我国盐碱水面积大，广泛分布于东北、西北、华北等内陆地区，水质类型多样，以碳酸盐型居多^[1]。过高的碳酸盐碱度对鱼类有强烈的毒害作用，如环境中氢氧根离子 (OH⁻)、碳酸氢根离子 (HCO₃⁻)、碳酸根离子 (CO₃ ²⁻) 等直接作用于鱼类的鳃上皮细胞，造成器质性损伤^[2]；鱼类鳃内二氧化碳分压 (pCO₂) 随碳酸盐碱度的升高维持在较低水平，导致低碳酸血症和呼吸性碱中毒^[3-4]；鱼体内的氨气 (NH₃) 不能与氢离子 (H⁺) 结合排出体外，发生氨中毒等^[5]。鱼类可以通过改变鳃组织的形态、调整含氮产物的代谢和排泄等方式适应高碱度环境^[6-8]，基因的差异表达也是鱼类应答碱胁迫的途径之一^[9-11]。不同鱼类对碳酸盐碱度的耐受性不同，目前国内外已有对包括青海湖裸鲤 (Gymnocypris przewalskii) 在内的20多种鱼类碱耐受性的报道^[7-8,12-23]，但多数是在极端高碱环境下经过进化具有生存优势的鱼类，如马加迪湖罗非鱼^[7](Oreochromis alcalicus grahami)、金字塔湖克拉克大麻哈鱼^[8] (Oncorhynchus clarki henshawi)、凡湖塔氏卡拉白鱼^[12] (Chalcalburnus tarichi) 等，且研究过程中往往胁迫方式比较单一、统计处理也比较简单。

尼罗罗非鱼 (O. niloticus) 生长速度快，是世界上最广泛养殖的鱼类之一，2019年我国养殖产量为1.64×10⁴ t^[24]。尼罗罗非鱼也是一种广盐性鱼类，具有在盐碱水域中养殖推广的潜力。有关尼罗罗非鱼对氯化钠 (NaCl) 盐度耐受性的研究较多^[25-28]，但对碳酸盐碱度耐受性的报道较少。雷衍之等^[29]发现当水体总碱度为48.2 me·L⁻¹时，相较于鲢 (Hypophthalmichthys molitrix)、鳙 (H. nobilis)、草鱼 (Ctenopharyngodon idella) 等淡水鱼，尼罗罗非鱼存活时间更长，但该碱度计量单位目前使用较少；赵岩等^[30]发现，尼罗罗非鱼在4和6 g·L⁻¹的碳酸盐碱水体中胁迫48 h无死亡个体，10 g·L⁻¹碱环境下的开始死亡时间明显早于8 g·L⁻¹，但并未计算准确的半致死浓度 (LC₅₀)。此外，在对尼罗罗非鱼进行耐盐碱新品种的选育过程中，为了优化选育和驯化方案，也需要对其盐碱耐受性进行全面深入的评估。

本研究以体质量差异3倍以上的大、小2种规格的尼罗罗非鱼幼鱼为对象，用碳酸氢钠 (NaHCO₃) 配置不同浓度的碱性水体，通过高浓度碱胁迫致死、急性碱胁迫和慢性碱驯化3种不同的胁迫方法，系统研究了尼罗罗非鱼对碳酸盐碱度的耐受性能，为其盐碱选育和盐碱水养殖提供参考资料。

1.   材料与方法

1.1   实验材料

实验自2020年10月1日起于上海海洋大学罗非鱼种质资源试验站进行。实验用鱼为新吉富罗非鱼品系后代。挑选同年繁殖且大、小2种规格 [ 大：(21.56±0.27) g，小：(5.92±0.03) g] 的鱼进行实验。正式实验前暂养24 h，暂养期间不投喂，选取体质健康、活力较强、大小均匀的个体。实验用水提前配置，根据水族箱 (46 cm×38 cm×31.5 cm) 体积计算所需NaHCO₃ (分析纯) 的质量，将相应NaHCO₃加至完全曝气的自来水中，均匀搅拌，连续充氧，待其稳定后使用。

