Isolation, identification and biological characteristics of lactobacillus from grass carp
-
摘要: 随着水产养殖病害问题日益严重,抗生素和药物使用对环境造成的危害越来越大,开展绿色生态防控技术研究是实现水产健康养殖的重要途径。该研究从健康草鱼 (Ctenopharyngodon idella) 肠道分离获得8株乳酸菌 (Lactobacillus),经生化反应和16S rRNA鉴定,均为植物乳杆菌 (L. plantarum)。生物学特性评价结果表明植物乳杆菌分离株Y190430的发酵性能最好,且具有良好的抗生素敏感性;与植物乳杆菌标准株ATCC8014和商品乳酸菌相比较,分离株Y190430对酸、碱、盐、温度等环境胁迫具有更好的耐受性,同时具有更快的产酸速率,并可通过代谢产物抑制病原菌生长,体外抑菌试验表明分离株Y190430对常见水产病原菌的拮抗能力更强。Abstract: As the problem of aquaculture diseases is growing, the harm of using antibiotics and drugs is more and more serious so the research on ecological control technology is an important way to achieve healthy aquaculture. In this study, eight lactobacillus strains were isolated from the intestinal tract of healthy grass carps (Ctenopharyngodon idella). The identification result indicates that all the eight strains were Lactobacillus plantarum. The results of biological characteristics evaluation show that L. plantarum strain Y190430 had a high growth rate, and it was sensitive to common antibiotics. In addition, compared with the standard strain and commercial lactobacillus, L. plantarum Y190430 represented better tolerance to environmental stress such as acid, alkali, salt and temperature. Besides, it had a higher acid production rate and inhibited the growth of pathogenic bacterias better. The results provide references for the research on ecological control of aquatic diseases.
-
Keywords:
- Lactobacillus /
- Fermenting /
- Antibiotic sensitivity /
- Ecological prevention and control /
- Probiotics
-
弧菌病是常见的水产养殖病害[1]。近年来随着水产养殖品种的增加和养殖规模的扩大,尤其是高密度养殖使水体自身调节能力降低,弧菌病害和氨氮 (NH4 +-N) 过量对水产养殖的负面影响越来越严重,有关水产养殖过程中弧菌病防治和水体污染治理的研究备受关注[2]。目前主要采用化学、物理手段进行弧菌病的防治,但物理手段会造成水体二次污染,化学手段会导致病原菌的抗药性,打破水域生态平衡,而生物手段则弥补了化学手段的不足,这类生态友好型的治理手段已成研发热点[3],生产上亟需更多的微生物制剂用于水产病害和水污染治理[4]。
光合细菌 (Photosynthetic bacteria, PSB) 是在厌氧条件下以光为能源,以二氧化碳 (CO2) 或有机物为碳源,进行不生氧光合作用的原核生物[5]。目前所知的光合细菌可分为着色杆菌科、外硫红螺菌科、紫色非硫细菌、绿色硫细菌、多细胞丝状绿细菌、螺旋杆菌科、含细菌叶绿素的专性好氧菌7大类群,其中在水产养殖方面应用最多的为紫色非硫细菌[6-8]。光合细菌将水体中的有机物转化为自身生长所需的能量,与病原微生物形成竞争关系,从而成为优势菌群,抑制病原菌的生长繁殖[9],降低水产养殖病害的发生率,而且光合细菌所含的营养物质能够提高养殖鱼虾的免疫力,大幅提升其产量[10]。光合细菌作为生防菌株,已有研究主要针对其能够高效降解水体中的三态氮、硫化氢等有害物质[11],而对同时具有弧菌拮抗作用和降解NH4 +-N、亚硝态氮 (NO2 −-N) 复合功能的光合细菌的研究较少。本研究通过分离筛选对弧菌具有抑制作用并能降解NH4 +-N和NO2 −-N的优良光合细菌,以期为水产养殖病害的生物防治和养殖水污染治理提供优良菌株。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试培养基
