Inhibitory activity of home-made garbage enzyme against aquatic pathogens and isolation and identification of its fermentation strains
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摘要:
为探讨自制环保酵素对水产病原微生物的抑制作用，该研究对其发酵菌株进行了分离。通过比浊法和平板划线法，确定自制环保酵素对水产病原微生物坎氏弧菌SP-1 (Vibrio campbellii SP-1)、哈维氏弧菌SP-1 (V. harveyi SP-1)、轮虫弧菌SP-1 (V. rotiferianus SP-1) 和嗜水气单胞菌245 (Aeromonas hydrophila) 的最低抑制浓度分别是体积分数是体积分数为11.5%、11%、6.2%和11%，最小杀菌浓度分别是体积分数为16%、16%、16%和12%。攻毒保护试验表明，自制环保酵素无菌上清液可使嗜水气单胞菌对斑马鱼 (Danio rerio) 的致死率降低 (90.5±6.49) %。pH、温度、蛋白酶敏感性试验显示自制环保酵素的主要抗菌活性物质为酸性物质，对加热和蛋白酶处理稳定。进一步从环保酵素中分离主要发酵菌株，通过ITS序列分析鉴定为库德毕赤酵母 (Pichia kudriavzevii)。研究结果可为自制环保酵素在水产养殖中对抗细菌性疾病的应用提供理论基础。
Abstract:In order to evaluate the inhibitory activity of home-made garbage enzyme against aquatic pathogens and to isolate their fermentation strains, we determined the minimum inhibitory concentrations of the home-made garbage enzyme on the aquatic pathogenic microorganisms Vibrio candida SP-1, V. harveyi SP-1, V. rotiferianus SP-1 and Aeromonas hydrophila 245 as 11.5%, 11%, 6.2% and 11% in volume fraction by turbidimetric method. The minimum bactericidal concentrations were determined as 16%, 16%, 16% and 12% in volume fraction by flat line scribing method. The challenge test proves that the supernatant of home-made garbage enzyme decreased (90.5±6.49) % of the mortality in zebrafish induced by A. hydrophila. The sensitivity tests of pH, temperature and protease prove that the main antibacterial active substances of home-made garbage enzyme were acidic substances that were stable to heating and protease treatment. Furthermore, the primary fermentation strain was separated from the garbage enzyme and identified as Pichia kudriavzevii by ITS sequence analysis. The results provide a theoretical basis for applying home-made garbage enzyme in combating bacterial diseases in aquaculture.
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Keywords:
- Garbage enzyme /
- Antibacterial effect /
- Aquatic pathogens /
- Pichia kudriavzevii
