Cloning and expression analysis of FMRFamide gene in Onchidium reevesii and inflammatory stimulaton on its gene expression
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摘要: 该文研究了瘤背石磺 (Onchidium reevesii) 在炎症刺激后体内FMRFamide基因的表达水平变化，以及FMRFamide多肽保持其自身稳态的分子机制。以瘤背石磺转录组中FMRFamide基因片段为基础，通过RACE (Rapid-amplification of cDNA ends) 技术克隆得到该基因cDNA的全长为2 618 bp，开放阅读框 (Open reading frame, ORF) 为882 bp，编码293个氨基酸，系统进化树显示该基因与静水椎实螺 (Lymnaea stagnalis) FMRFamide基因的亲缘关系最近，这和传统形态学分类相吻合。实时荧光定量结果显示FMRFamide基因在瘤背石磺的不同组织中均有表达，但在神经节部位的相对表达量极显著高于皮肤、腹足、肝胰腺、血细胞、性腺和肌肉组织 (P<0.01)。免疫组织化学验证了FMRFamide多肽在组织中与mRNA分布的一致性。炎症刺激实验结果表明，注射脂多糖 (LPS) 后，实验组神经节、肝胰腺、血细胞和皮肤中FMRFamide基因的mRNA表达水平显著高于对照组 (P<0.05)，且在刺激后第12小时相对表达量达到最高。综上，瘤背石磺FMRFamide主要存在于神经节中，通过神经内分泌系统参与肌体的免疫调节，对炎症刺激下的瘤背石磺保持体内稳态具有重大作用。Abstract: In this study, we investigated the expression of FMRFamide in vivo of Onchidium reevesii after inflammatory stimulus, and the molecular mechanism of FMRFamide polypeptide maintaining homeostasis. Based on a fragment of FMRFamide gene from the transcriptome of O. reevesii, we obtained the full-length cDNA of FMRFamide gene as 2 618 bp by RACE (Rapid-amplification of cDNA ends), including an open reading frame (ORF, 882 bp) which encoded a total of 293 amino acids. The results of the phylogenetic tree suggest that the FMRFamide gene of O. reevesii was most closely related to that of Lymnaea stagnalis, which is consistent with traditional morphological classification. The qRT-PCR results indicate that FMRFamide mRNA was distributed in different tissues of O. reevesii, but the expression in ganglion was very significantly higher than that in skin, hemocyte, hepatopancreas, muscle, gonad and pleopod (P<0.01). Immunohistochemistry verified the consistency of the FMRFamide peptide with mRNA distribution in tissues. The inflammatory stimulation experiment shows that the mRNA expression levels of FMRFamide gene in ganglia, hepatopancreas, hemocyte and skin were significantly higher in the experimental group than in the control group after lipopolysaccharide (LPS) injection (P<0.05), reaching the maximum value at 12th hour after stimulation. In conclusion, O. reevesii FMRFamide is mainly found in ganglia and is involved in collective immune regulation through neuroendocrine system, playing a significant role in maintaining the stability of tumefaciens in vivo under inflammatory stimuli.
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Keywords:
- Onchidium reevesii /
- FMRFamide /
- Genetic cloning /
- Inflammatory stimulus
