Effect evaluation of alizarin complexone marking for otoliths of juvenile black carp (Mylopharyngodon piceus)
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摘要: 放流标记技术研究是支撑增殖放流效果评估的重要内容。该研究用质量浓度为100 mg·L−1的茜素络合物 (ALC) 对约2月龄的青鱼 (Mylopharyngodon piceus) 幼鱼进行48 h浸泡，随后移入正常水体中恢复续养20 d。对其3种耳石在可见光和不同的激发光下进行比较分析，评价了茜素络合物在不同耳石上的沉积情况与标记效果。结果表明，通过在可见光和不同的激发光下进行观察，其3种耳石上均可见明显的标记区，标记率达100%。在对标记鱼恢复续养20 d后发现，耳石上的荧光标记区强度仍很高，表现出了较好的标记效果。此外，相关标记的最佳检测光源为蓝色激发光，绿色激发光次之。微耳石是用于青鱼幼鱼耳石荧光标记观察的最适类型，同时也是用于时滞检测的最适类型，其次是星耳石。此外，将鱼体浸泡入茜素络合物溶液中至其在耳石上形成标记沉积，以及将鱼体移出浸泡溶液至其耳石上标记区域消失，均存在1 d时滞。Abstract: Investigation on artificial marking technology is very important supporting work for national fish mark release recapture and effectiveness tracing evaluation issues. In this study, two-month old juvenile black carps (Mylopharyngodon piceus) had been immersed in alizarin complexone (ALC) at a concentration of 100 mg·L−1 for 48 h, and then transferred to normal water for 20 d. Three pairs of otoliths (i.e., sagitta, lapillus and asteriscus) were removed from the black carps by continuous sampling, observed under fluorescence microscope and photographed, so as to evaluate the characteristics of deposition and the marking effect of ALC in different otoliths. The results show that the marked areas were clearly observed in each otolith pair under visible light and different excitation light, with a 100% mark success rate. After 20 d of recovery culture in normal water without ALC, the intensity of ALC mark in otoliths of the marked fish was still very high, showing a good marking effect. Moreover, the optimum light source was blue excitation light, followed by green excitation light. The lapillus was the optimal otolith type for ALC marking and for judgment of time lag among the three pairs of otoliths, followed by asteriscus. In addition, there was a time lag of 1 day between the carps immersed in ALC solution and ALC deposition into otolith, as well as between removing immersed carps from ALC solution and disappearance of ALC mark from otolith.
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Keywords:
- Mylopharyngodon piceus /
- Otolith /
- Fluorescent marking /
- Alizarin complexone /
- Enhancement release