1.2   实验设计

1.2.1   高浓度碱胁迫致死实验

将大、小规格实验鱼由淡水分别直接移入碳酸盐碱度为30和22 g·L⁻¹水体中。发现死鱼立即捞出，记录每尾鱼的死亡时间。每组每种鱼设3个重复，每个重复30尾。

1.2.2   急性碱胁迫实验

根据预实验，大规格实验组设置8、9、10 g·L⁻¹ 3个碱度梯度，小规格实验组设置6、7、8 g·L⁻¹ 3个碱度梯度。将暂养后的实验鱼直接放入不同碱度组的水箱内，每组40尾，设3个平行，充分曝气的自来水组为对照，进行96 h急性碱胁迫实验。实验开始后，每4 h观察记录死亡情况。

1.2.3   慢性碱驯化实验

水体起始碱度为0 g·L⁻¹，分别以+2、+4、+6 g·(L·d)⁻¹的速度增加碳酸盐碱浓度来进行实验。每组40尾鱼，3个重复。实验开始后，每12 h观察记录死亡情况。实验期间用气泵不间断充氧，水温19~24 ℃，不喂食不换水，用虹吸管吸出粪便以保持水体清洁。以实验鱼静卧水箱底部、呼吸停止、用玻璃棒触碰无反应为死亡标准。

1.3   数据分析

利用MATLAB 8.4、Systat Sigma Plot 10.0和DPS软件对所得实验数据进行统计分析。

1.3.1   高浓度碱胁迫致死实验

计算平均存活时间 (Mean surviving time, MST, min)，以“平均值±标准差 ($ \overline { X}\pm { \rm {SD}} $)”表示。

1.3.2   急性碱胁迫实验

绘制随时间-碱度变化的累计死亡率观察值图；将累计死亡率转换成概率单位后，用线性回归模型拟合碱度与累计死亡率的回归方程，求出96 h LC₅₀；用互补重对数模型 (Complementary log-log model, CLL) 拟合不同碱度处理下大、小规格鱼各时间区间的累计死亡率曲面，模型拟合在DPS数据处理系统下进行^[31]。

其中实验鱼在时间t_j (j=12, 24,···, J) 被作用因子 (NaHCO₃) 的剂量d_i (i=6, 7,···, I) 致死的概率可表达为：

式中：β为描述剂量效应的待估参数；τ_j为至时间t_j的时间效应参数；p_ij为剂量d_i在0到j个时间单位内产生的累计死亡概率 (Cumulative mortality)；剂量d_i使受试个体在时间区间 [t_j−1,t_j] 内可能遭受的死亡率称为条件死亡概率 (Conditional mortality)，可表示为：

式 (2) 中β的含义与式 (1) 相同。γ_j为描述时间区间 [t_j−1, t_j] 内时间效应的待估参数，与τ_j在时间上的含义有所区别。γ_j和β通过二项分布最大似然函数逼近获得。对模型的拟合值与实测值之间的差异，分别采用Pearson卡方检验及Hosmer-Lemoshow统计量来检验模型的拟合度高低。

1.3.3   慢性碱驯化实验

绘制随时间-碱度变化的累计死亡率观察值图；用Logistic模型拟合累计死亡率和胁迫时间的关系曲线，分别求出致死碱度范围和LC₅₀。

2.   结果

2.1   高浓度碱胁迫致死实验

将实验鱼分别移入碳酸盐碱水体中，3 h内均全部死亡，但大规格鱼在高胁迫浓度下，MST为 (136.92±3.72) min，仍长于小规格鱼 [(114.08±4.36) min]。

2.2   急性碱胁迫实验

实验期间，对照组呼吸与游动保持正常，水质较清澈，全程未出现死亡个体，而碱胁迫组实验鱼陆续死亡。大规格鱼在碳酸盐碱度为8 g·L⁻¹时，无强烈应激表现，前24 h未出现死亡，随时间延长累计死亡率上升较平缓，96 h内不足20%；碳酸盐碱度为9 g·L⁻¹时，前72 h累计死亡率为22.5%，72 h后迅速上升，胁迫96 h达到52.5%；碳酸盐碱度为10 g·L⁻¹时，第12小时即出现死亡，前60 h累计死亡率小幅增长，60~72 h骤增，72 h死亡数达一半以上，96 h后仅剩少量存活 (图1-a)；小规格鱼在碳酸盐碱度6 g·L⁻¹时，胁迫48 h未出现死亡，96 h累计死亡率不足50%；碳酸盐碱度为7 g·L⁻¹时，前24 h累计死亡率为0，24~72 h呈匀速变化 (6%, 14%, 22%, 30%)，72 h后迅速增至64%；碳酸盐碱度为8 g·L⁻¹时，胁迫前期即开始死亡，出现急游冲撞、窜出水面、眼睛突出、眼白出血、呼吸运动加快等现象，胁迫60 h死亡已超半数，96 h后累计死亡率超过85% (图1-b)，且死亡个体大多具有眼部凸起发黑、身体僵硬、腹腔积水等特征；同时水质浑浊较快，含有大量泡沫。