光合细菌富集培养基为氯化钠 (NaCl) 2 g,七水硫酸镁 (MgSO4·7H2O) 0.2 g,氯化铵 (NH4Cl) 1 g,磷酸二氢钾 (KH2PO4) 1.75 g,乙酸钠 (CH3COONa) 3 g,酵母粉1 g,蒸馏水1 000 mL,pH 7.0,灭菌后加入2 g 碳酸氢钠 (NaHCO3)。光合细菌分离培养基为光合细菌富集培养基添加1.7%琼脂。光合细菌发酵培养基为LB培养基。弧菌的培养及抑菌作用测定培养基为2216E培养基 (蛋白胨5 g、酵母膏1 g、磷酸高铁0.01 g,琼脂20 g,陈海水1 000 mL,pH 8.0)。NH4 +-N降解培养基为NaCl 2 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,硫酸铵[(NH4)2SO4] 0.2358 g,KH2PO4 1.75 g,CH3COONa 3 g,酵母粉1 g,蒸馏水1 000 mL,pH 7.0,灭菌后加入2 g NaHCO3 (NH4 +-N质量浓度为50 mg·L−1)。NO2 −-N降解培养基为NaCl 2 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,NaNO2 0.246 4 g,KH2PO4 1.75 g,CH3COONa 3 g,酵母粉1 g,蒸馏水1 000 mL,pH 7.0,灭菌后加入2 g NaHCO3 (NO2 −-N质量浓度为50 mg·L−1)。柠檬酸盐利用培养基为NaCl 2 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,NH4Cl 1 g,KH2PO4 1.75 g,柠檬酸钠3 g,蒸馏水1 000 mL,pH 7.0,灭菌后加入2 g NaHCO3。
1.1.2 病原菌
副溶血弧菌 (Vibrio parahemolyticus)、鳗弧菌 (V. anguillarum)、创伤弧菌 (V. vulnificus) 由本实验室保藏提供。
1.2 样品的采集与富集
从连云港海域海州湾、车牛山岛、灌河入海口等区域采集海水样品20个,海泥样品4个,从南通市如东、启东地区海域采集海水样品4个,海泥样品2个。
取5 mL样品于25 mL富集培养基中,置于50 mL螺口离心管中,再加5 mL无菌液状石蜡,30 ℃,2 000 lx光照条件下富集培养,至培养物出现不同颜色。取1 mL培养物接种于新的富集培养基中继续培养,重复3~4次,得到深色培养液。
1.3 海洋光合细菌的分离纯化
采用双层平板涂布法和双层平板划线法。取不同的样品富集液,进行梯度稀释,分别取不同样品10−4、10−5、10−6稀释浓度的稀释液0.2 mL涂布于光合细菌分离培养基平板上,用一层融化后冷却至约45 ℃的分离培养基覆盖,静置凝固后,30 ℃光照条件下培养4 d。挑取红色、紫色、棕色和绿色等不同颜色菌落至新的分离培养基的平板上进行三区划线,进一步纯化,至在显微镜下观察菌体形态一致。
1.4 海洋光合细菌对弧菌的抑制作用测定
1.4.1 光合细菌菌悬液的制备
将分离得到的光合细菌菌株接种于装有25 mL LB液体培养基的50 mL离心管内,加入5 mL灭菌石蜡,在30 ℃、光照强度2 000 lx下培养4 d,菌液用无菌液体培养基调整光密度 (OD660 nm) 相等且OD660 nm≥1.5。
1.4.2 对弧菌的抑菌作用测定
采用牛津杯法。将在2216E培养基斜面上培养24 h的供试3种弧菌用无菌生理盐水洗下,制备成浓度为107个·mL−1的菌悬液,取0.1 mL菌悬液涂布在2216E培养基平板上。在距离培养皿边缘1.5 cm处的含菌平板四周均匀放置牛津杯,每个牛津杯中注入200 μL光合细菌不同菌株浓度为107个·mL−1的菌悬液,以等量的无菌培养基为对照,28 ℃恒温培养48 h,观察测定抑菌圈直径。每个菌株3个重复。
1.5 不同光合细菌菌株降解NH4 +-N和NO2 −-N作用测定
1.5.1 标准工作曲线制作
分别采用靛酚蓝分光光度法和盐酸萘乙二胺分光光度法 (GB/T 11889—1989) 测定溶液中NH4 +-N和NO2 −-N质量浓度。分别以NH4 +-N质量浓度和NO2 −-N质量浓度为横坐标,OD637 nm和OD538 nm为纵坐标,制作标准曲线,建立回归方程。
1.5.2 降解率测定
将光合细菌菌悬液 (OD660 nm≥1.5) 按10%的接种量接入装有25 mL液体降解培养基的50 mL离心管中,加入5 mL灭菌石蜡,每个菌株3个平行,在30 ℃、光照强度2 000 lx下静置培养4 d。发酵液于4 ℃、5 000 r·min−1条件下离心20 min,取上清液,测定不同菌株上清液的吸光值,根据标准曲线计算不同菌株发酵液中的氮质量浓度,以未接种的培养基作为对照,计算不同菌株的降解率。
$$ R=({{C}_{t}}-{{C}_{0}})/{{C}_{0}}\times 100{\text{%}} $$ (1) 式中:R为降解率;Ct为对照浓度;C0为处理浓度。
1.6 抑菌并高效降解NH4 +-N和NO2 −-N光合细菌菌株的初步鉴定
1.6.1 形态学观察
将筛选出的抑菌并高效降解NH4 +-N和NO2 −-N的光合细菌菌株接种于光合细菌分离培养基上,在30 ℃、光照强度2 000 lx下静置培养4 d,通过解剖镜观察培养基上菌落形态及颜色,挑取单菌落,进行革兰氏染色和鞭毛染色,显微镜观察菌体大小、形态和染色结果。
1.6.2 生理生化试验
挑取菌株3个单菌落至含2 mL无菌水的离心管中,振荡均匀并制成0.5麦氏浊度的均一菌悬液,吸取50~100 µL菌悬液接种至不同的生化管中,按照说明书于不同条件下培养,观察反应管的显色结果,将显色结果与《结果诠释表》比对,确定反应结果,以大肠杆菌为对照菌。
柠檬酸盐利用试验:将光合细菌菌悬液 (OD660 nm≥1.5) 按10%的接种量接入装有25 mL柠檬酸盐利用培养基的50 mL离心管中,加入5 mL灭菌石蜡,在30 ℃、2 000 lx下静置培养4 d,观察培养基颜色变化,确认菌株是否生长。
根据形态观察和生理生化反应结果,对照《伯杰细菌鉴定手册》 《常见细菌系统鉴定手册》对菌株进行初步鉴定。
1.6.3 16S rDNA序列分析
将P-3菌株样品送至上海生工生物工程有限公司,测定菌株的16S rDNA序列。所得的基因序列拼接完整后与NCBI数据库中的已知序列进行BLAST比对,选取近源序列,采用MEGA 7.0软件构建16S rDNA基因序列系统发育树。
2. 结果
2.1 海洋光合细菌的富集
在光照厌氧条件下30个不同样品多次富集培养,有6个样品出现了颜色变化,分离自灌河入海口海泥 (A) 为棕色,车牛山岛海水 (B) 和南通如东海泥 (C) 均为深红色,南通启东海水 (D) 和连云港高公岛表层海水 (E) 为红色,海州湾海水 (F) 为绿色 (图1),其他样品浑浊,未变色。
