Genetic diversity of silver carp (Hypophthalmichthys molitrix) in lower reaches of Yangtze River based on microsatellite markers
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摘要: 为了解长江下游鲢 (Hypophthalmichthys molitrix) 遗传多样性和遗传结构分布，该研究利用微卫星分子标记结合毛细管电泳技术，通过对2017—2019年长江湖口、安庆、芜湖、当涂、镇江、靖江、张家港和常熟8个江段鲢野生群体共327 份DNA进行基因分型与遗传多样性相关分析，比对了其遗传多样性、遗传分化和遗传结构情况。结果显示，长江下游8 个群体总体遗传多样性水平较高，但群体内缺乏足够的杂合子，8个群体等位基因数 (Na)介于6.0~12.3，有效等位基因数(Ne)介于3.94~6.10，观测杂合度 (Ho)和期望杂合度 (He)分别介于0.617~0.719和0.658~0.774，无偏期望杂合度(uHe)介于0.671~0.782，Shannon's信息指数 (I)介于1.38~1.86，群体内近交系数 (F)介于0.001~0.174；遗传分化分析显示Fst (F-statitics values) 介于0.006~0.068，基因流 (Nm)介于3.41~41.9，遗传距离 (D)介于0.001~0.106，湖口群体与其他群体表现出中等程度的遗传差异，其他群体间遗传差异很小，分子方差分析显示变异主要来自群体内 (97.6%)；遗传结构分析显示湖口群体有不同于其他群体的基因库。结果表明江湖连通性可能对于鲢在湖口江段展现独特遗传分化特征具有积极意义，而形成这种种群分化究竟是由于地理距离的空间隔离还是生境差异的生理屏障有待进一步探究。Abstract: In order to understand the genetic diversity and distribution of silver carp (Hypophthalmichthys molitrix) in the lower reaches of the Yangtze River, we used simple sequence repeats (SSR) combining with capillary electrophoresis to analyze 327 DNA samples of silver carp from eight wild populations in Yangtze River sections (Hukou, Anqing, Wuhu, Dangtu, Zhenjiang, Jingjiang, Zhangjiagang and Changshu sections) from 2017 to 2019, so as to investigate their genetic diversity, genetic differentiation and genetic structure. The results show that the genetic diversity of the eight populations was high. However, heterozygotes were not enough in the populations. The number of alleles ranged from 6.00 to 12.3, while the number of effective alleles ranged from 3.94 to 6.10. The observed heterozygosity and expected heterozygosity ranged from 0.617 to 0.719 and from 0.658 to 0.774, respectively. The unbiased expected heterozygosity ranged from 0.671 to 0.782. The Shannon's information index ranged from 1.38 to 1.86, and the inbreeding coefficient ranged from 0.001 to 0.174. The genetic differentiation analysis shows that the Fst value ranged from 0.006 to 0.068, while the gene flow ranged from 3.41 to 41.9. The genetic distance ranged from 0.001 to 0.106. Hukou population showed a moderate degree of genetic difference with the other populations, while the genetic differences among the other populations were small. Analysis of molecular variance shows that the variation mainly was within the population (97.6%). Genetic structure analysis shows that Hukou population had different gene pool from the other populations. The river-lake connectivity may be of positive significance for silver carp to show unique genetic differentiation characteristics in Hukou section of the Yangtze River. Therefore, whether the formation of this population differentiation is caused by the spatial isolation of geographical distance or the physiological barrier of habitat difference needs to be further studied.