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大型海藻主要分布在近岸海域的潮间带和潮下带区域，是海洋生态系统初级生产力的巨大贡献者，也是重要的海水养殖对象[1]。生活在潮间带的大型海藻经历着巨大的环境变化，如光照、温度、水分以及盐度变化等，这些环境因子共同影响着大型海藻的生长、生理和生态位等[1]。研究表明，温度胁迫通过影响植物光合机构的结构和功能，抑制光系统II (PSII) 供体侧水光解反应和PSII下游碳同化反应，进而影响光合电子传递，降低光合速率[2]；在高光条件下，植物则会因吸收过量的光而产生光抑制现象，对光合系统造成损伤，导致光合能力下降、生长发育受阻[3]；此外，高光胁迫也会影响叶绿体的形态结构和光合色素的组分[3]。由此可见，温度和光照对植物光合生理的影响尤为突出。
大型海藻属于低等植物，光合生理是所有光合藻类积累有机物、增加生物量的关键生理反应，同时也是大型海藻重要的碳汇过程[4]。有研究表明，大型海藻经过长期的进化已衍生出一套抵御温度和光照胁迫的高效策略，通过降低叶绿素a等光合色素的含量以减少光能吸收是其应对高光胁迫的关键方式之一[3,5]：缘管浒苔 (Ulva linza) 为了避免高光胁迫，其叶绿素a和叶绿素b含量随光照强度的增加而显著降低[5]；而通过热耗散机制应对过剩的产能则是大型海藻应对温度和光照胁迫的另一重要方式[3,6-7]；海带 (Saccharina japonica) 孢子体在高温条件下，暗适应后的藻体PSII最大光化学效率 (Fv/Fm) 显著下降，但它可以通过非光化学淬灭 (NPQ) 的增加使其热耗散 (光保护) 能力增强，从而使所能利用的光合有效辐射范围更广[7]。然而，尽管目前关于温度和光照对大型海藻光合生理影响的研究已有报道，但不同种属大型海藻的适应范围不同，如：针叶蕨藻 (Caulerpa sertularioides) 在26 ℃时光合活性最好[8]，而海带孢子体在环境温度达到14 ℃以上时，光合作用原初光反应过程会受抑制[7]；皱紫菜 (Porphyra crispata) 的适合生长光照强度为4 000~7 500 lx，光照强度过低时其光合作用降低[9]，而龙须菜 (Gracilaria lemaneiformis) 在光照强度3 000 lx以下生长较好，大于6 000 lx则生长相对较差[10]。因此，开展大型海藻对温度和光照的光合生理响应研究，有助于更科学地指导大型海藻在海水养殖、海洋生态修复等方面的应用。
异枝江蓠 (Gracilariopsis bailinae) 属于大型经济红藻，其生长速度快，全年可生长，可用于鲍鱼养殖、琼胶提取[11]及养殖水处理等[12-14]，在海水养殖和海洋生态修复上具有较好的应用前景，常见于我国的广东省和海南省[15]。目前，针对异枝江蓠的生长[11]、琼胶提取[14]与经济动物混养[16]等已有研究报道，但关于其光合生理方面的研究鲜有报道。为此，本研究利用叶绿素荧光技术，结合藻体光合色素含量和生长率的变化，探究了异枝江蓠对温度和光照强度的光合生理响应特征，以期丰富异枝江蓠在光合生理方面的研究，为其进一步的开发利用提供基础数据支撑。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
异枝江蓠于2021年7月采集自广东省湛江市雷州市乌石镇。采集后的鲜藻低温运回实验室，用灭菌海水和毛刷除去藻体表面的杂质后暂养于藻类培养室。暂养条件为温度25 ℃、光照强度5 000 lx、盐度30‰、pH 8.1、光周期12 L∶12 D。
1.2 实验设计
选取暂养后健康且生长状态相近的藻体，用吸水纸吸干表面水分后各称取1 g分别放入含有藻类营养液的不同烧杯 (500 mL) 中备用。根据前期预实验结果，设置了不同的温度梯度 (15、20、25、30和35 ℃) 和光照梯度 (1 000、3 000、6 000和9 000 lx)，将选取好的藻体放入对应温度或光照强度的光照培养箱中。藻体培养周期为7 d，每个处理设置3个平行，每2 d更换一次新鲜培养液。7 d后称取藻体鲜质量，并取定量的样品用于藻体光合色素和叶绿素荧光参数的测定。
1.3 特定生长率测定
用吸水纸吸干处理7 d后藻体表面水分并用分析天平 (FA1104，上海) 称量，根据Yong等[17]提出的公式计算藻体特定生长率 (SGR)，公式如下：
$$ {R}_{\mathrm{S}\mathrm{G}\mathrm{R}}=\frac{\mathrm{l}\mathrm{n}{M}_{7}-\mathrm{l}\mathrm{n}{M}_{0}}{7}\times 100\mathrm{\%} $$ (1) 式中：RSGR表示特定生长率 (%·d−1)；M0表示藻体初始鲜质量 (g)；M7表示藻体 7 d后的鲜质量 (g)。
1.4 光合色素测定
