草鱼源乳酸菌的分离鉴定及其生物学特性研究

王楠; 尹纪元; 王英英; 李莹莹; 吴斯宇; 石存斌; 李家豪; 曹际振; 王庆

doi:10.12131/20210039

草鱼源乳酸菌的分离鉴定及其生物学特性研究

王楠^{1, 2,},
尹纪元^2, ,,
王英英²,
李莹莹²,
吴斯宇²,
石存斌²,
李家豪²,
曹际振²,
王庆^2, ,

1.
上海海洋大学/水产科学国家级实验教学示范中心，上海 201306
2.
中国水产科学研究院珠江水产研究所/农业农村部渔药创制重点实验室/广东省水产动物免疫技术重点实验室，广东广州 510380

基金项目: 国家重点研发计划项目 (2019YFD0900102)；广东省促进经济高质量发展专项资金海洋经济发展项目 (GDOE〔2019〕A29)；中国水产科学研究院珠江水产研究所基本科研业务费 (2019XN-001)；财政部和农业农村部国家现代农业产业技术体系资助 (CARS-45)

详细信息

作者简介:
王　楠 (1997—)，女，硕士研究生，研究方向为水产动物病害与防控。E-mail: 1987897100@qq.com

通讯作者:
尹纪元 (1985—)，男，博士，助理研究员，从事水产病害与黏膜免疫研究。E-mail: neauyjy@126.com

王　庆 (1976—)，女，博士，研究员，从事水产动物病毒学研究。E-mail: sunny_929@163.com

中图分类号: S 917.1
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出版历程
- 收稿日期: 2021-01-18
- 修回日期: 2021-04-27
- 录用日期: 2021-05-11
- 网络出版日期: 2021-06-04
- 刊出日期: 2021-12-05

Isolation, identification and biological characteristics of lactobacillus from grass carp

1.
Shanghai Ocean University/National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai 201306, China
2.
Pearl River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences/Key Laboratory of Fishery Drug Development, Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Key Laboratory of Aquatic Animal Immune Technology of Guangdong Province, Guangzhou 510380, China

摘要

摘要: 随着水产养殖病害问题日益严重，抗生素和药物使用对环境造成的危害越来越大，开展绿色生态防控技术研究是实现水产健康养殖的重要途径。该研究从健康草鱼 (Ctenopharyngodon idella) 肠道分离获得8株乳酸菌 (Lactobacillus)，经生化反应和16S rRNA鉴定，均为植物乳杆菌 (L. plantarum)。生物学特性评价结果表明植物乳杆菌分离株Y190430的发酵性能最好，且具有良好的抗生素敏感性；与植物乳杆菌标准株ATCC8014和商品乳酸菌相比较，分离株Y190430对酸、碱、盐、温度等环境胁迫具有更好的耐受性，同时具有更快的产酸速率，并可通过代谢产物抑制病原菌生长，体外抑菌试验表明分离株Y190430对常见水产病原菌的拮抗能力更强。
- 乳酸菌 /
- 发酵性能 /
- 抗生素敏感性 /
- 生态防控 /
- 益生功能
Abstract: As the problem of aquaculture diseases is growing, the harm of using antibiotics and drugs is more and more serious so the research on ecological control technology is an important way to achieve healthy aquaculture. In this study, eight lactobacillus strains were isolated from the intestinal tract of healthy grass carps (Ctenopharyngodon idella). The identification result indicates that all the eight strains were Lactobacillus plantarum. The results of biological characteristics evaluation show that L. plantarum strain Y190430 had a high growth rate, and it was sensitive to common antibiotics. In addition, compared with the standard strain and commercial lactobacillus, L. plantarum Y190430 represented better tolerance to environmental stress such as acid, alkali, salt and temperature. Besides, it had a higher acid production rate and inhibited the growth of pathogenic bacterias better. The results provide references for the research on ecological control of aquatic diseases.
- Lactobacillus /
- Fermenting /
- Antibiotic sensitivity /
- Ecological prevention and control /
- Probiotics

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紫菜 (Porphyra spp.) 味道鲜美、营养丰富，是我国沿海地区重要的经济藻类，在食用海藻中占比高^[1]，但其收获具有季节性，且原料含水量高。新鲜紫菜极易腐败变质，保鲜贮运难度大^[2]。目前市场上现有的紫菜产品多以干制品为主，如紫菜圆饼、调味海苔、紫菜片等，存在品种单一、食用后容易口干、黏牙等问题。随着消费升级，单一的紫菜干制品已不能满足消费者对紫菜产品的多样化需求，开发健康美味、开袋即食的湿态紫菜产品对于推动紫菜行业的发展具有重要意义。

杀菌是确保即食产品货架期和食用安全的关键工序。热杀菌技术主要分为高压热杀菌和常压热杀菌，因简易实用、灭菌效果好、技术成熟等优点在食品工业中被广泛应用^[3-5]。高压热杀菌适用于低酸性罐头食品，常以耐热性强的肉毒梭状芽孢杆菌 (Clostridium botulinum) 作为杀菌对象，需采用100 ℃以上的温度，对产品的品质破坏较大^[6]。对于不宜采用高强度热杀菌的低酸性食品，可结合酸化工艺将产品的平衡pH降至4.6以下来抑制肉毒梭状芽孢杆菌的生长，然后采用较为温和的常压热杀菌 (杀菌温度≤100 ℃) 处理，但产品口味拓展容易受限^[7-8]。通过测定产品杀菌过程中的传热曲线并建立相应的传热模型，在满足微生物安全的前提下优化杀菌条件是提高产品品质的有效方法。Majumdar等^[9]通过拟合鲤 (Cyprinus carpio) 杀菌过程的温度曲线，在满足商业无菌的前提下，评估了不同杀菌强度对咖喱鱼感官特性的影响。Tribuzi等^[10] 通过测定贻贝 (Mytilus edulis) 肉杀菌过程的传热曲线，优化杀菌工艺条件，开发了可常温流通的贻贝肉。Tang等^[11]发现在相同杀菌强度下，不同温度会影响糖醋鱼的品质属性。Rsa等^[4]从产品质量和生产操作过程、能源消耗等方面综合评价了可变温灭菌釜的实际应用效果。目前，关于即食产品杀菌过程中的品质变化研究有一定的理论基础，但关于热杀菌工艺对于紫菜产品品质的影响尚不明确。

