62d 1 402.81±19.95ef 90 ℃, 11.5 min 18.73±0.13cd 13.59±0.77d 20.11±0.17bc 363.92±3.73c 1 474.49±14.97c 95℃,6.8 min 17.95±1.09d 13.27±0.64d 18.26±0.82c 326.89±4.78e 1 363.52±15.56f H0 23.03±0.44a 15.7±0.66bc 22.02±0.83bc 377.59±3.76b 1 522.07±10.23b 110 ℃, 32 min 23.62±0.85a 20.75±0.29a 27.78±1.42a 406.8±3.98a 1 607.89±15.13a 115 ℃, 10 min 21.28±0.3b 16.42±1.24b 22.96±4.61b 362.11±7.60c 1 464.16±30.88cd 121 ℃, 2.7 min 20.22±1.44bc 14.34±0.37cd 22.19±3.41bc 357.57±7.36c 1 424.58±30.26de 注：同列中不同字母间存在显著性差异 (P<0.05)。 Note: Values with different superscript letters within the same column have significant difference (P<0.05). 杀菌前经酸化处理的紫菜氨基酸总量低于未酸化样品，由于大多数蛋白质的等电点偏酸性，可能是酸化后紫菜的pH更接近等电点，此时的蛋白质更加稳定，不易降解为氨基酸[28]。在常压杀菌组中，“90 ℃、11.5 min”处理组的总氨基酸和鲜味氨基酸均比“85 ℃、26 min”和“95 ℃、6.8 min”处理组的高，滋味更为鲜美。高压热杀菌组中，随温度降低，紫菜的氨基酸总量逐渐降低，“110 ℃、32 min”对应的氨基酸总量远高于对照和其他处理组，可能是经过较长时间的热处理，紫菜中的蛋白质会逐渐降解成多肽及游离氨基酸等小分子呈味物质[29]。“121 ℃、2.7 min”处理时，紫菜中氨基酸总量最低，一方面此时紫菜组织结构破坏较小，另一方面可能有部分游离氨基酸与还原糖发生少许美拉德反应致使游离氨基酸总量有所下降[30]。
2.3.3 TAV
紫菜中呈味物质的含量及其阈值共同反映了滋味强度，TAV可客观地判定食品中单一组分的滋味强度对其整体风味的贡献。TAV>1表示该物质对滋味有重要影响[16]。图4从正面风味和负面风味两个角度展示了几种主要的呈味氨基酸。其中，谷氨酸和丙氨酸的TAV是其他滋味活性物质的数十倍，对鲜味和甜味的贡献很大。此外，甘氨酸作为一种重要的甜味氨基酸不仅赋予紫菜清甜的味道，还可以抑制苦味，对滋味有一定的改善作用[31]。在常压杀菌组和高压杀菌组中，分别是“90 ℃、11.5 min”和“110 ℃、32 min”杀菌条件下谷氨酸、丙氨酸和甘氨酸对应的TAV最高，滋味最好。
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图 4 不同杀菌条件下紫菜的滋味活度值Fig. 4 TAV value of laver under different sterilization conditions苦味氨基酸中组氨酸、精氨酸和缬氨酸的TAV较高，但均小于1。Lioe和Takara[32]研究发现苦味氨基酸含量低于其呈味阈值时，可增强其他呈味氨基酸的鲜味和甜味。精氨酸是苦味氨基酸，但其苦味可被氯化钠、谷氨酸钠等屏蔽，在水产品中具有提鲜作用并能够赋予水产品适宜的风味。整体而言，各组紫菜均呈现较好的滋味特征。
3. 结论
根据杀菌强度和保藏实验可知，酸化后紫菜产品在
$ {F\,}_{93.3}^{8.89} $ =5 min和低酸性紫菜产品在F0=3 min时可满足商业无菌要求，但常压热杀菌和高压热杀菌均会导致紫菜质构品质发生不同程度的劣化。质构、色泽和感官评分等结果表明相同杀菌强度下，较高的杀菌温度可以缩短杀菌时间，比低温长时杀菌能更好地保持产品的质构。对于包装规格小、扁平状紫菜产品，杀菌过程传热较快，过高的杀菌温度对设备的精准控制水平要求较高。此外，对于常压杀菌的酸味紫菜产品，“90 ℃、11.5 min”处理组紫菜的游离氨基酸总量最高，对于高压热杀菌的低酸性紫菜产品，随着杀菌温度的增加，紫菜中可溶性糖和游离氨基酸等物质减少。由综合评价分析可知，酸化组紫菜杀菌选择“90 ℃、11.5 min”，高温杀菌组紫菜杀菌选择“115 ℃、10 min”，该条件下既能实现常温贮藏，又兼具较好的感官品质和营养特性。 -
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图 1 常氧与低氧中鳃组织miRNA占小RNA的比例
Figure 1. Proportion of miRNA in whole small RNAs sequence in normoxic and hypoxic gill tissues
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图 2 常氧和低氧鳃组织差异miRNAs火山图
Figure 2. miRNAs volcano map of difference between normoxic and hypoxic gill tissues
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图 3 常氧和低氧鳃组织差异miRNAs聚类图
Figure 3. miRNAs clustering map of difference between normoxic and hypoxic gill tissues
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图 4 差异miRNAs靶基因数量统计分析
Figure 4. Statistical analysis of number of differential miRNAs target genes
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图 5 差异miRNAs靶向的热休克蛋白基因GO富集