图 1 富集筛选培养后的培养液A. 灌河入海口海泥;B. 车牛山岛海水;C. 南通如东海泥;D. 南通启东海水;E. 连云港高公岛表层海水;F. 海州湾海水。Fig. 1 Culture medium after enrichment and screeningA. Sea mud of the river empties into the sea; B. Cheniushan Island sea water; C. Sea mud of Rudong, Nantong; D. Sea water of Qidong, Nantong; E. Surface water of Gaogong Island, Lianyungang; F. Sea water of Haizhou Bay.2.2 海洋光合细菌的分离纯化
将富集的30个样品涂布于光合细菌平板上,从连云港高公岛海域海水分离纯化得到了橙红色的P-1菌株,从南通如东海泥中分离得到红色的P-2菌株,从连云港车牛山岛海域海水分离得到深红色P-3菌株。3个菌株的形态特征见表1、图2和图3,符合光合细菌的特征。
表 1 分离得到的3个光合细菌菌株的形态特征Table 1 Morphological characteristics of three isolates of photosynthetic bacteria菌株编号
Strain No.菌体形态
Mycelial morphology细胞大小
Cell size/μm革兰氏染色
Gram stain液体培养
Liquid culture菌落形态
Colony morphologyP-1 短杆状 1.47×0.83 G– 橙红色 橙色,边缘整齐,圆形,高突起 P-2 卵球状 1.02×0.23 G– 红色 深红色,边缘整齐,圆形,低突起,表面有光泽 P-3 细杆状 1.49×0.15 G– 深红色 红色,边缘整齐,圆形,表面低突 2.3 光合细菌菌株对3种弧菌的抑制作用
菌株P-3对3种弧菌均有抑制作用,对鳗弧菌的抑菌圈较明显,抑菌圈平均直径为 (5.26±0.03) mm。菌株P-1、P-2在平板对峙试验中,牛津杯周围基本上未现抑菌圈,说明这2株菌对副溶血弧菌、鳗弧菌和创伤弧菌没有拮抗作用 (表2、图4)。
表 2 不同光合细菌菌株对弧菌的抗菌效果Table 2 Antibacterial effect of strains against Vibrios指示菌
Indicator bacteria抑菌圈平均直径
Average diameter of inhibition zone/mmP-1 P-2 P-3 副溶血弧菌
V. Parahemolyticus— — 2.27±0.04 鳗弧菌 V. anguillarum — — 5.26±0.03 创伤弧菌 V. vulnificus 2.40±0.01 — 2.10±0.08 注:—. 无明显抑菌圈。 Note: —. No obvious bacteriostatic zone. 2.4 具有抑菌作用的光合细菌菌株降解NH4 +-N和NO2 −-N作用的测定
将光合细菌菌液加入含50 mg·L−1 NH4 +-N、NO2 −-N降解培养基中,光照厌氧条件30 ℃培养4 d,测定发酵液的吸光值,并通过回归方程计算氮浓度,结果见表3。3株菌株降解氮的能力较强,其中菌株P-2的NH4 +-N降解率最高 (93.39%),菌株P-3的NO2 −-N降解率最高 (94.98%)。
表 3 3株海洋光合细菌对氨氮和亚硝态氮的降解率Table 3 Ammonia nitrogen and nitrite nitrogen degradation rate of three marine photosynthetic bacteria菌株
编号
Strain No.氨氮 NH4 +-N 亚硝态氮 NO2 −-N 质量浓度
Concentration/
(mg·L−1)降解率
Degradation
rate/%质量浓度
Concentration/
(mg·L−1)降解率
Degradation
rate/%CK 48.78±0.00 — 48.91±0.35 — P-1 6.02±0.21 87.66±0.42 7.12±1.39 85.44±1.27 P-2 3.22±0.08 93.39±0.16 15.24±0.42 68.83±0.85 P-3 5.03±0.36 89.68±0.73 0.98±0.29 94.98±0.60 2.5 抑菌并高效降解NH4 +-N和NO2 −-N光合细菌菌株的鉴定
根据不同菌株抑菌作用、NH4 +-N和NO2 −-N降解作用结果,菌株P-3对3种弧菌的抑制作用以及对NO2 −-N的降解作用最强,同时对NH4 +-N的降解率较高,作为高效抑菌降解NH4 +-N和NO2 −-N的优良菌株进行初步鉴定。
2.5.1 形态学观察
菌落形态为红色圆球状,边缘整齐,表面低突 (图5);该菌为革兰氏阴性菌,细胞短杆状,大小为 (1.34~1.62) × (0.33~0.59) μm,单根极生鞭毛 (图6-a);菌株P-3在光照厌氧条件下,培养液呈深红色 (图6-b)。
2.5.2 生理生化特性
菌株P-3在麦芽糖、阿拉伯糖生化鉴定管颜色变为黄色、阳性,葡萄糖管颜色无变化,说明该菌具有分解阿拉伯糖和麦芽糖的能力,不能利用葡萄糖作为碳源;尿素酶、赖氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶实验呈阳性,表明菌株P-3能分解氨基酸使其脱羧生成胺;苯丙氨酸、肌醇试验为阴性;柠檬酸钠作为唯一碳源培养4 d,培养液颜色变为红色,为阳性,表明菌株P-3可以利用柠檬酸盐 (表4)。
表 4 菌株P-3生理生化试验结果Table 4 Physiological and biochemical characteristics of P-3 strain测定项目
Parameter反应结果 Reaction 菌株P-3
P-3 strain大肠杆菌 (对照)
Escherichia coli
(Control)肌醇 Inositol − − 明胶 Gelatin + − 尿素酶 Urease + − 赖氨酸脱羧酶 Lysine decarboxylase + − 精氨酸双水解酶 Arginine dihydrolase + + 苯丙氨酸 Phenylalanine − − 葡萄糖 Glucose − − 阿拉伯糖 Arabinose + + 麦芽糖 Malt dust + + 柠檬酸盐 Citrate + − 注:+. 阳性;−. 阴性;下同。 Note: +. Positive; −. Negative; the same below. 根据形态观察结果和生理生化试验,参照《伯杰细菌系统鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》对菌株P-3进行初步鉴定。