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罗非鱼 (Oreochromis mossambicus) 又称“白肉三文鱼” “21世纪之鱼” ，富含多种多不饱和脂肪酸和8种人体必需氨基酸，是一种适宜产业化、规模化加工的经济且优质的动物营养蛋白来源[1-2]。中国是全球最大的罗非鱼养殖产地，拥有完善的产业链和庞大的产业规模，2022年罗非鱼养殖产量高达173.89万t，同比增长4.59%[3]，产业发展空间广阔。罗非鱼一直是中国水产品对外出口的重要经济收入来源，但主要为冻全鱼、冻鱼片等初加工冷冻品，冰鲜、深加工产品和副产品开发利用较少[4]。近两年，水产品预制菜凭借良好的营养功能特性和加工适性深受消费者喜爱，市场规模增长态势显著[5]。罗非鱼口感鲜美、肌间刺少，适宜作为制备酸菜鱼和水煮鱼预制菜的原料，然而其肉质粗糙，在复热过程中易出现结构松散、严重脱浆等问题。因此，有必要优化冷冻罗非鱼片的挂浆工艺，控制其在复热过程中的品质稳定性，从而提升加工价值。
挂浆是肉制品加工中优化原料品质的重要方法，不仅可以改善原材料的质构特性和营养特性，还可增强食品风味，赋予其独特口感[6]。常见的挂浆原料包括蛋液、淀粉、食盐等，挂浆类肉制品的食用品质受到原料种类、浆液组成及烹饪方式等的影响。殷方玉等[7]对水滑肉挂糊成分的研究显示，当蛋清、水、食盐的添加质量分数分别为68%、50%、1.5%时，挂糊效果最好。赵钜阳等[8]通过调整预油炸虾肉的上浆配料，发现淀粉、水、蛋液和食盐添加量分别为虾肉质量的9%、9%、9%和1.7%时，虾肉半成品展现出的品质特性最佳。为了有效降低终产品的含油量和改善其品质，小麦分离蛋白[9-10]、大豆分离蛋白[9-11]、小麦面筋蛋白[12]、葛根粉[13]、多糖亲水胶体[14]、膳食纤维[15]等也成为新型挂浆原料被添加到各类挂浆肉制品中。此外，有研究显示，浆液中添加淀粉[16]或抗性淀粉可以提高挂浆油炸肉制品的脆度，不同种类和添加比例的淀粉会显著影响产品的食用品质。Sanz等[17]研究发现，在油炸鱿鱼圈中添加抗性淀粉后，其挂浆效果显著提升，使其硬度和酥脆性增强；Zhang等[18]研究表明，相较于豌豆淀粉和木薯淀粉，添加绿豆淀粉更能提高样品的色泽和脆性，降低吸油率；翟金玲等[19]研究发现，当油炸鱼块的裹糊配方中面粉和玉米淀粉以3∶2质量比添加时，其品质特性 (包括感官、色泽和油脂分布等) 较佳。
目前，关于挂浆类肉制品的研究主要集中在上浆配料的优化、降低吸油率、外壳增脆、内芯保水等方面，然而这些研究大多围绕油炸类挂浆肉制品展开，关于水煮类挂浆肉制品则鲜有报道，有关挂浆罗非鱼片工艺的研究尚为空白。因此，本研究以新鲜罗非鱼片为原材料，通过考察淀粉 (红薯淀粉和玉米淀粉的质量比为1∶1)、蛋清粉、花生油和腌制时间这4个因素对鱼片挂浆效果的影响，利用响应面分析优化，并进一步分析挂浆对蛋白质稳定性的影响，旨在提升罗非鱼片的品质，为酸菜罗非鱼片预制菜的生产提供可行性数据支持和理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜罗非鱼：广州市花都区 [(800±200) g∙尾−1]，总计32尾；姜：广州市朴朴超市；盐、糖、鸡精、料酒、玉米淀粉、红薯淀粉、白胡椒粉、花生油：广州市华润万家超市；蛋清粉：盛达食品添加剂有限公司；碳酸氢钠(NaHCO3)、大豆分离蛋白：哈尔滨市香坊区正通实验用品经销部；木薯淀粉：崇左市群力淀粉有限责任公司；魔芋葡甘露聚糖：湖北强森魔芋科技有限公司；耐高温蒸煮袋：河北稳一电子商务有限公司；自封袋：上海昌煜生化科技有限公司 (以上材料均为食品级)；其他常规试剂均为分析纯级别。
1.2 仪器与设备
电热恒温水浴锅 (HWS24，上海一恒科学仪器有限公司)；质构仪 (QTS-25，CNS FARNEL有限公司，英国)；吸光酶标仪 (Sunrise-basic Tacan，TECAN公司，瑞士)；红外光谱仪 (Affinity-1，岛津公司，日本)；其他仪器均为实验室常规设备。
1.3 样品制备
1.3.1 工艺流程
挂浆罗非鱼片制作工艺流程见图1。
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图 1 挂浆罗非鱼片制作工艺流程图Figure 1. Production process flow chart of tilapia fillets with hanging pulp1.3.2 关键操作要点
1)切片、去腥：顺着鱼肉纹理切片 (6 cm×5 cm×0.4 cm)，姜 (6%, w) 腌制20 min。
2)浸泡液浸泡：为改善鱼片保水性和抗冻性，按1∶3 将鱼片 (g) 加入浸泡液 (mL)（碳酸氢钠∶魔芋葡甘露聚糖∶大豆分离蛋白∶木薯淀粉=23∶4.5∶41∶28，质量比），4 ℃浸泡1 h [20]。
3)调味、挂浆：先向鱼片中加入盐0.8% (w)，白砂糖0.6% (w)，白胡椒粉 (w)、鸡精0.4% (w)，料酒3% (φ)，再加入适量蛋清粉、淀粉 (玉米淀粉与红薯淀粉的质量比为1∶1) 与6% (φ) 的纯净水混合均匀，最后加入适量花生油，装袋、排气、密封 (本研究中添加量比例均以鱼片质量计)。
4)腌制、冻藏：4 ℃腌制一段时间，−80 ℃冰箱速冻5 h以减少冰晶对鱼片组织结构的破坏，更好地保持其质量和新鲜度，最后转移至 −18 ℃冰箱冻藏。
1.4 单因素试验设计
在预实验基础上，选择淀粉 [m (玉米淀粉)∶m (红薯淀粉)=1∶1)] 添加量、蛋清粉添加量、花生油添加量和腌制时间4个因素设计试验，挂浆因素设计水平为淀粉和蛋清粉添加量0%、2%、4%、6%、8%，花生油添加量0%、0.5%、1%、1.5%、2%、4%、6%、8%，腌制时间0、15、30、45、60 min，当任一因素参数变化时，其余因素设定为淀粉、蛋清粉和花生油添加量4%，腌制时间30 min。冻藏7 d后室温下解冻90 min，对鱼片的质构特性、蒸煮损失率和汤汁浑浊度进行测定。