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鱼类生长激素(growth hormone，GH)是由脑垂体细胞合成和分泌的一种单链多肽，其分子量在22 kDa左右，可分为信号肽和成熟肽2个部分，信号肽一般由16~17个氨基酸残基组成，成熟蛋白由173~190个氨基酸组成。GH对鱼类最明显的作用是刺激鱼体重和体长的增长，促进发育，参与鱼体代谢调节，还可以调节海河洄游性鱼类的渗透压，并促进其对海水适应能力[1]。GH不但可以作为激素对鱼类的生长发育和生殖起重要作用，而且可以作为一种细胞分裂素，在免疫反应起作用，同时还参与调节蛋白质，糖和脂肪等的合成和释放，从而影响蛋白质、糖和脂肪的代谢[2-4]。深入研究鱼类生长激素的表达调控规律，弄清鱼类生长发育的调控机理，可为人工调控鱼类生长发育，促进水产养殖业的发展提供理论依据。
鲮(Cirrhinus molitorella)隶属鲤形目(Cypriniformes)鲤科(Cyprinidae)中的野鲮亚科(Labeoninae)，广泛分布于中国华南地区，东南亚和非洲的热带及亚热带地区[5]。鲮是中国华南地区重要的淡水养殖品种之一，其产量占广东、广西池塘养殖鱼类总产量的35%左右，具有产量高、抗病力强和肉质鲜美的特点，其适合制作罐装食品和鱼丸，是中国淡水鱼加工附加值最高的品种之一。但是鲮生长速度慢，且不耐低温，是目前制约鲮养殖产业发展的因素之一。与哺乳动物类似，鱼类生长发育主要受GH-IGF(胰岛素样生长因子)的调控，深入开展鲮生长激素表达调控机理的研究，以便为人工控制鲮的生长发育提供理论依据。目前该试验室已克隆了鲮生长激素cDNA并在大肠杆菌中进行了重组表达。为进一步研究在各种条件下鲮血液和脑垂体中生长激素蛋白的表达规律，必须要制备特异性强、灵敏度高的抗鲮生长激素抗体。因此，该研究在重组表达了鲮生长激素蛋白的基础上，制备了兔抗鲮生长激素多克隆抗体，并对其灵敏度和特异性进行了分析。
1. 材料和方法
1.1 材料
重组工程菌M15(pQE30-GH)由笔者实验室构建，新西兰大白兔(Oryctolagus cuniculus)购于广州中医药大学实验动物中心，鲮鱼购于广州鹭江市场，镍琼脂糖凝胶FF填料购自北京韦氏博慧色谱科技有限公司，HRP标记的羊抗兔IgG购于Amersham公司，DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，其它试剂均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 鲮生长激素的重组融合表达以及包涵体的分离
取含有500 mL LB(100 μg · mL-1 Amp和25 μg · mL-1 Km)及种菌的烧瓶，最佳诱导条件参照江世贵等[6]对鲮生长激素cDNA的克隆及其重组表达产物的促生长活性的研究。在37℃加入浓度为100 mmol · L-1的IPTG溶液使其终浓度1 mmol ·L-1 250 rpm振荡培养诱导5 h，4℃保存。菌体经超声波破碎后，4℃，8 000 rpm离心20 min，离心收集到的包涵体经TE1(Tris-Cl 10 mmol · L-1，pH 8.0，EDTA 1 mmol · L-1)，TE2[1%TritonX-100(V/V)，Tris-Cl 10 mmol · L-1，pH 8.0，EDTA 1 mmol · L-1]和TE3(尿素2 mol · L-1，Tris-Cl 10 mmol · L-1 pH 8.0，EDTA 1 mmol · L-1)洗涤后，即可得到初步纯化的包涵体蛋白，然后将包涵体蛋白溶解在变性液(尿素8 mol · L-1，Tris-Cl 20 mmol ·L-1 pH 8.0，0.5 mol · L-1 NaCl，5 mmol · L-1 imidazole，1 mmol · L-1 2-mercaptoethanol)中。
1.2.2 重组蛋白的纯化、复性和浓缩
经过包涵体分离得到的包涵体蛋白，在4℃，8 000 rpm离心10 min后，上清液用0.2 μm的过滤器过滤，然后上样经镍琼脂糖凝胶FF(装填后柱床长5 cm，直径1.6 cm)亲合层析。上柱后以含20 mmol · L-1，500 mmol · L-1的咪唑以及ddH2O进行阶段洗脱，流速1.5 mL · min-1，手工收集洗脱峰。将收集后的样品进行SDS-PAGE分析，同时将纯化后的蛋白用稀释变性液(尿素8 mol · L-1，Tris-Cl 20 mmol · L-1 pH8.0，0.5 mol · L-1 NaCl)稀释到1 mg · mL-1装入处理好的透析袋中，采用逐步稀释的方法复性。具体操作如下，将装有蛋白的透析袋放到等体积的复性液(氧化型谷胱甘肽0.1 mmol · L-1，还原型谷胱甘肽0.9 mmol · L-1，Tris-Cl 20 mmol ·L-1，pH 8.0)中，4℃搅拌过夜，使尿素浓度由4~2.5 mol · L-1，再到0.8 mol · L-1逐步稀释，然后在ddH2O(pH 8.0)透析过夜以除去剩余的变性剂。最后，将复性后的蛋白用超滤离心管过滤浓缩。