叶绿素a (Chl a)、类胡萝卜素 (Car) 使用甲醇法提取，称取处理7 d后的藻体0.1 g放入含有4颗研磨钢珠和2 mL甲醇的研磨管中 ，转入到组织细胞研磨仪 (JFstgrp-24，上海) 中，70 Hz研磨180 s，4 ℃黑暗提取24 h后转入高速离心机 (Heraeus Multifuge 3XR，德国) 5 000 r·min−1离心10 min，使用紫外分光光度计 (UV-2450，日本) 分别测量研磨管上清液在波长480、510、652、665、750 nm处的吸收值，根据以下公式计算Chl a和Car的质量分数[18]：
$$ {W}_{\mathrm{C}\mathrm{h}\mathrm{l}a}=\frac{[16.29\times ({A}_{665}-{A}_{750})-8.54\times ({A}_{652}-{A}_{750}\left)\right]\times V}{1\mathrm{ }000\times m} $$ (2) $$ {W}_{\mathrm{C}\mathrm{a}\mathrm{r}}=\frac{\left\{7.6\times \left[\left({A}_{480}-{A}_{750}\right)-1.49\times \left({A}_{510}-{A}_{750}\right)\right]\right\}\times V}{1\mathrm{ }000\times m} $$ (3) 式中：WChla为叶绿素a质量分数 (mg·g−1)；WCar为类胡萝卜素质量分数(mg·g−1)；A 为吸光值；V 为色素提取液的总体积 (mL)；m为藻体鲜质量 (g)
藻红蛋白 (PE)、藻蓝蛋白 (PC) 采用0.1 mol·L−1磷酸盐缓冲液 (pH 6.8) 提取，提取方法与上述提取Chl a和Car的方法一致，按以下公式计算质量分数[19]：
$$ {W}_{\mathrm{P}\mathrm{E}}=\frac{\left[\left({A}_{564}-{A}_{592}\right)-\left({A}_{455}-{A}_{592}\right)\times 0.20\right]\times 0.12\times V}{F_{\mathrm{w}} }$$ $$ {W}_{\mathrm{P}\mathrm{C}}=\frac{\left[\left({A}_{618}-{A}_{645}\right)-\left({A}_{592}-{A}_{645}\right)\times 0.51\right]\times 0.15\times V}{F_{\mathrm{w}}} $$ 式中：WPE为藻红蛋白的质量分数 (mg·g−1)；WPC为藻蓝蛋白质量分数 (mg·g−1)；A为吸光值；V为定容后的溶液体积 (mL)；FW为藻体鲜质量 (g)
1.5 叶绿素荧光参数测定
处理7 d后的样品暗适应30 min后，使用便携式脉冲调制荧光仪 (FMS-2，英国) 测定其PSII最大光化学效率 (Fv/Fm)、实际光能转化效率 (ΦPSII)、电子传递速率 (ETR)、光化学淬灭系数 (qP) 和非光化学淬灭系数 (NPQ)。
1.6 数据处理
所有数据以“平均值±标准差 (
$\overline x \pm {s} $ )”表示，采用IBM SPSS Statistics 25软件进行Pearson相关性分析、单因素方差 (One-way ANOVA) 分析和Duncan's多重比较检验处理 (P<0.05作为差异的显著性水平)。利用双因素方差 (Two-way ANOVA) 分析温度和光照强度对特定生长率、光合色素含量及叶绿素荧光参数的交互作用。2. 结果
2.1 温度和光照强度对异枝江蓠生长的影响
由图1可知，不同温度条件下，光照强度对异枝江蓠的生长有不同程度的促进作用。除15 ℃外，异枝江蓠的特定生长率随光照强度的增加显著上升 (P<0.05)，均在9 000 lx达到最大值 [(0.83±0.18)、(4.60±0.25)、(4.41±0.10)和(4.78±0.40)%·d−1]，相对1 000 lx分别增加了76.60%、61.75%、173.91%和256.72%；在1 000和3 000 lx下，随温度的上升，特定生长率先上升后下降，特定生长率最大值均出现在25 ℃；而在6 000和9 000 lx下，特定生长率随温度的升高而上升，25~35 ℃的特定生长率[(1.33~4.78)%·d−1]显著高于15~20 ℃[(0.25~0.83)%·d−1, P<0.05]。相关性分析结果显示，在20~35 ℃和3 000~9 000 lx下，特定生长率分别与光照强度和温度呈正相关 (P<0.05)，且随温度上升或光照强度增加相关性越强 (表1)。温度和光照强度对异枝江蓠特定生长率产生了极显著的影响 (P<0.01)，且存在交互作用 (表2)。表明在一定范围内升高温度和增加光照强度均能促进异枝江蓠的生长。