在厌氧光照条件下培养物为深红色的光合细菌有红假单胞菌属、红螺菌属和红微菌属,红螺菌属菌体为螺旋状,不具有脱氮能力,生境为淡水环境;红微菌属菌体为卵圆形至柠檬状,依靠周生鞭毛运动,且不能利用柠檬酸盐为碳源;红假单胞菌属的菌体为球形或杆状,单根极生鞭毛运动,不能利用葡萄糖,可以利用柠檬酸盐且具有脱氮作用,生境为海水环境,菌株P-3细胞形态、生理生化特性等与红螺菌属和红微菌属不同,而与红假单胞菌属的形态和生理生化特性一致,初步认为菌株P-3为红假单胞菌 (Rhodopseudomonas sp.,表5)。
表 5 红假单胞菌属菌株P-3鉴别特征Table 5 Identification characteristics of Rhodopseudomonas P-3性状
Characteristics菌株P-3
P-3 strain红假单胞菌属
Rhodopseudomonas sp.红螺菌属
Rhodospirillum sp.红微菌属
Rhodomicrobium sp.细胞大小 Cell size/μm (1.34~1.62) × (0.33~0.59) (0.6~5.0) × (0.4~0.5) 0.8~1.5 (2~2.8) × (1~1.2) 革兰氏染色 Gram stain G− G− G− G− 菌体形态 Strain morphology 杆状 球形或杆状 螺旋状 卵圆形至柠檬状 厌氧光照培养物颜色 Anaerobic lighting culture colour 深红色 深红色 红色至棕色 深红至红褐色 光照厌氧生长 Anaerobic growth under light + + + + 利用葡萄糖 Utilization of glucose − − − − 肌醇 Inositol − − 生境 Habitat 海水 淡水、海水和泥土 淡水 淡水和海水 明胶 Gelatin + ± 柠檬酸钠 Sodium citrate + + ± − 脱氮 Denitrifcation + + − ± 鞭毛 Flagella 极生 极生 极生 周生 注:G−. 革兰氏阴性;±. 部分菌株阳性,部分菌株阴性。 Note: G−. Gram-negative; ±. Some were positive and some were negative. 2.5.3 菌株P-3 16S rDNA序列分析
将菌株P-3的16S rDNA基因序列与NCBI中的序列进行比对,选取同属内同源相似性较高的不同菌株的16S rDNA序列,采用MEGA 7.0软件构建系统发育树,菌株P-3的16S rDNA与多株沼泽红假单胞菌 (R. palustris) 的相似性为99.31%,结果见图7。
3. 讨论
有学者认为光合细菌具有类胡萝卜素[12-13]、细菌叶绿素[14]等光合色素,在光照培养条件下,其培养液大多呈红色、紫色或者绿色等[5],如张小倩等[15]从辽河入海口筛选出1株产红色色素能力较强的红假单胞菌属菌株,王蕊等[16]从凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 池塘水样、底泥中分离到1株类胡萝卜素含量较高的粪红假单胞菌 (R. faecalis)。本研究分离到的3株光合细菌厌氧培养液颜色均为红色,与已有的研究中菌液颜色相符,利用这一特性初步筛选菌株,有助于寻找到更多的光合菌株资源。
弧菌属是水产养殖中一种常见的细菌性病原[17-18],目前用于弧菌病的拮抗菌主要有乳酸菌[19]、芽孢杆菌[20]、光合细菌[21]等。张信娣等[22]研究发现球形红假单胞菌X3在平板扩散法中对水产致病菌有微弱的抑制作用。本研究中的沼泽红假单胞菌对副溶血弧菌、鳗弧菌和创伤弧菌均具有拮抗作用,与张信娣等[22]的研究结果相似。
光合细菌可以吸收水体中的NH4 +-N、硝态氮 (NO3 −-N) 和NO2 −-N,起到改善水质、修复水环境的作用[23-25]。目前对改善养殖环境的光合细菌种类研究颇多,如海洋着色菌 (Marichromatium gracile) [26]、红假单胞菌[27]、类球红细菌 (Rhodobacter sphaeroides) [28]、沙氏外硫红螺菌 (Ectothiorhodospira shaposhnikovii) [29]等,这些光合菌降解效率各不相同。本试验分离筛选得到的菌株P-3与金春英等[30]和刘珍珠等[31]研究的沼泽红假单胞菌降解效果相近。金春英等[30]分离出1株沼泽红假单胞菌CQV97,其对不同质量浓度的NH4 +-N和NO2 −-N最大去除率分别为35%~96%和46.850%~99.998%;刘珍珠等[31]从冰川前缘原生裸地土壤中分离出1株为沼泽红假单胞菌LG,菌株对NH4 +-N的转化率最高为65.71%,对NO3 −-N的转化率为95.58%,已有的研究表明光合细菌在养殖水体的NH4 +-N和亚硝酸盐降解中发挥了重要作用。
本试验分离筛选得到的菌株P-3在NH4 +-N和NO2 −-N质量浓度为50 mg·L−1时,对NH4 +-N和NO2 −-N的降解率分别达89.68%和94.98%,同时对副溶血弧菌、鳗弧菌和创伤弧菌均具有抑制作用,具有复合功能,表现出潜在的开发应用前景。
-
图 6 分离株Y190430的产酸性能
a. 与标准株相比较具有显著性差异;b. 与商品株相比较具有显著性差异;ab. 与标准株、商品株相比较均具有显著性差异。
Figure 6. Ability to produce acid of Y190430 strain
a. Compared with standard strain, there is a significant difference; b. Compared with commercial lactobacillus, there is a significant difference; ab. Compared with standard strain and commercial lactobacillus, there is a significant difference.
