Comparative study on feeding frequency of hybrid F2 of Acanthopagrus schlegelii ♀ × Pagrus major♂ and A. schlegelii
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摘要: 比较了黑鲷 (Acanthopagrus schlegelii) ♀×真鲷 (Pagrus major) ♂杂交子二代 (杂交鲷或杂交F2) 与黑鲷幼鱼在不同投喂频率下生长性能、生理生化指标的差异表现，为新品种选育提供基础依据。选用杂交F2及黑鲷幼鱼为研究对象，设4个投喂频率组 (1T：1次·d−1、2T：2次·d−1、3T：3次·d−1、4T：4次·d−1)，进行40 d的养殖实验。结果显示，投喂频率从1T升至2T，杂交F2与黑鲷的增重率 (WGR)、特定生长率 (SGR)、成活率 (SR) 显著升高 (P<0.05)，胃蛋白酶、脂肪酶(LPS)、α-淀粉酶活力显著降低 (P<0.05)。投喂频率超过2T时，杂交F2和黑鲷各实验组的WGR、SGR、SR及消化酶活力均无显著差异 (P>0.05)；抗氧化酶活力3T与2T组间无显著差异 (P>0.05)，但显著高于4T (P<0.05)。相同的投喂频率下，2T组杂交F2的WGR、SGR、胃蛋白酶、LPS均显著高于黑鲷 (P<0.05)，4T组杂交F2的过氧化氢酶 (CAT)、总超氧化物歧化酶 (T-SOD) 均显著高于黑鲷 (P<0.05)。研究结果表明，杂交F2及黑鲷幼鱼的适宜投喂频率为2T，且杂交F2在所有组别中的生长性能表现均优于黑鲷。Abstract: In order to study and compare the differences of growth performance, physiological and biochemical indexes between the hybrid porgy (HF2) of Acanthopagrus schlegelii♀ (black porgy) ×Pagrus major♂ (red porgy) and A. schlegelii with different feeding frequencies, we selected the HF2 and A. schlegelii juveniles as the research objects, and set four feeding frequency groups: once·d −1, twice·d−1, 3 times·d−1 and 4 times·d−1 (marked as 1T, 2T, 3T and 4T), and carried out a 40-day breeding experiment. The results show that when the feeding frequency increased from 1T to 2T, the weight gain rate (WGR), specific growth rate (SGR) and survival rate (SR) of the HF2 and A. schlegelii increased significantly (P<0.05), while the activities of pepsin, lipase and α-amylase decreased significantly (P<0.05). There was no significant difference in the WGR, SGR, SR and digestive enzyme activities among the HF2 and A. schlegelii groups (P>0.05). When the feeding frequency was more than 2T, there was no significant difference in the WGR, SGR, SR and digestive enzyme activity among the experimental groups (P>0.05). The antioxidant enzyme activity had no significant difference between 3T and 2T groups (P>0.05), but was significantly higher than that in 4T group (P>0.05). In addition, with the same feeding frequency, the WGR, SGR, pepsin and lipase (LPS) of the HF2 in 2T group were significantly higher than those of A. schlegelii; the catalase (CAT) and total superoxide dismutase (T-SOD) of the HF2 in 4T group were significantly higher than those of A. schlegelii (P<0.05). Therefore, the optimum feeding frequency of the HF2 and A. schlegelii juveniles is 2T, and the growth performance of the HF2 is obviously better than that in A. schlegelii among all the experimental groups.
