紫海胆 (Anthocidaris crassispina) 隶属棘皮动物门、海胆纲、正形目、长海胆科、紫海胆属，在中国浙江、福建、台湾、广东和海南等省沿海海域均有广泛分布^[1]。海胆性腺不仅味道鲜美，而且含有大量的蛋白质、氨基酸、不饱和脂肪酸和其他生理活性物质。近年来，许多国家将其作为美味佳肴和保健食品^[2]，导致对其采捕量逐年上升。我国紫海胆资源量已渐趋减少，因此开展该品种的增养殖研究尤为重要。国内对紫海胆的研究主要集中在人工育苗^[3-5]、增殖放流^[6]、摄食生理^[7-10]及呼吸代谢^[11]等方面，目前有关经济类海胆摄食的基础生物学报道较少，大部分是关于光棘球海胆(Strongylocentrotus nudus，亦称大连紫海胆)和虾夷马粪海胆 (S. intermedius) 等种类的研究^[12-13]。

海胆在浮游幼体阶段以摄食单细胞藻类为主。单细胞藻类不仅含有丰富的蛋白质，还含有多种维生素以及促进动物体生长发育的必需氨基酸；这些单细胞藻类含色素，白天可进行光合作用，释放氧气，并可以吸收动物体内的排泄物以及由此产生的有害物质如氮，这对于改善育苗池的水质有重要作用^[14]。因此，单细胞藻类是紫海胆浮游幼体生长发育的物质和能量基础，对浮游幼体的生长发育及存活起关键作用。本实验利用海产经济动物育苗生产中常用的几种单胞藻^[15-19]投喂紫海胆浮游幼体，探讨紫海胆幼体的早期发育及其与饵料的关系，综合比较各实验组浮游幼体的生长发育及成活率，初步探讨各种单胞藻或混合投喂对紫海胆浮游幼体的饵料效果，从中选出适宜的饵料种类，以提高紫海胆浮游幼体的成活率，为紫海胆资源的增殖及养护提供基础参数。

1.   材料与方法

1.1   实验材料

实验所用的紫海胆亲体取自广东省惠州市碧甲小奥村，运往中国水产科学研究院南海水产研究所热带开发中心育苗车间进行实验。经过9 h的阴干运输，移入育苗水泥池中流水刺激，使其自然产卵、受精。38 h后受精卵发育至两腕浮游幼体，用400目和200目筛绢网滤出、清洗，再移至育苗水泥池中培养，培养密度为40个·L⁻¹。浮游幼体培育期间每日换水50%，8:30和17:30投喂纤细角毛藻 (Chaetoceros gracilis)、扁藻 (Platymonas subcordiformis)、绿色巴夫藻 (Pavlova viridis)、小球藻 (Chlorella vulgaris)、叉鞭金藻 (Dicrateria zhanjiangensis)、C. gracilis与D. zhanjiangensis) 按1∶1混合，投喂量为1×10⁴～7×10⁴个·mL⁻¹。浮游幼体培育期间水温 (29.7±0.48) ℃、pH 8.13±0.12、盐度31.4±0.86。以上藻类均取自中国水产科学研究院南海水产研究所热带水产研究开发中心藻种室，f/2培养液光照培养。

1.2   方法

1.2.1   浮游幼体摄食不同微藻的成活率

浮游幼体培育在760 L的水泥池中进行，培育密度为120个·L⁻¹，给浮游幼体投喂6组饵料：纤细角毛藻、湛江叉鞭金藻、扁藻、绿色巴夫藻、小球藻及纤细角毛藻和湛江叉鞭金藻1∶1混合藻，每组饵料均设置3个平行。每日8:30和17:30投喂，四腕之前每日投喂量为 (1~2)×10⁴个·mL⁻¹，六腕期日投喂量为 (3~4)×10⁴个·mL⁻¹，八腕前期 (4~5)×10⁴个·mL⁻¹，八腕后期 (6~7)×10⁴个·mL⁻¹，日换水50%。每隔3 天自培育池中取一部分浮游幼体，统计浮游幼体成活率 (当日浮游幼体存活数量/浮游幼体总数量×100%)。