图  1  尼罗罗非鱼随时间-碱度变化的累计死亡率观察值

Figure  1.  Observed value of cumulative mortality of Nile tilapia with time-alkalinity change

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基于线性回归模型拟合碱度与累计死亡率的回归方程，大、小规格急性胁迫96 h的LC₅₀分别为8.95和6.25 g·L⁻¹ (表1)。

表  1  基于线性回归模型尼罗罗非鱼累计死亡率的相关性分析

Table  1.  Correlation analysis of cumulative mortality of Nile tilapia by linear regression model

组别 Group	胁迫时间 Stress time/h	回归方程 Regression equation	相关系数 Correlation coefficient	P	半致死浓度 LC50/(g·L−1)
大规格鱼 Large size fish	96	y=0.329x−2.445	0.999	0.016	8.95
小规格鱼 Small size fish	96	y=0.200x−0.750	0.998	0.028	6.25

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进行各碱度各时间段累计死亡率的CLL模型拟合 (图2)。在实验设置的时间与碱度范围内，模拟的死亡概率是一个曲面，曲面的高度和变化均与观察值曲面相近。CLL模型下，大、小规格实验鱼急性胁迫96 h的LC₅₀分别为9.01和6.35 g·L⁻¹ (表2)。条件死亡率效应参数 (γ) 和累计死亡率效应参数 (τ) 估计值均随胁迫时间的延长而增大；模型经Pearson卡方检验及Hosmer & Lemeshow统计量检验均显著相关；模型系数β、γ_j经t检验相关极显著 (P<0.01，表2)。

图  2  互补重对数模型拟合尼罗罗非鱼随时间-碱度变化的累计死亡率

Figure  2.  Cumulative mortality of Nile tilapia estimated by CLL model with time-alkalinity change

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表  2  尼罗罗非鱼互补重对数模型的参数估计及其显著性检验

Table  2.  Estimated and tested parameters of complementary log-log model of Nile tilapia

组别 Group	半致死浓度 LC50/(g·L−1)	条件死亡率模型 Conditional mortality model						累计死亡率模型 Cumulative mortality model
		参数 Parameter	系数 Coefficient	标准误 Standard error	t 检验 t test	P		参数 Parameter	系数 Coefficient
大规格鱼 Large size fish	9.01	β	21.401 1	0.150 7	142.015 9	0.000 1		β	21.401 1
		γ48	−23.677 6	1.892 5	12.511 3	0.000 1		τ48	−22.710 7
		γ96	−21.714 4	3.050 7	7.117 8	0.000 1		τ96	−20.800 2
Pearson卡方检验值 Pearson's chi square test 11.529 08<χ2 0.05=25.00，df=15，P=0.775 71>0.05 Hosmer & Lemeshow 拟合度卡方统计量 Hosmer & Lemeshow statistic value 4.900 0<χ2 0.05=15.51，df=8，P=0.768 21>0.05
小规格鱼 Small size fish	6.35	β	11.405 9	2.138 8	5.332 8	0.000 1		β	11.405 9
		γ48	−12.630 2	1.894 3	6.667 5	0.000 1		τ48	−11.353 7
		γ96	−10.923 7	1.814 3	6.021 0	0.000 1		τ96	−9.524 9
Pearson卡方检验值 Pearson's chi square test 23.255 01<χ2 0.05= 25.00，df=15，P=0.107 09>0.05 Hosmer & Lemeshow 拟合度卡方统计量 Statistic value 13.002 9<χ2 0.05= 15.51，df=8，P=0.111 75>0.05
注：P>0.05表示模型拟合效果好。 Note: P>0.05 indicates that the model shows the best performance.