Figure 5. GO enrichment of differential miRNAs-targeted heat shock protein genes
表 1 斑马鱼低氧与常氧鳃中下调的miRNAs靶基因预测
Table 1 Prediction of down-regulated miRNAs target genes in hypoxic and normoxic gills of D. rerio
miRNA名称
miRNA name靶基因
Gene binding结合位点
Site目标区域的预测配对
Predicted pairing of target regiondre-miR-455-3p hspa14 935—941 
dnajb6b 1157—1163 
1829—1835 
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表 2 斑马鱼低氧与常氧鳃中上调miRNAs靶基因预测
Table 2 Prediction of up-regulated miRNAs target genes in hypoxic and normoxic gills of D. rerio
miRNA名称
miRNA name靶基因
Gene binding结合位点
Site目标区域的预测配对
Predicted pairing of target regiondre-miR-194a hspa12a 2262—2268 
dnajc5aa 4114—4120 
hspb7 1644—1650 
hsp70.3 245—251 
dnajb2 3834—3840 
dre-miR-155 hspa12a 2771—2777 
hspg2 3611—3617 
hspa13 308—314 
903—910 
dnajb2 1484—1490 
3420—3426 
dre-miR-130c hspa12a 3219—3225 
4709—4715 
dnajb2 920—926 
dre-miR-9 dnajc5aa 2348—2354 
dnajb2 5033—5039 
dre-miR-29a hspg2 2832—2839 
dre-miR-96-5p dnajb2 2290—2296 
5045—5051 
5094—5100 
下载: 导出CSV
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[1] RICHARDS J G. Physiological, behavioral and biochemical adaptations of intertidal fishes to hypoxia[J]. J Exp Biol, 2011, 214(2): 191-199. doi: 10.1242/jeb.047951
[2] 赵文文, 曹振东, 付世建. 溶氧水平对鳊鱼、中华倒刺鲃幼鱼游泳能力的影响[J]. 水生生物学报, 2013, 37(2): 314-320. doi: 10.7541/2013.20 [3] 钟雪萍, 王丹, 张义兵, 等. 鲫鱼低氧相关基因差减cDNA文库的构建与分析[J]. 水生生物学报, 2009, 33(1): 113-118. [4] BEST C, IKERT H, KOSTYNIUK D J, et al. Epigenetics in teleost fish: from molecular mechanisms to physiological phenotypes[J]. Comp Biochem Physiol B, 2018, 224: 210-244. doi: 10.1016/j.cbpb.2018.01.006
[5] 刘昌盛, 穆宇, 杜久林. 斑马鱼在生命科学研究中的应用[J]. 生命科学, 2007(4): 33-37. [6] SARASAMMA S, VARIKKODAN M M, LIANG S T, et al. Zebrafish: a premier vertebrate model for biomedical research in Indian scenario[J]. Zebrafish, 2017, 14(6): 589-605. doi: 10.1089/zeb.2017.1447
[7] 刘春晓, 吕为群, 杨志刚, 等. TGF-β/Smad信号通路响应光周期变化参与调控斑马鱼卵巢发育[J]. 南方水产科学, 2019, 15(3): 69-75. [8] SANTHAKUMAR K, JUDSON E C, ELKS P M, et al. A zebrafish model to study and therapeutically manipulate hypoxia signaling in tumorigenesis[J]. Cancer Res, 2012, 72(16): 4017-4027. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-11-3148
[9] 张凡, 黄秋花, 陈赛娟, 等. 用斑马鱼模型研究低氧应激在造血和血液疾病中的作用[J]. 上海交通大学学报 (医学版), 2016, 36(8): 1237-1241. [10] 狄治朝, 周涛, 许强华. 低氧胁迫与常氧条件下斑马鱼鳃中热休克蛋白基因家族的表达差异比较[J]. 大连海洋大学学报, 2018, 33(6): 11-16. [11] 徐湛宁. 草鱼在低氧胁迫下鳃的差异蛋白质组学及热休克诱导草鱼四倍体育种研究[D]. 上海: 上海海洋大学, 2018: 11-12. [12] 陈世喜, 王鹏飞, 区又君, 等. 急性和慢性低氧胁迫对卵形鲳鲹鳃器官的影响[J]. 南方水产科学, 2017, 13(1): 124-130. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2017.01.016 [13] REINHART B J, SLACK F J, BASSON M, et al. The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans[J]. Nature, 2000, 403(6772): 901-906. doi: 10.1038/35002607