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鱼类生长激素(growth hormone，GH)是由脑垂体细胞合成和分泌的一种单链多肽，其分子量在22 kDa左右，可分为信号肽和成熟肽2个部分，信号肽一般由16~17个氨基酸残基组成，成熟蛋白由173~190个氨基酸组成。GH对鱼类最明显的作用是刺激鱼体重和体长的增长，促进发育，参与鱼体代谢调节，还可以调节海河洄游性鱼类的渗透压，并促进其对海水适应能力[1]。GH不但可以作为激素对鱼类的生长发育和生殖起重要作用，而且可以作为一种细胞分裂素，在免疫反应起作用，同时还参与调节蛋白质，糖和脂肪等的合成和释放，从而影响蛋白质、糖和脂肪的代谢[2-4]。深入研究鱼类生长激素的表达调控规律，弄清鱼类生长发育的调控机理，可为人工调控鱼类生长发育，促进水产养殖业的发展提供理论依据。
鲮(Cirrhinus molitorella)隶属鲤形目(Cypriniformes)鲤科(Cyprinidae)中的野鲮亚科(Labeoninae)，广泛分布于中国华南地区，东南亚和非洲的热带及亚热带地区[5]。鲮是中国华南地区重要的淡水养殖品种之一，其产量占广东、广西池塘养殖鱼类总产量的35%左右，具有产量高、抗病力强和肉质鲜美的特点，其适合制作罐装食品和鱼丸，是中国淡水鱼加工附加值最高的品种之一。但是鲮生长速度慢，且不耐低温，是目前制约鲮养殖产业发展的因素之一。与哺乳动物类似，鱼类生长发育主要受GH-IGF(胰岛素样生长因子)的调控，深入开展鲮生长激素表达调控机理的研究，以便为人工控制鲮的生长发育提供理论依据。目前该试验室已克隆了鲮生长激素cDNA并在大肠杆菌中进行了重组表达。为进一步研究在各种条件下鲮血液和脑垂体中生长激素蛋白的表达规律，必须要制备特异性强、灵敏度高的抗鲮生长激素抗体。因此，该研究在重组表达了鲮生长激素蛋白的基础上，制备了兔抗鲮生长激素多克隆抗体，并对其灵敏度和特异性进行了分析。
1. 材料和方法
1.1 材料
重组工程菌M15(pQE30-GH)由笔者实验室构建，新西兰大白兔(Oryctolagus cuniculus)购于广州中医药大学实验动物中心，鲮鱼购于广州鹭江市场，镍琼脂糖凝胶FF填料购自北京韦氏博慧色谱科技有限公司，HRP标记的羊抗兔IgG购于Amersham公司，DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，其它试剂均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 鲮生长激素的重组融合表达以及包涵体的分离
取含有500 mL LB(100 μg · mL-1 Amp和25 μg · mL-1 Km)及种菌的烧瓶，最佳诱导条件参照江世贵等[6]对鲮生长激素cDNA的克隆及其重组表达产物的促生长活性的研究。在37℃加入浓度为100 mmol · L-1的IPTG溶液使其终浓度1 mmol ·L-1 250 rpm振荡培养诱导5 h，4℃保存。菌体经超声波破碎后，4℃，8 000 rpm离心20 min，离心收集到的包涵体经TE1(Tris-Cl 10 mmol · L-1，pH 8.0，EDTA 1 mmol · L-1)，TE2[1%TritonX-100(V/V)，Tris-Cl 10 mmol · L-1，pH 8.0，EDTA 1 mmol · L-1]和TE3(尿素2 mol · L-1，Tris-Cl 10 mmol · L-1 pH 8.0，EDTA 1 mmol · L-1)洗涤后，即可得到初步纯化的包涵体蛋白，然后将包涵体蛋白溶解在变性液(尿素8 mol · L-1，Tris-Cl 20 mmol ·L-1 pH 8.0，0.5 mol · L-1 NaCl，5 mmol · L-1 imidazole，1 mmol · L-1 2-mercaptoethanol)中。
1.2.2 重组蛋白的纯化、复性和浓缩
经过包涵体分离得到的包涵体蛋白，在4℃，8 000 rpm离心10 min后，上清液用0.2 μm的过滤器过滤，然后上样经镍琼脂糖凝胶FF(装填后柱床长5 cm，直径1.6 cm)亲合层析。上柱后以含20 mmol · L-1，500 mmol · L-1的咪唑以及ddH2O进行阶段洗脱，流速1.5 mL · min-1，手工收集洗脱峰。将收集后的样品进行SDS-PAGE分析，同时将纯化后的蛋白用稀释变性液(尿素8 mol · L-1，Tris-Cl 20 mmol · L-1 pH8.0，0.5 mol · L-1 NaCl)稀释到1 mg · mL-1装入处理好的透析袋中，采用逐步稀释的方法复性。具体操作如下，将装有蛋白的透析袋放到等体积的复性液(氧化型谷胱甘肽0.1 mmol · L-1，还原型谷胱甘肽0.9 mmol · L-1，Tris-Cl 20 mmol ·L-1，pH 8.0)中，4℃搅拌过夜，使尿素浓度由4~2.5 mol · L-1，再到0.8 mol · L-1逐步稀释，然后在ddH2O(pH 8.0)透析过夜以除去剩余的变性剂。最后，将复性后的蛋白用超滤离心管过滤浓缩。
1.2.3 抗血清的制备
将浓缩后的重组鲮GH作为抗原，采用改进的方法[7]免疫新西兰大白兔。在第1天和第3天，将1 mL样品A(300 μg · 500 μL-1纯化浓缩蛋白和500 μL Freund′s完全佐剂)采用多点注射到兔子的背部和腿部；第28天将1 mL样品B(300 μg · 500 μL-1纯化浓缩蛋白和500 μL Freund′s不完全佐剂)加强免疫1次。第35天，颈动脉取血，37℃放置2 h，4℃过夜，离心收集血清。