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中国海水养殖活动通常在近海水深15 m以浅进行[1]。自20世纪80年代起，世界各沿海地区的海湾养殖在迅猛发展的同时所带来的生态环境问题也引起了人们的广泛关注[2-5]。高密度养殖产生的剩余饵料、海水交换条件差等，使养殖海湾的生态环境普遍变差甚至恶化。开展养殖环境质量状况的定量评价，有助于深入了解亚热带海湾养殖对海洋环境的影响，为海水增养殖的可持续发展提供科学依据。
在近岸海域生态环境综合评价的研究中，世界各国学者提出了不同的评价方法和模型，包含物理、化学和生物等因子的基于生态系统水平的综合评价体系，如美国的“河口营养状态评估系统 (ASSETS)”[6-8]、欧盟的“综合评价法”(OSPAR-COMPP)[9]等。中国学者更是针对养殖海域提出了多种综合评价指标和体系，罗先香等[10]构建了基于“生境质量”和“生态响应”的集约化用海对海洋生态环境影响的综合指数法评价模型；蒲新明等[11]、谢玲等[12]按“压力-状态-响应”理论建立了海水养殖生态系统综合评价方法和模型；崔力拓[13]、钟硕良等[14]对海水、表层沉积物、养殖生物的质量评价采取加和平均综合指数法；吴海燕[15]以欧盟“水处理框架” (water framework directive, WFD)中的近岸海域生态质量状况 (ecological quality status, EcoQS) 综合评价体系为参照，并结合中国的实际情况，建立了福建近岸4个海湾的综合评价体系。这些方法均较全面但复杂，实际应用中需要的人力物力都较高。
Liao等[16]建立的养殖海域综合分级评价与预警方法较为简便 (7个指标)，且已在深圳大鹏澳的评价中取得了较好的效果。本研究拟把该方法推广至另外两个亚热带养殖海湾——钦州茅尾海和汕头白沙湾，利用该方法对这3个海湾2011—2012年的生态环境状况开展定性评价，并在此方法的基础上改进徐祖信[17-18]、Liu等[19]提出的河流综合水质标识指数评价方法，得到目标海域的状态指数，对定性评价获得的同一级别进行优劣区分，以期建立适合亚热带养殖海湾生态环境综合分级定量评价的方法。
1. 材料与方法
1.1 研究海域
2011年6月至2012年9月，租用快艇对钦州茅尾海、深圳大鹏澳、汕头白沙湾海域进行周年的现场调查，站位设置见图1。其中茅尾海设置站位16个 (M1—M16)，大鹏澳10个 (D1—D10)，白沙湾13个 (B1—B13)，调查时间分别为茅尾海 (夏2011-06-28—29；秋2011-10-28—29；冬2012-01-09；春2012-04-27)、大鹏澳 (秋2011-11-18；冬2012-02-24；春2012-06-02；夏2012-09-01)、白沙湾 (秋2011-11-16；冬2012-02-22；春2012-05-31；夏2012-08-30)。此外，白沙湾在2013—2018年持续开展了10个航次的调查，时间分别为201305 (6站)、201405 (6站)、201408 (6站)、201504 (6站)、201605 (7站)、201608 (7站)、201705 (13站)、201708 (13站)、201803 (13站)、201808 (13站)。本研究所用数据均取自表层。
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图 1 茅尾海、大鹏澳、白沙湾调查站位示意图Figure 1. Survey stations of Maowei Sea, Dapeng Cove and Baisha Bay1.2 评价方法
1.2.1 养殖海域综合分级评价与预警
Liao等[16]建立的养殖海域综合分级评价与预警方法包括5个水环境指标和2个沉积物指标 (表1)，分别为水体的溶解氧 (DO)、透明度 (SD)、无机氮 [DIN，包括亚硝态氮(NO2-N)、硝态氮(NO3-N)和铵态氮(NH4-N)]、磷酸盐 (PO4-P)、叶绿素a (Chl a)和沉积物的硫化物 (Sul)、有机碳 (OC)。根据表1的标准和方法进行评价，得到目标海域的生态环境质量等级和预警指标。该评价方法把养殖海湾的环境状况划分为3类，优劣顺序为良好 (G)、中等 (M)、较差 (B)。若2个站位或区域的等级相同，则按照下文的综合水质标识指数区分高低。
表 1 养殖海域综合分级评价与预警Table 1. Comprehensive grading evaluation factors and early warning for shallow-water farming area指标
Factor良好
Good中等
Medium较差
Bad预警 Early warning 数值
Value面积比例；等级；环境风险
Area ratio; Level; Environmental riskρ (溶解氧)/(mg·L−1) DO >5 3.5~5 <3.5 <4.5 >20%；优先预警；养殖场生态环境严重恶化，养殖生物和底栖生态受到危害的风险