[14] 曾幼玲, 杨瑞瑞. 植物miRNA的生物学特性及在环境胁迫中的作用[J]. 中国农业科学, 2016, 49(19): 3671-3682. doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.19.001 [15] QIAN M, WANG S, GUO X, et al. Hypoxic glioma-derived exosomes deliver microRNA-1246 to induce M2 macrophage polarization by targeting TERF2IP via the STAT3 and NF-κB pathways[J]. Oncogene, 2020, 39(2): 428-442. doi: 10.1038/s41388-019-0996-y
[16] ZHAO Y, ZHU C D, YAN B, et al. miRNA-directed regulation of VEGF in tilapia under hypoxia condition[J]. Biochem Bioph Res Commun, 2014, 454: 183-188. doi: 10.1016/j.bbrc.2014.10.068
[17] SUN X H, WANG X, ZHANG Y, et al. Exosomes of bone-marrow stromal cells inhibit cardiomyocyte apoptosis under ischemic and hypoxic conditions via miR-486-5p targeting the PTEN/PI3K/AKT signaling pathway[J]. Thromb Res, 2019, 177: 23-32. doi: 10.1016/j.thromres.2019.02.002
[18] 曲凌云, 孙修勤, 相建海, 等. 热休克蛋白研究进展[J]. 海洋科学进展, 2004, 22(3): 385-391. doi: 10.3969/j.issn.1671-6647.2004.03.019 [19] 黄勇, 龚望宝, 陈海刚, 等. 基于RNA-Seq高通量测序技术的大口黑鲈转录组分析[J]. 南方水产科学, 2019, 15(1): 106-112. doi: 10.12131/20180066 [20] NAORA H. Involvement of ribosomal proteins in regulating cell growth and apoptosis: translational modulation or recruitment for extraribosomal activity[J]. Immunol Cell Biol, 1999, 77(3): 197-205. doi: 10.1046/j.1440-1711.1999.00816.x
[21] ZHI F, SHAO N, XUE L, et al. Characteristic MicroRNA expression induced by δ-Opioid receptor activation in the rat liver under prolonged hypoxia[J]. Cell Physiol Biochem, 2017, 44(6): 2296-309. doi: 10.1159/000486067
[22] CHEN P J, WENG J Y, HSU P H, et al. NPGPx modulates CPEB2-controlled HIF-1α RNA translation in response to oxidative stress[J]. Nucleic Acids Res, 2015, 43(19): 9393-9404. doi: 10.1093/nar/gkv1010
[23] CAI Y H, LI Y P. Upregulation of miR-29b-3p protects cardiomyocytes from hypoxia-induced apoptosis by targeting TRAF5[J]. Cell Mol Biol Lett, 2019, 24(1): 27. doi: 10.1186/s11658-019-0151-3
[24] ZHANG H, LI H, GE A, et al. Long non-coding RNA TUG1 inhibits apoptosis and inflammatory response in LPS-treated H9c2 cells by down-regulation of miR-29b[J]. Biomed Pharmacother, 2018, 101: 663-669. doi: 10.1016/j.biopha.2018.02.129
[25] DING S, MIERADILIJIANG A, ZHOU Z, et al. Histamine deficiency aggravates cardiac injury through miR-206/216b-Atg13 axis-mediated autophagic-dependant apoptosis[J]. Cell Death Dis, 2018, 9(6): 694. doi: 10.1038/s41419-018-0723-6
[26] YAN Y, CHENG W, ZHOU W, et al. Elevation of circulating miR-210-3p in high-altitude hypoxic environment[J/OL]. Front Physiol, 2016, 7: 84. DOI: 10.3389/fphys.2016.00084.
