盐度骤变对金钱鱼幼鱼鳃线粒体丰富细胞形态结构的影响

余焱方, 刘鉴毅, 冯广朋, 赵峰, 孙雪娜, 王妤, 邹雄, 黄晓荣, 李琪, 孙艳秋, 郑文明

余焱方, 刘鉴毅, 冯广朋, 赵峰, 孙雪娜, 王妤, 邹雄, 黄晓荣, 李琪, 孙艳秋, 郑文明. 盐度骤变对金钱鱼幼鱼鳃线粒体丰富细胞形态结构的影响[J]. 南方水产科学, 2021, 17(2): 60-69. DOI: 10.12131/20200214
引用本文: 余焱方, 刘鉴毅, 冯广朋, 赵峰, 孙雪娜, 王妤, 邹雄, 黄晓荣, 李琪, 孙艳秋, 郑文明. 盐度骤变对金钱鱼幼鱼鳃线粒体丰富细胞形态结构的影响[J]. 南方水产科学, 2021, 17(2): 60-69. DOI: 10.12131/20200214
YU Yanfang, LIU Jianyi, FENG Guangpeng, ZHAO Feng, SUN Xuena, WANG Yu, ZOU Xiong, HUANG Xiaorong, LI Qi, SUN Yanqiu, ZHENG Wenming. Effect of abrupt salinity change on morphology and structure of mitochondria-rich cells in Scatophagus argus[J]. South China Fisheries Science, 2021, 17(2): 60-69. DOI: 10.12131/20200214
Citation: YU Yanfang, LIU Jianyi, FENG Guangpeng, ZHAO Feng, SUN Xuena, WANG Yu, ZOU Xiong, HUANG Xiaorong, LI Qi, SUN Yanqiu, ZHENG Wenming. Effect of abrupt salinity change on morphology and structure of mitochondria-rich cells in Scatophagus argus[J]. South China Fisheries Science, 2021, 17(2): 60-69. DOI: 10.12131/20200214

盐度骤变对金钱鱼幼鱼鳃线粒体丰富细胞形态结构的影响

基金项目: 中央级公益性科研院所基本科研业务费重点项目 (2019Z01);国家重点研发计划项目 (2019YFD 0900405)
详细信息
    作者简介:

    余焱方 (1994—),女,硕士研究生,研究方向为鱼类生理生态学。E-mail: 15955487288@163.com

    通讯作者:

    刘鉴毅 (1965—),男,研究员,从事珍稀濒危水生动物保护及水产生态养殖研究。E-mail: liujy@ecsf.ac.cn

  • 中图分类号: S 917.4

Effect of abrupt salinity change on morphology and structure of mitochondria-rich cells in Scatophagus argus

  • 摘要: 文章采用显微技术研究了盐度骤降 (20盐度组投入5盐度组)、盐度骤升 (20盐度组投入35盐度组)胁迫下,金钱鱼 (Scatophagus argus) 幼鱼鳃线粒体丰富细胞 (Mitochondria-rich cells, MRCs) 形态结构的变化。结果显示,低盐胁迫3 h MRCs长径 [(9.517±1.390) μm]和短径 [(7.150±1.448) μm]较对照组长径 [(7.317±0.986) μm]和短径 [(5.067±0.467) μm]显著增大 (P<0.05),高盐胁迫6 h MRCs数量显著增加。显微结果表明,胁迫24 h鳃丝处于渗透机制的主动调节阶段;超微结构观察发现鳃丝分化出2种类型的MRCs:1) Ⅰ型MRCs,椭圆形,胞核形状不规则,内脊发达,顶端开口处于关闭或开放状态,主要存在于低盐环境;2) Ⅱ型MRCs,圆形,胞核规则呈圆形,具有多个顶端开口。具不同形状的线粒体,a型线粒体着色较浅,呈短粗状;b型线粒体着色较深,呈小的颗粒状,主要存在于高盐环境。综上所述,金钱鱼幼鱼对盐度骤变产生应答反应机制,通过MRCs体积、数量、形状结构,以及线粒体的形状结构变化共同维持内环境稳定。
    Abstract: The morphological changes of mitochondria rich cells (MRCS) in gills of juvenile goldfish (Scatophagus argus) were studied by microscopic technique under the stress of sudden salinity drop (20 salinity group put into 5 salinity group) and salinity sudden rise (20 salinity group put into 35 salinity group). The results show that the long and short diameters of MRCs were (9.517±1.390) μm and (7.150±1.448) μm, respectively, significantly higher than those of the control which were (7.317±0.986) μm and (7.317±0.986) μm (P<0.05), respectively; and the MRCs number increased significantly at 6th hour. Two types of MRCs were discovered: Type I MRCs, oval in shape with irregular nuclei, well-developed inner ridges and closed or open apical openings; Type II MRCs, round, with regular round nuclei and multiple apical openings. With different shapes of mitochondria, Type a mitochondria were slightly stained, showing short and thick shape; Type b mitochondria were more deeply stained, showing small granular. The results indicate that juvenile S. argus will produce a response mechanism through the changes of MRCs volume, quantity, shape and structure, as well as the shape and structure of mitochondria in order to maintain the stability of internal environment.
  • 虾青素是一种脂溶性酮式类胡萝卜素[1],其分子结构中含有11个共轭双键、2个β-紫罗兰酮环和羟基。虾青素因具有抗氧化[2-3]、抗炎[4-5]和免疫调节[6-7]等作用而受到广泛关注,它在保护人类和动物免受包括心血管疾病、糖尿病、癌症和一些免疫系统疾病方面具有巨大的应用潜力[8],已被广泛应用于食品、膳食补充剂、药品和化妆品等各个领域。