1.2.2   浮游幼体摄食不同单胞藻对生长发育的影响

浮游幼体培育是在760 L的水泥池中，培育密度120个·L⁻¹，给浮游幼体投喂6组饵料：纤细角毛藻、湛江叉鞭金藻、扁藻、绿色巴夫藻、小球藻及纤细角毛藻和湛江叉鞭金藻1∶1混合藻，每组饵料均设置3个平行。分别于实验的第5、第11、第17、第21天，用Toup View图像分析软件对显微镜下放大后的浮游幼体测量各实验组海胆浮游幼体的体长、口后腕骨针长度、躯干部骨针长度、骨针间距、胃长。

1.3   数据分析

实验数据采用Excel 2010和SPSS 19.0统计软件进行方差分析；用Toup View图像分析软件对显微镜下放大后的浮游幼体进行拍照并测量大小。

2.   结果

2.1   紫海胆早期发育过程

紫海胆在水温 (29.7±0.48) ℃下，胚胎发育和幼体发育的过程共经历约22 d，每个阶段所经历的时间有所不同，且都具有显著的形态差异。紫海胆从受精卵发育到稚海胆的发育过程为：受精卵、胚胎发育、棱柱幼虫、长腕幼虫 (又细分为两腕幼虫、四腕幼虫、六腕幼虫和八腕幼虫)、幼体变态期以及稚海胆。其中前期胚胎发育速度较快，整个过程持续约12 h。从棱柱幼虫阶段发育到两腕幼虫阶段所经历的时间最短，大约只有2 h。长腕幼体各阶段发育时间为17 h后进入两腕幼体阶段，1 d 7 h发育到四腕幼虫阶段，5 d后发育到六腕幼虫阶段，8 d后发育到八腕幼体阶段 (表1、图1)。在八腕幼体的后期，开始分化出海胆原基，再由海胆原基分化出触手、棘、钳棘、骨板等，最终成为形态与成海胆基本相似的、底栖匍匐生活的稚海胆。

表  1  紫海胆胚胎和幼体发育过程

Table  1.  Embryonic and larval development process of 　　 A. crassispina $\overline {\mathit{\boldsymbol{X}}}{\bf \pm {{SD}}} $

发育阶段 Developmental stage	受精后时间 Time after fertilization	体长 Body length/μm	图示 Figure
受精卵 Fertilized eggs	0 h	83.90±1.5	图1-a
2细胞期 Two-cell stage	1 h 30 min	84.70±1.3	图1-b
4细胞期 Four-cell stage	1 h 45 min	93.40±4.1	图1-c
8细胞期 Eight-cell stage	2 h	93.50±4.4	图1-d
多细胞期 Multicellular stage	3 h	95.20±4.2	图1-e
囊胚期 Blastula	4 h	92.90±0.8	图1-f
原肠期 Gastrula	10 h	103.27±2.3	图1-g
棱柱幼体 Prism	15 h	116.50±11.3	图1-h
二腕幼体 Two-armed larva	17 h	138.50±9.9	图1-i
四腕幼体 Four-armed larva	1 d 7 h	329.70±39.7	图1-j
六腕幼体 Six-armed larva	5 d	514.80±43.1	图1-k
八腕幼体 Eight-armed larva	8 d	761.10±83.2	图1-l
稚海胆 Juvenile	22 d	373.12±12.9	图1-n

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图  1  紫海胆胚胎及幼体发育过程

a. 受精卵；b. 2细胞期；c. 4细胞期；d. 8细胞期；e. 多细胞期；f. 囊胚期；g. 原肠期；h. 棱柱幼体期；i. 二腕幼体；j. 四腕幼体；k. 六腕幼体；l、m. 八腕幼体；n. 稚胆

Figure  1.  Embryonic development of A. crassispina

a. Fertilized eggs; b. Two-cell stage; c. Four-cell stage; d. Eight-cell stage; e. Multicellular stage; f. Blastula; g. Gastrula; h. Prism; i. Two-armed larva; j. Four-armed larva; k. Six-armed larva; l and m. Eight-armed larva; n. Juvenile