极高。透明度/m SD >1.5 0.5~1.5 <0.5 <0.5 w(硫化物)/ (mg·kg−1) Sul ≤300 300~600 >600 >600 ρ (无机氮)/ (mg·L−1) DIN ≤0.3 0.3~0.5 >0.5 >0.4 >50%；一般预警；水体富营养化，发生赤潮的风险较高。 ρ (磷酸盐)/ (mg·L−1) PO4-P ≤0.03 0.03~0.05 >0.05 >0.03 ρ (叶绿素a)/(mg·m−3) Chl a ≤5 5~15 >15 >5 w(有机碳)/% OC ≤2 2~5 >5 >3 >50%；一般预警；沉积环境恶化。 单个站位生态环境等级 区域生态环境等级 良好 Good 溶解氧指标必须为良好，其余6项指标中，无较差，且最多允许1项为中等； 等级为良好的水域面积大于50%，且等级为差的水域面积必须小于10%。 中等 Medium 溶解氧指标必须为良好或中等，其余6项中有4项为中等； 有10%～20%的水域水质状况为较差，或50%以上的水域水质状况为中等。 较差 Bad 溶解氧指标为差，或3项以上指标为较差； 有20%以上的水域水质状况为较差。 1.2.2 综合水质标识指数 (Iwq)
综合水质标识指数 (Iwq=X1.X2X3X4)由两部分组成，前半部分(X1.X2)为计算所得，后半部分 (X3X4)为与水体功能区目标的比较结果[17-19]。本文的目标是比较同一等级环境状况的优劣，因此只涉及前半部分的计算值，其中X1代表第i项因子的类别；X2代表第i项因子的监测数据在该类别变化区间中所处的位置。X1.X2的数值需通过单因子指数 (Pi)计算获得，即X1.X2=Pi，为便于比较，对计算结果取小数点后2位。评价因子选用表1所列的7个指标。
当因子的评价级别为良好时，对溶解氧和透明度：Pi=2−(Ci−Cls)/Cls (当Ci≥3×Cls时，Pi=0)；对其余5个因子：Pi=1+ Ci/Cus。
当因子评价级别为中等时，对溶解氧和透明度：Pi=2+(Cus−Ci)/(Cus−Cls)；对其余5个因子：Pi =2+(Ci−Cls)/(Cus−Cls)。
当因子评价级别为较差时，对溶解氧和透明度：Pi = 4+[ (Cls−Ci)/Cls]×4；对其余5个因子：Pi = 4+(Ci−Cus)/ Cus。
式中Ci为指标的监测值，Cus为相应等级的标准上限值，Cls为相应等级的标准下限值 (表1)，即评级为良好时，DO、SD只有下限值，其余5个参数只有上限值；评级为中等时，这7个参数均有上限值和下限值；评级为较差时DO、SD只有上限值，其余5个参数只有下限值。考虑到表1中的7个评价因子对养殖生物和环境影响的不同程度，计算目标海域的Iwq时分别对优先预警和一般预警因子取不同的权重系数 (优先取0.2，一般取0.1)：
$$ \begin{array}{c} {I_{{\rm{wq}}}} =[0.2 \times \displaystyle\sum {\left( {{P_{i - {\rm{DO}}}} + {P_{i - {\rm{SD}}}} + {P_{i - {\rm{Sul}}}}} \right)} ]\\ {\rm{ + }}\left[ {0.1 \times \displaystyle\sum {\left( {{P_{i - {\rm{DIN}}}} + {P_{i{\rm{ - PO_4 - P}}}} + {P_{i - {\rm{Chla}}}} + {P_{i - {\rm{OC}}}}} \right)} } \right]\end{array} $$ 1.2.3 评价方法
应用上文的评价及计算方法，得到单个站位及各个海域的评价等级和状态指数，同时确定各次调查的预警因子。比较站位间或区域间的环境状况时，先看级别评价的结果，同一级别下则依据状态指数Iwq来区分优劣，即同级别时指数低则环境质量相对较好。
1.3 样品和数据分析方法
本文的环境参数均按海洋监测规范(2007版)进行调查和分析，所用到的均为表层数据(0.5 m)，利用Excel 2010处理数据，在Surfer和Sigma plot中画图。
2. 结果
2.1 茅尾海环境质量评价
茅尾海为钦州湾北部的一个内湾，北部有茅岭江、钦江和大榄江3条径流注入 (前两者为常年性入海河流)，南部通过狭窄的湾颈与钦州湾的外湾 (钦州港) 相接后，与北部湾相通，是一个典型的受径流影响的袋状内海海湾。其北部沿岸地带几乎遍布池塘养殖，河口区有大片红树林分布，南部湾颈处有小规模的浮排养殖。茅尾海是中国南方最大的近江牡蛎天然采苗和养殖加工基地，享有“中国大蚝之乡”的美誉，并被列为国家级水产种质资源保护区。
