Effects of different C/N ratios on formation of biofloc, water quality and microflora in aquaculture water of Chinemys reevesii
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摘要: 为探讨生物絮团技术应用于龟鳖类养殖中的可行性，并确定其最佳添加量，通过调控中华草龟 (Chinemys reevesii) 养殖水体中的碳氮比（质量比），分析生物絮团形成及其对水质和菌落的影响。实验以添加蔗糖设计碳氮比为10∶1 (CN-10)、15∶1 (CN-15)、20∶1 (CN-20) 的实验组和对照组 (CG)，进行为期40 d的养殖。结果显示，各组生物絮团体积指数 (FVI) 随碳氮比的增加而增大，在28 d后趋于稳定；碳氮比≥10时氨氮和亚硝酸盐处理效果显著，其中CN-15组40 d后氨氮和亚硝酸盐的去除率分别为76.7%和64.4%。碳氮比为15∶1时能促进龟池生物絮团的形成，并可有效降低水中氨氮、亚硝酸盐水平。对实验组 (CN-15) 与对照组的生物絮团进行高通量测序，发现2种水体中生物絮团的优势菌门均为变形菌门、拟杆菌门、放线菌门，但各优势菌门占比有所差异。研究表明，添加不同碳氮比可影响中华草龟养殖水体生物絮团的形成、水质和菌群结构。碳氮比为15∶1是形成生物絮团的最适比例，在促进生物絮团形成的同时，对水质也具有较强的调节能力。Abstract: In order to determine the feasibility and the best addition amount of biofloc technology in turtle culture, we studied the formation of biofloc and its effects on water quality and microflora by regulating the C/N ratio in the culture water of Chinemy sreevesii. We carried out an experiment with the addition of sucrose at 10∶1 (CN-10), 15∶1 (CN-15), 20∶1 (CN-20) and the control group for 40 d. The results show that the biofloc volume index of each group of biofloc became stable after 28 d, and the treatment effect of ammonia nitrogen and nitrite was significant with the C/N ratio≥10∶1. Among them, the removal rate of ammonia nitrogen and nitrite after 40 d of the group with a C/N ratio of 15∶1 were 76.7% and 64.4%, respectively, which indicates that the C/N ratio of 15∶1 can promote the formation of biofloc, and reduce the level of ammonia nitrogen and nitrite in the water effectively. The biological flocs of the experimental group (CN-15) and the control group were sequenced by high-throughput sequencing, and the results show that the dominant phyla of biofloc in the two water bodies were Proteobacteria, Bacteroidetes and Actinobacteria, but the proportion of each dominant bacteria phylum was different. In conclusion, the addition of different C/N ratios can affect the formation of biofloc, water quality and microflora of C. reevesii ponds. 15∶1 is the optimal C/N ratio for the formation of biofloc, which can promote the formation of biofloc and has a strong ability to regulate water quality.