    虾青素在自然界的主要存在形式是与不同种类脂肪酸结合的虾青素酯[9],红球藻 (Haematococcus) 中虾青素组成约为70%的单酯形式、25%的双酯形式和5%的游离形式[10]。天然的虾青素酯存在成分复杂、功能差异大等问题[11],且大多数动物体内不能合成虾青素,只能从食物等其他途径获得[12]。此外,有研究表明游离形式虾青素的生物利用度更高、更容易被机体吸收利用[13],因此将虾青素酯水解制备游离虾青素,是提升虾青素产品品质和功能活性的一个重要研究方向。虾青素酯的水解反应一般通过强碱皂化或酶解的方式进行[14]。皂化法是水解虾青素酯的传统方法[15-16],过程中需要使用强碱溶液,反应条件剧烈,反应过程的废液会造成环境污染隐患,并且虾青素对热敏感,高温反应条件可能会导致虾青素降解,并容易产生虾红素等副产物[17-18]。酶解法具有反应条件温和、水解效率高、副产物少、产物生物安全性好等优势,是皂化法的理想替代方法[19]。孔凡华等[20]通过比较不同脱脂方法所测得的虾青素含量,总结出酶解法对虾青素的含量影响较小,先酶解再进行液相色谱分析可以准确定量样品中虾青素的含量。

    脂肪酶 (EC 3.1.1.3) 是一种能够水解三酰基甘油酯的酶,也可催化酯化、酯交换等反应。关于使用脂肪酶水解虾青素酯已有相关研究。Zhao等[21]使用在毕赤酵母 (Pichia sp.)中表达的碱性脂肪酶用于水解虾青素酯,以吐温80作为乳化剂,在pH 7.0、温度28 ℃、4.6 U·μg−1脂肪酶剂量和0.1 mol·L−1磷酸钠缓冲液的条件下,7 h内可回收63.2%的游离虾青素。Gao等[22]在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中表达了一种新型的链霉菌脂肪酶OUC-Sb-lip12用于水解虾青素酯,100 μg虾青素酯中虾青素得率为61.43 μg。现有研究表明利用脂类水解酶酶解制备虾青素的得率较高,但存在反应时间较长、菌株来源安全性较低的问题。因此,目前需要找到一种水解效率高、反应过程温和、反应副产物少、来源安全的酶,快速制备游离虾青素,为后续虾青素的综合利用提供参考。

    本文从浅紫色链霉菌 (Streptomyces violascens) ATCC 27968中发掘Sv-lip5脂肪酶,并使用食品级表达系统枯草芽孢杆菌WB800对其进行克隆表达。探究了其酶学性质及其在虾青素酯水解中的应用,进一步丰富了虾青素酯水解酶库,实现了在短时间内大量制备游离虾青素,为提升虾青素的功能活性和生物利用度提供有益参考。

    实验所用pP43NMK质粒及枯草芽孢杆菌WB800感受态细胞均为本实验室保藏;用于基因克隆的大肠杆菌 (Escherichia coli) Trelief TM5α购自北京天根生化科技。

    虾青素酯 (虾青素酯质量分数为10%) 购自云南爱尔发生物技术股份有限公司,纯度高于96%;虾青素购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;对硝基苯酚棕榈酸酯购自美国SIGMA公司;胶回收试剂盒购自美国OMEGA公司;质粒提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司;色谱级甲醇和甲基叔丁基醚用于液相检测;其余试剂如二氯甲烷、异丙醇等均为分析纯。

    BCM-1000型生物净化工作台 (苏州净化公司);DYY-6C型核酸电泳仪 (北京市六一仪器厂);5804R高速冷冻离心机 (Eppendorf公司);Thermo Scientific Multiskan FC酶标仪 (Thermo Scientific公司);LC-20A高效液相色谱仪 (日本岛津公司)。

    基于本实验室的浅紫色链霉菌 ATCC 27968的测序结果,找到具有脂肪酶活性的片段,对其进行克隆表达,将蛋白命名为Sv-lip5。根据已有的分析方法对脂肪酶DNA序列进行分类,使用Clustal W进行多序列比对,利用ESPript 3.0网站对序列的比对结果进行在线展示和输出,使用ExPaSy (https://web.expasy.org/protparam/) 计算理论分子量和等电点。

    根据脂肪酶基因序列及载体序列,使用SnapGene软件进行引物设计 (表1)。

    表  1  引物设计
    Table  1.  Sequences of primers
    引物名称
    Primer name
    引物序列 (5'—3')
    Primer sequence (5'—3')
    Sv-lip5-R cagtggtggtggtggtggtgccaggccagttgggc
    Sv-lip5-F taacacatgcctcagctgcagtgcacggccgggca
    Bone-R tgcagctgaggcatgtgttac
    Bone-F caccaccaccaccaccactgatgaaagcttggcgtaatc
    Tong-R cacacaggaaacagctatgacc
    Tong-F gagttgctagtaacatctgaccg
    下载: 导出CSV 
    | 显示表格

    以Sv-lip5片段为模板,利用表1设计的引物进行扩增,扩增完成后以无缝连接的形式构建重组质粒,测序正确后提取质粒pP43NMK-Sv-lip5,导入感受态细胞WB800中表达蛋白。

    利用质粒上His-tag标签蛋白与镍柱结合的性质对Sv-lip5纯化,依次使用体质量分数为20%的乙醇、水冲洗柱子,后用6倍柱体积的Tris-HCl (0.1 mol·L−1) 缓冲液平衡镍柱,将冻干后复溶的酶液过膜后分批加入平衡后的镍柱中,确保酶与镍柱充分结合。使用不同浓度的咪唑Tris-HCl缓冲液洗脱,收集不同浓度的洗脱液,浓缩后通过SDS-PAGE蛋白电泳验证纯化结果。