紫菜叶片极薄、质地较软，对加热时间和温度较为敏感。过度杀菌会导致紫菜细胞破裂、质构软烂、色泽劣变，严重降低产品感官和营养价值。为降低紫菜在杀菌过程中的品质劣化程度，本文从工艺角度出发，结合传热曲线的测定和商业保藏实验，探究了即食紫菜的最低杀菌强度。在满足安全杀菌强度的前提下，结合感官和营养品质特性优选热处理温度-时间组合。同时，针对酸化 (酸味) 和低酸性两类即食紫菜产品，比较了常压热杀菌和高压热杀菌两种工艺对紫菜品质的影响，为多口味常温即食紫菜产品的开发提供参考。

1. 材料与方法

1.1 原料与试剂

干紫菜 (坛紫菜P. haitanensis) 由南通丁布儿海苔食品有限公司 (中国江苏省南通市) 提供；食用级柠檬酸 (河南万邦实业有限公司)；碳酸钠 (Na₂CO₃)、氢氧化钠 (NaOH)、苯酚 (C₆H₅OH)、硫酸 (H₂SO₄)、福林酚 (C₅H₁₀O₅)、乙醇 (C₂H₆O) 和三氯乙酸 (C₂HCl₃O₂) 等 [国药集团化学试剂有限公司 (上海)] 均为分析级。

1.2 仪器与设备

DZ400/2D型真空包装机 (上海尤溪机械设备有限公司)；700×800双罐式全自动杀菌锅(温州市龙强轻工机械有限公司)；SCIENTZ-10ND冷冻干燥机 (宁波新芝生物科技有限公司)；UltraScan Pro 1166高精度分光测色仪 (美国Hunterlab公司)；TA-XT plus物性分析仪 (英国SMS公司)；4K15冷冻离心机 (美国SIGMA公司)；UV-1800紫外-可见分光光度计 (日本岛津制作所)；THZ-82水浴振荡器 (上海力辰邦西仪器科技有限公司)；FE 28 pH计 [梅特勒-托利多仪器 (上海) 有限公司]；Agilent 1100全自动氨基酸分析仪 (德国赛卡姆Sykam公司)；TrackSense Pro无线温度测定系统 (丹麦ELLAB公司)。

1.3 样品制备

低酸性组将干紫菜浸泡在10倍质量的蒸馏水中充分复水，剪成长约2 cm的条状，挤压将紫菜水分质量分数调至约85%，真空包装(每袋15 g) 后杀菌。酸化组用柠檬酸溶液(3 g·L⁻¹) 代替蒸馏水复水，控制酸化后紫菜的平衡pH介于4.2~4.4，其他步骤同低酸性组。杀菌后部分样品采用冷冻干燥机冻干后粉碎至40目，于−20 ℃密封保存，用于测定可溶性糖和游离氨基酸；另一部分样品直接用于感官评价、色泽和质构的测定。

1.4 杀菌曲线的测定

将无线温度探头尖端插入紫菜样品袋中冷点处，真空封口后与同批样品一起置于杀菌锅内 (常压热杀菌使用恒温水浴锅；高压热杀菌组使用全自动反压杀菌锅)，紫菜初温控制在(20±2) ℃。通过数据采集器记录杀菌过程产品的冷点温度 (中心温度) 变化，每30 s记录一次。低酸性紫菜分别测定110、115和121 ℃下的温度变化，酸化后的紫菜测定85、90和95 ℃下的温度变化，并计算对应的杀菌强度值。以时间为横坐标、温度和累计杀菌强度为纵坐标绘制即食紫菜的杀菌曲线。

1.5 杀菌强度 (F值) 的计算

1.5.1 高压热杀菌

参考姜启兴等^[12]的方法计算。

$$ F={\int }_{0}^{t}{10}^{(T-121.1)/Z}\mathrm{d}t $$

(1)

式中：t为杀菌时间；T为对应时间样品的中心温度，以90 ℃作为起点温度；Z为目标微生物的温度敏感性，对于低酸性食品，取10 ℃。

1.5.2 常压热杀菌

参考高沛等^[13]的方法计算。

$$ F={\int }_{0}^{t}{10}^{(T-93.3)/Z}\mathrm{d}t $$

(2)

式中：t 为杀菌时间；T为对应时间样品的中心温度，以70 ℃作为起点温度；Z为目标微生物的温度敏感性，对于酸性食品，取8.89 ℃。

1.6 微生物分析

菌落总数参照GB 4789.2—2016《食品微生物学检验　菌落总数测定》的平板计数法进行测定；大肠菌群参照GB 4789.3—2016《食品微生物学检验　大肠菌群计数》方法测定。

1.7 感官评分

感官评定小组成员由10男10女组成，小组成员均接受过良好的感官培训。分别从色泽、外观、滋味、口感和总体喜爱度等方面进行评价，感官评定标准见表1。

表 1 即食紫菜的感官评分表

Table 1 Sensory evaluation of instant laver

评分标准 Scoring standard	级别 (分值) Type (Point)
评分标准 Scoring standard	一级 First grade	二级 Second grade	三级 Third grade
色泽 Color	紫黑色，光泽明亮 (7~9)	紫绿色，无光泽 (4~6)	黄绿色 (1~3)
外观 Appearance	组织坚实，结构完整 (7~9)	组织松软，结构较完整 (4~6)	组织软烂，结构不完整 (1~3)
滋味 Taste	有紫菜特有鲜香味 (7~9)	稍有其他异味，能接受 (4~6)	有腥味等令人不悦的味道 (1~3)
质地 Texture	有韧性，不黏牙 (7~9)	较有韧性，微黏可接受 (4~6)	软烂或干硬，难以接受 (1~3)
喜爱度 Preference	非常喜欢 (7~9)	较喜欢，整体可接受 (4~6)	不喜欢 (1~3)