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2.3   慢性碱驯化实验

大规格鱼在3种碱变化速度下，累计死亡率波峰不显著 (图3-a)；小规格鱼在3种碱变化速度下，其累计死亡率出现3个明显的峰值，按时间先后分别为+6、+4和+2 g·(L·d)⁻¹组 (图3-b)。实验中以2 g·(L·d)⁻¹的幅度增加碱度，大、小规格实验鱼胁迫96 h均未出现死亡，碳酸盐碱度达12 g·L⁻¹时累计死亡率均为100%；+4 g·(L·d)⁻¹组在碱度达12 g·L⁻¹时，大规格鱼累计死亡半数以上，小规格鱼全部死亡；+6 g·(L·d)⁻¹组在碱度达12 g·L⁻¹时，大规格鱼累计死亡24%，小规格鱼累计死亡率从0升至100%。

图  3  尼罗罗非鱼慢性碱驯化下的累计死亡率观察值

Figure  3.  Observed value of cumulative mortality of Nile tilapia with gradual alkalinity

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利用Logistic模型将尼罗罗非鱼的累计死亡率和胁迫时间按照不同碳酸盐碱度变化速度进行统计拟合 (图4)，得出慢性碱驯化过程中实验鱼的致死碱度范围及半致死碱度 (表3)。

图  4  Logistic模型拟合慢性碱驯化下尼罗罗非鱼的累计死亡率

Figure  4.  Cumulative mortality of Nile tilapia estimated by Logistic model with gradual alkalinity

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表  3  慢性碱驯化下尼罗罗非鱼累计死亡率相关分析

Table  3.  Correlation Analysis of cumulative mortality of Nile tilapia with gradual alkalinity

组别 Group	碱度变化速度 Rate of alkaline change/[g·(L·d)−1]	成活时间 Survival time/h	死亡碱度下限 Lower limit of dead alkalinity/(g·L−1)	生存碱度上限 Upper limit of survival alkalinity/(g·L−1)	半致死浓度 LC50/(g·L−1)	相关系数 Correlation coefficient
大规格鱼 Large size fish	+2	144	8.20	12.00	10.55	0.999
	+4	92	7.21	15.92	11.59	0.997
	+6	68	6.64	17.07	13.03	0.997
小规格鱼 Small size fish	+2	140	8.01	11.50	9.91	0.999
	+4	68	6.91	11.98	8.87	0.997
	+6	52	5.90	15.23	8.54	0.999

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3.   讨论

LC₅₀是衡量盐碱水体对鱼毒害影响的指标^[9]。常见鱼类的96 h LC₅₀ ^[13-21]见表4。本实验急性碱胁迫96 h大规格尼罗罗非鱼的LC₅₀为106.55×10⁻³ mol·L⁻¹，小规格的为74.40×10⁻³ mol·L⁻¹ (不同文献中碱度单位有差异，此处统一按1 g·L⁻¹=84×10⁻⁶ mol·L⁻¹计算)。可见尼罗罗非鱼的耐碱能力虽弱于青海湖裸鲤、卡拉白鱼等耐高碱鱼类，但仍强于大多淡水养殖鱼类。另外，当慢性驯化实验中碱度为12 g·L⁻¹时，+2 g·(L·d)⁻¹组累计死亡率均达100%；+4 g·(L·d)⁻¹组大规格鱼累计死亡半数以上，小规格鱼全部死亡；+6 g·(L·d)⁻¹组小规格鱼累计死亡率从0升至100%。推测碳酸盐碱度12 g·L⁻¹可能是尼罗罗非鱼碱耐受能力的拐点。

表  4  常见鱼类急性胁迫96 h的半致死浓度

Table  4.  96 h LC₅₀ values of alkalinity of common fish species

种类　　　　　　 Species	规格 Size	半致死浓度 LC50/(mol·L−1)	文献 Reference
青海湖裸鲤 Gymnocypris przewalskii	(12.52±0.32) g	150.18×10−3	[13]
达里湖高原鳅 Triplophysa dalaica	(8.72±1.20) g	120.0×10−3	[13]
威海卡拉白鱼 Chalcalburnus chalcoides aralensis	2.60~4.62 g	112.23×10−3	[14]
大鳞副泥鳅 Paramisgurnus dabryanus	(47.32±0.88) g	88.83×10−3	[13]
黄鳝 Monopterus albus	(11.82±1.51) g	75.94×10−3	[15]
黑龙江泥鳅 Misgurnus mohoity (Dybowski)	(16.3±0.53) g	72.62×10−3	[13]
异育银鲫 Carassiusauratus gibelio	(28.20±3.91) g	70.368×10−3	[16]
达里湖鲫 Carassius auratus Linnacus	(4.16±0.47) cm	63.42×10−3	[17]
彭泽鲫 Carassius auratus var. pengzesis	3.26~3.68 g	59.87×10−3	[18]
花鲈 Lateolabrax maculatus	(3.19±0.21) cm	46.18×10−3	[19]
叶尔羌高原鳅 Triplophysa yarkandensis	4.64~11.39 g	35.143×10−3	[20]
欧鲇 Silurus glurnis Linnaeus	(0.32±0.11)~(0.73±0.12) g	5.099×10−3	[21]