    使用对硝基苯酚棕榈酸酯进行酶活性测定。吸取甘氨酸氢氧化钠 (Gly-NaOH) 缓冲液 (0.1 mol·L−1, pH 9.0) 500 μL于2 mL EP管中,加入50 μL酶液和20 μL pNPP底物 (0.02 mol·L−1),混合后于40 ℃水浴锅中反应5 min,加入330 μL 1%的SDS缓冲液终止反应。取200 μL反应液于405 nm测定吸光度。

    脂肪酶酶活性 (U) 单位的定义:在一定的反应条件下,每分钟水解底物释放1 μmol对硝基苯酚(p-nitrophenol, pNP) 所需的酶量定义为一个酶活单位,即1 U。

    取等量酶液在不同温度 (25、30、35、40、45、50、55、60 ℃) 下水解对硝基苯酚棕榈酸酯,测定酶活性。将最适温度下的活性定义为100%,计算其他温度下的相对酶活。取等量酶液分别在不同温度 (35、40、45、50 ℃) 下孵育42 h,在一定时间间隔取样,最适条件下测定酶活,同一温度下以0 h酶活定义为100%,分别计算不同温度下酶的活性。

    选取100 mmol·L−1的pH 4.0~6.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、pH 6.0~8.0的磷酸盐缓冲液、pH 8.0~9.0的Tris-HCl缓冲液、pH 9.0~10.0的Gly-NaOH缓冲液作为酶反应的缓冲液进行反应,测定不同pH下的酶活性。将最适pH下的活性定义为100%,计算其他pH条件下的相对酶活。取等量酶液于上述缓冲液中孵育96 h,在不同时间间隔取样,在最适条件下测定酶活,同一pH下酶活最高的时间点的活性定义为100%,分别计算在不同pH缓冲液中脂肪酶的活性。

    在酶液中分别加入钴离子 (Co2+)、钾离子 (K+)、锌离子 (Zn2+)、镁离子 (Mg2+)、镍离子 (Ni2+)、锰离子 (Mn2+)、钡离子 (Ba2+)、钠离子 (Na+)、钙离子 (Ca2+)、铜离子 (Cu2+)、铁离子 (Fe3+) 及化学试剂乙二胺四乙酸二钠 (Na2-EDTA),使其终浓度为1和10 mmol·L−1,将其置于37 ℃下保存1 h,进行酶活测定,探究金属离子及化学试剂对脂肪酶Sv-lip5的影响。在酶液中添加表面活性剂 (吐温60、吐温80、司盘20、司盘80、曲拉通X-100),探究表面活性剂对脂肪酶活性的影响。对照组中不添加金属离子或化学试剂,定义其活性为100%,反应体系和反应条件与实验组相同,分别计算添加金属离子及表面活性剂的实验组中脂肪酶活性。

    利用Sv-lip5进行虾青素酯的水解,水解反应体系为2 mg的雨生红球藻 (Haematococcus pluvialis) 油,溶于500 μL的无水乙醇中,超声加速溶解。25 mL的棕色具塞三角瓶作为反应容器,加入500 μL的底物,5 mL的Gly-NaOH缓冲液,加入不同量的酶粉后,充入氮气后密封,将其置于40 ℃水浴摇床中进行反应。

    实验设定pH为4.0~10.0,加酶量设置为80~900 mg,反应时间设置为0~25 h,分析不同pH、乙醇与缓冲液比例、加酶量和反应时间对水解率的影响。

    反应结束后取500 μL反应液,使用体积比为1∶2的异丙醇和二氯甲烷进行萃取,离心去上清,收集有机相并氮吹至近干,后用1∶1的色谱纯甲醇和甲基叔丁基醚1 mL复溶,过0.22 μm有机滤膜收集样品至棕色液相上样瓶中,避光保存待测。通过高效液相色谱 (HPLC) 检测虾青素的生成量。

    HPLC检测所用色谱柱为YMC-Carotenoid-C30 (4.6 mm×250 mm, 5 µm),紫外检测波长为475 nm,流动相为甲基叔丁基醚 (A) 和甲醇 (B),采用线性梯度洗脱的方式[23-24],0~15 min,B为90%;15~25 min,B从90%降至40%;25~35 min,B由40%重新升至90%。流速设置为1 mL·min−1,柱温箱35 ℃,进样量20 μL。

    采用Origin Pro软件进行数据统计和图片处理,数据均为3次平行。

    在杆菌状链霉菌ATCC 27968[25]测序结果中找到脂肪酶Sv-lip5的基因序列,其序列长度为1 014 bp,该蛋白编码了338个氨基酸,预测分子量为34.8 kD、等电点为5.36,对其进行脂肪酶多序列比对 (图1),结果表明Sv-lip5属于脂肪酶第四家族,具有第四家族的特征。

    图  1  Sv-lip5进化树分析
    Figure  1.  Phylogenetic analysis of Sv-lip5

    阳性克隆验证结果见图2-a。验证正确后的菌株在LB培养基中发酵12 h后,收集发酵液进行离心,上清液即为粗酶液。使用镍柱对粗酶进行纯化,用不同浓度的咪唑Tris-HCl缓冲液 (pH 8.0) 进行洗脱,收集各浓度洗脱液,浓缩后利用SDS-PAGE蛋白电泳进行验证,验证结果见图2-b,在0.1 mol·L−1的咪唑浓度下洗脱出了目标蛋白条带,蛋白大小与预测分子量相近,表明蛋白成功纯化。