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1.8 质构测定

使用TA-XT plus物性分析仪对紫菜的韧性、硬度和黏度进行测试。称取1 g紫菜，多层平摊叠放铺于钳口装置 (HDP/VB) 上(堆叠厚度约为7~9 mm)进行剪切测试。测前速度为0.5 mm·s⁻¹；测中速度为0.5 mm·s⁻¹；变形量为70%，触发力为10.0 g。在物性分析系统中对紫菜切割过程的应力-距离进行编程，仪器在下压时自动测试样品高度 (mm)；以最大正峰值时的剪切力除以样品的高度表示硬度 (g·mm⁻¹)；以应力-距离曲线初始点剪切至距离30%时的斜率表示韧性 (g·s⁻¹)；曲线上负峰面积值表示黏度 (g·s)。每组样品测定7次取平均值。

1.9 色泽测定

使用高精度分光测色仪测定色泽，在反射模式下测定L^* (明暗度)、a^* (红绿度) 和b^* (黄蓝度) 等色泽参数，每组样品测定10次取平均值。

1.10 pH测定

pH的测定参考GB 5009.237—2016《食品安全国家标准　食品pH值的测定》。

1.11 可溶性糖测定

参考周浩宇等^[14]的方法，略作修改。将0.1 g紫菜冻干粉溶于20 mL去离子水中，置于50 ℃恒温振荡水浴锅中提取1 h，离心取上清液，沉淀物重复提取1次。合并2次上清液，定容至50 mL，采用苯酚-硫酸法测定可溶性糖含量，结果以质量分数计 (mg·g⁻¹)。

1.12 游离氨基酸的定

游离氨基酸参照Hua等^[15]的方法，结果以质量分数计。滋味活度值 (Taste activity value, TAV) 的计算及滋味阈值参考温心怡^[16]的方法。TAV计算为：

$$ {\rm{TAV}}=C/T $$

(3)

式中：C_{为游离氨基酸的质量分数[mg·(100 g)⁻¹]；T为游离氨基酸对应的滋味阈值质量分数[mg·(100 g)⁻¹]。}

1.13 数据分析

实验结果以“平均值±标准差 ( $ \overline X \pm {\rm{SD}} $ )”表示，除质构和色泽外，所有实验指标重复测定3次。采用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析，采用Duncan's多重分析进行组间显著性检验，显著性水平为P<0.05，采用Origin 2022绘图。

2. 结果与分析

2.1 即食紫菜杀菌强度确定

2.1.1 不同温度下传热曲线及累计杀菌强度F值

F值表示在一定温度条件下产品的受热时间，可用于评价热杀菌过程的有效性，是国际通用的热力杀菌强度表述符号^[5]。通过测定整个杀菌过程中产品中心温度随时间的变化，可以计算F值并评价杀菌效果，在此基础上通过比较相同杀菌强度F值时的不同杀菌温度-时间组合对产品品质的影响，来确定具体的杀菌参数。

本研究的紫菜采用蒸煮袋包装，产品整体呈薄片状，且含水量较高，有效提高了产品的传热速率。不同温度下紫菜的传热曲线和累计F值见图1。杀菌温度越高，达到相同杀菌强度所需要的恒温时间越短。由于紫菜产品较薄，121 ℃时的热力致死时间 (F₀值) 从3 min升至4 min所需延长的恒温时间仅0.6 min，且杀菌温度的波动也较大。因此从设备和生产稳定性的角度考虑，不建议选用过高的温度。

图 1 不同温度下紫菜的杀菌曲线

Fig. 1 Sterilization curve of laver at different temperatures

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由杀菌曲线知，85、90和95 ℃温度组的冷却阶段积累的 $ {F\,}_{93.3}^{8.89} $ 值分别为0.007、0.07和0.09；110、115和121 ℃温度组冷却阶段积累的F₀值分别为0.09、0.28和0.38。通过减除冷却阶段的累计F值，结合各温度下的杀菌曲线可得不同F值所需的恒温加热时间。

2.1.2 即食紫菜安全性分析

保温实验参照GB 4789.26—2013《食品安全国家标准　食品微生物学检验　商业无菌检验》进行，杀菌后的样品在37 ℃培养箱中保藏10 d，通过观察产品的感官变化、胀袋情况和微生物实验等确定安全杀菌强度F值。酸化后紫菜的平衡pH约4.2~4.3，根据美国食品药品监督管理局 (Food and Drug Administration, FDA) 建议，产品平衡pH介于4.2~4.4的需满足杀菌强度F值≥5 min^[5]。酸化后紫菜选取90 ℃为代表温度，分别对该温度下杀菌强度 $ {F\,}_{93.3}^{8.89} $ 达到5、6、7和8 min的紫菜进行保温实验。未酸化的紫菜选取115 ℃为代表温度，对其温度下杀菌强度F₀达到3、4、5和6 min的紫菜进行保温实验，杀菌时间和安全性分析结果见表2。

表 2 不同杀菌强度对即食紫菜安全性的影响

Table 2 Effect of different sterilization intensity on safety of laver

温度 Temperature/℃	F值 F-value/min	t/min	结果 Result	菌落总数 Total plate count	大肠菌群 Total coliform
90	5	11.5	商业无菌	nd	nd
	6	12.5	商业无菌	nd	nd
	7	14	商业无菌	nd	nd
	8	15.5	商业无菌	nd	nd
115	3	10	商业无菌	nd	nd
	4	13	商业无菌	nd	nd
	5	16	商业无菌	nd	nd
	6	19	商业无菌	nd	nd
注：nd. 未检测到。 Note: nd. Undetected.