1.5 响应面试验设计
综合挂浆罗非鱼片的单因素试验结果设计四因素三水平 (−1、0、1) 试验，控制淀粉添加量、蛋清粉添加量、花生油添加量、腌制时间范围分别为2%~6%、2%~6%、1%~2%、0~30 min。选取质构及汤汁浑浊度的加权平均值作为响应值，优化提高冷冻挂浆罗非鱼片品质稳定性的工艺参数。各指标加权评分计算方法为[20-21]：
$$ {Y}{{\mathrm{=}}10}{ \times }{y}_{1}{\mathrm{+}}{10}{ \times }{y}_{2}{\mathrm{=}}{10}{ \times }\left(\frac{{x}}{{x}_{{\mathrm{a}}}}\right){\mathrm{+}}{10}{ \times }\left(\frac{{x}_{{\mathrm{b}}}}{{x}}\right){} $$ (1) 式中：Y表示综合加权得分；y1表示质构(硬度)得分；y2表示汤汁浑浊度得分；x表示测试值；xa表示测试最大值；xb表示测试最小值。
1.6 蒸煮损失率测定
鱼片100 ℃煮制2 min后，准确记录蒸煮前后鱼片的质量，蒸煮损失率按式(2)计算：
$$ 蒸煮损失率{\mathrm{=}} \frac{\mathrm{样}\mathrm{品}\mathrm{原}\mathrm{质}\mathrm{量}{\text{−}}\mathrm{蒸}\mathrm{煮}\mathrm{后}\mathrm{质}\mathrm{量}}{\mathrm{样}\mathrm{品}\mathrm{原}\mathrm{质}\mathrm{量}} \times 100{\text{%}}$$ (2) 1.7 质构测定
参考熊雅雯等[20]的方法并略作修改 (下压距离：3 mm)。每组鱼片100 ℃煮制2 min后拭干水分，切成长方体小块 (4 cm×3 cm×4 mm)，质构仪平行测定3次，取6个点的均值 (图2)。
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图 2 挂浆罗非鱼片质构测试点示意图Figure 2. Schematic diagram of texture test point of tilapia fillets1.8 汤汁浑浊度测定
参考曲佳明[22]的方法，按鱼肉 (g) 和水 (mL) 1∶4的质量体积比，于100 ℃煮制3 min，取2 mL汤汁稀释10倍并混匀，酶标仪 (波长640 nm) 测定，汤汁浑浊度结果用OD值表示。
1.9 感官评价
选取10名经过一定感官分析培训的同学对煮制后的罗非鱼片进行评价，评定过程互不干扰，综合评分取均值。感官评定标准见表1。
表 1 感官评定标准Table 1. Sensory evaluation criteria评分指标
Scoring index评分标准
Scoring criterion分值
Score色泽
Colour鱼片表面及切面有光泽，淡淡黄色 15~20 鱼片表面及切面稍有光泽，有些许黄色 10~15 鱼片表面及切面黯淡无光泽， 黄色明显 1~10 外观
Appearance鱼片组织致密光滑，纹理清晰，无裂缝，形态完整 15~20 鱼片组织局部松散，纹理较清晰，有些许裂缝，形态基本完整 10~15 鱼片组织过于松散，纹理模糊，裂缝较多，无完整形态 1~10 香气
Fragrance有清新的鱼鲜味，无异味 15~20 有淡淡鱼腥味，无明显异味 10~15 鱼腥味较重 1~10 口感
Taste鱼片肉质细嫩爽滑，咀嚼性好，适口性好 15~20 鱼片肉质较细嫩爽滑，咀嚼性一般，适口性一般 10~15 鱼片肉质干涩，咀嚼性差，适口性差 1~10 可接受度
Acceptability可接受度较高 15~20 可接受度一般 10~15 不可接受 1~10 1.10 肌原纤维蛋白 (MP) 二级结构相对含量的测定
参考 Pazos等[23]的方法提取MP。煮制后的样品切碎，每组准确称取2 g置于50 mL离心管中，加入10 mL Tris-HCl缓冲液 (含10 mmol·L−1 Tris-HCl和5 mmol·L−1 PMSF，pH 7.2，4 ℃)，冰浴条件下12 000 r·min −1均质2 min，所得匀浆在4 ℃、10 000 r·min −1离心20 min后弃上清液，于沉淀中加入20 mL盐溶液 (含0.6 mol·L−1 NaCl、10 mmol·L−1 Tris-HCl缓冲液、5 mmol·L−1 PMSF，pH 7.2，4 ℃) 均质混匀，冰浴静置30 min后在4 ℃、10 000 r·min −1离心20 min，所得上清液即为肌原纤维蛋白溶液。参考李锐等[24]的方法利用傅里叶红外光谱测定结构并运用PeakFit v4.12软件计算其含量。
1.11 微观结构观察
参考熊雅雯等[20]的方法并稍作修改。煮制后的样品切成2 cm×2 cm×4 mm的小块固定24 h，0.1 mol·L−1 PBS缓冲液、蒸馏水各冲洗5 min，不同梯度体积分数乙醇 (30%、50%、70%、80%、90%、100%) 分别浸泡40 min，冷冻干燥48 h后喷金，台式场发射扫描电子显微镜 (Su8020) 放大100倍观察。
1.12 数据分析
利用Origin 2021、Rstudio 4.3.1和Design-Expert 13软件进行实验数据处理、作图和分析。
2. 结果与分析
2.1 挂浆罗非鱼片在不同淀粉添加量下煮制品质的变化
图3显示，随着淀粉添加量的增加，煮制后挂浆罗非鱼片的汤汁浑浊度先上升后下降再上升，蒸煮损失率显著下降 (p<0.05)。当淀粉添加量为8%时，挂浆罗非鱼片的蒸煮损失率最低 (7.1%)，汤汁浑浊度最高 (0.182)，可能是因为糊化变性的淀粉和变性蛋清中的卵白蛋白、卵类黏蛋白包裹在鱼片周围，形成一层具有良好保水性与密封性的保护膜，有效延缓了肌肉蛋白变性的速度和水分流失的时间，降低了蒸煮损失[25]，但挂浆鱼片表面大量结块、脱落和溶解的淀粉胶体导致汤汁浑浊度增加。