1.2.3 抗血清的制备
将浓缩后的重组鲮GH作为抗原，采用改进的方法[7]免疫新西兰大白兔。在第1天和第3天，将1 mL样品A(300 μg · 500 μL-1纯化浓缩蛋白和500 μL Freund′s完全佐剂)采用多点注射到兔子的背部和腿部；第28天将1 mL样品B(300 μg · 500 μL-1纯化浓缩蛋白和500 μL Freund′s不完全佐剂)加强免疫1次。第35天，颈动脉取血，37℃放置2 h，4℃过夜，离心收集血清。
1.2.4 ELISA分析
采用间接ELISA检测抗血清效价。用pH 9.6，0.05 mol · L-1的碳酸盐缓冲液将纯化的重组鲮生长激素稀释为20 μg · mL-1，包被酶标板，每孔100 μL，4℃包被过夜。次日每孔加入100 μL 5%的脱脂奶粉，37℃封闭1 h后，用pH 7.4的PBST洗涤3次。然后每孔加入200~51 200倍稀释的兔抗血清100 μL，阴性对照为1：50倍稀释的免疫前血清，空白对照为兔抗血清稀释液(PBS)，每份样品均做1平行，37℃孵育1 h后，同上洗涤3次。再次每孔加入100 μL HRP标记的羊抗兔IgG，37℃孵育1 h后，同上洗涤3次。接下来每孔加入100 μL TMB显色液，37℃避光反应20 min后，每孔再加入50 μL 2 mol · L-1硫酸终止液。最后，在酶标仪上测450 nm下的OD值。
1.2.5 Western blotting分析
将抗原稀释为0.5、1、2、4和10 ng，经15% SDS-PAGE电泳分离后转移到硝酸纤维素膜上。用稀释度1：500的抗血清作为一抗[8]，比例1：2 000作为二抗稀释度，DAB显色。标准分子量蛋白质转膜后用丽春红染色液染色。
鲮组织提取物中GH同源蛋白质的检测。取100 mg脑垂体组织加入到100 μL抽提液(4 M Urea，0.5% W/V SDS，10 mM EDTA和2 mM PMSF)中匀浆，94℃孵育10 min，10 000 g离心10 min后，用Bradford方法进行定量测定[9-10]。取鲮血4℃，6 500 rpm离心20 min分离血清，同样用Bradford方法进行定量测定。分别取1 μg脑垂体提取蛋白和1 μg血清蛋白进行Western blotting分析。
2. 结果和讨论
2.1 鲮生长激素的重组融合表达以及包涵体的分离、纯化和浓缩
如图 1所示，IPTG可诱导M15(pQE30-GH)在大肠杆菌中大量表达。SDS-PAGE凝胶电泳结果显示，1条24.5 kDa的诱导表达重组鲮GH带。经过包涵体分离、纯化、浓缩得到纯度很高的蛋白。
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图 1 鲮鱼生长激素的重组融合表达，包涵体的分离，纯化和浓缩电泳图M. 低分子量蛋白标准；1. IPTG诱导生长激素的表达；2. 生长激素表达负对照；3. M15(pQE30)诱导表达；4. 包涵体分离后电泳图；5. 包涵体纯化后电泳图；6. 纯化蛋白浓缩后电泳图Fig. 1 The electrophoresis map of the recombinant expression and purification of mud carp growth hormoneM. low molecular weight protein marker; 1. the growth hormone induced by IPTG; 2. growth hormone expressed negative control; 3. M15(pQE30)expressed; 4. inclusion body; 5. purified inclusion body; 6. condensed protein2.2 ELISA分析结果
兔抗鲮生长激素的血清进行间接ELISA检测时，当(样品吸光值－空白吸光值)/(阴性吸光值－空白吸光值)＞2.1即认为是阳性[11]，经计算，此研究制备的兔抗血清效价为1 : 12 800(表 1)。
表 1 ELISA检测结果Table 1 The results of ELISA免疫血清稀释倍数
the antiserum dilution times免疫血清OD450
the antiserum OD450阴性对照血清OD450
normal rabbit serum OD450空白对照OD450
black control OD450P/N 1:200 1.186 0.336 0.175 + 1:400 1.138 0.336 0.175 + 1:800 1.180 0.336 0.175 + 1:1 600 1.029 0.336 0.175 + 1:3 200 0.872 0.336 0.175 + 1:6 400 0.656 0.336 0.175 + 1:12 800 0.533 0.336 0.175 + 1:25 600 0.464 0.336 0.175 － 1:51 200 0.379 0.336 0.175 － 2.3 Western blotting分析结果