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由保温实验结果知，紫菜在 $ {F\,}_{93.3}^{8.89} $ =5 min、F₀=3 min时即可达到保藏要求。在此杀菌强度下，常压杀菌组分别选定85、90和95 ℃比较不同杀菌时间处理后紫菜的品质变化，高压杀菌组分别选取110、115和121 ℃探究较优的杀菌参数。减除降温过程所累计的F值再查杀菌曲线得85、90和95 ℃达到杀菌强度 $ {F\,}_{93.3}^{8.89} $ =5 min所需时间分别为26、11.5和6.8 min；110、115和121 ℃达到杀菌强度F₀=3 min所需时间分别为32、10和2.7 min。为进一步确定杀菌参数，对不同杀菌条件下即食紫菜的感官品质和营养成分进行对比分析。

2.2 杀菌条件对即食紫菜感官及理化品质的影响

2.2.1 色差和pH

色泽是影响消费者选择产品的重要指标^[17]。L^*表示亮度，值越大颜色越亮。由表3知，在相同杀菌强度F值下两种杀菌方式产品的L^*均未发生显著变化，但高压杀菌组的紫菜亮度整体高于常压杀菌组；a^*表示紫菜的红绿程度，值越大，红色越明显；b^*表示紫菜黄蓝程度，值越大黄色越明显。相同杀菌强度F值下，随着杀菌温度的升高，均表现为a^*逐渐升高、b^*降低的趋势，即温度越高、杀菌时间越短紫菜的红色越明显，整体色泽维持越好。同一杀菌强度下随温度降低，pH略有下降。推测是低温长时间的热处理对紫菜的组织结构破坏较大，细胞内部酸性物质溶出，降低了产品的pH，这也对叶绿素造成破坏，导致低温杀菌的紫菜黄色明显。此外，高压杀菌组紫菜的a^*显著低于常压杀菌组 (P<0.05)。未杀菌时紫菜中的藻红蛋白能反射红光并吸收蓝光使紫菜呈红色，但高压组杀菌温度高，易降解藻红蛋白，使紫菜加热后由红色变成了绿色^[18-19]。Miyamoto等^[20]发现紫菜在烘烤后也存在类似的变绿现象。

表 3 不同杀菌条件下紫菜的色差和pH

Table 3 Color and pH value of laver under different sterilization conditions

杀菌方式　　　 Sterilization method	组别 Group	明暗度 L^*	红绿度 a^*	黄蓝度 b^*	pH
常压 Normal pressure	A₀	28.98±0.74^b	1.04±0.06^b	0.27±0.16^f	4.29±0.03^d
	85 ℃, 26 min	28.79±0.49^b	0.43±0.07^d	0.8±0.15^d	4.19±0.01^e
	90 ℃, 11.5 min	28.71±0.44^b	0.58±0.07^c	0.75±0.2^d	4.21±0.02^e
	95 ℃, 6.8 min	29.05±0.55^b	0.61±0.03^c	0.51±0.12^e	4.22±0.02^e
高压 High pressure	H₀	30±0.5^a	1.48±0.26^a	0.86±0.25^d	6.36±0.02^b
	110 ℃, 32 min	29.83±1.08^a	0.02±0.06^f	2.62±0.24^a	6.16±0.06^c
	115 ℃, 10 min	29.92±0.51^a	0.12±0.06^ef	2.26±0.23^b	6.4±0.04^ab
	121 ℃, 2.7 min	29.9±0.78^a	0.14±0.07^e	1.4±0.17^c	6.45±0.01^a
注：H₀指未杀菌样品，A₀指酸化后未杀菌样品；同列中不同字母间存在显著性差异 (P<0.05)；下表同此。 Note: H₀ refers to non-sterilized sample; A₀ refers to the sample not sterilized after acidification. Values with different superscript letters within the same column have significant difference (P<0.05). The same case in the following tables.

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2.2.2 质构

质构是评价即食紫菜品质的一项重要指标，一般情况下韧性和硬度越大，表明紫菜的咀嚼口感越好，组织越坚实，结构越完整。表4为不同温度下 $ {F\,}_{93.3}^{8.89} $ =5 min (常压热杀菌)和F₀=3 min (高压热杀菌) 的紫菜质构变化。未经杀菌处理的紫菜的初始韧性、硬度和黏度的数值分别为24.99、41.05和0.59，酸化后韧性和硬度降至21.03和37.29，黏度升至1.78，可以明显看出酸化对紫菜的质构具有一定的破坏作用。但常压热杀菌组的质构仍优于高压热杀菌组，说明酸化 (pH<4.6) 与温和的热处理结合可减少杀菌后紫菜质构劣化。

表 4 不同杀菌条件对紫菜质构的影响

Table 4 Texture of laver under different sterilization conditions

杀菌方式　　　 Sterilization method	组别 Group	韧性 Toughness/(g·s⁻¹)	硬度 Hardness/(g·mm⁻¹)	黏度 Adhesioness/(g·s)
常压组 Normal pressure	A₀	21.03±2.21^b	37.29±4.7^bc	1.78±0.4^b
	85 ℃, 26 min	12.36±1.51^d	14.97±3.09^de	3.75±0.79^e
	90 ℃, 11.5 min	18.65±3.01^bc	27.08±2.81^c	2.92±0.4^cd
	95 ℃, 6.8 min	18.69±3.32^bc	30.51±7.75b^c	2.39±0.48^c
高压组 High pressure	H₀	24.99±3.85^a	41.05±12.93^a	0.59±0.16^a
	110 ℃, 32 min	12.55±1.83^d	11.3±3.71^e	4.58±0.78^f
	115 ℃, 10 min	16.07±2.3^c	22.38±5.33^cd	3.21±0.44^de
	121 ℃, 2.7 min	16.36±2.16^c	25.77±9.04^c	2.65±0.62^cd

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在相同的杀菌强度F值下，随着杀菌温度升高，紫菜的韧性和硬度均增大，同时黏度下降，表现出更好的咀嚼感。这是因为紫菜包装较薄、传热较快，高温短时对紫菜品质的破坏较小，更有利于保持产品口感。

2.2.3 感官评分

感官评价是通过人的感官知觉对被测对象进行综合评价，其结果最接近消费者的判定标准，感官评分的高低直接影响消费者的接受度^[21]。不同杀菌温度下紫菜的感官品质见图2。通过不同属性对应的面积判断可知“85 ℃、26 min”和“110 ℃、32 min”时处理的紫菜感官得分，远低于相同杀菌强度F值下的另外两组样品，这与本文的色泽和质构结果一致。随着温度的升高，相同杀菌强度F值下的紫菜在色泽和滋味上的差异不大，但质感、组织状态和整体的感官评分明显升高。这是因为食品质量属性的耐热性远远大于微生物的耐热性，采用更高的温度和更短的时间，维持同样杀菌效果的同时可减少对质量属性的影响^[22]，类似的结果在斑点叉尾鮰 (Ictalurus punctatus) 软罐头的研究中也有发现^[12]。此外，酸化结合巴氏杀菌的紫菜感官得分明显高于高压热杀菌组，因此通过酸化降低杀菌强度可获得更好的产品品质。