    图  2  Sv-lip5的核酸电泳结果 (a) 和SDS-PAGE蛋白纯化结果 (b)
    Figure  2.  Nucleic acid electrophoresis results (a) and SDS-PAGE protein purification results (b) of Sv-lip5

    在25~65 ℃测定了Sv-lip5的最适温度和温度稳定性 (图3-a),可以看出Sv-lip5的最适温度为45 ℃,EST4也显示出相同的最适温度,并且可在较宽的温度范围内高效使用,适用于较高温度下的生物技术应用[26]。在25~45 ℃内,酶活逐渐增强至最大值,相对酶活保持在80%以上,之后随着温度的升高酶活逐渐下降,在65 ℃时相对酶活呈现较低状态 (22.3%)。酶的温度稳定性见图3-b,在缓冲液中孵育9 h后,40 ℃时的酶活迅速下降。经孵育42 h后,所有实验组残余酶活均在36.8%以上。

    图  3  Sv-lip5的酶学性质分析
    Figure  3.  Analysis of enzymatic properties of Sv-lip5

    本实验在pH 4.0~10.6内考察了Sv-lip5的最适pH及pH稳定性 (图3-c),表明Sv-lip5在pH为10.0的条件下表现出最佳活性,而在柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中活性普遍较低,最高活性仅23.7%,因此Sv-lip5对底物对硝基苯酚棕榈酸酯的水解活性表现出碱性偏好性。pH会影响酶活性中心基团的解离状态,当酶处于最适pH条件下,其活性基团处于适合与底物结合的解离状态;当其处于高于或低于最适pH的环境时,其活性基团解离状态改变,酶活性相应降低。pH也会影响酶的稳定性,过高或过低的pH会改变酶活性中心的构象,使酶活性降低。Sv-lip5在pH 9.0~10.0内均有较高的酶活,体现出碱性偏好性;但在pH稳定性的测定中,长时间处于pH 10.0的强碱环境中,酶活性有较明显下降,可能pH 10.0的环境对酶活性中心的构象有一定改变 (图3-c3-d)。Est16也被发现是碱性酯酶,其最适pH为8.0~9.0,可在7.0~11.0的宽pH范围内保持活性稳定[27]。当pH高于10.0时,Sv-lip5的相对酶活急速下降,当pH为10.6时残余酶活为50.4%。同时,在pH同为8.0的不同缓冲液条件下,Sv-lip5的酶活也表现出差异性,这种差异性是酶活性测定中的普遍现象[28]。叶凤凌等[29]阐述了pH环境对于植物多酚抑制氧合酶的影响,其中相同pH条件下的硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液以及Tris-HCl缓冲液中酶活性存在较大差别,可能是因为各缓冲液中不同的阴离子种类对酶活性的影响程度不同。

    图3-e的金属离子实验表明,1 mmol·L−1的Ca2+和10 mmol·L−1的Co2+和Ba2+增强了酶活性,在解脂耶氏酵母 (Yarrowia lipolytica) 中克隆表达的脂肪酶YLIP15也表明Ca2+具有增强酶活性的作用,而Mg2+则对YLIP4、YLIP5、YLIP7脂肪酶活性表现出抑制作用[30],与本实验结果一致。10 mmol·L−1浓度下除K+和Ni2+显著降低了酶活性外,其余金属离子都显示出轻微抑制。添加表面活性剂会显著影响Sv-lip5的活性,司盘20、司盘80、吐温60、吐温 80以及曲拉通X-100均对其活性有一定程度的抑制作用 (图3-f),司盘20和吐温60使其活性分别降低了25.7%和55.3%,可能是因为表面活性剂抑制了分子间和分子内的蛋白质相互作用[31]

    本实验结果表明Sv-lip5对虾青素酯具有显著的水解作用,反应前后物质对比见图4-a。反应前22.5~30 min内全部为虾青素酯,经过Sv-lip5作用后,可将其大部分转化为第5.5分钟出峰的游离虾青素。虾青素酯水解反应pH优化反应结果见图4-b。由于Sv-lip5是碱性脂肪酶,在碱性条件下显示出最佳活性且稳定性较好。在pH为9.0的缓冲液中水解反应效果最佳,反应12 h后可产生17.18 μg虾青素,但在其最适pH 10.0的条件下该酶的水解效果反而显著降低,仅产生5.03 μg虾青素,可能是由于该酶在pH 10.0下的稳定性较差,12 h的反应时间导致酶活性降低,虾青素产量也随之减少。碱性脂肪酶Lipase-YH也存在相同现象,其在pH 6.0~7.0内虾青素产量逐渐增加,但在偏碱性 (pH 8.0~9.0) 条件下却逐渐减少[32],可能是碱性环境下虾青素存在一定程度的降解。

    图  4  Sv-lip5在虾青素酯水解反应中的条件优化
    Figure  4.  Optimization of reaction conditions of hydrolysis of astaxanthin ester by Sv-lip5

    乙醇和缓冲液比例对于虾青素酯水解具有一定的影响 (图4-c),当乙醇和缓冲液比为1∶12时,水解效果最佳,可产生27.63 μg虾青素,其余比例下的水解效果均比较微弱,虾青素产量均小于10.98 μg。