将抗原稀释为0.5、1、2、4和10 ng，经15% PAGE电泳分离后，转移到硝酸纤维素膜上。用稀释度1：500的抗血清作为一抗，比例1：2 000作为二抗稀释度，DAB显色。标准分子量蛋白质转膜后用丽春红染色液染色。结果显示，可检测到10 ng抗原量，表明此抗体灵敏度较高(图 2)。
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图 2 抗体灵敏度分析M. 低分子量蛋白标准；1. 10 ng抗原；2. 4 ng抗原；3. 2 ng抗原；4. 1 ng抗原；5. 0.5 ng抗原Fig. 2 The antibody sensitivety analysisM. low molecular weight protein marker; 1. 10 ng antigen; 2. 4 ng antigen; 3. 2 ng antigen; 4. 1 ng antigen; 5. 0.5 ng antigen为了解这一抗血清的特异性，取鲮脑垂体组织和血清进行Western blotting分析。结果显示，用此多抗可检测到1条大约为21.5 kDa的条带(图 3)，这说明这一多抗具有较好的免疫特性。
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图 3 抗体特性性分析M. 低分子量蛋白标准；1. 血清；2. 脑组织Fig. 3 The antibody specificity analysisM. low molecular weight protein marker; 1. serum; 2. pituitary此试验所表达的重组鲮生长激素主要以包涵体形式存在。另外，包涵体中的杂蛋白较少、且50%以上为重组蛋白，给重组蛋白的纯化带来便利。经过3次TE缓冲液洗涤，包涵体达到了较好的纯化效果，洗涤后重组蛋白纯度达到85%以上。初步纯化后的包涵体重组蛋白经镍琼脂糖凝胶FF亲和层析后，由含20 mmol · L-1，500 mmol · L-1的咪唑以及ddH2O进行阶段洗脱，进一步纯化该重组蛋白，纯度可达到95%以上。由于GH基因内Cys含量较高，分子内可形成2个二硫键，在复性时容易形成蛋白质聚集体，所以笔者利用GSH/GSSG氧化交换系统促使二硫键的正确配对，同时采用稀释复性和透析复性相结合的方式对纯化蛋白进行复性。在复性过程中融合蛋白的再聚合是令人棘手的问题。姚燕等[12]中华绒鳌蟹(Eriocheir japonica sinensis)蜕皮抑制激素基因的表达及抗体制备研究表明在可在复性液中加入甘油增加粘度来减少蛋白分子间的相互作用，从而阻止透析复性过程中蛋白的再聚合，并且L-精氨酸作为小分子促溶剂，使整个透析过程中蛋白的聚合几率降到最低。张傅山等[13]研究表明在复性液中加入10%无水乙醇可提高复性效率。另外，蛋白质浓度也是影响蛋白质复性的重要因素。当蛋白浓度超过1 mg · mL-1时，即使复性液中加入甘油和L-精氨酸，复性后透析时仍会出现浑浊现象。笔者在试验中并没有加入促溶剂，直接将纯化后的蛋白用复性稀释液稀释到1 mg · mL-1再进行复性也得到了较好的复性效果。
经过包涵体分离的蛋白通过镍琼脂糖凝胶FF填料来分离带His标签的重组蛋白，其纯度可达95%以上。分离纯化的蛋白质大小为24.5 kDa，这比GH成熟蛋白大了约3 kDa左右，这是因为6xHis标签的分子量约为3 kDa，而GH成熟蛋白的分子量约为22 kDa，所以该蛋白质带大小与预期大小一致。纯化的方法有很多，此试验采用的是亲和层析，该纯化方法简便，分离效果好，其纯化产物可达95%以上，且经过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色呈现均一的1条带。这说明该纯化产物可用于抗体的制备和后续的生化实验的需要。
用经改良的方法进行免疫新西兰大白兔，经过35 d免疫注射后，用间接ELISA方法检测其抗体滴度为12 800，可以用来Western blotting分析。用改良后的方法来免疫新西兰大白兔在时间上由原来的3~4个月缩短到35 d，大大缩短了制备高效抗血清的时间，且所制备抗血清均能用于ELISA和Western blotting分析。胡志红等[14]用改良的方法制备了猴(Macaca mulatta)Esc-615基因多克隆抗体的制备，其抗血清滴度达到100 000。冯浩等[8]制备了青鱼(Mylopharyngodon piceus)生长激素多克隆抗血清也能用于ELISA和Western blotting分析。从而表明了上诉方法制备抗鲮GH的多克隆抗体不仅简便，而且行之有效，可为生长激素活性及功能的研究提供有效免疫学鉴定工具。
此试验制备的兔抗鲮生长激素多克隆抗体，经ELISA检测其滴度为12 800，经Western blotting分析，可以检测到10 ng的抗原量，而且可以在脑垂体提取物和血清中检测到大小为21.5 kDa的蛋白质，充分说明该抗体具有较强的灵敏性和免疫原性，为进一步研究在不同条件下鲮血液和脑垂体中生长激素蛋白的表达规律奠定了基础。