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大规格鱼的高浓度致死MST、急性碱胁迫96 h LC₅₀ [(136.92±3.72) min, 8.95 g·L⁻¹] 均高于小规格 [(114.08±4.36) min, 6.25 g·L⁻¹]；慢性碱驯化下，大规格鱼LC₅₀均高于10 g·L⁻¹，小规格鱼的低于10 g·L⁻¹；大规格的生存碱度上限比小规格高1~4 g·L⁻¹，死亡碱度下限与小规格差异不显著。上述结果说明体质量会影响鱼类对环境的耐受性。在幼鱼阶段，体质量增加3倍以上的罗非鱼对碳酸盐碱胁迫的耐受性显著增强。值得注意的是，慢性碱驯化实验中大规格鱼LC₅₀随碱变化速度的增大而上升，小规格鱼则随碱变化速度的增大而下降，究其原因有2个：1) 慢性碱驯化实验中，小规格鱼累计死亡率出现3个明显的峰值，而大规格鱼死亡变化平缓，在碳酸盐碱度达12 g·L⁻¹时，小规格鱼较大规格死亡情况更集中；2) 实际操作中碱度以脉冲式增加，碱度的拟合值较实测值准确度可能较低，拟合曲线并未穿过全部数据点。

本研究在慢性碱驯化实验中发现，同规格鱼在不同碱变化速度下的存活时间不同。+2 g·(L·d)⁻¹组实验鱼的存活时间较长 (大：144 h，小：140 h)，+6 g·(L·d)⁻¹组实验鱼较短 (大：68 h，小：52 h)。+4 g·(L·d)⁻¹组实验鱼存活时间 (大：92 h，小：68 h) 和+6 g·(L·d)⁻¹组差异不显著。尽管在较高的碱变化速度下，生存碱度上限、死亡碱度下限发生变化，但实际该数值变化并不会提高耐受性。因此认为在碱驯化过程中，碱度日增加2 g·L⁻¹对尼罗罗非鱼的存活更加友好，养殖中可通过2 g·(L·d)⁻¹的碱增加使其耐受更高浓度的碳酸盐碱水体。另外，可以推测碱度日增加1 g·L⁻¹时罗非鱼存活时间更长，但驯化时间和成本也会相应增加。

碱度对鱼类的毒性具有剂量效应和时间效应^[17]。CLL模型最先应用在不同昆虫的化学及生物杀虫剂毒力测定的数据分析上，优点在于可以揭示时间与剂量间的互作效应，使实验数据更充分更完整^[31]。本研究引入CLL模型用于急性碱胁迫下尼罗罗非鱼的“时间-碱度-死亡率”分析。结果发现，和线性回归相比，CLL模型可直接反映不同时间区间的死亡变化情况，拟合程度更高，且胁迫过程中的时间效应在数值上表现为逐渐增强 (大：−23.677 6<−21.714 4，−22.710 7<−20.800 2；小：−12.630 2<−10.923 7，−11.353 7<−9.524 9)，不仅解释了胁迫后期实验鱼死亡数量骤增现象，同时也说明在有效的胁迫时间、碱度范围内，CLL模型适于此类数据的分析。但对于慢性碱驯化而言，时间因子和碱度因子并非2个独立变量，存在线性关系，两者共同作用导致累计死亡率的特定变化，不满足CLL模型基于双独立变量的要求。此外，笔者也试图利用双变量Logistic模型^[32]解释慢性碱驯化下碱度、时间对尼罗罗非鱼的致死影响，但由于双变量Logistic模型多应用于温度等连续变化的作用因子，实验点较多，和本实验浓度变化明显不同，因此并不适合。