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2.2   摄食不同微藻浮游幼体的成活率

用SPSS 20.0软件对不同微藻和紫海胆浮游幼体进行相关性分析，分析结果见图2，以不同微藻作为海胆幼体的饵料，其成活率存在显著差异。培育受精至第21天时已经发育到八腕幼体后期，摄食湛江叉鞭金藻的海胆浮游幼虫的成活率为 (23.12±1.8)%，摄食角毛藻的成活率为 (11.41±5.7)%，摄食绿色巴夫藻和小球藻的成活率分别为 (7.33±6.08)%、(2.82±1.4)%，摄食混合饲料的成活率为 (1.33±0.57)%，摄食扁藻的浮游幼体在受精发育第9天后全部死亡 (图2)。表明喂食金藻浮游幼体的成活率显著高于其他单胞藻单独投喂 (P<0.05)，摄食角毛藻和巴夫藻的浮游幼体成活率又显著高于小球藻和混合藻，摄食扁藻的浮游幼体成活率最低。

图  2  投喂6种不同藻类时浮游幼体的存活状况

Figure  2.  Survival rate of A. crassispina fed with six different microalgae diets

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2.3   浮游幼体摄食不同单胞藻对生长发育的影响

前期以角毛藻和金藻混合喂食的海胆浮游幼体整体发育速度最快，幼体体长为 (774.74±77.86) μm，显著高于其他5种处理 (P<0.05，图3-a)，个体发育整齐，在第15天左右体长有下降趋势，陆续完成变态。在培育受精第18天，摄食金藻的浮游幼体体长为 (755.40±53.74) μm，显著高于摄食其他单胞藻组 (P<0.05)。摄食扁藻的浮游幼体在发育第3天时，体长开始呈下降趋势，生长速度较慢，大部分停留在四腕阶段，发育至第13天全部死亡，没有完成整个变态发育过程。

图  3  投喂6种不同藻类时浮游幼体的体长、躯干部骨针长度和口后腕骨针长度

Figure  3.  Larval length, body-rod length and post-oral arm length of A. crassispina larvae fed with six different microalgae diets

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培育至第13天期间，摄食混合藻浮游幼体的躯干部骨针长度显著高于摄食其他单胞藻的浮游幼体 (P<0.05)，其次是金藻、角毛藻、小球藻、巴夫藻和扁藻 (图3-b)。在培育第13至第18天期间，摄食金藻、小球藻、角毛藻、巴夫藻和混合藻的海胆浮游幼体的躯干部骨针长度呈上升趋势，显著高于摄食混合藻的浮游幼体 (P<0.05)。结果表明，培育第13天，摄食混合藻浮游幼体的口后腕骨针长度显著高于摄食角毛藻的浮游幼体 (P<0.05)，摄食金藻、小球藻和巴夫藻海胆浮游幼体的口后腕骨针长度无显著差异 (图3-c)。在培育第18天，摄食金藻浮游幼体的口后腕骨针长度显著高于摄食其他单胞藻的浮游幼体 (P<0.05)，其次是小球藻、角毛藻、巴夫藻。

3.   讨论

3.1   紫海胆早期发育特征

在水温为 (29.7±0.48) ℃的环境下，紫海胆发育至囊胚期、原肠期的时间分别在第4和第10小时，紫海胆的囊胚期、原肠期发育速度与暖水性的白棘三列海胆 (Teipneustes gratilla) 在25.8~27.5 ℃水温下的发育速度相近 (囊胚期时间5~9 h)^[20]，但是快于冷水性光棘球海胆 (Mesocentrotus nudus)、中间球海胆 (Strongylocentrotus intermedius)^[21]和高腰海胆 (Mespilia globulus)^[22]的前期发育速度。就幼体发育速度而言，尤其是紫海胆进入六腕幼体后的发育速度快于16 ℃水温下的冷水性光棘球海胆、中间球海胆^[21]和25~26 ℃水温下的高腰海胆^[22]。而较16 ℃水温下的冷水性光棘球海胆、中间球海胆发育至四腕幼体的时间较慢^[21] (表2)。基于以上几种海胆比较分析，紫海胆的胚胎发育速度均快于以上3种冷水性海胆，紫海胆进入八腕阶段均快于以上4种海胆。

表  2  不同海胆胚胎和幼体发育过程比较

Table  2.  Combined embrryonic and larval development process of different A. crassispina