表 2 分离菌株的生理生化特征
Table 2 Physiological and biochemical characteristics of isolated strains
生化项目
Biochemical item分离菌株
Isolated strainC13 C14 C15 C16 C17 C18 C20 C35 苦杏仁苷 Amy gdalin + + + + + + + + 阿拉伯糖 Pectinose + + + + + + + + 纤维二糖 Cellobiose + + + + + + + + 七叶苷 Aesculin + + + + + + + + 果糖 Fructose + + + + + + + + 半乳糖 Galactose + + + + + + + + 葡萄糖 Glucose + + + + + + + + 葡萄糖酸盐 Gluconic acid − − − − − − − − 乳糖 Lactose + + + + + + + + 麦芽糖 Maltose + + + + + + + + 甘露醇 Mannitol + + + + + + + + 甘露糖 Mannose + + + + + + + + 松三糖 Melezitose + + + + + + + + 蜜二糖 Melibiose + + + + + + + + 棉籽糖 Raffinose − − − − − − − − 鼠李糖 Rhamnose − − − − − − − − 核糖 Ribose + + + + + + + + 水杨素 Salicin + + + + + + + + 山梨糖 Sorbose − − − − − − − − 蔗糖 Sucrose + + + + + + + + 蕈糖 Trehalose + + + + + + + + 木糖 Xylose − − − − − − − − 注:+. 阳性;−. 阴性。 Note: +. Positive; −. Negative. 表 3 分离菌株Y190430对酸碱的耐受性
Table 3 Acid base tolerance of Y190430 strain
$ \overline { \boldsymbol{X}}\pm { \bf {SD}}$ 培养pH
Incubation pH菌落总数 CFU/(logCFU·mL−1) 植物乳杆菌Y190430
L. plantarum Y190430植物乳杆菌ATCC8014
L. plantarum ATCC8014商品乳酸菌
Commercial lactobacillus2.0 2.50±0.08AB 1.10±0.03 1.70±0.05 3.0 3.50±0.05AB 2.90±0.02 3.20±0.05 4.0 7.30±0.04AB 5.90±0.04 7.00±0.07 5.0 8.30±0.02AB 8.10±0.07 8.10±0.07 5.6 8.90±0.24 8.80±0.02 8.80±0.07 6.0 8.80±0.04AB 8.50±0.04 8.60±0.07 7.0 8.50±0.02A 8.30±0.02 8.40±0.08 8.0 8.20±0.04B 8.10±0.07 8.00±0.07 9.0 8.00±0.04AB 7.50±0.02 7.70±0.02 注:A. 植物乳杆菌Y190430与植物乳杆菌ATCC8014相比较具有显著性差异;B. Y190340与商品株相比较具有显著性差异。 Note: A. Significant difference between L. plantarum Y190430 and L. plantarum ATCC8014; B. Significant difference between L. plantarum Y190430 and commercial lactobacillus. 表 4 分离菌株Y190430对渗透压的耐受性
Table 4 Osmotic pressure tolerance of Y190430 strain
$ \overline { \boldsymbol{X}}\pm { \bf {SD}}$ 氯化钠
质量分数
NaCl mass fraction/%菌落总数 CFU/(log CFU·mL−1) 植物乳杆菌Y190430
L. plantarum Y190430植物乳杆菌ATCC8014
L. plantarum ATCC8014商品乳酸菌
Commercial lactobacillus0.9 8.90±0.08B 8.80±0.08 8.50±0.16 2.0 8.70±0.16B 8.50±0.16 7.90±0.16 4.0 7.10±0.16 6.90±0.08 6.90±0.16 6.0 6.50±0.08 6.70±0.16 6.40±0.16 8.0 5.10±0.24 5.00±0.16 4.70±0.20 注:B表示植物乳杆菌Y190430与商品株相比具有显著性差异 (P<0.05)。 Note: B represents significant difference between L. plantarum Y190430 and commercial lactobacillus (P<0.05). 表 5 分离株Y190430的药敏测试结果
Table 5 The results of antibiotic sensitivity of Y190430 strain
抗生素
Antibiotics标准抑菌直径
Standard inhibition zone diameter/mm植物乳杆菌 Y190430
L. plantarum Y190430耐药 (R)
Resistance中等敏感 (I)
Intermediate敏感 (S)
Susceptible抑菌圈直径
Inhibition zone diameter/mm敏感性
Susceptibility青霉素 Penicillin ≤19 20~27 ≥28 25.85±0.11 I 氨苄西林 Ampicillin ≤28 — ≥29 34.03±0.09 S 多西环 Doxycycline ≤12 13~15 ≥16 21.26±0.07 S 四环素 Tetracycline ≤14 15~18 ≥19 18.37±0.11 I 氯霉素 Chloramphenicol ≤12 13~17 ≥18 27.62±0.10 S 氟苯尼考 Florfenicol ≤12 13~17 ≥18 30.95±0.08 S 红霉素 Erythromycin ≤13 14~22 ≥23 25.71±0.05 S 林可霉素 Lincomycin ≤14 15~20 ≥21 28.25±0.07 S 表 1 分离菌株的菌落形态特征
Table 1 Colony morphological characteristics of isolated strains
编号
No.是否光滑
Smooth or
rough边缘形状
Edge
shape菌落颜色
Strain
colour透明度
Transparency菌落形状
Strain
shapeC13 是 整齐 白色 无 圆形 C14 是 整齐 白色 无 圆形 C15 是 整齐 白色 无 圆形 C16 是 整齐 白色 无 圆形 C17 是 整齐 白色 无 圆形 C18 是 整齐 白色 无 圆形 C20 是 整齐 白色 无 圆形 C35 是 整齐 白色 无 圆形 表 6 分离菌株Y190340对水产养殖常见致病菌的抑制作用