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图 2 微卫星位点HLJBL168、HLJBL184、HLJBL220基因分型结果
Figure 2. Genotype of microsatellite loci HLJBL168, HLJBL184 and HLJBL220
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图 3 基于遗传距离的长江下游8个鲢群体UPGMA聚类图
Figure 3. UPGMA tree based on genetic distance among eight silver carp populations in lower Yangtze River
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图 5 长江下游8个鲢群体聚类结果图 (K=4)
Figure 5. Clustering diagram of eight populations of H. molitrix in lower Yangtze River (K=4)
表 1 长江下游鲢采样情况
Table 1 Sampling of H. molitrix in lower Yangtze River
地点
Location简称
Code坐标
Coordinates采样时间段
Sampling time数量
Number湖口 Hukou HK 116°15'32''E, 29°47'02''N 2018.06—2019.07 26 安庆 Anqing AQ 117°0'18''E, 30°29'28''N 2018.10—2019.12 53 芜湖 Wuhu WH 118°19’59″E, 31°23’58″N 2017.03—2018.04 21 当涂 Dangtu DT 118°27'3''E, 31°34'10''N 2017.03—2018.04 27 镇江 Zhenjiang ZJ 119°20'45''E, 32°11'42''N 2017.03—2018.04 51 靖江 Jingjiang JJ 120°17'31''E, 31°57'30''N 2017.03—2018.04 30 张家港 Zhangjiagang ZJG 120°26'55''E, 31°59'20''N 2017.03—2018.04 67 常熟 Changshu CS 120°54'12''E, 31°46'34''N 2017.03—2018.04 52 
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表 2 基于11个微卫星标记的鲢遗传多样性水平
Table 2 Genetic diversity level of H. molitrix based on 11 simple sequence repeats
基因座
Locus等位
基因数
Na观测
杂合度
Ho期望
杂合度
He多态
信息含量
PIC哈迪-温伯格
平衡
HWEHLJBL165 8 0.594 0.669 0.618 ns HLJBL168 7 0.626 0.691 0.630 ns HLJBL169 10 0.529 0.512 0.479 ns HLJBL170 9 0.525 0.670 0.625 *** HLJBL174 21 0.850 0.916 0.909 ** HLJBL176 17 0.793 0.882 0.869 ns HLJBL184 17 0.670 0.729 0.706 * HLJBL203 14 0.742 0.744 0.700 ns HLJBL216 17 0.637 0.886 0.874 *** HLJBL217 25 0.745 0.936 0.930 ** HLJBL220 19 0.657 0.865 0.851 *** 平均值 Mean 14.909 0.670 0.773 0.744 — 注：***. 极显著偏离哈迪-温伯格平衡；**. 中等显著偏离哈迪-温伯格平衡；*. 轻微显著偏离哈迪-温伯格平衡；ns. 未偏离哈迪-温伯格平衡。 Note: ***. Extremely significantly deviated from the Hardy-Weinberg equilibrium; **. Moderate significantly deviated from the Hardy-Weinberg equilibrium; *. Slightly significantly deviated from the Hardy-Weinberg equilibrium; ns. Non-significantly deviated from the Hardy-Weinberg equilibrium.