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Keywords:
- Chinemys reevesii /
- Biofloc /
- Water quality indicators /
- High-throughput sequencing
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生物絮团技术 (Biofloc technology, BFT) 是一种低成本、可持续且环境友好的水产养殖技术[1-2]；通过添加外部碳源调控水体中的碳氮比，促进形成含有细菌、真菌、原生动物、微藻等的生物凝絮物，并利用系统中自养细菌和异氧细菌等微生物的处理作用，从水产养殖废水中吸收有害氮组分以改善水质，同时可产生微生物蛋白，直接作为水产动物的饲料[3-5]。生物絮团技术不仅可为水产动物提供必需的营养物质，最大限度地减少了水体交换，同时可在一定程度上减少饲料供给。目前该技术已在虾类养殖中广泛应用[6-8]，在其他水产动物上的研究、应用也越来越多，如草鱼 (Ctenopharyngodon idella)[9-10]、鲤 (Cyprinus carpio)[11-12]、尼罗罗非鱼 (Oreochromis niloticus)[13-14]、团头鲂 (Megalobrama amblycephala)[15-16]等。
中华草龟 (Chinemys reevesii) 是龟鳖目中的常见种类，具有繁殖率高、抗逆性强、生长快等诸多优势，兼具较高的食用、药用和观赏价值，已成为我国产量最高的经济龟类[17]。目前中华草龟的人工养殖技术主要为温室养殖，该技术虽可大幅提高其生长速度，缩短养殖周期，增加养殖产量和经济效益[18]，但存在水质调控成本高、高蛋白饲料投喂量大等高投入、高污染的问题[19]。养殖过程中大量高蛋白饲料投喂会引起水体化学需氧量 (COD)、总氮和总磷指标偏高，养殖废水对外界环境造成巨大压力。随着环保意识的提高，养殖废水的控制与处理成为中华草龟温室养殖中亟待解决的问题。目前龟鳖养殖废水处理的相关研究较少，主要集中在化学絮凝法[20]和生物改良[21-22]等方式，王芬等[23]通过藕鳖共作的生态养殖实验发现中华鳖的成活率、特定生长率和饲料转化率相较于传统养殖模式均有较大提升，水体中氨氮 (
$ {\rm{NH}}_4^+$ -N)、COD等指标显著降低，莲藕产量也得到了提高。许明宸[24]利用微生物制剂结合湿地的方式处理养殖尾水，建立快速而稳定的尾水净化系统，实现养殖尾水零排放。温室龟鳖养殖的高密度和高投入导致养殖用水的严重污染，而现有的龟鳖尾水处理方式显然无法与温室养殖有机结合。生物絮团作为一种新型水产养殖技术，其充分利用微生物的水质高效处理作用，使其在高密度养殖中备受青睐[25-26]。因此本研究通过调控水体碳氮比，探讨碳源添加量对中华草龟温室养殖过程中生物絮团形成及水质的影响，研究建立并维持生物絮团的最佳条件，以期实现中华草龟温室养殖水体零排放的目的。1. 材料与方法
1.1 实验材料
中华草龟幼龟取自金华市绿和生态水产养殖公司，平均体质量为 (76.66±9.83) g，体质健康，饲养15 d后进行实验。
1.2 实验方法
实验在温室内70 cm×50 cm×40 cm的实验池中进行，每个实验池养殖中华草龟6只。使用经曝气后的自来水蓄水20 cm，养殖水温采用自动加热棒控温在 (31.4±0.7) ℃，实验期间使用充氧泵 (森森牌CT-404，8 W) 对水体进行曝气，每个实验池设1个气石。不进行换水和排污，但定期补充系统运行蒸发和采样失水。每天07:00投喂乌龟专用膨化饲料 (mC∶mN=6∶1，北京大北农科技集团股份有限公司) 1次，日投喂量为龟体质量的1%。设3个实验组，利用Avnimelech[1]的方法计算出调控不同碳氮比所要投放的蔗糖质量，实验中的碳氮比指添加物质 (饲料和蔗糖) 的碳元素与氮元素的质量比，计算公式如下：
$$ m_{\mathrm{C}}=m_{\mathrm{CH}} \times W_{\mathrm{C} / \mathrm{CH}}$$ (1) $$ m_{\mathrm{N}}=m_{\mathrm{F}} \times W_{\mathrm{N} / \mathrm{F}} \times W_{\mathrm{N} / \mathrm{ex}}$$ (2) $$ {\rm{AN}}_{{{\rm{removed}}}}=\left(\dfrac{\mathrm{AN}_{\mathrm{CG}}-{\rm{AN}}_{\rm{EG}}}{{\rm{AN}}_{\rm{CG}}}\right) \times 100{\text{%}}$$ (3) $$ \mathrm{NIT}_{\text {removed }}=\left(\dfrac{{\rm{NIT}}_{\rm{CG}}- {\rm{NIT}}_{\rm{EG}}}{{\rm{NIT}}_{\rm{CG}}}\right)\times 100 {\text{%}}$$ (4) 式中：