    通过调整酶量进行虾青素酯的水解研究 (图4-d),当添加80、160、240 mg脂肪酶时,虾青素的含量波动较小,水解效率较差,最高虾青素产量仅15.68 μg。当加酶量为320 mg时,虾青素产量有微弱的提升,第12小时水解率最高,可获得34.31 μg虾青素。在反应体系中添加400和500 mg酶粉时,水解效果有明显的转变。向反应体系中添加500 mg酶粉,第1小时的虾青素产量就可达87.95 μg,水解前后对比结果 (图4-a) 显示,反应完全时可以得到138.27 μg的虾青素,水解率为95.13%。Gao等[22]克隆表达的OUC-Sb-lip12也可用于虾青素酯的水解,在第12小时水解率达96.29%,通过优化时间与加酶量,本研究中Sv-lip5在12 h内水解率可达98.27%,200 μg虾青素酯中游离虾青素产量为147.48 μg,高于Gao等[22]报道的OUC-Sb-lip12水解游离虾青素产量,可能是由于反应过程中虾红素等副产物产生较少。经测定,Sv-lip5的比酶活为12.46 U·g−1,当酶添加量增加至一定程度后,其可高效水解虾青素酯。后续可以通过优化培养基成分与酶表达体系效率,进一步降低酶制备成本,保障虾青素酯的低成本高效水解;同时,可通过固定化[33-34]等方式提高Sv-lip5的回收利用率,进一步降低游离虾青素的制备成本。此外,Huang等[32]通过优化发酵pH、培养基配方以及甲醇浓度提高酶活性,使其适合大规模生产虾青素,旨在开发新型高效的酶工艺以减少成本消耗。本实验也可通过进一步水解体系优化等手段逐步完善虾青素酯水解反应,弥补光、热以及氮气充入不均一性对虾青素的部分降解。

    当酶量添加量较多时,酶粉与底物充分接触,1 h内就可达到较高的水解率,随着时间的延长,虾青素酯仍可继续降解,但后续降解速率逐渐变缓。当酶量添加较少时,虾青素的水解受到极大限制,在第12或第15小时可达到最大水解率,随着时间的延长,生成的虾青素也会受到环境因素的影响部分分解,19 h后部分曲线有下降趋势 (图4-d)。因此加酶量和时间对虾青素酯的水解相互影响。只有当加酶量到达一定限度时,水解反应才能以较高速率进行,且加酶量的增长可加速水解进程。

    本研究克隆表达了来自浅紫色链霉菌的脂肪酶Sv-lip5,该酶的蛋白分子量约34.8 kD,比活力为12.46 U·g−1,在45 ℃、pH为10.0的条件下显示出最佳酶活力,可用于虾青素酯的水解,水解产物为游离虾青素。该酶可耐碱性环境,从而避免了反应过程中杂菌的生长,通过优化反应条件得出,当乙醇与缓冲液体积比为1∶12、反应pH为9.0、加酶量为900 mg、在40 ℃下反应12 h,200 μg虾青素酯最终可收获147.48 μg游离虾青素。

  • 图  1   5盐度组胁迫金钱鱼鳃的显微结构图

    a. 5盐度组3 h鳃丝整体图;b. 5盐度组3 h鳃丝部分放大图;c. 5盐度组6 h鳃丝部分放大图;d. 5盐度组12 h鳃丝部分放大图;e. 5盐度组24 h鳃丝部分放大图;f. 对照组 (20盐度) 鳃丝; g. 5盐度组96 h鳃丝部分放大图;MRCs. 线粒体丰富细胞;MC. 黏液细胞;BC. 血细胞;GL. 表示次级鳃小片直径;pl. 初级鳃小片;sl. 次级鳃小片;ecm. 在细胞外软骨质中;后图同此

    Figure  1.   Microscopic structure of S. argus gills at salinity of 5

    a. Whole picture of gill filament at salinity of 5 and at 3rd hour; b. Enlarged view of gill filament at salinity of 5 and at 3rd hour ; c. Enlarged view of gill filament at salinity of 5 and at 6th hour; d. Enlarged view of gill filament at salinity of 5 and at 12th hour; e. Enlarged view of gill filament at salinity of 5 and at 24th hour; f. Gill filament at salinity of 20 (Control group); g. Enlarged view of gill filament at salinity of 5 and at 96th hour; MRCs. Mitochondrion-rich cells; MC. Mucus cell; BC. Blood cell; GL. Secondary gill lamella diameter; pl. Primary gill lamella; sl. Secondary gill lamella; ecm. In extracellular cartilaginous bone. The same below.

    图  2   35盐度组胁迫金钱鱼鳃的显微结构图

    a. 35盐度组3 h鳃丝部分放大图;b. 35盐度组6 h鳃丝部分放大图;c. 35盐度组12 h鳃丝部分放大图;d. 35盐度组24 h鳃丝部分放大图;e. 35盐度组96 h鳃丝部分放大图;f. 对照组 (20盐度) 鳃丝部分放大图

    Figure  2.   Microscopic structure of S. argus gills at salinity of 35

    a. Enlarged view of gill filament at salinity of 35 and at 3rd hour; b. Enlarged view of gill filament at salinity of 35 and at 6th hour; c. Enlarged view of gill filament at salinity of 35 and at 12th hour; d. Enlarged view of gill filament at salinity of 35 and at 24th hour; e. Enlarged view of gill filament at salinity of 35 and at 96th hour; f. Control group, enlarged view of gill filament at salinity of 20

    图  3   5盐度组胁迫对金钱鱼鳃超微结构的影响

    a. 5盐度组3 h后鳃小片的超微结构; b. 5盐度组3 h后鳃的线粒体丰富细胞超微结构图,示Ⅰ型线粒体丰富细胞;c. 5盐度组6 h后鳃的线粒体丰富细胞超微结构图;d. 5盐度组12 h后鳃的线粒体丰富细胞超微结构图;e. 5盐度组24 h后鳃的线粒体丰富细胞超微结构图;f. 5盐度组48 h后鳃的线粒体丰富细胞超微结构图;g. 5盐度组96 h后鳃的线粒体丰富细胞超微结构图,示Ⅱ型线粒体丰富细胞结构;Ao. 顶端开口;Ap. 顶端小窝;MRCs. 线粒体丰富细胞;M. 线粒体;M1. a型线粒体;M2. b型线粒体;N. 细胞核;tn. 管网结构;lv. 光泡;JC. 紧密连接;N1. 形成色素的细胞核;h. 示a型线粒体;i. 对照组(20盐度组) 鳃超微结构整体图;Ts. 微细小管系统;后图同此