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图 1 不同温度和光照强度下的异枝江蓠特定生长率注：不同小写字母表示在相同温度条件下不同光照强度处理间差异显著 (P<0.05)，不同大写字母表示在相同光照强度条件下不同温度处理间差异显著 (P<0.05)；后图同此。Figure 1. Specific growth rate of G. bailinae at different temperatures and light intensitiesNote: Different lowercase letters indicate significant differences between different light intensity treatments under the same temperature condition (P<0.05), while different uppercase letters indicate significant differences between different temperature treatments under the same light intensity condition (P<0.05). The same case in the following figures.表 1 温度、光照强度与异枝江蓠生长、光合色素及叶绿素荧光参数的相关性分析Table 1. Correlation analysis between temperature and light intensity and growth, photosynthetic pigments and chlorophyll fluorescence parameters of G. bailinae项目
Item光照强度 Light intensity/lx 温度 Temperature/℃ 1 000 3 000 6 000 9 000 15 20 25 30 35 特定生长率 SGR 0.501 0.668** 0.873** 0.889** 0.197 0.766** 0.898** 0.938** 0.958** 叶绿素 a Chl a 0.242 −0.195 −0.704** −0.727** −0.130 −0.782** −0.910** −0.935** −0.950** 类胡萝卜素 Car −0.042 0.041 −0.188 −0.215 −0.310 −0.736** −0.910** −0.101 −0.730** 藻红蛋白 PE 0.978** 0.948** 0.886** 0.842** 0.011 −0.849** −0.910** −0.937** −0.950** 藻蓝蛋白 PC 0.951** 0.969** 0.992** 0.923** −0.130 −0.882** −0.920** −0.947** −0.950** PSII最大光化学效率 Fv/Fm 0.804** 0.745** 0.752** 0.792** −0.710** −0.799** −0.420 −0.532 −0.230 实际光能转化效率 ΦPSII 0.885** 0.776** 0.878** 0.895** −0.910** −0.853** −0.940** −0.913** −0.790** 电子传递速率 ETR 0.859** 0.537* 0.784** 0.890** −0.910** −0.902** −0.900** −0.771** −0.600* 光化学淬灭系数 qP 0.918** 0.866** 0.912** 0.929** −0.920** −0.835** −0.920** −0.755** −0.760** 非光化学淬灭系数 NPQ 0.007 0.679** 0.952** 0.848** 0.912** 0.936** 0.937** 0.966** 0.902** 注：** 表示在0.01水平 (双尾) 极显著相关，* 表示在0.05水平 (双尾) 显著相关。 Note: **. Extremely significant correlation at 0.01 level (Two-tailed); *. A significant correlation at 0.05 level (Two-tailed). 表 2 温度和光照强度对异枝江特定生长率的双因素方差分析Table 2. Two-way ANOVA analysis for effects of temperature and light intensity on specific growth rate of G. bailinae变异来源
Source of variation自由度
DFF 显著性
Sig.温度
Temperature4 802.800 <0.000 1 光照强度
Light intensity3 233.200 <0.000 1 温度×光照强度
Temperature×Light intensity12 37.810 <0.000 1 残差
Residual40 2.2 温度和光照强度对异枝江蓠色素含量的影响
