Isolation and identification of Aeromonas veronii from diseased Micropterus salmoides
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摘要: 为查明2020年春季广东省佛山市某养殖场人工养殖大口黑鲈 (Micropterus salmoides) 鱼苗出现暴发性死亡的病因，该研究对患病大口黑鲈鱼苗肝脏组织中分离的一株细菌GZXR2020进行了分子鉴定，PCR扩增获得该菌株的16S rRNA基因和gyrB基因全长序列，BLAST显示其与维氏气单胞菌 (Aeromonas veronii) 的相应序列高度同源，同源性分别高于99.5%和98.3%。根据VITEK2全自动细菌鉴定系统45个理化项目的鉴定结果、羊血琼脂平板溶血实验呈β-溶血的结果，进一步通过毒力基因检测并结合补充理化鉴定结果，可判断此分离菌株为维氏气单胞菌温和生物型 (A. veronii bv. sobria)。人工回归感染实验采用低、中、高3种菌液浓度 (3×107、1.5×108和3×108 CFU·mL−1) 进行腹腔注射攻毒，可分别导致7%、40%和100%的死亡率，证实维氏气单胞菌温和生物型是引起此次大口黑鲈暴发性死亡的致病原。药物敏感性实验显示，在所检测的17种抗菌药物中，该菌株对大观霉素、氟罗沙星、氟苯尼考等7种药物敏感。Abstract: Sudden death occurred in Micropterus salmoides larvae reared on a farm in Foshan, Guangdong Province of China in spring of 2020. To investigate the etiology of this disease, we isolated a strain of bacteria GZXR2020 from the liver tissue of diseased M. salmoides larvae and conducted its molecular identification. We obtained the full-length sequences of the 16S rRNA gene and gyrB gene of the strain by PCR amplification. BLAST results show that the sequences were highly homologous to the corresponding sequence of Aeromonas veronii in GenBank, with homology higher than 99.5% and 98.3%, respectively. Using VITEK2 automatic bacterial identification system and according to the results of a total of 45 physical and chemical identification, sheep blood agar plate hemolysis test that showed β-hemolysis, detection of the virulence genes as well as the physicochemical identification, we identified the bacteria as A. veronii bv. sobria. In the artificial regression infection experiment, intraperitoneal injection of 3×107, 1.5×108 and 3×108 CFU·mL−1 resulted in 7%, 40% and 100% mortality, respectively. The drug sensitivity test of a total of 17 antimicrobial agents shows that the strain GZXR2020 was highly sensitive to seven antibacterial drugs such as spectinomycin, fleroxacin, florfenicol and so on.