    Figure  3.   Effects of salinity 5 stress on ultrastructure of gill of S. argus

    a. Ultrastructure structure of gill lamella at salinity of 5 and at 3rd hour; b. Ultrastructure structure of MRCs of gill lamella at salinity of 5 and at 3rd hour, showing Type I mitochondrionrich cells; c. Ultrastructure structure of MRCs of gill lamella at salinity of 5 and a 6th hour; d. Ultrastructure structure of MRCs of gill lamella at salinity of 5 and at 12th hour; e. Ultrastructure structure of MRCs of gill lamella at salinity of 5 and at 24th hour; f. Ultrastructure structure of MRCs of gill lamella at salinity of 5 and at 48th hour; g. Ultrastructure structure of MRCs of gill lamella at salinity of 5 and at 96th hour, showing Type II mitochondrion-rich cells; Ao. Apical opening; Ap. Apical crypt; MRCs. Mitochondrion-rich cells; M1. Type a Mitochondrion; M2. Type b mitochondrion; N. Nucleus; tn. Tubular network; lv. Light vesicles; JC. Junctional complex; N1. Chromogenic nucleus; h. Showing Type a mitochondrion; i. Control group (salinity of 20), whole picture of gill ultrastructure; Ts. Microtubule system; the same below.

    图  4   35盐度组盐度骤降胁迫对金钱鱼幼鱼鳃超微结构的影响

    a. 35盐度组3 h后鳃的线粒体丰富细胞超微结构图;b. 35盐度组3 h后鳃的线粒体丰富细胞超微结构图放大图;c. 35盐度组6 h后鳃的线粒体丰富细胞超微结构图;d. 35盐度组12 h后鳃的线粒体丰富细胞超微结构图;e. 35盐度组24 h后鳃的线粒体丰富细胞超微结构图;f. 35盐度组48 h后鳃的线粒体丰富细胞超微结构图;g. 35盐度组96 h后鳃的线粒体丰富细胞超微结构图;h. 对照组 (20盐度) 鳃超微结构图;i. 对照组 (20盐度) 鳃超微结构整体图

    Figure  4.   Effects of salinity 35 stress on ultrastructure of gill of S. argus

    a. Ultrastructure structure of gill lamella at salinity of 35 and at 3rd hour; b. Enlarged view of ultrastructure structure of MRCs of gill lamella at salinity of 35 and at 3rd hour; c. Ultrastructure structure of MRCs of gill lamella at salinity of 35 and a 6th hour; d. Ultrastructure structure of MRCs ofgill lamella at salinity of 35 and at 12th hour; e. Ultrastructure structure of MRCs of gill lamella at salinity of 35 and at 24th hour; f. Ultrastructure structure of MRCs of gill lamella at salinity of 35 and at 48th hour; g. Ultrastructure structure of MRCs of gill lamella at salinity of 35 and at 96th hour; h. Control group (salinity of 20), ultrastructure structure of gill lamella; i. Control group (salinity of 20), whole picture of gill ultrastructure

    表  1   不同盐度下金钱鱼鳃线粒体丰富细胞长径、短径变化

    Table  1   Changes of long and short diameters of MRCs in S. argus gill at different salinities

    时间
    t/h
    长径 Long diameter/μm 短径 Short diameter/μm
    20 (对照组)
    20 (Control group)
    5盐度组
    5 salinity group
    35盐度组
    35 salinity group
    20 (对照组)
    20 (Control group)
    5盐度组
    5 salinity group
    35盐度组
    35 salinity group
    3 7.317±0.986b 9.517±1.390c 6.933±0.831b 5.067±0.467b 7.150±1.448c 4.367±0.344ab
    6 8.033±0.873b 7.400±1.0.17b 4.783±1.020b 5.133±0.880b
    12 6.333±1.336b 6.267±0.723a 4.750±0.747b 3.850±0.638a
    24 6.567±0.582a 7.967±0.647b 4.433±0.723a 5.133±0.859b
    48 5.933±1.96a 6.917±1.187ab 4.017±0.360a 4.650±0.766ab
    96 7.650±0.403a 7.167±0.508ab 5.333±0.582a 5.967±0.588c
    注:表格中同一列参数后面有一个字母相同则无显著差异 (Duncan's法,P>0.05),反之,则差异显著 (P<0.05);后表同此 Note: If there is a same letter after the same column of numbers in the table, there is no significant difference (Duncan's, P>0.05); otherwise, the difference is significant (P<0.05). The same case in the following table.
    下载: 导出CSV

    表  2   不同盐度下金钱鱼次级鳃小片直径的变化

    Table  2   Changes in diameter of secondary gill lamella of of S. argus at different salinities

    时间
    t/h
    20 (对照组)
    20 (Control group)
    5盐度组
    5 salinity group
    35盐度组
    35 salinity group
    310.567±1.217b12.783±1.603c21.333±2.510c
    68.317±1.312a10.750±2.157b
    128.933±2.554ab6.050±0.967a
    247.867±0.512a8.867±0.950b
    488.383±1.147a10.667±1.922b
    967.950±2.000a10.717±0.682b
    下载: 导出CSV
  • [1] 王刚, 李加儿, 区又君, 等. 温度、盐度、pH对卵形鲳鲹幼鱼离体鳃组织耗氧量的影响[J]. 南方水产科学, 2011, 7(5): 37-42. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2011.05.006
    [2] 强俊, 王辉, 李瑞伟, 等. 盐度对奥尼罗非鱼仔、稚鱼生长、存活及其消化酶活力的影响[J]. 南方水产, 2009, 5(5): 8-14.
    [3]