Table 6 Inhibitory effect of Y190340 strain on common pathogenic bacteria in aquaculture
致病菌
Pathogen平均抑菌圈直径 Average inhibition zone diameter/mm 植物乳杆菌 Y190430
L. plantarum Y190430植物乳杆菌 ATCC8014
L. plantarum ATCC8014商品乳酸菌
Commercial lactobacillus舒伯特气单胞菌 A. schubertii 8.11±0.02 8.53±0.02 8.32±0.06 嗜水气单胞菌 A. hydrophila 8.89±0.07A 7.69±0.08 9.76±0.05 迟缓爱德华氏菌 E. tarda 9.03±007AB 8.51±0.07 7.96±0.04 铜绿假单胞菌 P. aeruginosa 12.77±0.05B 10.32±0.06 11.43±0.04 维氏气单胞菌 A. veronii 9.89±0.02 7.53±0.07 9.76±0.07 植物乳杆菌 ATCC8014 L. plantarum ATCC8014 — — 乳酸乳球菌 NZ9000 L. lactis NZ9000 — — — 注:—. 无抑菌作用;A. 与标准株相比较具有显著性差异;B. 与商品株相比较具有显著性差异;AB. 与标准株、商品株相比较均具有显著性差异。 Note: —. No bacteriostatic effect; A. Compared with the standard strain, there is a significant difference; B. Compared with commercial lactobacillus, there is a significant difference; AB. Compared with the standard strain and commercial lactobacillus, there is a significant difference. -
[1] WANG P, JI J, ZHANG Y. Aquaculture extension system in China: development, challenges, and prospects[J]. Aquacult Rep, 2020, 17: 1-9.
[2] 农业农村部渔业渔政管理局. 2020中国渔业统计年鉴[M]. 北京: 中国农业出版社, 2020: 1, 24. [3] 朱文根, 李星浩, 饶刘瑜, 等. 感染草鱼呼肠孤病毒对肠道菌群多样性的影响[J]. 水生生物学报, 2019, 43(1): 109-116. doi: 10.7541/2019.014 [4] 祖国掌, 余为一, 李槿年, 等. 草鱼细菌性败血症的诊断及流行病学调查[J]. 淡水渔业, 2000, 30(5): 35-37. doi: 10.3969/j.issn.1000-6907.2000.05.017 [5] BRUDESETH B E, WIULSRØD R, FREDRIKSEN B N, et al. Status and future perspectives of vaccines for industrialised fin-fish farming[J]. Fish Shellfish Immunol, 2013, 35(6): 1759-1768. doi: 10.1016/j.fsi.2013.05.029
[6] WANG Q C, JI W, XU Z. Current use and development of fish vaccines in China[J]. Fish Shellfish Immunol, 2020, 96: 223-234. doi: 10.1016/j.fsi.2019.12.010
[7] 马丽, 吴金英, 高凇泽, 等. 海豚链球菌simA和pgmA真核表达质粒对尼罗罗非鱼免疫保护的研究[J]. 南方水产科学, 2020, 16(3): 38-46. doi: 10.12131/20190163 [8] 徐吟梅. 首个草鱼出血病活疫水产疫苗成功问世[J]. 现代渔业信息, 2011, 26(3): 73-74. [9] 巩华. 水产疫苗添新军——嗜水气单胞菌败血症灭活疫苗获生产批文[J]. 海洋与渔业, 2012(3): 49-49. doi: 10.3969/j.issn.1672-4046.2012.03.045 [10] 钱冬, 陈月英, 沈锦玉, 等. 引起鱼类暴发性流行病的嗜水气单胞菌的血清型, 毒力及溶血性[J]. 微生物学报, 1995, 35(6): 460-464. [11] 魏文娟, 赵姝, 王元, 等. 副溶血弧菌养殖对虾分离株耐药性及耐药基因分析[J]. 南方水产科学, 2020, 16(1): 9-16. doi: 10.12131/20190165 [12] 郭秀平, 刘毅辉, 潘厚军, 等. 我国水产药物残留与休药期研究现状概述[J]. 海洋与渔业, 2018(11): 76-78. [13] ZIELIŃSKA D, DŁUGOSZ E, ZAWISTOWSKA-DENIZIAK A. Functional properties of food origin lactobacillus in the gastrointestinal ecosystem: in vitro study[J]. Probiotics Antimicrob Proteins, 2019, 11(3): 820-829. doi: 10.1007/s12602-018-9458-z
[14] HYRONIMUS B, LE MARREC C, SASSI A H, et al. Acid and bile tolerance of spore-forming lactic acid bacteria[J]. Int J Food Microbiol, 2000, 61(2/3): 193-197.
[15] MIKULSKI D, JANKOWSKI J, MIKULSKA M, et al. Effects of dietary probiotic (Pediococcus acidilactici) supplementation on productive performance, egg quality, and body composition in laying hens fed diets varying in energy density[J]. Poult Sci, 2020, 99(4): 2275-2285. doi: 10.1016/j.psj.2019.11.046
[16] KEWCHAROEN W, SRISAPOOME P. Probiotic effects of Bacillus spp. from Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) on water quality and shrimp growth, immune responses, and resistance to Vibrio parahaemolyticus (AHPND strains)[J]. Fish Shellfish Immunol, 2019, 94: 175-189.