在温度为15 ℃时，异枝江蓠的Chl a、Car、PE和PC质量分数随光照强度的增加均无显著性变化 (P>0.05)；而温度介于20~35 ℃时，4种色素质量分数整体上随光照强度的增加而显著下降 (P<0.05)，且均在光照强度为1 000 lx时达到最大值、在9 000 lx时 (除30 ℃时的Car) 取得最小值 (图2)。在相同的光照强度下，随着温度的上升，Chl a和Car质量分数的变化不一 (图2-a和2-b)，而PE和PC质量分数整体上呈增加趋势 (图2-c和2-d)，且不同光照强度下两者均在35 ℃时达到最大值，分别为PE：(0.205±0.009)、(0.185±0.014)、(0.119±0.030) 和 (0.104±0.009) mg·g−1，PC：(0.349±0.015)、(0.336±0.020)、(0.243±0.008) 和 (0.168±0.015) mg·g−1。相关性分析结果显示 (表1)，PE和PC质量分数在不同光照强度下与温度呈极显著正相关 (P<0.01)，在20~35 ℃时与光照强度呈极显著负相关 (P<0.01)；Chl a质量分数在6 000~9 000 lx和20~35 ℃时分别与温度和光照强度呈极显著负相关 (P<0.01)；Car质量分数与温度无显著相关性 (P>0.05)，在20、25和35 ℃时与光照强度呈极显著负相关 (P<0.01)。温度和光照强度对4种色素均有极显著影响 (P<0.01)，除Car外 (P>0.05)，温度和光照强度对Chl a、PE和PC含量的影响均存在交互作用 (P<0.01，表3)。
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图 2 不同温度和光照强度下的异枝江蓠色素质量分数Figure 2. Pigment mass fraction of G. bailinae at different temperatures and light intensities表 3 温度和光照强度对异枝江蓠光合色素的双因素方差分析Table 3. Two-way ANOVA analysis for effects of temperature and light intensity on photosynthetic pigments of G. bailinae光合色素 Photosynthetic pigment 变异来源 Source of variation 自由度 DF F 显著性 Sig. 叶绿素 a Chl a 温度 Temperature 4 36.650 <0.000 1 光照强度 Light intensity 3 53.480 <0.000 1 温度×光照强度 Temperature×Light intensity 12 4.415 0.000 2 残差 Residual 40 类胡萝卜素 Car 温度 Temperature 4 23.850 <0.000 1 光照强度 Light intensity 3 14.830 <0.000 1 温度×光照强度 Temperature×Light intensity 12 1.490 0.168 4 残差 Residual 40 藻红蛋白 PE 温度 Temperature 4 448.300 <0.000 1 光照强度 Light intensity 3 219.400 <0.000 1 温度×光照强度 Temperature×Light intensity 12 25.370 <0.000 1 残差 Residual 40 藻蓝蛋白 PC 温度 Temperature 4 356.000 <0.000 1 光照强度 Light intensity 3 131.500 <0.000 1 温度×光照强度 Temperature×Light intensity 12 14.400 <0.000 1 残差 Residual 40 2.3 温度和光照强度对异枝江蓠叶绿素荧光参数的影响
2.3.1 PSII光化学效率参数
PSII最大光化学效率在15和20 ℃时随光照强度的增加显著下降 (P<0.05)，25~35 ℃时则无显著性变化 (P>0.05)；在不同光照强度条件下，PSII最大光化学效率与温度呈极显著正相关 (P<0.01，表1)，且25~35 ℃时PSII最大光化学效率 (0.738~0.803) 显著高于15~20 ℃ (0.513~0.610) (P<0.05，图3-a)。实际光能转化效率在不同温度下随光照强度的增加而下降，而电子传递速率在15~30 ℃时与实际光能转化效率的表现一致，在35 ℃时呈先下降后上升再下降的趋势；在相同光照强度下，实际光能转化效率和电子传递速率均随温度上升整体呈上升趋势，且均在35 ℃时达到最大值 (图3-b和3-c)。相关性分析结果显示，实际光能转化效率和电子传递速率与温度呈正相关，与光照强度呈负相关 (P<0.05，表1)。温度和光照强度对PSII的最大光化学效率、实际光能转化效率和电子传递速率均有极显著影响 (P<0.01)，且对实际光能转化效率和电子传递速率有交互作用 (表4)。