    BRADFORD Y, CONLIN T, DUNN N, et al. Enhancements and updates to the Zebrafish Model Organism Database[J]. Nucleic Acids Res, 2011, 39: 822-829. doi: 10.1093/nar/gkq1077

    [4]

    KANEKO T, WATANABE S, LEE K M. Functional morphology of mitochondrion-rich cells in euryhaline and stenohaline teleosts[J]. Aqua-BioScience Monographs, 2008, 1(1): 1-62.

    [5]

    WANG H P, LEE T. New insights into fish ion regulation and mitochondrion-rich cells[J]. Comp Biochem Physiol A, 2007, 148(3): 479-497. doi: 10.1016/j.cbpa.2007.06.416

    [6]

    WATSON C J, NORDI W M, ESBAUGH A J. Osmoregulation and branchial plasticity after acute freshwater transfer in red drum, Sciaenops ocellatus[J]. Comp Biochem Physiol A, 2014, 178: 82-89.

    [7] 兰国宝, 阎冰, 廖思明, 等. 金钱鱼生物学研究及回顾[J]. 水产科学, 2005, 24(7): 39-41. doi: 10.3969/j.issn.1003-1111.2005.07.013
    [8] 王妹, 邓思平, 陈华谱, 等. 金钱鱼 Amhr2基因的克隆及表达分析[J]. 广东海洋大学学报, 2018, 38(3): 17-24. doi: 10.3969/j.issn.1673-9159.2018.03.003
    [9] 梁雪梅. 催乳素在金钱鱼盐度适应过程中的机理研究[D]. 上海: 上海海洋大学, 2018: 31-59.
    [10] 仲勇. 盐度影响金钱鱼生长及渗透相关基因的表达[D]. 上海: 上海海洋大学, 2019: 31-59.
    [11] 刘永士, 徐嘉波, 施永海, 等. 盐度对金钱鱼幼鱼消化酶和抗氧化酶活性的影响[J]. 水产科技情报, 2020, 47(4): 181-185.
    [12] 林浩然. 鱼类生理学[M]. 广州: 中山大学出版社. 2011: 205-221.
    [13] 区又君, 李加儿, 谢菁, 等. 鲻早期发育阶段鳃的超微结构及其呼吸表面积的研究[J]. 南方水产科学, 2014, 10(4): 52-57. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2014.04.009
    [14] 李霞. 水产动物组织胚胎学[M]. 北京: 中国农业出版社, 2005: 118-121.
    [15]

    SINHA A K, MATEY V, GIBLEN T, et al. Gill remodeling in three freshwater teleosts in response to high environmental ammonia[J]. Aquat Toxicol, 2014, 155: 166-180. doi: 10.1016/j.aquatox.2014.06.018

    [16] 区又君, 林先智, 李加儿, 等. 遮目鱼幼鱼鳃线粒体丰富细胞的形态结构及其在不同盐度下的变化[J]. 中国细胞生物学学报, 2014, 36(12): 1622-1629.
    [17] 宋郁. 金钱鱼渗透压调节机理及其它相关研究[D]. 上海: 上海海洋大学, 2012: 17-18.
    [18] 吴勇, 施钢, 谢又兴, 等. 急性盐度胁迫对细鳞鱼刺幼鱼存活及摄饵的影响[J]. 渔业研究, 2020, 42(4): 348-355.
    [19] 王信海, 蔺玉华, 姜秋俚, 等. 盐度对咸海卡拉白鱼生长及组织学特征的影响[J]. 中国水产科学, 2008, 15(5): 808-815. doi: 10.3321/j.issn:1005-8737.2008.05.013
    [20] 党云飞, 徐伟, 耿龙武, 等. NaCl盐度和NaHCO3碱度对大鳞鲃幼鱼生长及鳃组织特征的影响[J]. 中国水产科学, 2013, 20(3): 577-584.
    [21]

    IURI S A, ANNIA A B, INDIANARA F B, et al. Salinity influence on growth, osmoregulation and energy turnover in juvenile pompano Trachinotus marginatus Cuvier 1832[J]. Aquaculture, 2016, 455: 63-72. doi: 10.1016/j.aquaculture.2016.01.010

    [22] 李佳佳. 暗纹东方鲀早期发育阶段渗透压调节能力的研究[D]. 南京: 南京师范大学, 2008: 41-49.
    [23] 吴贝贝. 长江口中华鲟幼鱼鳃氯细胞的形态结构及盐度适应性变化[D]. 上海: 上海海洋大学, 2014: 26-29.
    [24]

    KANG C K, YANG W K, LIN S T, et al. The acute and regulatory phases of time-course changes in gill mitochondrion-rich cells of seawater-acclimated medaka (Oryzias dancena) when exposed to hypoosmotic environments[J]. Comp Biochem Physiol A, 2013, 164(1): 181-191. doi: 10.1016/j.cbpa.2012.08.010

    [25]

    SEO M Y, MEKUCHI M, TERANISHI K, et al. Expression of ion transporters in gill mitochondrion-rich cells in Japanese eel acclimated to a wide range of environmental salinity[J]. Comp Biochem Physiol A, 2013, 166(2): 323-332. doi: 10.1016/j.cbpa.2013.07.004