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鱼类运动轨迹监测技术主要有视觉监测技术和声波监测技术。视觉监测技术以视频、图片观察和手工记录为主[1-7]，可以在鱼类不受干扰的情况下较好地对其行为进行观察、记录和分析，但后期数据处理难度较大、误差大且监测数据连续性差。早期的研究主要是对鱼类的行为特征进行观察和描述，基本处于“定性”分析阶段，很难得到鱼类运动行为响应的量化指标。声波监测技术分为被动声学法和主动声学法两种[8]：被动声学法是通过鱼类发出的声波特征进行探测和识别[9]；主动声学法是通过声波设备接收鱼类的回波信号并进行分析和识别，具有受水域环境影响小、应用范围广泛等优势，是当今国内外研究和应用最为广泛的一种方法[10]。目前，声波监测技术应用最广泛的有鱼探仪，采用鱼探仪对水域鱼类资源的丰度[11-16]、时空分布情况 [17-21]和活动规律[22-23]等方面的研究已取得了很多成果，但该技术仅对鱼群的种类、大小和距离进行探测，无法准确定位到鱼类的位置及其运动轨迹。
声学标签系统 (Acoustic Tag System，ATS) 是声波监测技术的一种被动声学法，根据鱼类个体大小和研究周期选择合适的声学标签 (Acoustic tag，也称声学信号发射器) 类型和参数对鱼类运动轨迹进行监测[24]，已逐步成为鱼类行为学研究最主要的手段。目前，国外对声学标签系统的应用研究成果主要有鱼类资源的丰度评估[25]、鱼类的游泳模式[26]、栖息地特征评价[27-29]、鱼类的产卵场地[30]、鱼类的生存情况[31]、鱼类的行为差异[32]、鱼类行为模型[33]等。我国仅有环境变化对鱼类行为的影响[34-35]和水利工程建设对鱼类洄游能力[36-37]等相关方向的研究成果报道。
声学标签系统主要用于江河湖库、海洋、大坝、河口海岸、船闸码头等的鱼类运动轨迹监测，并通过鱼类运动行为响应情况评估鱼类的丰度、种群结构、生理行为、迁徙及栖息地变化等，但应用在水生态环境对鱼类行为产生影响等方面的研究成果相对较少。因此，可将声学标签监测技术在鱼类运动行为学的应用与养殖、生态学、声学、数学模型以及计算机仿真技术等学科相结合，进行多学科的交叉利用与研究。
1. 声学标签监测技术
1.1 声学标签系统的组成
声学标签系统由硬件和软件2个部分组成。硬件部分由声学标签信号接收器、水听器、标签激活器、标签、标签检测器和电脑组成，软件部分包括Tag Programmer (用于激活及休眠标签)、Acoustic Tag (用于原始数据收集及存储) 和Mark Tags (用于原始数据文件中的环境噪音和标签回声信息处理) 3个模块。
1.2 声学标签系统的工作原理
声学标签系统采用4个水听器 (Hydrophone，简写为H1、H2、H3和H4) 接收移植或捆绑于鱼类身上的声学标签发射出来的声波，通过数据线传输到信号终端处理器进行信号处理，最后经计算机终端去噪处理后即可得到鱼类的二维、三维行为轨迹坐标。
1.3 声学标签系统的操作方法
声学标签系统的具体操作方法为：
1) 水听器布设。将水听器下端固定于2个不同平面 (图1)，并设置水听器底部的三维坐标及相关参数。水听器的坐标可根据监测目的选择大地坐标或相对坐标进行设置。4个水听器监测的水域范围一般为0.5 km。如监测范围为河流等线状水域可进行多个水听器线状布设；如监测范围为大水域可根据水域情况布设多个水听器，最多可布设16个，或将水听器固定于监测船进行监测，如果监测船更换位置需要重新设置水听器坐标。
2) 采用标签激活器对声学标签进行唯一编码 (即发射频率) 激活，并用标签检测器检测是否激活成功。编码根据声波信号的发射频率进行设置，设置范围一般为1 000～6 000 Hz。可根据实际情况需要选择编码大小，如设置的发射频率为3 000 Hz即每3 s可获得1个声波信号，1个信号代表1个轨迹点。每1 h为一组数据计，一组数据有1 200个轨迹点，一年可监测到的轨迹点约1 051.2 × 104个。
3) 将已激活的声学标签捆绑或移植于试验鱼身上，水听器将接收到声学标签发射出来的声波信号并通过信号线传输至信号处理器，在PC终端便可实时监控鱼类的二维、三维运动轨迹 (图2)。
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图 2 实时监测的鱼类三维 (a)、二维 (b) 运动轨迹Figure 2. 3D (a) and 2D (b) motion trajectories of fish in real-time4) 采用数据处理软件Mark Tags模块对采集的原始信号进行去噪处理即可获得鱼类二维、三维运动轨迹坐标。
2. 鱼类运动轨迹数据处理方法
在数据监测过程中，除了接收到这些具有特定发射频率的标签发射的声波信号之外，还会接收到其他噪声的声波信号 (图3)，或者接收的信号不连续，这些信号数据通常被称为“异常数据”。由于异常数据的存在导致监测到的原始轨迹数据杂乱无序 (图2)，很难从这些庞大的试验数据中获取隐藏于其中的信息和数据变化规律。如果对这些原始数据直接进行分析，得到的结果将是不准确甚至是错误的。因此，在数据分析，首先要对这些杂乱无序的大数据进行处理，对原始的运动轨迹数据进行去噪、清洗，转换成简洁、高效的鱼类二维、三维行为轨迹数据 (图4)，最后加载到数据库中。