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图 3 不同温度和光照强度下的异枝江蓠光化学效率参数Figure 3. Photochemical efficiency parameters of G. bailinae at different temperatures and light intensities表 4 温度和光照强度对异枝江蓠 PSII 光化学效率参数的双因素方差分析Table 4. Two-way ANOVA analysis for effects of temperature and light intensity on photochemical efficiency parameters of PSII of G. bailinae光化学效率参数
Photochemical efficiency parameter变异来源
Source of variation自由度
DFF 显著性
Sig.PSII 最大光化学效率 Fv/Fm 温度 Temperature 4 290.800 <0.000 1 光照强度 Light intensity 3 10.380 <0.000 1 温度×光照强度 Temperature×Light intensity 12 1.864 0.069 9 残差 Residual 40 实际光能转化效率 ΦPSII 温度 Temperature 4 61.560 <0.000 1 光照强度 Light intensity 3 106.000 <0.000 1 温度×光照强度 Temperature×Light intensity 12 4.071 0.000 4 残差 Residual 40 电子传递速率 ETR 温度 Temperature 4 53.820 <0.000 1 光照强度 Light intensity 3 70.460 <0.000 1 温度×光照强度 Temperature×Light intensity 12 4.001 0.000 4 残差 Residual 40 2.3.2 荧光淬灭参数
图4为不同温度和光照强度下的异枝江蓠光化学淬灭系数和非光化学淬灭系数。结果显示：在不同温度下，光化学淬灭系数随光照强度的增加显著下降 (P<0.05)，与光照强度呈极显著负相关 (P<0.01，表1)；相反，在不同的光照强度条件下，光化学淬灭系数随温度的上升显著上升 (P<0.05)，且与温度呈极显著正相关 (P<0.01，图4-a和表1)。非光化学淬灭系数在不同温度下随光照强度的增加显著上升 (P<0.05)；在 6 000和9 000 lx时，非光化学淬灭系数随温度的上升显著上升 (P<0.05)，在1 000和3 000 lx时则均表现为先上升后下降 (图4-b)。表明温度和光照强度对异枝江蓠荧光淬灭参数具有显著影响 (P<0.05)，且存在交互作用 (表5)。
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图 4 不同温度和光照强度下的异枝江蓠荧光淬灭参数Figure 4. Fluorescence quenching parameters of G. bailinae at different temperatures and light intensities表 5 温度和光照强度对异枝江蓠荧光淬灭参数的双因素方差分析Table 5. Two-way ANOVA analysis for effects of temperature and light intensity on fluorescence quenching parameters of G. bailinae荧光淬灭参数
Fluorescence quenching parameter变异来源
Source of variation自由度
DFF 显著性
Sig.光化学淬灭系数 qP 温度 Temperature 4 86.340 <0.000 1 光照强度 Light intensity 3 73.660 <0.000 1 温度×光照强度 Temperature×Light intensity 12 3.471 0.001 5 残差 Residual 40 非光化学淬灭系数 NPQ 温度 Temperature 4 204.600 <0.000 1 光照强度 Light intensity 3 338.400 <0.000 1 温度×光照强度 Temperature×Light intensity 12 33.670 <0.000 1 残差 Residual 40 3. 讨论
不同大型海藻对温度和光照强度的适应性不同，生长率的变化可直观反映其生长状况的变化[8,20]。本研究中，温度 (15和20 ℃) 和光照强度 (1 000 lx) 较低时，异枝江蓠的生长受到抑制；而在20~35 ℃和3 000~9 000 lx下，异枝江蓠的特定生长率分别与光照强度和温度呈正相关 (P<0.05)，并在35 ℃、9 000 lx时达到最大。而其他研究显示，龙须菜在水温19~27 ℃和光照强度3 000 lx以下时生长最佳；皱紫菜在17~20 ℃和4 000~7 500 lx时生长较好，高于23 ℃时其生长受到抑制，光照强度过低时其光合作用也会减弱[9]。由此可见，大型海藻对温度和光照强度的适应存在种属差异，过高或过低的温度和光照强度均会抑制藻体生长。大部分大型海藻生长的适宜温度为15~25 ℃[21]，而本研究中，异枝江蓠生长最适温度为35 ℃，这与钟志海等[16]报道的结果 (33 ℃) 相近，表明异枝江蓠是一种喜高温的大型海藻。