图 2 不同杀菌温度下紫菜的感官得分

Fig. 2 Sensory scores of laver under different sterilization temperatures

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2.3 杀菌条件对紫菜营养成分的影响

2.3.1 可溶性糖

多糖是构成紫菜细胞壁的主要物质，起着将相邻细胞黏合在一起的作用，是细胞间黏附的主要决定因素^[23]。不同温度杀菌后紫菜的可溶性糖含量见图3。未经杀菌时紫菜的可溶性糖质量分数为69.54 mg·g⁻¹，酸化后增至77.85 mg·g⁻¹，由此可知pH<4.2可提高紫菜中糖的溶解性。杀菌后紫菜的可溶性多糖含量比杀菌前均有增加，且相同杀菌强度F值下温度越低紫菜中可溶性糖含量越高，这与质构和感官的结果趋势相反，也进一步表明低温长时间杀菌对紫菜品质的破坏较大。这可能是由于长时间的热处理过程导致紫菜中糖类大分子解聚，细胞壁成分增溶和结构改变，降低了多糖物质的聚合度，提高了多糖的溶解性和可提取性^[24]。这一变化与果蔬质构软化的过程相似，果蔬在成熟、加工及储藏过程中，细胞壁会发生弱化和分解，导致果胶溶解性增加，细胞壁强度下降和细胞间黏附减少，进而导致硬度下降^[25]。

图 3 不同杀菌条件下紫菜的可溶性糖质量分数

注：不同小写字母表示各样品具有显著差异 (P<0.05)。

Fig. 3 Mass fraction of soluble sugar of laver under different sterilization conditions

Note: Different lowercase letters indicate significant differences among the samples (P<0.05).

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2.3.2 游离氨基酸

游离氨基酸不仅可以提供人体必需的营养，还是紫菜的主要滋味物质，其含量和组成直接影响紫菜的风味。根据氨基酸的呈味特性，可以将其分为鲜味 (天冬氨酸和谷氨酸)、甜味 (丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸) 和苦味 (精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和缬氨酸) 等类型^[26]。本文分析了紫菜中17种主要游离氨基酸和牛磺酸，不同杀菌处理后紫菜的游离氨基酸组成相似，占比最高的依次为谷氨酸、牛磺酸、丙氨酸、天冬氨酸 (表5)。其中牛磺酸占氨基酸总量的20%以上，对促进大脑发育、抗氧化有良好功效^[27]。谷氨酸、丙氨酸和天冬氨酸是紫菜中主要的鲜味氨基酸，与紫菜的良好风味密切相关^[21]。

表 5 不同杀菌条件下每100 g紫菜中游离氨基酸的质量

Table 5 Mass of free amino acids in per 100 g laver under different sterilization conditions mg

组别 Group	天冬氨酸 Asp	谷氨酸 Glu	丝氨酸 Ser	组氨酸 His	苏氨酸 Thr	甘氨酸 Gly	精氨酸 Arg
A₀	142.98±3.57^c	434.82±4.88^ab	7.78±0.34^bc	9.79±1.44^bc	24.19±0.47^cd	64.92±0.45^c	27.94±0.86^d
85 ℃, 26 min	140.57±1.40^c	412.42±6.08^c	7.83±1.08^bc	7.05±1.62^c	23.93±0.80^cd	66.5±0.52^bc	29.26±1.21^cd
90 ℃, 11.5 min	150.58±1.37^b	426.15±4.90^b	7.76±0.52^bc	10.94±1.07^b	25.38±0.54^c	61.94±0.8^d	28.73±0.30^d
95 ℃, 6.8 min	140.85±1.55^c	400.32±5.24^c	6.68±0.58^cd	13.82±1.90^a	22.95±0.71^d	60.9±0.44^d	27.33±1.24^d
H₀	141.54±1.20^c	440.15±5.82^a	9.83±0.22^a	13.91±1.69^a	27.67±0.77^b	68.26±0.45^b	32.42±1.81^b
110 ℃, 32 min	160.49±5.79^a	401.48±9.11^c	8.56±0.49^b	13.6±0.92^a	32.15±2.40^a	78.22±1.13^a	36.37±2.43^a
115 ℃, 10 min	138.77±2.46^c	401.04±5.04^c	7.04±1.15^cd	15.52±1.23^a	28.85±1.13^b	66.92±2.34^bc	32.29±0.93^b
121 ℃, 2.7 min	141.04±4.41^c	376.50±10.64^d	6.27±0.18^d	15.82±1.51^a	27.63±1.39^b	66.25±3.17^bc	31.75±2.82^bc

组别 Group	丙氨酸 Ala	酪氨酸 Tyr	半胱氨酸 Cys	缬氨酸 Val	蛋氨酸 Met	苯丙氨酸 Phe	异亮氨酸 Ile
A₀	255.87±8.85^d	16.24±0.53^b	2.67±0.04^e	24.1±4.27^abc	1.69±0.6^a	12.72±2.03^d	11.88±1.79^d
85 ℃, 26 min	246.00±4.10^e	16.70±1.41^b	4.73±0.09^d	22.71±0.28^bc	2.92±2.39^a	16.01±0.43^bc	13.92±1.05^c
90 ℃, 11.5 min	267.28±3.86^bc	16.13±0.70^b	5.71±0.23^a	22.98±0.59^bc	3.04±0.34^a	16.30±0.86^bc	15.24±0.22^c
95 ℃, 6.8 min	236.80±2.65^f	16.19±0.65^b	5.00±0.21^cd	22.50±0.29^c	2.22±0.58^a	16.07±0.91^bc	15.51±0.71^c
H₀	273.25±3.36^b	17.18±0.37^b	4.64±0.25^d	26.65±0.38^a	2.33±0.28^a	14.75±1.19^c	11.17±0.52^d
110 ℃, 32 min	304.07±1.84^a	20.03±1.00^a	5.29±0.36^abc	26.53±0.51^a	2.48±0.36^a	19.59±0.34^a	20.08±0.68^a
115 ℃, 10 min	264.33±5.64^cd	17.37±0.90^b	5.22±0.42^bc	25.61±0.96^ab	2.55±0.6^a	17.88±0.17^ab	17.99±1.16^b
121 ℃, 2.7 min	260.32±4.38^cd	16.86±0.61^b	5.55±0.24^ab	24.43±0.52^abc	2.90±0.58^a	17.27±1.07^b	17.67±1.89^b