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表 3 长江下游8个江段鲢的遗传多样性水平
Table 3 Genetic diversity of H. molitrix in eight sections of lower Yangtze River
群体
Population等位
基因
Na有效等位
基因
Ne私有等位
基因
Ar观测
杂合度
Ho期望
杂合度
He无偏期望
杂合度
uHeShannon's
信息指数
I群体内近交
系数
F湖口 HK 6.000±0.853 3.943±0.682 2 0.648±0.078 0.658±0.069 0.671±0.070 1.375±0.175 0.011±0.051 安庆 AQ 12.273±2.273 5.867±1.272 17 0.718±0.039 0.751±0.042 0.758±0.042 1.832±0.202 0.040±0.019 芜湖 WH 8.636±1.357 5.286±1.021 1 0.719±0.057 0.725±0.052 0.743±0.054 1.673±0.189 0.001±0.047 当涂 DT 6.818±0.861 4.770±0.679 2 0.692±0.057 0.741±0.037 0.755±0.038 1.597±0.145 0.065±0.056 镇江 ZJ 11.273±2.149 6.102±1.348 6 0.691±0.042 0.755±0.040 0.762±0.041 1.808±0.205 0.080±0.035 靖江 JJ 8.909±1.665 5.206±1.192 3 0.653±0.046 0.717±0.046 0.730±0.047 1.645±0.194 0.087±0.034 张家港 ZJG 11.273±1.711 5.927±1.009 3 0.617±0.036 0.772±0.036 0.778±0.037 1.848±0.177 0.174±0.072 常熟 CS 11.000±1.673 5.962±1.012 7 0.655±0.038 0.774±0.037 0.782±0.037 1.859±0.174 0.137±0.060 平均值 Mean 9.523±0.603 5.383±0.365 5.123 0.674±0.018 0.737±0.016 0.747±0.016 1.705±0.064 0.074±0.018
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表 4 基于分子方差分析法 (AMOVA) 的8个鲢群体遗传变异结果
Table 4 Molecular variance (AMOVA) results of eight H. molitrix populations
变异来源
Source of variation自由度
df离差平方和
Sum of squares方差分量
Variance components方差分量比例
Percentage of variation/%群体间 Among populations 7 82.294 0.097 2.37 群体内 Within populations 646 2 581.102 3.996 97.63 总变异 Total variation 653 2 663.396 4.093 100.00
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表 5 基于微卫星标记的鲢群体Fst (对角线以下) 和基因流 (对角线以上) 配对估计值
Table 5 Estimated pairwise Fst (below diagonal) and Nm (above diagonal) of H. molitrix based on simple sequence repeats
湖口
HK安庆
AQ芜湖
WH当涂
DT镇江
ZJ靖江
JJ张家港
ZJG常熟
CS湖口 HK — 4.265 4.553 3.748 3.538 3.674 3.885 3.409 安庆 AQ 0.055 — 21.732 16.276 41.851 25.488 24.958 24.452 芜湖 WH 0.052 0.011 — 11.802 18.199 17.587 15.180 15.284 当涂 DT 0.063 0.015 0.021 — 17.548 17.505 12.762 14.626 镇江 ZJ 0.066 0.006 0.014 0.014 — 28.015 27.298 33.488 靖江 JJ 0.064 0.010 0.014 0.014 0.009 — 18.377 16.173 张家港 ZJG 0.060 0.010 0.016 0.019 0.009 0.013 — 38.421 常熟 CS 0.068 0.010 0.016 0.017 0.007 0.015 0.006 —
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表 6 长江下游8个鲢群体遗传距离的配对矩阵
Table 6 Genetic distance Pairwise matrix of eight H. molitrix populations in lower Yangtze River
湖口
HK安庆
AQ芜湖
WH当涂
DT镇江
ZJ靖江
JJ张家口
ZJG常熟
CS湖口 HK — 安庆 AQ 0.082 — 芜湖 WH 0.078 0.005 — 当涂 DT 0.092 0.016 0.017 — 镇江 ZJ 0.099 0.001 0.007 0.014 — 靖江 JJ 0.094 0.003 0.003 0.008 0.001 — 张家港 ZJG 0.087 0.010 0.013 0.025 0.009 0.009 — 常熟 CS 0.105 0.009 0.010 0.020 0.004 0.011 0.003 —
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