光合作用是绿色植物最基本的生命能量来源[22]，叶绿素荧光包含了丰富的光合生理信息，是探究不同环境条件对藻类光合作用能力影响的最佳方法[8,23]。PSII最大光化学效率值的变化可以反映光抑制的程度，值越大其发生光抑制的程度越低[24]。相关研究表明，低温、高光条件可能使藻体PSII能量吸收和耗散平衡功能受损，导致PSII最大光化学效率降低，藻体光合系统吸收过剩光能后引起PSII反应中心关闭，即产生光抑制或光保护现象，以保护PSII免受光损伤[21,25]。本研究中，异枝江蓠PSII最大光化学效率在15~20 ℃时随光照强度的增加而显著下降 (P<0.05)，且在15~20 ℃时的值显著低于25~35 ℃。可见，低温以及低温时给予的高光可能导致异枝江蓠PSII反应中心关闭，PSII活性降低，有效光能转化效率下降，具体表现为藻体生长受到一定程度的抑制。然而，在25~35 ℃时，高光并未导致异枝江蓠PSII最大光化学效率的显著下降，与缘管浒苔[5]、皱紫菜[6]等的研究结果不一致，这可能与温度和光照强度的共同作用效应相关，具体原因有待进一步研究。
实际光能转化效率、电子传递速率和光化学淬灭系数与PSII电子传递活性和效率相关，其值越高说明电子传递活性越大[24]。研究表明，针叶蕨藻的生长率变化与其实际光能转化效率、电子传递速率及光化学淬灭系数的变化表现一致[8]；然而，在本研究中，三种叶绿素荧光参数均随光照强度的增加而下降，但异枝江蓠的特定生长率却有相反的表现，说明光照强度增加所导致的异枝江蓠电子传递速率下降可能并未达到最终影响藻体生长的程度，异枝江蓠可能通过其他策略适应高光。目前认为，植物在响应高光时主要通过增加热耗散 (即非光化学淬灭系数) 来调节PSII的活性，避免光抑制，实现光保护[25-27]。大型海藻，如海带孢子体[7]、缘管浒苔[5]、皱紫菜[6]、裙带菜 (Undaria pinnatifida)[6] 等相关研究也表明非光化学淬灭系数的增加在藻体适应环境改变的过程中起重要作用。本研究中，异枝江蓠非光化学淬灭系数随光照强度的增加而上升，说明其可能通过增加热耗散的方式调节PSII的活性实现自我保护，整体表现为藻体特定生长率随光照强度的增加而上升。此外，异枝江蓠实际光能转化效率、电子传递速率和光化学淬灭系数在不同光照强度下均随温度的上升而升高，但低光照 (1 000和3 000 lx) 时，其特定生长率和非光化学淬灭系数却随温度的升高先升后降；这可能是因为在低光照条件下，过高的温度造成藻体吸收的多余能量无法耗散，最终导致藻体生长率下降。值得注意的是，目前有研究认为植物通过热耗散保护光系统的现象与光系统的循环电子流 (CEF) 相关，植物在干旱、强光、弱光、高温和低温等逆境胁迫下可以激发CEF来适应环境胁迫，但其响应机制仍不清楚[28]，进一步深入研究可能有助于加深对大型海藻逆境响应机制的了解。
光合色素是植物光合作用的关键物质[21]。研究表明，光合色素含量的下调也是植物实现光保护的一种重要手段[3]。本研究中，异枝江蓠4种色素含量在高光照时显著下降，说明其通过下调光合色素含量进行光保护；而色素含量减少生长率却上升，则可能与色素对能量利用效率的提高有关[29]。此外，PE和PC在高温时含量较高且与温度呈显著正相关 (P<0.05)。PE和PC既是红藻中重要的两种捕光色素蛋白[30]，也是藻体细胞的贮存蛋白，有利于藻类在自然界中的生存竞争[31]。温度升高促进了异枝江蓠PE和PC的合成，说明异枝江蓠在高温条件下通过增加藻胆蛋白含量从而提高捕光效率及蛋白贮存，增强其生存能力，实现了在高温条件下的快速生长；这与刺枝鱼栖苔 (Acanthophora spicifera)[32]、皱紫菜[9]等的研究结果类似。
综上所述，温度和光照强度对异枝江蓠生长及光合生理具有重大影响。异枝江蓠是一种喜高温的大型海藻，藻胆蛋白含量的增加有助于提高其在高温条件下的生存能力；高光照降低了异枝江蓠的电子传递速率，但其可通过增加热耗散和减少光合色素的合成来实现光保护。鉴于在实际的海水养殖和海洋生态修复中，随着纬度的不同以及季节的更替，温度和光合有效辐射均会有较大的波动，且海水深度的改变也会影响光合有效辐射；因此，异枝江蓠比较适合在我国热带、亚热带地区栽培或用作海洋生态修复的备选藻种。在应用过程中，应着重关注温度和光照强度的变化，优先选择水温25 ℃以上、光照强度9 000 lx左右的水域环境；温度和光照强度过低时，可能会使藻体光合生理受限而导致其养殖产量低、碳汇效果不佳、死亡等。
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图 1 青鱼幼鱼的3类耳石
a. 矢耳石；b. 微耳石；c. 星耳石。
Figure 1. Three types of otoliths from juvenile black carp
a. Sagitta; b. Lapillus; c. Asteriscus.