$m_{\mathrm{C}}$ 为碳质量；$m_{\mathrm{CH}}$ 为所需碳水化合物的添加量；$W_{\rm{c} / \rm{ch}}$ 为碳水化合物中碳的质量分数；$m_{\mathrm{N}}$ 为氮质量；$m_{\mathrm{F}} $ 为投喂的饲料量；$W_{\mathrm{N} / \mathrm{F}} $ 为饲料中氮的质量分数；$W_{\mathrm{N} / \mathrm{ex}} $ 为排泄物中氮的质量分数；ANremoved和NITremoved分别为氨氮和亚硝酸盐的去除率；CG为对照组；EG为实验组。将蔗糖溶于水中，在投饲后的水体中添加，使水体碳氮质量比分别为10∶1 (CN-10)、15∶1 (CN-15)和20∶1 (CN-20)，每组3个平行，同时设1个对照组CG。对照组仅投喂饲料，全程未添加蔗糖。
实验期间每日进行水质检测，其中溶氧、pH、温度采用电极法测定，氨氮、亚硝酸盐、总氮使用Clever Chem 380全自动间断化学分析仪测定，通过公式(3)、(4)计算氨氮 (
${\rm{NH}}_4^+ $ -N)、亚硝酸盐 (NO2-N) 的去除率，整个实验周期40 d。1.3 生物絮团体积与形态观察
通过使用Imhoff管 (1000-0010, Nalgene) 进行生物絮团沉积量 (BFV) 的测定，每7 d进行一次取样，样品体积为1 L，经30 min沉降后记录沉积物的体积量，每组取3个平行的平均值。采用徕卡DM2500全自动显微镜拍照记录生物絮团的粒径，实验具体步骤参照陈鹏飞[27]的研究方法。
1.4 生物絮团基因组DNA提取
对采集的CN-15实验组和对照组的水样2 L用0.22 µm滤膜进行真空抽滤，将滤膜置入5 mL无菌袋，于−80 ℃保存，絮团DNA采用Ezup柱式细菌基因组DNA提取试剂盒 (上海生工生物工程股份有限公司) 进行提取，对提取后的DNA经琼脂糖凝胶电泳检测其质量和完整性，所有DNA均在−20 ℃下保存。
1.5 高通量测序
将提取的絮团基因组DNA进行16S rDNA可变区扩增、纯化与构建测序文库，并进行Illumina MiSeq测序。对测序获得的有效序列进行OTU聚类分析，使用RDP classifier 贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，并在各个水平统计每个样本的群落组成。
2. 结果
2.1 生物絮团沉积量及其形态结构观察
对照组的生物絮团沉积量在整个实验期间保持在2 mL·L−1以下 (图1)。实验组水体中的生物絮团沉积量呈上升趋势，14 d后均高于对照组且差异显著 (P<0.05)；28 d后基本保持稳定，为4~7 mL·L−1。在显微镜下 (400×) 观察，生物絮团平均直径约100~300 μm，絮团中充满较多的丝状体和细微颗粒(图2)。
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图 1 实验期不同处理组的生物絮团沉积量动态变化Figure 1. Dynamic changes of biofloc deposits in different groups during experimental period2.2 碳氮比对水质因子的调控
水质检测结果显示，对照组的溶解氧质量浓度和pH均高于实验组且存在显著差异 (P<0.05)，其中CN-20组的溶解氧仅为0.21 mg·L−1，pH为7.01 (表1)。表明添加碳源可以显著降低养殖水体中的氨氮浓度 (P<0.05)，在实验第1—第18天，各组氨氮浓度均先升高后降低，养殖20 d后，各实验组的氨氮浓度显著低于对照组并处于较低水平，40 d后CN-15组的氨氮水平最低，仅为0.52 mg·L−1，氨氮去除率为76.7%；实验组与对照组的亚硝酸盐浓度在养殖15 d后差异显著，实验组显著低于对照组 (P<0.05)，其中CN-15和CN-20组在35 d后显著下降，并维持在0.48和0.42 mg·L−1，亚硝酸盐去除率分别为64.4%和68.9%；添加碳源对总氮的影响较小，对照组与实验组总氮浓度无显著差异 (P>0.05，图3)。在养殖期的第11—第25天，实验组的氨氮和亚硝酸盐浓度大幅降低，这也再一次佐证通过添加碳源生成生物絮团对养殖水体具有显著的净化效果。
表 1 实验结束时不同处理组养殖水体的水质参数Table 1. Water quality of aquaculture water bodies in different groups at the end of test组别
Group温度
Temperature/℃酸碱度
pH溶解氧质量浓度
ρ(DO)/
(mg·L−1)氨氮质量浓度
ρ(NH4 +-N)/
(mg·L−1)亚硝酸盐质量浓度
ρ(NO2-N)/