组别 Group	亮氨酸 Leu	赖氨酸 Lys	脯氨酸 Pro	牛磺酸 Tau		总氨基酸 Total amino acid
A₀	18.01±1.47^d	13.93±2.25^cd	19.73±2.43^bc	343.03±10.91^d		1 432.30±37.78^cde
85 ℃, 26 min	19.38±0.34^cd	14.87±0.53^bcd	19.72±1.32^bc	338.27±6.62^d		1 402.81±19.95^ef
90 ℃, 11.5 min	18.73±0.13^cd	13.59±0.77^d	20.11±0.17^bc	363.92±3.73^c		1 474.49±14.97^c
95℃,6.8 min	17.95±1.09^d	13.27±0.64^d	18.26±0.82^c	326.89±4.78^e		1 363.52±15.56^f
H₀	23.03±0.44^a	15.7±0.66^bc	22.02±0.83^bc	377.59±3.76^b		1 522.07±10.23^b
110 ℃, 32 min	23.62±0.85^a	20.75±0.29^a	27.78±1.42^a	406.8±3.98^a		1 607.89±15.13^a
115 ℃, 10 min	21.28±0.3^b	16.42±1.24^b	22.96±4.61^b	362.11±7.60^c		1 464.16±30.88^cd
121 ℃, 2.7 min	20.22±1.44^bc	14.34±0.37^cd	22.19±3.41^bc	357.57±7.36^c		1 424.58±30.26^de
注：同列中不同字母间存在显著性差异 (P<0.05)。 Note: Values with different superscript letters within the same column have significant difference (P<0.05).

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杀菌前经酸化处理的紫菜氨基酸总量低于未酸化样品，由于大多数蛋白质的等电点偏酸性，可能是酸化后紫菜的pH更接近等电点，此时的蛋白质更加稳定，不易降解为氨基酸^[28]。在常压杀菌组中，“90 ℃、11.5 min”处理组的总氨基酸和鲜味氨基酸均比“85 ℃、26 min”和“95 ℃、6.8 min”处理组的高，滋味更为鲜美。高压热杀菌组中，随温度降低，紫菜的氨基酸总量逐渐降低，“110 ℃、32 min”对应的氨基酸总量远高于对照和其他处理组，可能是经过较长时间的热处理，紫菜中的蛋白质会逐渐降解成多肽及游离氨基酸等小分子呈味物质^[29]。“121 ℃、2.7 min”处理时，紫菜中氨基酸总量最低，一方面此时紫菜组织结构破坏较小，另一方面可能有部分游离氨基酸与还原糖发生少许美拉德反应致使游离氨基酸总量有所下降^[30]。

2.3.3 TAV

紫菜中呈味物质的含量及其阈值共同反映了滋味强度，TAV可客观地判定食品中单一组分的滋味强度对其整体风味的贡献。TAV>1表示该物质对滋味有重要影响^[16]。图4从正面风味和负面风味两个角度展示了几种主要的呈味氨基酸。其中，谷氨酸和丙氨酸的TAV是其他滋味活性物质的数十倍，对鲜味和甜味的贡献很大。此外，甘氨酸作为一种重要的甜味氨基酸不仅赋予紫菜清甜的味道，还可以抑制苦味，对滋味有一定的改善作用^[31]。在常压杀菌组和高压杀菌组中，分别是“90 ℃、11.5 min”和“110 ℃、32 min”杀菌条件下谷氨酸、丙氨酸和甘氨酸对应的TAV最高，滋味最好。

图 4 不同杀菌条件下紫菜的滋味活度值

Fig. 4 TAV value of laver under different sterilization conditions

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苦味氨基酸中组氨酸、精氨酸和缬氨酸的TAV较高，但均小于1。Lioe和Takara^[32]研究发现苦味氨基酸含量低于其呈味阈值时，可增强其他呈味氨基酸的鲜味和甜味。精氨酸是苦味氨基酸，但其苦味可被氯化钠、谷氨酸钠等屏蔽，在水产品中具有提鲜作用并能够赋予水产品适宜的风味。整体而言，各组紫菜均呈现较好的滋味特征。

3. 结论

根据杀菌强度和保藏实验可知，酸化后紫菜产品在 $ {F\,}_{93.3}^{8.89} $ =5 min和低酸性紫菜产品在F₀=3 min时可满足商业无菌要求，但常压热杀菌和高压热杀菌均会导致紫菜质构品质发生不同程度的劣化。质构、色泽和感官评分等结果表明相同杀菌强度下，较高的杀菌温度可以缩短杀菌时间，比低温长时杀菌能更好地保持产品的质构。对于包装规格小、扁平状紫菜产品，杀菌过程传热较快，过高的杀菌温度对设备的精准控制水平要求较高。此外，对于常压杀菌的酸味紫菜产品，“90 ℃、11.5 min”处理组紫菜的游离氨基酸总量最高，对于高压热杀菌的低酸性紫菜产品，随着杀菌温度的增加，紫菜中可溶性糖和游离氨基酸等物质减少。由综合评价分析可知，酸化组紫菜杀菌选择“90 ℃、11.5 min”，高温杀菌组紫菜杀菌选择“115 ℃、10 min”，该条件下既能实现常温贮藏，又兼具较好的感官品质和营养特性。

图 1 分离菌株的菌落形态特征 (a) 及革兰氏染色 (b)

Figure 1. Colony morphological characteristics (a) and gram staining (b) of isolated strains

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图 2 分离菌株的16S rRNA序列的PCR扩增结果

Figure 2. PCR amplification results of 16S rRNA sequence of isolated strains

M. DL2 000 Marker; 1. C13; 2. C14; 3. C15; 4. C16; 5. C17; 6. C18; 7. C20; 8. C35.

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图 3 基于分离菌株16S rRNA序列的系统发育树

Figure 3. Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequences of isolated strains

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图 4 分离菌株的发酵生长曲线

Figure 4. Fermentation growth curve of isolated strains

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图 5 分离菌株Y190430的环境耐受性分析结果

a. 温度耐受性；b. 酸碱耐受性；c. 渗透压耐受性。

Figure 5. Environmental tolerance analysis results of Y190430 strain

a. Temperature tolerance; b. Acid base tolerance; c. Osmotic pressure tolerance.