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图 3 不同淀粉添加量下挂浆罗非鱼片汤汁浑浊度和蒸煮损失率的变化注：相同指标的不同小写字母表示差异显著 (p<0.05)。Figure 3. Changes of turbidity of the soup and cooking loss rate of tilapia fillets under different starch additionsNote: Different lowercase letters for the same indicator represent significant differences (p<0.05).图4显示，添加适量淀粉可显著改善样品的质构特性，这与刘璐等[26]和黄晓冰等[27]的研究结果相似。淀粉颗粒间隙在热处理过程中随淀粉量的增多不断减少、遇水溶胀，形成均匀稠密的网状，有利于改善鱼片结构稳定性和口感[28]，但过量淀粉易导致鱼片外裹浆过于黏稠，降低原有品质。综合来看，淀粉添加量应控制在2%~6%。
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图 4 不同淀粉添加量下挂浆罗非鱼片质构的变化注：*. 两组间差异显著 (p<0.05)；**. 两组间差异极显著 (p<0.01)；***. 两组间差异极其显著(p<0.001)；NS. 两组间差异不显著；折线代表均值的变化趋势。Figure 4. Changes of texture of tilapia fillets under different starch additionsNote: *. The difference between the two groups is significant (p<0.05); **. The difference between the two groups is very significant (p<0.01); ***. The difference between the two groups is extremely significant (p<0.001); NS. The difference between the two groups is not significant; the broken line represents the change trend of the mean value.2.2 挂浆罗非鱼片在不同蛋清粉添加量下煮制品质的变化
图5显示，随着蛋清粉添加量的增加，煮制后挂浆罗非鱼片的汤汁浑浊度先显著降低后显著升高，蒸煮损失率先显著升高后显著降低 (p<0.05)。汤汁浑浊度在蛋清粉添加量为4%时最低 (0.053)，可能是由于蛋清粉的胶凝、保水和黏性作用所致，蛋清粉黏性与添加量呈正相关，所形成的保护膜、吸附水分和油脂的能力可有效减少鱼片汁液和营养物质的流失[29]，但添加过多的蛋清粉易在水中形成胶状物质，增加浑浊度。
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图 5 不同蛋清粉添加量下挂浆罗非鱼片汤汁浑浊度和蒸煮损失率的变化注：相同指标的不同小写字母表示差异显著 (p<0.05)。Figure 5. Changes of turbidity of soup and cooking loss rate of tilapia fillets under different egg white powder additionsNote: Different lowercase letters for the same indicator represent significant differences (p<0.05).图6显示，增加蛋清粉添加量可显著提高样品的质构参数，这与李金星等[30]和叶丽红等[31]的研究结果一致。蛋清粉营养价值高、稳定性好，可增加黏度和弹性、改善膜形成能力，促进蛋清蛋白巯基相互结合形成二硫键，加强凝胶的网络结构[32]。随着蛋清粉添加量的增加，蛋白浓度和卵白蛋白聚集体的相对分子质量增大，且蛋清蛋白在热变性和凝集过程中，蛋白质疏水基团的暴露导致分子间的交联增强[33]，有利于提高鱼片质构稳定性，改善品质。综合来看，蛋清粉添加量应控制在2%~6%。
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图 6 不同蛋清粉添加量下挂浆罗非鱼片质构的变化注：*. 两组间差异显著(p<0.05)；**. 两组间差异极显著(p<0.01)；***. 两组间差异极其显著(p<0.001)；NS. 两组间差异不显著；折线代表均值的变化趋势。Figure 6. Changes of texture of tilapia fillets under different egg white powder additionsNote: *. The difference between the two groups is significant (p<0.05); **. The difference between the two groups is very significant (p<0.01); ***. The difference between the two groups is extremely significant (p<0.001); NS. The difference between the two groups is not significant; the broken line represents the change trend of the mean value.2.3 挂浆罗非鱼片在不同花生油添加量下煮制品质的变化