(mg·L−1)总氮质量浓度
ρ(TN)/
(mg·L−1)对照 Control 31.4±0.7a 7.32±0.17a 1.20±0.22a 2.23±0.12a 1.35±0.05a 27.86±3.74a CN-10 31.1±0.5a 7.26±0.30b 0.40±0.09b 0.73±0.06b 1.18±0.14a 26.31±2.31a CN-15 31.3±0.9a 7.21±0.29b 0.29±0.08b 0.52±0.18b 0.48±0.04b 18.22±1.53b CN-20 31.5±1.2a 7.01±0.47b 0.21±0.12b 0.60±0.15b 0.42±0.04b 19.97±3.36b 注：同列中不同字母间存在显著性差异 (P<0.05)。 Note: Values with different letters within the same column have significant difference (P<0.05). ![]()
图 3 实验期不同处理组氨氮、亚硝酸盐和总氮的动态变化Figure 3. Dynamic changes of mass concentration of ammonia-N, nitrite-N and total nitrogen in different groups during experimental period2.3 细菌菌落结构分析
对CN-15实验组与对照组进行高通量测序。对照组和实验组中微生物群落在门水平上的分布情况见图4。两组样品细菌共隶属于15个菌门，其中变形菌门、拟杆菌门、放线菌门、绿弯菌门和Patescibacteria为优势菌门。其中变形菌门占比最多，在对照组和实验组中分别占43.58%和50.78%。对照组中的拟杆菌门、绿弯菌门、厚壁菌门、梭杆菌门和Dependentiae占比高于实验组，分别高出14.86%、1.88%、2.6%、2.13%和2.36%；而实验组 (CN-15) 中的变形菌门、放线菌门和Patescibacteria的占比高于对照组，分别高出7.2%、11.29%和5.73%。除纤维杆菌门和蓝菌门只存在于对照组中 (占比0.34%)，其余菌门在两组中均有一定占比。
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图 4 对照组与实验组 (CN-15) 细菌门水平的分布情况Figure 4. Distribution of bacterial phylum levels in control group and experimental group (CN-15)在纲水平上，两组样品细菌主要隶属于32个菌纲，其主要优势菌纲为γ-变形菌纲和拟杆菌纲，在对照组中分别占38.88%和35.38%，在实验组中分别占47.78%和19.53% (图5)。此外，放线菌纲、厌氧绳菌纲、δ-变形菌纲在实验组和对照组中为次要优势菌纲。实验组中γ-变形菌纲、放线菌纲、纤细菌纲、Parcubacteria、绿弯菌纲的丰度显著高于对照组，且Gracilibacteria、Parcubacteria、绿弯菌纲均为实验组特有菌纲；而对照组中的拟杆菌纲、厌氧绳菌纲、梭杆菌、Babeliae、α-变形菌纲、梭菌纲、芽孢杆菌纲和纤维杆菌纲高于实验组，纤维杆菌纲为对照组特有菌纲。
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图 5 对照组与实验组 (CN-15) 细菌纲水平的分布情况Figure 5. Distribution of bacterial class levels in control group and experimental group (CN-15)属水平上，两组样品共检测出113个菌属，实验组中主要可鉴定优势菌群为多核杆菌属和沉积物杆状菌属，而对照组为腐败螺旋菌属、噬几丁质菌属和拟杆菌属。实验组中Ambiguous、多核杆菌属、沉积物杆状菌属、Terrimonas、Nitrospira显著高于对照组。对照组中拟杆菌属、分支杆菌属、海洋杆菌属、Azospira 、Permianibacter、Hypnocyclicus、Bacteriovorax、Bdellovibrio、Streptococcus等含量高于实验组，Parasutterella和Mucilaginibacter是对照组特有菌属；而多核杆菌属、Terrimonas、Haliscomenobacter和Leucobacter在实验组中含量较高 (图6、图7)。
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图 6 对照组与实验组 (CN-15) 细菌属水平的分布情况Figure 6. Distribution of bacterial genus levels in control group and experimental group (CN-15)![]()