[27] SHEN Y, ZHAO Y, WANG L, et al. MicroRNA-194 overexpression protects against hypoxia/reperfusion-induced HK-2 cell injury through direct targeting Rheb[J]. J Cell Biochem, 2018, 120(5): 8311-8318.
[28] MATSUURA Y, WADA H, EGUCHI H, et al. Exosomal miR-155 derived from hepatocellular carcinoma cells under hypoxia promotes angiogenesis in endothelial cells[J]. 2019, 64(3): 792-802.
[29] YAN J R, XUE H J, WU S Q, et al. Ginsenoside-Rb1 protects hypoxic- and ischemic-damaged cardiomyocytes by regulating expression of miRNAs[J]. EVID-Based Compl Alt, 2015, 171306. DOI: 10.1155/2015/171306.
[30] SHAN F, LI J, HUANG Q Y. HIF-1 alpha-induced up-regulation of miR-9 contributes to phenotypic modulation in pulmonary artery smooth muscle cells during hypoxia[J]. J Cell Physiol, 2014, 229(10): 1511-1520. doi: 10.1002/jcp.24593
[31] TIAN L, CAI D, ZHUANG D, et al. miR-96-5p regulates proliferation, migration, and apoptosis of vascular smooth muscle cell induced by angiotensin II via targeting NFAT5[J]. J Vasc Res, 2020, 57(2): 1-11.
[32] 郭伟, 许万福, 赵俊红, 等. microRNA-1和热休克蛋白90在心肌缺氧复氧中的关系[J]. 中国分子心脏病学杂志, 2019, 108(5): 57-61. [33] 苑洁, 邹云增. 压力超负荷致小鼠心肌肥厚中miR-378对热休克转录因子-1的调节作用[J]. 中国临床医学, 2019, 26(40): 543-648. [34] CLAEYS K G, SOZANSKA M, MARTIN J J, et al. DNAJB2 expression in normal and diseased human and mouse skeletal muscle[J]. Am J Pathol, 2010, 176(6): 2901-2910. doi: 10.2353/ajpath.2010.090663
[35] VINCENZO L, CARMEN A, ERWIN K, et al. Chaperonopathies: spotlight on hereditary motor neuropathies[J]. Front Mol Biosci, 2016, 3: 81. DOI: 10.3389/fmolb.2016.00081.
[36] ZHU Y, ZHOU H, ZHU Y, et al. Gene expression of Hsp70, Hsp90, and Hsp110 families in normal and abnormal embryonic development of mouse forelimbs[J]. Drug Chem Toxicol, 2012, 35(4): 432-444. doi: 10.3109/01480545.2011.640683
[37] DING Y, LIU W, GORE B, et al. Abstract 41: Dnajb6b is a novel genetic modifier for cardiomyopathy that regulates ER stress response[J]. Circul Res, 2014, 115(Suppl 1): A41.
[38] TRANLUNDMARK K, CHANG Y T, TANNENBERG P, et al. Lack of perlecan heparan sulfate impairs pulmonary vascular development and is protective in hypoxia induced pulmonary hypertension[J]. Cardiovasc Res, 2015, 107(1): 20-31. doi: 10.1093/cvr/cvv143
-
期刊类型引用(6)
1. 郑杰秋，邢东旭，李庆荣，黎尔纳，符兵，廖森泰，邹宇晓，周东来. 沼泽红假单胞菌的生物学功能及其在水产养殖中的研究进展. 中国畜牧兽医. 2025(02): 707-717 . 
百度学术
2. 冯元泰，史荣君，李俊伟，区又君，齐占会，黄洪辉，贾旭颖. 不同日龄四指马鲅幼鱼肠道结构和菌群组成变化分析. 南方水产科学. 2025(01): 153-163 . 本站查看
3. 梁帅，黄哲，丛玉婷，卢亚楠，王媛，王丽，王连顺，杨国军. 光合细菌在水产养殖中的应用研究进展. 饲料研究. 2024(24): 142-146 . 百度学术
4. 靳鹏，和子涵，武婧玉，贾一然，张晓彤，张建新. 1株光合细菌的分离鉴定、培养基优化及脱氮特性研究. 河南农业科学. 2023(07): 136-143 . 百度学术
5. 鲁晏宏，王蕊，王珺，胡婷，付维来，朱传忠，汪攀. 1株耐盐耐低温沼泽红假单胞菌的分离筛选及培养基优化. 饲料研究. 2023(20): 103-108 . 百度学术
6. 谷雪勤，王庆奎，王洋. 海水鱼循环水养殖系统中细菌群落结构研究进展. 天津农学院学报. 2022(02): 76-84 . 百度学术
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