图7显示，与对照组相比，煮制后挂浆罗非鱼片的汤汁浑浊度、蒸煮损失率在花生油添加量为0.5%、1%、6%时显著降低；1.5%、2%、4%时显著升高；8%时，样品汤汁浑浊度显著升高，蒸煮损失率显著降低 (p<0.05)。彭晓龙[34]的研究表明，适量油脂可改善产品品质，如减少蒸煮损失、保持水分和风味等，但由于花生油在加热过程中可渗入样品中，并与其表面淀粉和内部蛋白质充分接触反应[35]，在汤汁中形成乳化或分散体系，添加过多会增加汤汁浑浊度、蒸煮损失和油脂吸收率，影响食用品质。
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图 7 不同花生油添加量下挂浆罗非鱼片汤汁浑浊度和蒸煮损失率的变化注：相同指标的不同小写字母表示差异显著 (p<0.05)。Figure 7. Changes of turbidity of soup and cooking loss rate of tilapia fillets under different peanut oil additionsNote: Different lowercase letters for the same indicator represent significant differences (p<0.05).图8显示，改变花生油添加量对样品质构影响不大 (p>0.05)，Chang等[36]也在探讨油脂对鱼糜制品质构特性的影响中得到相似结果。不同花生油添加量下的样品硬度、胶着性、咀嚼性这3个指标高度相关[37]且均低于对照组，可能是在加热过程中油脂发生氧化作用，蛋白质发生聚合链反应、羰氨反应和分子重排[38-39]所致。综合数据结果和鉴于花生油具有防止粘连和润滑的作用，其添加量控制在1%~2%较佳。
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图 8 不同花生油添加量下挂浆罗非鱼片质构的变化注：*. 两组间差异显著(p<0.05)；**. 两组间差异极显著(p<0.01)；***. 两组间差异极其显著(p<0.001)；NS. 两组间差异不显著；折线代表均值的变化趋势。Figure 8. Changes of texture of tilapia fillets under different peanut oil additionsNote: *. The difference between the two groups is significant (p<0.05); **. The difference between the two groups is very significant (p<0.01); ***. The difference between the two groups is extremely significant (p<0.001); NS. The difference between the two groups is not significant; the broken line represents the change trend of the mean value.2.4 挂浆罗非鱼片在不同腌制时间下煮制品质的变化
图9显示，随着腌制时间的延长，挂浆罗非鱼片的汤汁浑浊度先显著升高后显著降低，蒸煮损失率先显著降低后显著升高 (p<0.05)，这可能与腌制时间对鱼片组织结构和化学成分的影响有关。黄莉等[40]和贺思翔[41]研究发现，延长腌制时间会增加鱼片的蒸煮损失率，与本实验结果一致。
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图 9 不同腌制时间下挂浆罗非鱼片汤汁浑浊度和蒸煮损失率的变化注：相同指标的不同小写字母表示差异显著 (p<0.05)。Figure 9. Changes of turbidity of soup and cooking loss rate of tilapia fillets under different pickling timeNote: Different lowercase letters for the same indicator represent significant differences (p<0.05).图10显示，延长腌制时间可以降低样品的硬度、弹性、胶着性、咀嚼性，样品的内聚性、胶着性、咀嚼性在腌制时间为30 min时最高，这可能是由于盐溶性蛋白的不断溶出使蛋白质交联作用更完全，形成新的较为紧密的三维结构[42-43]。综合来看，腌制时间应控制在30 min以内。
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图 10 不同腌制时间下挂浆罗非鱼片质构的变化注：*. 两组间差异显著(p<0.05)；**. 两组间差异极显著(p<0.01)；***. 两组间差异极其显著(p<0.001)；NS. 两组间差异不显著；折线代表均值的变化趋势。Figure 10. Changes of texture of tilapia fillets under different pickling timeNote: *. The difference between the two groups is significant (p<0.05); **. The difference between the two groups is very significant (p<0.01); ***. The difference between the two groups is extremely significant (p<0.001); NS. The difference between the two groups is not significant; the broken line represents the change trend of the mean value.2.5 罗非鱼片挂浆工艺的响应面试验结果