图 7 对照组与实验组 (CN-15) 部分细菌属水平差异图Figure 7. Difference of bacterial genus level between control group and experimental group (CN-15)3. 讨论
3.1 不同碳氮比下温室中华草龟池生物絮团形成与水质调控
生物絮体是由有机物和微生物组成的非均匀颗粒的聚集基质[28]，通过添加碳源以增加碳氮比，刺激异养细菌的生长，并使其利用总氮作为氮源以产生细菌蛋白[29]。随着碳氮比的增加，生物絮团形成并逐渐稳定，并开始进行同步硝化、反硝化作用 (SND) 和除磷作用以调节水质，将水体中的含氮化合物直接以氮氧化物或氮气的形式排出[30]。当mC∶mN=15∶1时，对总氮、硝酸盐和磷酸盐的去除效果最佳[31]。同时，生物絮团还具有促进水产动物生长[32]、增强抗氧化功能[33]及降低饲料系数[34]等诸多功效，甚至可以增强水产动物对常见水产致病菌的抗病性[35]，这使得生物絮团技术在水产养殖行业得到了广泛应用。本研究同样发现当mC∶mN≥15时，对中华草龟池的水质调控效果最佳，在mC∶mN≥10时能形成稳定的生物絮团，生物絮团生成量随碳氮比的增大而增多，当碳氮比达到20∶1时生物絮团的生成量与碳氮比为15∶1时差异不显著(P>0.05)，但水面产生较多泡沫，溶解氧和pH更低。因此，可推断当碳氮比为15∶1时，温室中华草龟池水体中形成了较为稳定的生物絮团，水体中氨氮、亚硝酸盐含量较低。这与卢炳国等[9]对草鱼池生物絮团形成的研究结果类似，而邓吉朋等[36]发现：保持水体碳氮比为20∶1时有利于斑节对虾 (Penaeus monodon) 池生物絮团的形成；孙盛明等[15]研究发现团头鲂养殖水体中生物絮团的碳氮比大于16时可有效调节水质；Zhe 等[37]发现当碳氮比为20时，生物絮团能有效净化水质，促进黄金鲫 (Carassius auratus) 生长，提高饲料利用率，增强消化酶活力；国外针对生物絮团中添加碳源以控制碳氮比使其达到最佳效果的研究同样非常多，但针对不同物种，其最适比例也存在明显差异。Mirzakhani等[38]发现当碳氮比为15∶1时，生物絮团系统对尼罗罗非鱼的生长性能、肠道组织结构和免疫应答最佳。由此可见，合理的碳氮比是形成生物絮团并发挥其最佳效果的必要条件[27,39]。除碳氮比外，增氧曝气也是生物絮团形成的必要条件，人工曝气的主要目的是维持生物絮团的悬浮和微生物供氧所需。随着实验进行，水体中的溶氧量维持在较低水平，仅为0.2~0.4 mg·L−1。这既与增氧泵功率较小有关，也与生物絮团中大量微生物的耗氧有关。虽然人工曝气量较小，但由于实验池水位较浅，加上中华草龟自身的爬行搅动，使得生物絮团始终能维持一定的悬浮状态而未发生崩解。
3.2 中华草龟养殖水体生物絮团细菌菌群结构分析
高通量测序是一种低成本、更准确的新一代测序技术，可以同时对含多种生物的微生物群落进行鉴定[40-42]。本实验对碳氮比为15∶1的实验组与对照组的中华草龟养殖水体中生物絮团的细菌组成进行高通量测序。结果显示，在门水平上，主要为变形菌门和拟杆菌门，这与日本对虾 (P. japonicus) 养殖过程中生物絮团微生物多样性的结果类似[43]。生物絮团是一个以异养微生物为主体的团聚物，因此其中有许多异养细菌在发挥作用，并在生物絮团净化水质方面起主导作用，主要为变形菌门、拟杆菌门和放线菌门。养殖水体中变形菌门的种类大都是共生细菌，主要功能是清除污水中的有机物，在养殖尾水以及一些废水处理中发挥重要作用[44-47]。作为一种应用广泛的益生菌，拟杆菌 (Bacteroides) 可产生促进养殖生物生长的益生素[48]。放线菌门是一种常见的益生菌，王俊华等[49]研究发现放线菌可有效去除黑臭水体中的氨氮、磷酸盐等污染物，有利于水生生物的生长发育；同时，放线菌为分支状菌丝体，其菌丝可以伸展到絮团以外，从而形成生物絮团的主要骨架结构，在生物絮团形成过程中发挥重要功能[1]；这也是实验组的生物絮团生成量高于对照组的原因之一。除几种主要优势菌门外，厚壁菌门也有一定占比，包括梭菌纲和芽孢杆菌纲，且对照组含量显著高于实验组。在纲水平上，主要优势菌纲为变形菌纲、拟杆菌纲，其次是放线菌纲、厌氧绳菌纲。中华草龟养殖水体的生物絮团中，变形菌在数量上占主导地位。已有研究表明，污水处理系统的生物絮团中，变形菌纲占支配地位[50-51]，变形菌具有清除污水中有机物的作用[46]，能有效调节养殖水质。与对照相比，实验组 (CN-15) 放线菌纲的占比较大，这与放线菌组成生物絮团的基本结构这一特性有关。Gracilibacteria为实验组特有菌纲，隶属于芽单胞菌门，在废水处理中有一定的除磷功效[52]。在属水平上，不动杆菌属和气单胞菌属是水产养殖中常见的条件致病菌，在实验组 (CN-15) 的生物絮团水体中，不动杆菌属占比为0.02%，气单胞菌属占比为0.09%，均小于对照组的0.65%和0.53%。Bacteroides和Azospira在对照组中的占比显著高于实验组，Bacteroides是一类以有机物为最终电子受体的细菌，该菌可利用水体中的多种有机物碳源进行异养代谢反应，产生琥珀酸、乙酸、甲酸、乳酸和丙酸等。Azospira是一类兼性厌氧细菌，能利用水体中的多种碳源和氮源进行代谢，进行异化性硝酸盐还原作用，在不良环境下形成胞素，同时分泌大量多糖，在水体中进行反硝化作用。