[17] CHEN C C, LI J Y, ZHANG H X, et al. Effects of a probiotic on the growth performance, intestinal flora, and immune function of chicks infected with Salmonella pullorum[J]. Poult Sci, 2020, 99(11): 5316-5323. doi: 10.1016/j.psj.2020.07.017
[18] 陈凯, 朱璐丹, 谭宏亮, 等. 2株乳酸菌抑菌作用研究及安全性评价[J]. 南方水产科学, 2019, 15(5): 118-125. doi: 10.12131/20190012 [19] FENG Z F, SONG X J, ZHAO L T, et al. Isolation of probiotics and their effects on growth, antioxidant and non-specific immunity of sea cucumber Apostichopus japonicus[J]. Fish Shellfish Immunol, 2020, 106: 1087-1094. doi: 10.1016/j.fsi.2020.08.049
[20] BENBARA T, LALOUCHE S, DRIDER D et al. Lactobacillus plantarum S27 from chicken faeces as a potential probiotic to replace antibiotics: evidence[J]. Benef Microbes, 2020, 11(2): 163-173. doi: 10.3920/BM2019.0116
[21] 布坎南 R E, 吉本斯 N E. 伯杰细菌鉴定手册[M]. 中国科学院微生物研究所《伯杰细菌鉴定手册》翻译组, 译. 北京: 科学出版社, 1984: 809. [22] YIN J Y, WANG Q, WANG Y Y, et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus[J]. J Fish Dis, 2019, 42(26): 817-824.
[23] 高艳侠, 张德锋, 可小丽, 等. 罗非鱼源无乳链球菌肠道拮抗芽孢杆菌的筛选及其生物学特性[J]. 微生物学报, 2019, 59(5): 926-938. [24] 农村农业部渔业渔政管理局, 全国水产技术推广总站. 2020中国水生动物卫生状况报告[R]. 北京: 中国农业出版社, 2020: 3. [25] 蒋魁, 徐力文, 苏友禄, 等. 2012年~2014年南海海水养殖鱼类病原菌哈维弧菌分离株的耐药性分析[J]. 南方水产科学, 2016, 12(6): 99-107. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2016.06.013 [26] 朱世超, 钱卓真, 吴成业. 水产品中7种大环内酯类抗生素残留量的测定HPLC-MS/MS法[J]. 南方水产科学, 2012, 8(1): 54-60. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2012.01.009 [27] WANG Z, WANG L, CHEN Z, et al. In vitro evaluation of swine-derived Lactobacillus reuteri: probiotic properties and effects on intestinal porcine epithelial cells challenged with Enterotoxigenic Escherichia coli K88[J]. J Microbiol Biotechnol, 2016, 26(6): 1018-1025. doi: 10.4014/jmb.1510.10089
[28] MOHAMMADIAN T, NASIRPOUR M, TABANDEH M R, et al. Administrations of autochthonous probiotics altered juvenile rainbow trout Oncorhynchus mykiss health status, growth performance and resistance to Lactococcus garvieae, an experimental infection[J]. Fish Shellfish Immunol, 2019, 86: 269-279. doi: 10.1016/j.fsi.2018.11.052
[29] SHA Y J, WANG L, LIU M, et al. Effects of lactic acid bacteria and the corresponding supernatant on the survival, growth performance, immune response and disease resistance of Litopenaeus vannamei[J]. Aquaculture, 2016, 452: 28-36. doi: 10.1016/j.aquaculture.2015.10.014
[30] LI C, REN Y C, JIANG S H, et al. Effects of dietary supplementation of four strains of lactic acid bacteria on growth, immune-related response and genes expression of the juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus Selenka[J]. Fish Shellfish Immunol, 2018, 74: 69-75. doi: 10.1016/j.fsi.2017.12.037
[31] De MELO P V, de OLIVEIRA C B, JÚNIOR A M, et al. How to select a probiotic? A review and update of methods and criteria[J]. Biotechnol Adv, 2018, 36(8): 2060-2076. doi: 10.1016/j.biotechadv.2018.09.003
[32] MAN L L, XIANG D J. Characterization of a broad spectrum bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum MXG-68 from inner Mongolia traditional fermented koumiss[J]. Folia Microbiol (Praha), 2019, 64(6): 821-834. doi: 10.1007/s12223-019-00697-0
[33] 王水泉, 包艳, 董喜梅, 等. 植物乳杆菌的生理功能及应用[J]. 中国农业科技导报, 2010, 12(4): 49-55. doi: 10.3969/j.issn.1008-0864.2010.04.10 [34] 刘佳琪, 高帅, 段可馨, 等. 鱼源植物乳杆菌表达IPNV VP2-VP3重组蛋白及其口服免疫程序[J]. 水产学报, 2017, 41(4): 622-627. [35] NEWAJ F A, AL-HARBI A H, AUSTIN B. Review: developments in the use of probiotics for disease control in aquaculture[J]. Aquaculture, 2014, 431: 1-11. doi: 10.1016/j.aquaculture.2013.08.026
[36] CANDELA M, PERNA F, CARNEVALI P, et al. Interaction of probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium strains with human intestinal epithelial cells: adhesion properties, competition against enteropathogens and modulation of IL-8 production[J]. Int J Food Microbiol, 2008, 125(3): 286-292. doi: 10.1016/j.ijfoodmicro.2008.04.012
[37] FRAQUEZA M J. Antibiotic resistance of lactic acid bacteria isolated from dry-fermented sausages[J]. Int J Food Microbiol, 2015, 212(SI): 76-88.