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图 4 去噪处理后鱼类三维 (a)、二维 (b) 运动轨迹Figure 4. 3D (a) and 2D (b) motion trajectories of fish after denoising监测到的异常数据类型主要有4类：噪声值、缺失值、异常值 (离群值) 和重复值。数据清洗过程通常是将重复和多余的数据筛选后清除、将缺失的数据补充完整、将错误的数据纠正或删除，最后整理可用的数据库，为数据挖掘和分析的准确性奠定基础。以下是根据不同异常数据类型采用不同的数据清洗方法。
2.1 噪声值
在采集声学标签声波信号的同时也会接收到其他噪声声波的信号 (图5)，通过数据处理软件Mark Tags模块设置相关的去噪参数，或者添加噪声过滤器即可对采集到的原始信号进行去噪和过滤处理，得到声学标签的声波信号 (图6)。
2.2 缺失值
缺失值的清洗方法有删除法、均值插补法、热卡填补法、最近距离决定填补法、回归填补法、多重填补方法、K-最近邻法、有序最近邻法和基于贝叶斯的方法等。根据数据的缺失程度选择不同的清洗方法，其中删除法方法适用于数据比较多且缺失值的数量占整个数据的比例相对较小的情况，可以直接将缺失值删除掉，是一种最简单有效的方法。
在鱼类运动轨迹数据采集过程中，会出现由于环境客观条件造成信号无法获取而导致轨迹缺失的情况，可通过均值插补法进行插补 (图7)，但某个时间段的缺失值较多则不再进行插补。如设置的声波信号发射频率为3 s，若信号中断时间超过10 s时将不再进行插补 (图8)。采用数据处理软件的Mark Tags模块过程中即可实现缺失值的自动插补。
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图 7 对缺失值进行均值插补后鱼类运动轨迹Figure 7. Fish trajectories after mean interpolation of missing values2.3 异常值 (离群点)
异常值清洗方法主要有统计分析法、3∂原则、箱型图分析等，其中统计分析法是一种常用的简单方法。对数据库进行简单的筛选和统计，分别对鱼类运动轨迹三维坐标的x、y、z值进行排序，取数据的最大值和最小值来判断是否超出取值范围，若超出该范围则作删除处理。鱼类运动轨迹坐标应出现在水域内如a点，如果轨迹点如b点出现在水域外则显然不合常理，此为异常值，b点坐标应被删除 (图9)。
2.4 重复值
对于数据重复值的判断主要采用排序与合并的方法。重复值的检测方法主要有2个步骤：首先将数据库的数据按一定规律排序，然后通过比较相邻数据的相似情况来检测数据是否重复。对鱼类的三维运动轨迹重复值进行统计，通过判断鱼类在某处的重现性来获得鱼类的运动行为规律以及对栖息场所的偏好等信息。
要从这些庞大的数据中获得鱼类重现频率较高的轨迹坐标，需要采用数据查询语言对数据进行查询以获取有用的数据信息。数据查询语言Frequency函数是统计各区间段数值频率的一个函数，其结构为Frequency (Data_array和bins_array)，其中Data_array是用于判断的数组或者数据区域，而bins_array是用于输出结果数据的分割点。其查询步骤为：输入函数Frequency→设定参数data_array和bins_array→选择输出结果的单元格区域→按F2键输入函数公式→按“Ctrl+Shift+Enter”可返回一个数组。
为获得鱼类的运动轨迹分布情况，可将轨迹坐标分别投影在xy平面和xz平面上即可得到轨迹散点图。散点图在大数据分析中的作用尤为明显，其可以展示数据的分布和聚合情况。通过散点图中散点的疏密程度和变化趋势来获得鱼类运动行为规律，轨迹越密集说明鱼类出现的频率越高。
3. 声学标签系统的应用实例
实测水域为某高校校园的景观湖，水域面积为5.3 × 103 m2，水深为1.6～2.5 m，湖内修建有景观亭 (图10)。湖内水源的主要补给来源为天然降水和校内污水处理站的中水补给，湖中有鲤 (Cyprinus carpio)、鲫 (Carassius auratus) 等湖泊常见鱼种。景观湖为封闭水域，自净能力较差，水中的氮 (N)、磷 (P) 营养元素长期积累容易导致水体的富营养化，尤其是在夏季，气温高容易导致水质恶化，严重影响景观湖的生态功能和景观效果。