总体来看，在中华草龟养殖中，添加碳源对草龟池生物絮团的菌群结构有一定影响，包括变形菌门、放线菌门和放线菌门等的占比，同时降低了假交替单胞菌属 (Pseudoalteromonas) 和弧菌属(Vibrio) 等条件致病菌的比例；生物絮团菌群结构随碳氮比的不同会发生一定变化，关于不同微生物对水质的调节机理、有益菌和致病菌的比例等系列问题还需进一步研究。
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图 1 实验期不同处理组的生物絮团沉积量动态变化
Figure 1. Dynamic changes of biofloc deposits in different groups during experimental period
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图 3 实验期不同处理组氨氮、亚硝酸盐和总氮的动态变化
Figure 3. Dynamic changes of mass concentration of ammonia-N, nitrite-N and total nitrogen in different groups during experimental period
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图 4 对照组与实验组 (CN-15) 细菌门水平的分布情况
Figure 4. Distribution of bacterial phylum levels in control group and experimental group (CN-15)
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图 5 对照组与实验组 (CN-15) 细菌纲水平的分布情况
Figure 5. Distribution of bacterial class levels in control group and experimental group (CN-15)
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图 6 对照组与实验组 (CN-15) 细菌属水平的分布情况
Figure 6. Distribution of bacterial genus levels in control group and experimental group (CN-15)
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图 7 对照组与实验组 (CN-15) 部分细菌属水平差异图
Figure 7. Difference of bacterial genus level between control group and experimental group (CN-15)
表 1 实验结束时不同处理组养殖水体的水质参数
Table 1 Water quality of aquaculture water bodies in different groups at the end of test
组别
Group温度
Temperature/℃酸碱度
pH溶解氧质量浓度
ρ(DO)/
(mg·L−1)氨氮质量浓度
ρ(NH4 +-N)/
(mg·L−1)亚硝酸盐质量浓度
ρ(NO2-N)/
(mg·L−1)总氮质量浓度
ρ(TN)/
(mg·L−1)对照 Control 31.4±0.7a 7.32±0.17a 1.20±0.22a 2.23±0.12a 1.35±0.05a 27.86±3.74a CN-10 31.1±0.5a 7.26±0.30b 0.40±0.09b 0.73±0.06b 1.18±0.14a 26.31±2.31a CN-15 31.3±0.9a 7.21±0.29b 0.29±0.08b 0.52±0.18b 0.48±0.04b 18.22±1.53b CN-20 31.5±1.2a 7.01±0.47b 0.21±0.12b 0.60±0.15b 0.42±0.04b 19.97±3.36b 注：同列中不同字母间存在显著性差异 (P<0.05)。 Note: Values with different letters within the same column have significant difference (P<0.05). 
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