1.2.4 ELISA分析
采用间接ELISA检测抗血清效价。用pH 9.6，0.05 mol · L-1的碳酸盐缓冲液将纯化的重组鲮生长激素稀释为20 μg · mL-1，包被酶标板，每孔100 μL，4℃包被过夜。次日每孔加入100 μL 5%的脱脂奶粉，37℃封闭1 h后，用pH 7.4的PBST洗涤3次。然后每孔加入200~51 200倍稀释的兔抗血清100 μL，阴性对照为1：50倍稀释的免疫前血清，空白对照为兔抗血清稀释液(PBS)，每份样品均做1平行，37℃孵育1 h后，同上洗涤3次。再次每孔加入100 μL HRP标记的羊抗兔IgG，37℃孵育1 h后，同上洗涤3次。接下来每孔加入100 μL TMB显色液，37℃避光反应20 min后，每孔再加入50 μL 2 mol · L-1硫酸终止液。最后，在酶标仪上测450 nm下的OD值。
1.2.5 Western blotting分析
将抗原稀释为0.5、1、2、4和10 ng，经15% SDS-PAGE电泳分离后转移到硝酸纤维素膜上。用稀释度1：500的抗血清作为一抗[8]，比例1：2 000作为二抗稀释度，DAB显色。标准分子量蛋白质转膜后用丽春红染色液染色。
鲮组织提取物中GH同源蛋白质的检测。取100 mg脑垂体组织加入到100 μL抽提液(4 M Urea，0.5% W/V SDS，10 mM EDTA和2 mM PMSF)中匀浆，94℃孵育10 min，10 000 g离心10 min后，用Bradford方法进行定量测定[9-10]。取鲮血4℃，6 500 rpm离心20 min分离血清，同样用Bradford方法进行定量测定。分别取1 μg脑垂体提取蛋白和1 μg血清蛋白进行Western blotting分析。
2. 结果和讨论
2.1 鲮生长激素的重组融合表达以及包涵体的分离、纯化和浓缩
如图 1所示，IPTG可诱导M15(pQE30-GH)在大肠杆菌中大量表达。SDS-PAGE凝胶电泳结果显示，1条24.5 kDa的诱导表达重组鲮GH带。经过包涵体分离、纯化、浓缩得到纯度很高的蛋白。
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图 1 鲮鱼生长激素的重组融合表达，包涵体的分离，纯化和浓缩电泳图M. 低分子量蛋白标准；1. IPTG诱导生长激素的表达；2. 生长激素表达负对照；3. M15(pQE30)诱导表达；4. 包涵体分离后电泳图；5. 包涵体纯化后电泳图；6. 纯化蛋白浓缩后电泳图Fig. 1 The electrophoresis map of the recombinant expression and purification of mud carp growth hormoneM. low molecular weight protein marker; 1. the growth hormone induced by IPTG; 2. growth hormone expressed negative control; 3. M15(pQE30)expressed; 4. inclusion body; 5. purified inclusion body; 6. condensed protein2.2 ELISA分析结果
兔抗鲮生长激素的血清进行间接ELISA检测时，当(样品吸光值－空白吸光值)/(阴性吸光值－空白吸光值)＞2.1即认为是阳性[11]，经计算，此研究制备的兔抗血清效价为1 : 12 800(表 1)。
表 1 ELISA检测结果Table 1 The results of ELISA免疫血清稀释倍数
the antiserum dilution times免疫血清OD450
the antiserum OD450阴性对照血清OD450
normal rabbit serum OD450空白对照OD450
black control OD450P/N 1:200 1.186 0.336 0.175 + 1:400 1.138 0.336 0.175 + 1:800 1.180 0.336 0.175 + 1:1 600 1.029 0.336 0.175 + 1:3 200 0.872 0.336 0.175 + 1:6 400 0.656 0.336 0.175 + 1:12 800 0.533 0.336 0.175 + 1:25 600 0.464 0.336 0.175 － 1:51 200 0.379 0.336 0.175 － 2.3 Western blotting分析结果
将抗原稀释为0.5、1、2、4和10 ng，经15% PAGE电泳分离后，转移到硝酸纤维素膜上。用稀释度1：500的抗血清作为一抗，比例1：2 000作为二抗稀释度，DAB显色。标准分子量蛋白质转膜后用丽春红染色液染色。结果显示，可检测到10 ng抗原量，表明此抗体灵敏度较高(图 2)。
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图 2 抗体灵敏度分析M. 低分子量蛋白标准；1. 10 ng抗原；2. 4 ng抗原；3. 2 ng抗原；4. 1 ng抗原；5. 0.5 ng抗原Fig. 2 The antibody sensitivety analysisM. low molecular weight protein marker; 1. 10 ng antigen; 2. 4 ng antigen; 3. 2 ng antigen; 4. 1 ng antigen; 5. 0.5 ng antigen为了解这一抗血清的特异性，取鲮脑垂体组织和血清进行Western blotting分析。结果显示，用此多抗可检测到1条大约为21.5 kDa的条带(图 3)，这说明这一多抗具有较好的免疫特性。