由于春、夏季水域生态环境变化较大，因此对鱼类在春、夏季的运动行为轨迹进行了监测。发现春、夏两季鱼类的运动轨迹变化明显 (图11，图12)：春季到夏季，在水平方向上鱼类离污染源的距离越大，垂直方向上鱼类由底层往表层迁移。引起鱼类运动行为发生变化的主要原因除了水温外，还与水中溶解氧 (Dissolved oxygen, DO) 含量和藻类死亡释放的毒素如微囊藻毒素的分布有关。夏季水温高，日照充足，加上N、P营养物质的不断输入，湖内藻类及其他浮游生物迅速繁殖并消耗水中大量的氧气 (O2) 导致水中DO含量不断下降，且得不到及时补充，致使O2收支不平衡，藻类死亡并释放衍生污染物。说明鱼类运动行为发生改变主要与水环境因子有关，通过评价鱼类运动行为与水环境因子的相关性，可为养殖水质及水生态健康评价等提供参考依据。
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图 11 春季 (a) 和夏季 (b) 鱼类运动轨迹在水平面的分布情况Figure 11. Distribution of fish motion trajectories in horizontal direction in spring (a) and summer (b)![]()
图 12 春季 (a) 和夏季 (b) 鱼类运动轨迹在水深方向的分布情况Figure 12. Distribution of fish motion trajectories in vertical direction in spring (a) and summer (b)4. 应用前景
目前，鱼类声学标签监测技术多应用于江河湖库和海洋等鱼类丰度、种群结构等方面的研究。采用该技术对自然水域环境中鱼类的运动行为轨迹进行实时监测，可为研究水利工程建设对鱼类洄游能力、产卵以及栖息地的影响，鱼类在生境变化过程的行为响应，鱼类毒理性行为响应，鱼类行为水质监测系统建设，水生态环境健康评价以及水生态修复效果评价等提供科学的依据，是一种实时有效、快速的先进技术。
此外，根据鱼类对不同养殖水质环境的行为响应可为水产养殖提供重要的指导信息[38-39]。目前，该声学标签监测技术在水产养殖业的应用较少，具有广泛的应用前景。如通过研究鱼类的运动轨迹变化规律，掌握鱼类的栖息场所，指导人工繁殖和幼鱼培育，可以提高幼鱼的成活率和质量；此外，鱼食投放和污染物的排入会引起水质的改变，鱼类如果表现出逃避行为，且大多数都集中在洁净水的一端，表明水质遭受到污染。因此，通过连续测定鱼类的运动轨迹，对比鱼类当前运动轨迹与历史运动轨迹的变化，可实现渔业养殖水质环境的实时在线监测和预警，为提高水产养殖的产量和质量提供可靠的科学依据。
利用声学标签监测技术对鱼类运动行为轨迹进行24 h监测，获得鱼类的实时三维运动轨迹坐标并进行相关的数据分析及应用，是一种先进的技术手段。与其他监测技术相比，声学标签监测技术具有原位观察、数据处理方法简单、可24 h实时监控鱼类的二维、三维运动轨迹等优势。但该技术是通过接收鱼类身上声学标签发送的声波信号来确定鱼类的位置，在数据监测过程中可能会出现鱼类死亡、声学标签丢失和标签电量不足等情况，因此需要技术人员及时对监测数据进行实时监控和数据处理分析，以保证监测数据的连续性和准确性。
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图 1 人工感染后大口黑鲈出现的症状
a. 鳞片脱落、尾鳍基部出血；b. 病鱼肝脏、脾脏与肾脏肿大
Figure 1. Symptoms of M. salmoides after artificial infection
a. Scale exfoliation, bleeding of the base of caudal fin; b. Swelling of liver, spleen and kidney of the infected fish
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图 2 根据细菌16S rRNA基因序列 (a) 与gyrB基因序列 (b) 构建的系统进化树
Figure 2. Phylogenetic trees constructed based on sequences of 16S rRNA (a) and gyrB (b)
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图 3 分离菌株GZXR2020在羊血琼脂板上的β-溶血环
a. 分离菌株GZXR2020；b. 大肠杆菌；标尺显示单菌落直径
Figure 3. Beta hemolysis of isolated strain GZXR2020 on sheep blood agar
a. Isolated strain GZXR2020; b. E.coli. The bar shows the single colony diameter.