2.5.1 响应面模型建立和试验结果分析
基于单因素试验结果进行响应面试验设计与优化 (表2)。所得回归拟合方程为：Y=16.45+1.16A−0.878 3B−0.504 2C−0.371 7D−0.125 0AB−0.132 5AC+0.140 0AD−0.975 0BC−0.105 0BD−0.665 0CD−2.67A2−2.13B2−2.29C2−1.32D2。
表 2 响应面试验设计及结果Table 2. Design and results of response surface experiment试验号
Test No.A：淀粉添加量
Starch additionB：蛋清粉添加量
Egg white powder additionC：花生油添加量
Peanut oil additionD：腌制时间
Pickling time硬度
Hardness/g汤汁浑浊度
Turbidity of soup综合得分
Comprehensive score1 0 −1 1 0 135.85 0.062 13.33 2 0 0 −1 −1 127.59 0.056 13.74 3 −1 0 0 −1 121.31 0.067 12.14 4 0 1 −1 0 156.43 0.073 13.16 5 1 −1 0 0 86.00 0.045 13.84 6 1 0 1 0 137.66 0.072 12.40 7 0 1 1 0 81.00 0.080 9.25 8 −1 0 −1 0 131.15 0.119 9.64 9 1 0 −1 0 121.43 0.064 12.46 10 0 −1 0 1 90.15 0.047 13.60 11 0 0 0 0 215.20 0.060 17.12 12 0 0 0 0 223.69 0.067 16.72 13 0 0 0 0 190.18 0.065 15.43 14 1 0 0 −1 123.19 0.056 13.54 15 1 0 0 1 125.29 0.057 13.50 16 0 −1 0 −1 144.67 0.062 13.73 17 −1 0 0 1 121.50 0.074 11.51 18 0 −1 −1 0 99.80 0.051 13.29 19 −1 0 1 0 95.47 0.077 10.11 20 0 1 0 −1 149.21 0.086 11.90 21 −1 1 0 0 81.63 0.071 9.99 22 0 0 −1 1 148.75 0.066 13.47 23 −1 −1 0 0 77.72 0.061 10.85 24 0 0 0 0 205.38 0.063 16.32 25 1 1 0 0 104.00 0.058 12.41 26 0 0 1 1 97.32 0.069 10.87 27 0 0 0 0 179.49 0.052 16.68 28 0 1 0 1 99.37 0.065 11.37 29 0 0 1 −1 157.71 0.067 13.77 方差分析和显著性检验 (表3) 结果显示，回归模型p<0.000 1 (差异极显著)，失拟项p>0.05 (差异不显著)，且r2=0.938 6，说明该方程很好地拟合了数据，可用于优化冷冻罗非鱼片的挂浆工艺。综合来看，各因素对综合得分的影响排序为：淀粉添加量 (A)>蛋清粉添加量 (B)>花生油添加量 (C)>腌制时间 (D)。
表 3 回归模型的方差分析结果Table 3. Analysis of variance results of regression model方差来源
Source of variance平方和
Square sum自由度
Degree of freedom均方
Mean squareF p 显著性
Significance模型 Model 116.85 14 8.35 15.29 <0.000 1 ** 淀粉添加量 (A) Starch addition 16.12 1 16.12 29.53 <0.000 1 ** 蛋清粉添加量 (B) Egg white powder addition 9.26 1 9.26 16.96 0.001 0 ** 花生油添加量 (C) Peanut oil addition 3.05 1 3.05 5.59 0.033 1 * 腌制时间 (D) Pickling time 1.66 1 1.66 3.04 0.103 3 交互项AB Interaction term AB 0.062 5 1 0.062 5 0.114 5 0.740 1 交互项AC Interaction term AC 0.070 2 1 0.070 2 0.128 6 0.725 2 交互项AD Interaction term AD 0.078 4 1 0.078 4 0.143 6 0.710 4 交互项BC Interaction term BC 3.80 1 3.80 6.96 0.019 4 * 交互项BD Interaction term BD 0.044 1 1 0.044 1 0.080 8 0.780 4 交互项CD Interaction term CD 1.77 1 1.77 3.24 0.093 4 二次项A2 Quadratic term A2 46.28 1 46.28 84.77 <0.000 1 ** 二次项B2 Quadratic term B2 29.50 1 29.50 54.02 <0.000 1 ** 二次项C2 Quadratic term C2 33.90 1 33.90 62.10 <0.000 1 ** 二次项D2 Quadratic term D2 11.34 1 11.34 20.78 0.000 4 ** 残差 Residual 7.64 14 0.546 0 失拟项 Misfit item 6.01 10 0.601 2 1.47 0.377 8 纯误差 Pure error 1.63 4 0.408 0 总和 Sum 124.50 28 注：*. 