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图 3 抗体特性性分析M. 低分子量蛋白标准；1. 血清；2. 脑组织Fig. 3 The antibody specificity analysisM. low molecular weight protein marker; 1. serum; 2. pituitary此试验所表达的重组鲮生长激素主要以包涵体形式存在。另外，包涵体中的杂蛋白较少、且50%以上为重组蛋白，给重组蛋白的纯化带来便利。经过3次TE缓冲液洗涤，包涵体达到了较好的纯化效果，洗涤后重组蛋白纯度达到85%以上。初步纯化后的包涵体重组蛋白经镍琼脂糖凝胶FF亲和层析后，由含20 mmol · L-1，500 mmol · L-1的咪唑以及ddH2O进行阶段洗脱，进一步纯化该重组蛋白，纯度可达到95%以上。由于GH基因内Cys含量较高，分子内可形成2个二硫键，在复性时容易形成蛋白质聚集体，所以笔者利用GSH/GSSG氧化交换系统促使二硫键的正确配对，同时采用稀释复性和透析复性相结合的方式对纯化蛋白进行复性。在复性过程中融合蛋白的再聚合是令人棘手的问题。姚燕等[12]中华绒鳌蟹(Eriocheir japonica sinensis)蜕皮抑制激素基因的表达及抗体制备研究表明在可在复性液中加入甘油增加粘度来减少蛋白分子间的相互作用，从而阻止透析复性过程中蛋白的再聚合，并且L-精氨酸作为小分子促溶剂，使整个透析过程中蛋白的聚合几率降到最低。张傅山等[13]研究表明在复性液中加入10%无水乙醇可提高复性效率。另外，蛋白质浓度也是影响蛋白质复性的重要因素。当蛋白浓度超过1 mg · mL-1时，即使复性液中加入甘油和L-精氨酸，复性后透析时仍会出现浑浊现象。笔者在试验中并没有加入促溶剂，直接将纯化后的蛋白用复性稀释液稀释到1 mg · mL-1再进行复性也得到了较好的复性效果。
经过包涵体分离的蛋白通过镍琼脂糖凝胶FF填料来分离带His标签的重组蛋白，其纯度可达95%以上。分离纯化的蛋白质大小为24.5 kDa，这比GH成熟蛋白大了约3 kDa左右，这是因为6xHis标签的分子量约为3 kDa，而GH成熟蛋白的分子量约为22 kDa，所以该蛋白质带大小与预期大小一致。纯化的方法有很多，此试验采用的是亲和层析，该纯化方法简便，分离效果好，其纯化产物可达95%以上，且经过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色呈现均一的1条带。这说明该纯化产物可用于抗体的制备和后续的生化实验的需要。
用经改良的方法进行免疫新西兰大白兔，经过35 d免疫注射后，用间接ELISA方法检测其抗体滴度为12 800，可以用来Western blotting分析。用改良后的方法来免疫新西兰大白兔在时间上由原来的3~4个月缩短到35 d，大大缩短了制备高效抗血清的时间，且所制备抗血清均能用于ELISA和Western blotting分析。胡志红等[14]用改良的方法制备了猴(Macaca mulatta)Esc-615基因多克隆抗体的制备，其抗血清滴度达到100 000。冯浩等[8]制备了青鱼(Mylopharyngodon piceus)生长激素多克隆抗血清也能用于ELISA和Western blotting分析。从而表明了上诉方法制备抗鲮GH的多克隆抗体不仅简便，而且行之有效，可为生长激素活性及功能的研究提供有效免疫学鉴定工具。
此试验制备的兔抗鲮生长激素多克隆抗体，经ELISA检测其滴度为12 800，经Western blotting分析，可以检测到10 ng的抗原量，而且可以在脑垂体提取物和血清中检测到大小为21.5 kDa的蛋白质，充分说明该抗体具有较强的灵敏性和免疫原性，为进一步研究在不同条件下鲮血液和脑垂体中生长激素蛋白的表达规律奠定了基础。
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图 1 不同投喂频率下杂交鲷与黑鲷消化酶活力比较
柱形图上方无字母或相同字母表示差异不显著 (P>0.05)，不同小写字母表示实验组间差异显著 (P<0.05)，不同大写字母表示实验组内种间差异显著 (P<0.05)，后图同此。
Figure 1. Comparison of digestive enzyme activities of hybrid porgy of A. schlegelii ♀× P. major♂ and A. schlegelii with different feeding frequencies
No letters or the same letters above the column chart indicate no significant difference (P>0.05), while different small letters indicate significant difference between the experimental groups (P<0.05). Different capital letters indicate significant difference among the species within the experimental groups (P<0.05). The same case in the following figures.