表 1 分离菌株GZXR2020对17种抗菌药物的敏感性
Table 1 Antibiotic sensitivities of isolated strain GZXR2020 to 17 antibacterials
抗菌药物
Antibaterial抑菌圈直径
Inhibition
zone/mm药物敏感性
Antibiotic
sensitivity大观霉素 Spectinomycin 36 S 卡那霉素 Amikacin 17 I 链霉素 Streptomycin 12 I 妥布霉素 Tobramycin 12 R 罗红霉素 Roxithromycin 14 R 乙酰螺旋霉素 Acetylspiramycin 21 R 磺胺异噁唑 Sulfisoxazole 16 R 复方新诺明 Cotrimoxazole 21 R 氟罗沙星 Fleroxacin 23 S 利福平 rifampicin 19 S 氟苯尼考 Florfenicol 30 S 阿莫西林 Amoxicillin 8 R 青霉素 Penicillin 13 R 氨苄西林 Ampicillin 13 R 四环素 Tetracycline 25 S 多西环素 doxycycline 24 S 头孢氨苄 Cefalexin 18 S 注：R. 耐药；I. 中等敏感；S. 敏感 Note: R. Low or no sensitivity; I. Moderate sensitivity; S. High sensitivity 
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表 2 分离菌株GZXR2020的生化鉴定结果
Table 2 Biochemical identification results of strain GZXR2020
测定项目 Test item GZXR2020 测定项目 Test item GZXR2020 丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶
Alanine-phenylalanine-proline aromatase+ 蔗糖
Sucrose+ 谷氨酸-甘氨酸-精氨酸芳胺酶
Glutamic acid-glycine-arginine aromatase+ D-塔格糖
D-tagatose− 吡咯烷基芳胺酶 Pyrrolidine arylaminase − D-海藻糖 D-trehalose + L-阿拉伯醇 L-arabinol − 柠檬酸盐 (钠) Citrate (sodium) − D-纤维二糖 D-cellobiose − 丙二酸盐 Malonate − β -半乳糖苷酶 β-galactosidase + 5-酮-葡萄糖苷 5-Keto-glucoside − H2S产生 H2S production − 乳酸盐产碱 Alkali production by lactate − β-N-乙酰葡萄糖苷酶 β-N-acetyl glucosidase + α-葡萄糖 α-glucose − 谷氨酰芳胺酶 Glutamyl aromatase − 琥珀酸盐产碱 Alkali production by succinate + D-葡萄糖 D-glucose + N-乙酰- β-半乳 N-acetyl-β-galactosaminase − γ-谷氨酰转移酶 γ-glutamyltransferase − α-半乳糖苷酶 α-galactosidase − 葡萄糖发酵 Glucose fermentation + 磷酸酶 Phosphatase − β-葡萄糖苷酶 β-glucosidase − 氨基乙酸芳胺酶 Aminoacetic acid arylamidase − D-麦芽糖 D-maltose + 鸟氨酸脱羧酶 Ornithine decarboxylase − D-甘露醇 D-mannitol + 赖氨酸脱羧酶 Lysine decarboxylase − 脱羧酶阴性控制 Decarboxylase negative control − D-甘露糖 D-mannose + β-木糖苷酶 β-xylosidase − 组氨酸同化 Histidine assimilation + β-丙氨酸芳胺酶 β-alanine aromatase − β-葡萄糖苷酸酶 β-glucosidase − L-脯氨酸芳胺酶 L-proline aromatase + 0/129耐受 0/129 Resistance + 脂酶 Lipase − L-苹果酸盐同化 L-malate assimilation − 酪氨酸芳胺酶 Tyrosine aromatase + L-乳酸盐同化 L-lactate assimilation − 侧金盏花醇 Adonitol − D-山梨醇 D-sorbitol − 古老糖 Palatinose − 注： +. 阳性；−. 阴性 Note: +. Positive; −. Negative
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