[38] 阚刘刚, 赵丽杰, 李秀业, 等. 鸡沙门氏菌病的生物预防和控制研究进展[J]. 动物营养学报, 2018, 30(9): 3432-3443. doi: 10.3969/j.issn.1006-267x.2018.09.012 [39] 杨红玲, 孙云章, 叶继丹, 等. 2株鱼源乳酸菌的生物学特性研究[J]. 西北农林科技大学学报 (自然科学版), 2008, 36(8): 25-30. [40] 杨媛媛, 王楠楠, 曹青, 等. 鲫肠道乳酸菌的分离及益生特性[J]. 水产学报, 2018, 42(10): 1596-1605. [41] 赵芳, 李艳琴, 李彬春. 模拟人体胃肠道环境筛选益生乳杆菌[J]. 微生物学通报, 2016, 43(6): 1396-1403. [42] 龙华. 温度对鱼类生存的影响[J]. 中山大学学报 (自然科学版), 2005, 44(S1): 254-257. [43] KAKELAR H M, BARZEGARI A, HANIFIAN S, et al. Isolation and molecular identification of Lactobacillus with probiotic potential from abomasums driven rennet[J]. Food Chem, 2019, 272: 709-714. doi: 10.1016/j.foodchem.2018.08.081
[44] GHOLIZADEH P, MAHALLEI M, PORMOHAMMAD, et al. Microbial balance in the intestinal normal microbiome and its association with diabetes, obesity and allergic disease[J]. Microb Pathogenesis, 2019, 127: 48-55. doi: 10.1016/j.micpath.2018.11.031
[45] KIYMACI M E, ALTANLAR N, GUMUSTAS M A, et al. Quorum sensing signals and related virulenc inhibition of Pseudomo nasaeruginosa by a potential probiotic strain's organic acid[J]. Microb Pathogenesis, 2018, 121: 190-197. doi: 10.1016/j.micpath.2018.05.042
[46] WANG A R, RAN C, WANG Y B, et al. Use of probiotics in aquaculture of China: a review of the past decade[J]. Fish Shellfish Immunol, 2019, 86: 734-755. doi: 10.1016/j.fsi.2018.12.026
[47] CAI Y, BENNO Y, NAKASE T, et al. Specific probiotic characterization of Weissella hellenica DS-12 isolated from flounder intestine[J]. J Gen Appl Microbiol, 1998, 44(5): 311-316. doi: 10.2323/jgam.44.311
[48] WANG Y G, LEE K L, NAJIAH M, et al. A new bacterial white spot syndrome (BWSS) in cultured tiger shrimp Penaeus monodon and its comparison with white spot syndrome (WSS) caused by virus[J]. Dis Aquat Organ, 2000, 41(1): 9-18.
[49] 骆艺文, 郝志凯, 王印庚, 等. 一株引起刺参“腐皮综合征”的蜡样芽胞杆菌[J]. 水产科技情报, 2009, 36(2): 60-63. doi: 10.3969/j.issn.1001-1994.2009.02.011 [50] VELMURUGAN S, PALANIKUMAR P, VELAYUTHANI P, et al. Bacterial white patch disease caused by Bacillus cereus, a new emerging disease in semi-intensive culture of Litopenaeus vannamei[J]. Aquaculture, 2015, 444(3): 49-54.
[51] 闫肃, 李慧敏, 张晓冬, 等. 不同食物来源乳酸细菌的安全性评价[J]. 食品与发酵工业, 2018, 44(5): 82-89. [52] 李绍戊, 王荻, 刘红柏, 等. 鱼源嗜水气单胞菌多重耐药菌株整合子的分子特征[J]. 中国水产科学, 2013, 20(5): 1015-1022. [53] 王冉, 刘铁铮, 王恬. 抗生素在环境中的转归及其生态毒性[J]. 生态学报, 2006, 26(1): 265-270. doi: 10.3321/j.issn:1000-0933.2006.01.032 [54] 乔毅. 江苏省沿海地区水产养殖主要致病菌耐药性研究[D]. 上海: 上海海洋大学, 2015: 1-96. [55] AQUILANTI L, GAROFALO C, OSIMANI A A, et al. Isolation and molecular characterization of anti biotic-resistant lactic acid bacteria from poultry and swine meat products[J]. J Food Protect, 2007, 70(3): 557-565. doi: 10.4315/0362-028X-70.3.557
[56] ROJO-BEZARES B, SÁENZ Y, POETA P A, et al. Assessment of antibiotic susceptibility within lactic acid bacteria strains isolated from wine[J]. Int J Food Microbiol, 2006, 111(3): 234-240. doi: 10.1016/j.ijfoodmicro.2006.06.007
[57] GEVERS D, HUYS G, SWINGS J. In vitro conjugal transfer of tetracycline resistance from Lactobacillus isolates to other gram positive bacteria[J]. FEMS Microbiol Lett, 2003, 225(1): 125-130. doi: 10.1016/S0378-1097(03)00505-6
-
期刊类型引用(3)
1. 王晗,卢圣鄂,卓维,亓俊朋,任风鸣. Illumina高通量测序辅助分离鉴定宽体金线蛭肠炎病病原菌. 中国药学杂志. 2025(07): 695-703 . 百度学术
2. 田甜,张建明,朱欣,张德志,胡亚成. 50日龄中华鲟幼鱼肠道微生物群落结构特征及其影响因素. 南方水产科学. 2025(02): 102-109 . 本站查看
3. 杨飞,汪斌,喻召雄,周治兵,兰松,张中良,周波. 长江鲟源致病性中间气单胞菌的分离鉴定及药敏试验. 西南农业学报. 2024(12): 2787-2792 . 百度学术
其他类型引用(2)