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图 2 不同投喂频率下杂交鲷与黑鲷肝脏抗氧化指标比较
Figure 2. Comparison of liver antioxidant indexes of hybrid porgy of A. schlegelii ♀× P. major♂ and A. schlegelii with different feeding frequencies
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图 3 不同投喂频率下杂交鲷与黑鲷肝功能指标比较
Figure 3. Comparison of liver function indexes of hybrid porgy of A. schlegelii ♀×P. major♂ and A. schlegelii with different feeding frequencies
表 1 不同投喂频率下杂交鲷与黑鲷生长性能和形态指标的变化差异
Table 1 Difference of growth performance and morphological indexes of hybrid porgy of A. schlegelii ♀× P. major♂ and A. schlegelii with different feeding frequencies
指标
Index实验鱼
Experimental fish组别 Group 1T 2T 3T 4T 初始体质量 IBW/g HF2 6.42±0.14 AS 6.52±0.23 终末体质量 FBW/g HF2 26.06±1.34bA 41.87±0.22aA 39.27±0.71abA 32.73±3.23ab AS 22.98±0.70bB 28.99±3.11aB 27.68±2.06abB 28.43±1.75a 增重率 WGR/% HF2 305.85±20.91bA 552.13±11.25aA 511.63±11.05abA 409.86±20.25ab AS 252.31±10.79bB 344.48±47.69aB 324.37±31.66abB 335.87±26.80a 特定生长率 SGR/% HF2 3.50±0.13bA 4.67±0.32aA 4.53±0.04abA 4.06±0.24ab AS 3.15±0.08bB 3.72±0.26aB 3.61±0.19aB 3.68±0.15a 肥满度 CF/% HF2 3.08±0.22 4.08±0.83 3.88±0.42A 3.39±0.52 AS 3.16±0.17 3.26±0.02 2.92±0.28B 2.92±0.20 肝体比 HSI/% HF2 1.61±0.05bA 1.95±0.25a 1.84±0.17b 1.31±0.17c AS 1.40±0.08bcB 1.65±0.03a 1.54±0.26b 1.33±0.12c 脏体比 VSI/% HF2 7.15±0.46a 5.77±0.80ab 5.28±0.14abA 5.71±0.91b AS 6.95±0.41a 6.73±0.43ab 6.15±0.26abB 5.86±0.47b 成活率 SR/% HF2 93.33±1.36b 98.89±1.57a 94.44±3.42ab 97.22±1.57ab AS 92.78±3.42b 98.89±0.79a 97.78±1.57ab 97.22±2.08ab 体质量变异系数 CV/% HF2 6.50±1.08 7.65±3.70 7.48±7.07 15.43±9.88 AS 7.89±2.86 12.74±4.24 10.88±3.38 15.30±6.81 摄食量 FI/g HF2 25.01±8.52 29.79±7.06 31.92±7.28 31.95±7.22 AS 24.95±8.14 30.10±7.11 31.80±6.94 31.57±6.85 饲料系数 FCR HF2 1.30±0.50 0.83±0.11 0.97±0.32 1.26±0.51 AS 1.54±0.56 1.39±0.47 1.46±0.34 1.43±0.38 注：HF2. 杂交F2；AS. 黑鲷；同行中上标不同小写字母表示差异显著 (P<0.05)；同列中上标不同大写字母表示差异显著 (P<0.05)。 Note: HF2. Hybrid F2 of A. schlegelii♀ × P.major ♂; AS. A.schlegelii; values with different superscript small letters within the same row indicate significant difference (P<0.05); while values with different superscript capital letters within the same column indicate significant difference (P<0.05). 
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