发育阶段 Developmental stage	紫海胆 A. crassispina	高腰海胆[22] M. globulus	光棘球海胆[21] M. nudus	中间球海胆[21] S. intermedius
受精卵 Fertilized eggs	0 h	0 h	0 h	0 h
2细胞期 Two-cell stage	1 h 30 min	1 h	1 h	1 h
4细胞期 Four-cell stage	1 h 45 min	1 h 30 min	1 h 30 min	1 h 30 min
8细胞期 Eight-cell stage	2 h	2 h	2 h	2 h 30 min
多细胞期 Multicellular stage	3 h	4 h 30 min	5 h	5 h
囊胚期 Blastula	4 h	8 h	10 h	11 h
原肠期 Gastrula	10 h	15 h	15 h	18 h
四腕幼体 Eight-armed larva	1 d 7 h	2 d 10 h	1 d 2 h	1 d 3 h
六腕幼体 Six-armed larva	5 d	7 d 13 h	8 d 16 h	9 d 18 h
八腕幼体 Eight-armed larva	8 d	9 d 18 h	19 d 1 h	21 d 2 h

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3.2   浮游幼体在不同生长阶段对饵料的选择

饵料对水产养殖动物的存活、生长以及其他生命活动均有显著影响。本实验中，各日龄浮游幼体均能摄食混合藻、金藻、角毛藻、小球藻和巴夫藻，不能摄食亚心性扁藻。这与大连紫海胆浮游幼体^[23]、马粪海胆浮游幼体^[13]、糙海参 (Holothuria scabra) 浮游幼体^[24]、合浦珠母贝 (Pinctada fucata) 幼虫^[25]、黄边糙鸟蛤 (Trachycardium flavum) 幼虫^[26]等对单胞藻的摄食选择相似。这些结果表明浮游幼体更容易摄食胞径较小且呈圆形的单胞藻。角毛藻富含海洋无脊椎动物浮游幼体正常发育所需的必需脂肪酸^[7,15]，混合藻、金藻、角毛藻和巴夫藻无细胞壁，在浮游幼体胃内经机械作用和消化酶的作用下，易被裂解、消化并排泄。而扁藻具有一层纤维素细胞壁，很难被裂解和消化，导致摄食扁藻的海胆浮游幼体胃部由起初的大和圆逐渐变小和萎缩。在马粪海胆的浮游幼体培育中，随着幼体的生长发育，游泳能力有所增强，在后期能够捕食到游泳相对较快的扁藻藻细胞^[13]。以上事实说明，金藻和角毛藻可以作为海胆浮游幼体的开口饵料，扁藻适合作为浮游幼体的后期饵料。

3.3   浮游幼体摄食不同单胞藻对生长发育的影响

取样观察发现，因投喂饵料不同各组浮游幼体生长发育差异较大。培养前期，湛江叉鞭金藻与角毛藻混合投喂时，海胆浮游幼体的生长发育较快，浮游幼体数量较多，均为八腕浮游幼体，均显著高于其他5种单胞藻的单独投喂 (P<0.05)。国内外许多学者已经证实角毛藻是培育海胆类浮游幼体的优质饵料^[23,27-28]。而投喂扁藻的海胆浮游幼体生长缓慢发生滞育，存活的浮游幼体数量很少，均为四腕浮游幼体且畸形较多。分析原因可能是扁藻藻细胞游泳相对较快，紫海胆的早期浮游幼体的游泳能力较弱，很难捕食到扁藻藻细胞，导致胃部逐渐萎缩，发育畸形。就单胞藻混合投喂对海胆浮游幼体生长发育高于单独投喂的效果，王笑月^[29]发现简单角刺藻与盐藻混合投喂光棘球海胆与中间球海胆杂交的浮游幼体效果较好；王波等^[30]使用角毛藻和硅藻、金藻混合投喂中间球海胆浮游幼体均有良好的饵料效果。通常认为，多种单胞藻混合投喂使各饵料营养成分相互补充，提高了饵料营养价值，更利于浮游幼体的生长和成活。投喂合适的饵料，会使紫海胆的浮游幼体顺利发育变态，为后期成海胆的发育打下良好的基础。