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图 6 分离株Y190430的产酸性能

a. 与标准株相比较具有显著性差异；b. 与商品株相比较具有显著性差异；ab. 与标准株、商品株相比较均具有显著性差异。

Figure 6. Ability to produce acid of Y190430 strain

a. Compared with standard strain, there is a significant difference; b. Compared with commercial lactobacillus, there is a significant difference; ab. Compared with standard strain and commercial lactobacillus, there is a significant difference.

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表 2 分离菌株的生理生化特征

Table 2 Physiological and biochemical characteristics of isolated strains

生化项目 Biochemical item	分离菌株 Isolated strain
生化项目 Biochemical item	C13	C14	C15	C16	C17	C18	C20	C35
苦杏仁苷 Amy gdalin	+	+	+	+	+	+	+	+
阿拉伯糖 Pectinose	+	+	+	+	+	+	+	+
纤维二糖 Cellobiose	+	+	+	+	+	+	+	+
七叶苷 Aesculin	+	+	+	+	+	+	+	+
果糖 Fructose	+	+	+	+	+	+	+	+
半乳糖 Galactose	+	+	+	+	+	+	+	+
葡萄糖 Glucose	+	+	+	+	+	+	+	+
葡萄糖酸盐 Gluconic acid	−	−	−	−	−	−	−	−
乳糖 Lactose	+	+	+	+	+	+	+	+
麦芽糖 Maltose	+	+	+	+	+	+	+	+
甘露醇 Mannitol	+	+	+	+	+	+	+	+
甘露糖 Mannose	+	+	+	+	+	+	+	+
松三糖 Melezitose	+	+	+	+	+	+	+	+
蜜二糖 Melibiose	+	+	+	+	+	+	+	+
棉籽糖 Raffinose	−	−	−	−	−	−	−	−
鼠李糖 Rhamnose	−	−	−	−	−	−	−	−
核糖 Ribose	+	+	+	+	+	+	+	+
水杨素 Salicin	+	+	+	+	+	+	+	+
山梨糖 Sorbose	−	−	−	−	−	−	−	−
蔗糖 Sucrose	+	+	+	+	+	+	+	+
蕈糖 Trehalose	+	+	+	+	+	+	+	+
木糖 Xylose	−	−	−	−	−	−	−	−
注：+. 阳性；−. 阴性。 Note: +. Positive; −. Negative.

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表 3 分离菌株Y190430对酸碱的耐受性

Table 3 Acid base tolerance of Y190430 strain $ \overline { \boldsymbol{X}}\pm { \bf {SD}}$

培养pH Incubation pH	菌落总数 CFU/(logCFU·mL⁻¹)
培养pH Incubation pH	植物乳杆菌Y190430 L. plantarum Y190430	植物乳杆菌ATCC8014 L. plantarum ATCC8014	商品乳酸菌 Commercial lactobacillus
2.0	2.50±0.08^AB	1.10±0.03	1.70±0.05
3.0	3.50±0.05^AB	2.90±0.02	3.20±0.05
4.0	7.30±0.04^AB	5.90±0.04	7.00±0.07
5.0	8.30±0.02^AB	8.10±0.07	8.10±0.07
5.6	8.90±0.24	8.80±0.02	8.80±0.07
6.0	8.80±0.04^AB	8.50±0.04	8.60±0.07
7.0	8.50±0.02^A	8.30±0.02	8.40±0.08
8.0	8.20±0.04^B	8.10±0.07	8.00±0.07
9.0	8.00±0.04^AB	7.50±0.02	7.70±0.02
注：A. 植物乳杆菌Y190430与植物乳杆菌ATCC8014相比较具有显著性差异；B. Y190340与商品株相比较具有显著性差异。 Note: A. Significant difference between L. plantarum Y190430 and L. plantarum ATCC8014; B. Significant difference between L. plantarum Y190430 and commercial lactobacillus.

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表 4 分离菌株Y190430对渗透压的耐受性

Table 4 Osmotic pressure tolerance of Y190430 strain $ \overline { \boldsymbol{X}}\pm { \bf {SD}}$

氯化钠质量分数 NaCl mass fraction/%	菌落总数 CFU/(log CFU·mL⁻¹)
氯化钠质量分数 NaCl mass fraction/%	植物乳杆菌Y190430 L. plantarum Y190430	植物乳杆菌ATCC8014 L. plantarum ATCC8014	商品乳酸菌 Commercial lactobacillus
0.9	8.90±0.08^B	8.80±0.08	8.50±0.16
2.0	8.70±0.16^B	8.50±0.16	7.90±0.16
4.0	7.10±0.16	6.90±0.08	6.90±0.16
6.0	6.50±0.08	6.70±0.16	6.40±0.16
8.0	5.10±0.24	5.00±0.16	4.70±0.20
注：B表示植物乳杆菌Y190430与商品株相比具有显著性差异 (P<0.05)。 Note: B represents significant difference between L. plantarum Y190430 and commercial lactobacillus (P<0.05).