    [26]

    INOKUCHI M, HIROI J, WATANABE S, et al. Gene expression and morphological localization of NHE3, NCC and NKCC1a in branchial mitochondria-rich cells of Mozambique tilapia (Oreochromis mossambicus) acclimated to a wide range of salinities[J]. Comp Biochem Physiol A, 2008, 151(2): 151-158. doi: 10.1016/j.cbpa.2008.06.012

    [27]

    CHIO J H, LEE K M, INOKUCHI M, et al. Morphofunctional modifications in gill mitochondria-rich cells of Mozambique tilapia transferred from freshwater to 70% seawater, detected by dual observations of whole-mount immunocytochemistry and scanning electron microscopy[J]. Comp Biochem Physiol A, 2011, 158(1): 132-142. doi: 10.1016/j.cbpa.2010.09.019

    [28] 王雯, 温久福, 区又君, 等. 急性淡水胁迫对斜带石斑鱼幼鱼鳃线粒体丰富细胞形态结构的影响[J]. 应用海洋学学报, 2016, 35(4): 546-549.
    [29] 魏渲辉, 汝少国, 徐路, 等. 海水和淡水适应过程中广盐性鱼类鳃氯细胞的形态与功能变化及其激素调节[J]. 海洋科学, 2001, 25(4): 16-20. doi: 10.3969/j.issn.1000-3096.2001.04.006
    [30] 温久福, 蓝军南, 曹明, 等. 盐度对花鲈幼鱼花鲈幼鱼鳃、脾及肌肉组织结构的影响[J]. 渔业科学进展, 2020, 41(1): 112-118.
  • 期刊类型引用(14)

    1. 李培玉,王美琪,宋志东,胡顺鑫,刘财礼,李璐,刘经未,陆国峰. 牛磺酸对幼刺参生长、抗氧化和代谢酶活性的影响. 广东海洋大学学报. 2024(01): 9-19 . 百度学术
    2. 徐创文,蒋魁,虞为,林黑着,王鹏飞,赵超,刘曦瑶,杨铿. 丁酸梭菌对花鲈幼鱼生长性能、免疫消化及肠道菌群的影响. 南方农业学报. 2024(02): 366-377 . 百度学术
    3. 庄杰贵,牛军锋,黄小林. 海生物杀生剂对花鲈幼鱼的急性毒性试验. 河北渔业. 2024(06): 5-7+46 . 百度学术
    4. 黄嘉,冉旭东,刘欣平,胡伟,唐仁军,郑娟,陈拥军,何远法,林仕梅. 胆汁酸和牛磺酸对大口黑鲈生长、肝脏健康及肠道屏障的影响. 水产学报. 2024(09): 38-48 . 百度学术
    5. 李淑怡,冀晓雨,邵天娇,白莹. 牛磺酸在水产养殖中的应用研究进展. 饲料研究. 2024(18): 173-177 . 百度学术
    6. 米红波,鹿悦,陈敬鑫,李学鹏,励建荣. 牛磺酸和谷氨酰胺对石斑鱼的应激缓解作用. 水产科学. 2024(06): 865-874 . 百度学术
    7. 许长峰,王海丽. 胆汁酸生物学功能及其在水产养殖中的应用前景. 饲料研究. 2023(04): 152-155 . 百度学术
    8. 谢璐霞. 牛磺酸对猪抗氧化功能的影响. 国外畜牧学(猪与禽). 2023(05): 37-39 . 百度学术
    9. 鲍俊杰,王永杰,陈红莲,孙雯,张静,周蓓蓓. 基于非靶向代谢组学分析两种日粮模式下克氏原螯虾肌肉的代谢差异. 南方水产科学. 2023(05): 104-112 . 本站查看
    10. 张建明,张德志,舒德斌,田甜,饶军,苏巍. 4种中药复方对长江鲟幼鱼抗氧化和抗应激指标的影响. 南方农业学报. 2022(02): 568-576 . 百度学术
    11. YING Ziwei,BAO Yuyuan,LI Yinkang,YE Guoling,ZHANG Shuhuan,XU Peng,ZHU Junhua,XIE Xiaoyong. Impact of Different Diets on Adult Tri-Spine Horseshoe Crab, Tachypleus tridentatus. Journal of Ocean University of China. 2022(03): 541-548 . 必应学术
    12. 黄健彬,迟艳,周传朋,黄小林,黄忠,虞为,荀鹏伟,吴杨,张宇,林黑着. 褐藻寡糖对卵形鲳鲹幼鱼生长性能、抗氧化能力和免疫功能的影响. 南方水产科学. 2022(03): 118-128 . 本站查看
    13. 虞为,陈雪晴,杨育凯,张燕娃,黄小林,黄忠,李涛,马振华,吴洽儿,于刚,周传朋,林黑着. 饲料中添加雨生红球藻对尖吻鲈生长性能、抗氧化能力及免疫状态的影响. 南方水产科学. 2022(05): 46-54 . 本站查看
    14. 贾慧凝,侍苗苗,卞永乐,侍崇敬,刘恒蔚,宋学宏,秦粉菊. 纳米硒对低氧胁迫下中华绒螯蟹免疫保护和抗氧化能力的影响. 南方水产科学. 2022(06): 100-109 . 本站查看

    其他类型引用(13)

图(4)  /  表(2)
计量
  • 文章访问数: 
  • HTML全文浏览量: 
  • PDF下载量: 
  • 被引次数: 27
出版历程
  • 收稿日期:  2020-10-14
  • 修回日期:  2020-11-14
  • 网络出版日期:  2020-12-13
  • 刊出日期:  2021-04-04

目录

/

返回文章
返回