差异显著 (p<0.05)；**. 差异极显著 (p<0.01)。 Note: *. Significant difference (p<0.05); **. Extremely significant difference (p<0.01). 2.5.2 响应面交互作用分析
响应面图的坡度越陡峭，响应值受对应因素的影响越显著[44]。由此可知，蛋清粉与花生油交互作用对煮制后挂浆罗非鱼片的综合得分影响最大。从图11可知，固定蛋清粉添加量不变，不断增加淀粉添加量、花生油添加量和腌制时间，挂浆罗非鱼片的综合得分先升高后下降，分别在4%、1.5%、15 min左右达到最大值，其中综合得分在花生油添加量>1.5%时下降较快，这可能是因为花生油添加量偏高导致油脂在加热过程中发生乳化作用，增加了汤汁浑浊度。固定淀粉添加量不变，不断增加花生油添加量和腌制时间，挂浆罗非鱼片的综合得分先上升后下降，这可能是因为油脂覆盖、腌制过程中的影响和鱼片内外部结构变化等因素综合作用的结果。
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图 11 各因素交互作用对挂浆罗非鱼片品质影响的响应面图Figure 11. Response surface diagram of interaction of various factors on quality of tilapia fillets2.5.3 模型优化及验证
综合回归模型分析并考虑到实际实验中操作的便利性，最终确定罗非鱼片的最佳挂浆工艺参数为：淀粉添加量4.4%、蛋清粉添加量3.6%、花生油添加量1.4%、腌制时间13 min，在此条件下煮制挂浆罗非鱼片的综合得分理论值为16.70。优化条件下鱼片进行3次重复试验的硬度为 (178.4±5.43) g，汤汁浑浊度为0.055±0.004，蒸煮损失率为 (7.1±0.15)%，对比对照组 (未挂浆) 鱼片，硬度提高了74.2%，汤汁浑浊度和蒸煮损失率分别降低了42.7%和36%，综合得分 (16.16±0.53) 与预测值相近，进一步证明该模型可用来优化罗非鱼片的挂浆工艺。
2.6 感官评价
图12为优化工艺处理的罗非鱼片 (实验组) 和未挂浆罗非鱼片 (对照组) 在冻藏10 d后煮制的感官评价结果。由图可知，除鱼片色泽略低于对照组外，实验组其余指标的感官得分均显著优于对照组，说明经优化后的挂浆工艺制备的罗非鱼片，口感、风味和可接受度均较好。
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图 12 不同处理条件对冷冻罗非鱼片煮制后感官品质的影响Figure 12. Effects of different treatment conditions on sensory quality of frozen tilapia fillets after cooking2.7 肌原纤维蛋白二级结构的变化
图13为优化工艺处理的罗非鱼片 (实验组) 和未挂浆罗非鱼片 (对照组) 在冻藏10 d煮制后的肌原纤维蛋白二级结构的相对含量。由图可知，实验组鱼片的α-螺旋和β-转角结构相对含量高于对照组，β-折叠和无规则卷曲结构相对含量低于对照组，说明挂浆鱼片中蛋白质功能性和结构稳定性更高。这是因为挂浆层可以提高热传导效应，减缓水分流失及蛋白质与高温水的直接接触，蛋白质变性程度降低，可提供更多氢键和内部相互作用，且高温蒸煮下鱼片蛋白空间位置可能在熵的作用下发生重排，增加了相对稳定结构的比例[45]。
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图 13 不同处理条件对冷冻罗非鱼片煮制后肌原纤维蛋白二级结构相对含量的影响Figure 13. Influence of different treatment conditions on relative content of secondary structure of myofibrillar protein after cooking frozen tilapia fillets2.8 微观结构变化
由图14可知，对照组鱼肉横、纵切面粗糙，肌纤维间距大，存在较多大的空隙及断裂现象；实验组鱼肉横、纵切面光滑，肌纤维密度大，相互间连接的紧密性和规则性较强，说明优化条件下挂浆鱼片的组织结构完整性和质构稳定性较好。这主要是因为挂浆提供的保护层有利于保持鱼肉的肌纤维结构、减少水分流失，提高了煮制时热量传导的均匀性，以及表面淀粉的吸水作用，使得鱼肉质构更加稳定，品质更优。
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图 14 不同处理条件下冻藏10 d后煮制罗非鱼片组织结构 (100×)注：a、b分别表示蒸馏水处理横切面、纵切面；c、d分别表示优化工艺处理横切面、纵切面。Figure 14. Tissue structure of cooked tilapia fillets after 10 d of freezing under different treatment conditions (100×)Note: a, b represent distilled water treatment cross-section and longitudinal section, respectively; c, d represent optimized process treatment cross-section and longitudinal section, respectively.3. 结论