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表 5 分离株Y190430的药敏测试结果

Table 5 The results of antibiotic sensitivity of Y190430 strain

抗生素 Antibiotics	标准抑菌直径 Standard inhibition zone diameter/mm			植物乳杆菌 Y190430 L. plantarum Y190430
抗生素 Antibiotics	耐药 (R) Resistance	中等敏感 (I) Intermediate	敏感 (S) Susceptible	抑菌圈直径 Inhibition zone diameter/mm	敏感性 Susceptibility
青霉素 Penicillin	≤19	20~27	≥28	25.85±0.11	I
氨苄西林 Ampicillin	≤28	—	≥29	34.03±0.09	S
多西环 Doxycycline	≤12	13~15	≥16	21.26±0.07	S
四环素 Tetracycline	≤14	15~18	≥19	18.37±0.11	I
氯霉素 Chloramphenicol	≤12	13~17	≥18	27.62±0.10	S
氟苯尼考 Florfenicol	≤12	13~17	≥18	30.95±0.08	S
红霉素 Erythromycin	≤13	14~22	≥23	25.71±0.05	S
林可霉素 Lincomycin	≤14	15~20	≥21	28.25±0.07	S

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表 1 分离菌株的菌落形态特征

Table 1 Colony morphological characteristics of isolated strains

编号 No.	是否光滑 Smooth or rough	边缘形状 Edge shape	菌落颜色 Strain colour	透明度 Transparency	菌落形状 Strain shape
C13	是	整齐	白色	无	圆形
C14	是	整齐	白色	无	圆形
C15	是	整齐	白色	无	圆形
C16	是	整齐	白色	无	圆形
C17	是	整齐	白色	无	圆形
C18	是	整齐	白色	无	圆形
C20	是	整齐	白色	无	圆形
C35	是	整齐	白色	无	圆形

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表 6 分离菌株Y190340对水产养殖常见致病菌的抑制作用

Table 6 Inhibitory effect of Y190340 strain on common pathogenic bacteria in aquaculture

致病菌 Pathogen	平均抑菌圈直径 Average inhibition zone diameter/mm
致病菌 Pathogen	植物乳杆菌 Y190430 L. plantarum Y190430	植物乳杆菌 ATCC8014 L. plantarum ATCC8014	商品乳酸菌 Commercial lactobacillus
舒伯特气单胞菌 A. schubertii	8.11±0.02	8.53±0.02	8.32±0.06
嗜水气单胞菌 A. hydrophila	8.89±0.07^A	7.69±0.08	9.76±0.05
迟缓爱德华氏菌 E. tarda	9.03±007^AB	8.51±0.07	7.96±0.04
铜绿假单胞菌 P. aeruginosa	12.77±0.05^B	10.32±0.06	11.43±0.04
维氏气单胞菌 A. veronii	9.89±0.02	7.53±0.07	9.76±0.07
植物乳杆菌 ATCC8014 L. plantarum ATCC8014	—		—
乳酸乳球菌 NZ9000 L. lactis NZ9000	—	—	—
注：—. 无抑菌作用；A. 与标准株相比较具有显著性差异；B. 与商品株相比较具有显著性差异；AB. 与标准株、商品株相比较均具有显著性差异。 Note: —. No bacteriostatic effect; A. Compared with the standard strain, there is a significant difference; B. Compared with commercial lactobacillus, there is a significant difference; AB. Compared with the standard strain and commercial lactobacillus, there is a significant difference.

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施引文献(11)

期刊类型引用(6)

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4.	靳鹏，和子涵，武婧玉，贾一然，张晓彤，张建新. 1株光合细菌的分离鉴定、培养基优化及脱氮特性研究. 河南农业科学. 2023(07): 136-143 . 百度学术
5.	鲁晏宏，王蕊，王珺，胡婷，付维来，朱传忠，汪攀. 1株耐盐耐低温沼泽红假单胞菌的分离筛选及培养基优化. 饲料研究. 2023(20): 103-108 . 百度学术
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1. 材料与方法
1.1 原料与试剂
1.2 仪器与设备
1.3 样品制备
1.4 杀菌曲线的测定
1.5 杀菌强度 (F值) 的计算
1.5.1 高压热杀菌
1.5.2 常压热杀菌
1.6 微生物分析
1.7 感官评分
1.8 质构测定
1.9 色泽测定
1.10 pH测定
1.11 可溶性糖测定
1.12 游离氨基酸的定
1.13 数据分析
2. 结果与分析
2.1 即食紫菜杀菌强度确定
2.1.1 不同温度下传热曲线及累计杀菌强度F值
2.1.2 即食紫菜安全性分析
2.2 杀菌条件对即食紫菜感官及理化品质的影响
2.2.1 色差和pH
2.2.2 质构
2.2.3 感官评分
2.3 杀菌条件对紫菜营养成分的影响
2.3.1 可溶性糖
2.3.2 游离氨基酸
2.3.3 TAV
3. 结论

1. 材料与方法
1.1 原料与试剂
1.2 仪器与设备
1.3 样品制备
1.4 杀菌曲线的测定
1.5 杀菌强度 (F值) 的计算
1.5.1 高压热杀菌
1.5.2 常压热杀菌
1.6 微生物分析
1.7 感官评分
1.8 质构测定
1.9 色泽测定
1.10 pH测定
1.11 可溶性糖测定
1.12 游离氨基酸的定
1.13 数据分析
2. 结果与分析
2.1 即食紫菜杀菌强度确定
2.1.1 不同温度下传热曲线及累计杀菌强度F值
2.1.2 即食紫菜安全性分析
2.2 杀菌条件对即食紫菜感官及理化品质的影响
2.2.1 色差和pH
2.2.2 质构
2.2.3 感官评分
2.3 杀菌条件对紫菜营养成分的影响
2.3.1 可溶性糖
2.3.2 游离氨基酸
2.3.3 TAV
3. 结论

参考文献(57)

施引文献

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草鱼源乳酸菌的分离鉴定及其生物学特性研究

作者简介: 王 楠 (1997—)，女，硕士研究生，研究方向为水产动物病害与防控。E-mail: 1987897100@qq.com

通讯作者: 尹纪元 (1985—)，男，博士，助理研究员，从事水产病害与黏膜免疫研究。E-mail: neauyjy@126.com 王 庆 (1976—)，女，博士，研究员，从事水产动物病毒学研究。E-mail: sunny_929@163.com

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