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图 2 不同取样天数标记组和对照组青鱼幼鱼的体质量和全长变化 (N=5)
*. 两组间差异显著 (P<0.05)。
Figure 2. Change of body mass and total length of black carp of marking group and control group on different sampling day (N=5)
*. Significant difference between two groups (P<0.05).
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图 3 经茜素络合物标记后恢复续养第10天时青鱼幼鱼矢耳石、微耳石、星耳石分别在可见光、蓝色激发光、绿色激发光和紫色激发光下的标记效果
a1. 矢耳石分别在可见光、蓝色激发光、绿色激发光和紫色激发光下的标记效果；b1. 微耳石分别在可见光、蓝色激发光、绿色激发光和紫色激发光下的标记效果；c1. 星耳石分别在可见光、蓝色激发光、绿色激发光和紫色激发光下的标记效果；图中白色箭头表示由矢耳石、微耳石、星耳石核心指向荧光标记轮。
Figure 3. Marking effect of three types of otoliths of juvenile black carp under different light sources on 10th day of recovery culture after ALC immersion
a1. Marking effect of sagitta under visible light, blue excitation light, green excitation light and purple excitation light; b1. Marking effect of lapillus under visible light, blue excitation light, green excitation light and purple excitation light; c1. Marking effect of asteriscus under visible light, blue excitation light, green excitation light and purple excitation light. The white arrows show that the core of sagitta, lapillus and asteriscus point to the fluorescent marker ring.
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图 4 青鱼幼鱼经茜素络合物浸泡标记后恢复续养第0、第5、第10、第15和第20天时微耳石在蓝色激发光的标记效果
Figure 4. Marking effect of lapillus of juvenile black carp under blue light source on 0th, 5th, 10th, 15th, 20th day of recovery culture after ALC immersion
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图 5 青鱼幼鱼经茜素络合物浸泡标记后恢复续养第5天时微耳石标记效果
2个白色箭头分别指向微耳石的2条紫红色标记环；黑色短线表示微耳石新形成的日轮所在位置，即为一明带和一暗带组合；4个黑色箭头则分别指向微耳石外部新形成的4个日轮。
Figure 5. Marking effect of lapillus of juvenile black carp under four light sources on 5th day of recovery culture after ALC immersion
Two white arrows point to two purple red marker rings in lapillus; the black dash shows the position of the newly formed daily growth increments in lapillus, which is a combination of a bright band and a dark band; the four black arrows point outward to the four newly formed daily growth increments in lapillus.
表 1 青鱼幼鱼3类耳石在不同光源下的检测效果
Table 1 Detection effect of three types of otoliths from juvenile black carp under four different light sources
恢复续养天数
Days of recovery
culture/d实验鱼数
Number of
fish耳石类型
Otolith
type耳石标本数
Number of
otolith标记强度 Marker intensity 可见光
BS蓝色激发光
WBS绿色激发光
WGS紫色激发光
WUS0 5 矢耳石 10 2 (++) 2 (++) 2 (++) 1 (+) 5 5 矢耳石 10 2 (++) 3 (+++) 3 (+++) 2 (++) 10 5 矢耳石 10 2 (++) 4 (++++) 3 (+++) 2 (++) 15 5 矢耳石 10 1 (+) 4 (++++) 3 (+++) 2 (++) 20 5 矢耳石 10 1 (+) 3 (+++) 2 (++) 1 (+) 0 5 微耳石 10 2 (++) 3 (+++) 3 (+++) 2 (++) 5 5 微耳石 10 3 (+++) 4 (++++) 4 (++++) 3 (+++) 10 5 微耳石 10 3 (+++) 4 (++++) 4 (++++) 3 (+++) 15 5 微耳石 10 2 (++) 4 (++++) 4 (++++) 3 (+++) 20 5 微耳石 10 2 (++) 4 (++++) 4 (++++) 2 (++) 0 5 星耳石 10 2 (++) 2 (++) 2 (++) 1 (+) 5 5 星耳石 10 3 (+++) 3 (+++) 2 (++) 1 (+) 10 5 星耳石 10 3 (+++) 3 (+++) 2 (++) 1 (+) 15 5 星耳石 10 3 (+++) 2 (++) 1 (+) 1 (+) 20 5 星耳石 10 2 (++) 2 (++) 1 (+) 1 (+) 
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