本研究通过添加淀粉、蛋清粉、花生油及调整腌制时间改善挂浆罗非鱼片的品质，并获得最佳工艺条件：淀粉添加量 4.4%、蛋清粉添加量3.6%、花生油添加量 1.4%、腌制时间 13 min。在此条件下制作的罗非鱼片经煮制后，与对照组 (未挂浆) 相比，硬度提高了74.2%，汤汁浑浊度和蒸煮损失率分别降低了42.7%和36%，感官评分显示鱼片的口感、风味和可接受度优于对照组。挂浆后鱼片肌原纤维蛋白二级结构中β-折叠相对含量低于对照组，α-螺旋相对含量高于对照组，观察微观结构显示鱼片肌纤维密度更大，切面更光滑，相互间连接的紧密性更强、更有规则。总体而言，优化挂浆工艺处理罗非鱼片可提升产品食用品质和蛋白质结构的稳定性。本研究为进一步提升以罗非鱼为原料制作酸菜鱼、水煮鱼等预制鱼产品的品质提供了技术支撑。
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图 1 FMRFamide基因的氨基酸序列及cDNA全长
浅灰色阴影部分是该基因编码信号肽部分，起始密码子和终止密码子用方框标出，深灰色阴影是磷酸化位点，末端加尾信号AATAAA用下划线标出，poly (A) 用斜体表示
Figure 1. Amino acid sequence and full length cDNA of FMRFamide gene
The light grey shaded portion is the signal peptide portion of the gene; the start and stop codons are boxed; the dark grey shaded portion is the phosphorylation site; the end plus tail signal AATAAA is underlined, and poly (A) is in italics.
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图 2 利用MEGA-X软件基于NJ法构建的FMRFamide系统进化树
Figure 2. NJ phylogenetic tree of FMRFamide by MEGA-X
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图 3 OrFMRFamide在各组织的相对表达量
**. 极显著性差异 (P<0.01)
Figure 3. mRNA relative expression of OrFMRFamide in different tissues
**. Very significant at 0.01 level (P<0.01)
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图 4 免疫组化结果
a. 神经节；b. 腹足；c. 肝胰腺；d. 肌肉；e. 皮肤；f. 性腺；箭头表示FMRFamide多肽
Figure 4. Immunohistochemistry results
a. Ganglia; b. Pleopod; c. Hepatopancreas; d. Muscle; e. Skin; f. Gonad; arrows represent FMRFamide polypeptides.
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图 5 OrFMRFamide基因在炎症刺激后在不同组织中的相对表达量
图中不同字母表示差异显著 (P<0.05)
Figure 5. Relative expression of OrFMRFamide gene in different tissues after inflammatory stimulation
Different letters in the figure indicate significant difference (P<0.05).
表 1 实验中所用引物序列
Table 1 Primers used in this experiment
引物
Primer引物序列 (5'–3')
Primer sequence用途
FunctionOrFMRFamide-F1 CTTAGGAGTGGGAACAGC 验证目的片段 OrFMRFamide-R1 CGGCTGGAGATTTGATTG OrFMRFamide-F2 CGGACCAGTACGACCAAC OrFMRFamide-R2 GTTCAGTCCGCCCTAATG OrFMRFamide-3'RACE-inter ACTGGTTTGGGTAGCA 3'RACE 特异性引物 OrFMRFamide-3'RACE-outer ATGGCAACAATGTCTTTCG OrFMRFamide-5'RACE-inter GAGCAGAAGATGGCGT 5'RACE 特异性引物 OrFMRFamide-5'RACE-outer TCCTCGCTTTGCCTCA OrFMRFamide-RT-F AGCTGGAGGACACACTGAGGCA Real-time RT-PCR OrFMRFamide-RT-R TGCCACATCGCCCTCATCGG 18S-F TCCGCAGGAGTTGCTTCGAT 18S-R ATTAAGCCGCAGGCTCCACT 
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