茅尾海的周年调查 (表2)，四季的生态环境质量均为中等，其中夏季调查时Iwq最高(1.80)，出现SD和DIN预警，显示水体富营养化，养殖生物受到较高的危害风险；秋季次之，Iwq为1.72；冬季Iwq位居第三，PO4-P发生预警，表明水体发生赤潮的风险较高；春季Iwq最低。就四季总体生态环境质量而言，优劣顺序为春季>冬季>秋季>夏季。图2左图显示，茅岭江口的M10、M11和钦江口的M14、M16在四季的Iwq差异较大，M5在冬季的Iwq明显较其余3个季度的数值低，其余站位四季的Iwq差异均较小。普遍而言，不同季度的环境状况差异不明显，没有哪个季度的Iwq在各站位间占共同的高位或低位，即使在海域平均Iwq最高的夏季，也只有一半的站位数值高于其他季节。
表 2 3个海域四季环境状况分级评价结果Table 2. Comprehensive rating quantitative assessment of four seasons in three sea areas站位
Station茅尾海
Maowei Sea大鹏澳
Dapeng Cove白沙湾
Baisha Bay春
Spr.夏
Sum.秋
Aut.冬
Win.春
Spr.夏
Sum.秋
Aut.冬
Win.春
Spr.夏
Sum.秋
Aut.冬
Win.1 M M G G M M G G M M M M 2 M M M M M M G G G M M M 3 M M G M M G M G M M M M 4 M M M M M M G G M M M M 5 M M G G M M G G G M M M 6 M M M M M M M G M M M M 7 M M M M M M G G G M M M 8 M G M G M M G G M M M M 9 M M M M M G G G M M M M 10 M M M M M M G G M M M M 11 M M M M − − − − * M M M 12 M M M M − − − − * M M M 13 M M M M − − − − * M M M 14 M M M M − − − − − − − − 15 M M M M − − − − − − − − 16 M M M M − − − − − − − − 级别 Level M M M M M M G G M M M M Iwq 1.66 1.8 1.72 1.67 1.91 1.79 1.34 1.84 1.64 2.98 2.21 2.82 警兆 Early warning factor − SD、DIN − PO4-P PO4-P DO、
PO4-P− Chl a PO4-P、
Chl aDIN、
PO4-PDIN、
PO4-PDIN、
PO4-P注：−. 无调查站位；*. 数据缺失
Note: −. No survey stations; *. Data missing![]()
图 2 3个海域四季调查的综合水质标识指数 (左) 及其年度均值 (右)Figure 2. Iwq index (left) and its annual average value (right) of four seasons in three sea areas就各个站位的四季均值而言 (图2右图)，位于茅尾海南北中轴线中部的M8的Iwq (1.41)明显低于其他站位，而茅岭江口的M10、M11和钦江口的M14、M16的Iwq较高 (1.85~2.20)，其余站位数值不高且相近 (1.54~1.76)，这可能与茅尾海的入海径流有较大关系。茅尾海雨量高峰集中在6—8月，降水量约占全年雨量的57%；主要入海河流为茅岭江和钦江，年均径流量分别为15.97×108和11.69×108 m3，输沙量为31.86×104 t、26.99×104 t [20]。夏季 (201106)时大量降水冲刷地表，入海河流携带泥沙、污染物等，降低了海域的透明度，提升了营养物质的含量。茅岭江主要接纳农业污染 (氮肥、磷肥等)，而流经市区的钦江接纳的主要是工业废水和生活污水 (含磷洗涤剂已被限制使用)。在这些因素的共同作用下，夏季时透明度和无机氮出现预警，海域水质全年最差，这与蓝文陆等[21]在2010年6月对该海域的调查结果一致，2010年丰水期时茅尾海DIN浓度大于35 μmol·L−1；而位于两条主要入海河流的河口处4个站位 (M10、M11、M14、M16)的Iwq较其他站位高，环境质量相对较差。韦蔓新等[22-23]根据1983—1999年的调查结果认为，陆源输送对茅尾海磷的影响不大，特别是枯水季节无机磷主要来源于水体自身磷的再生。本研究冬季调查时PO4-P发生警兆，此时为枯水期，海域Chl a均值较低 (1.95 mg·m−3)，平均水温仅11.09 ℃，过低的水温抑制了浮游植物的生长繁殖，致使其对磷酸盐的消耗降低，因而PO4-P出现预警。尽管本海域以贝类养殖为主[24]，而贝类通过滤食水体中浮游植物和有机颗粒物能对海水起净化作用，但北部沿岸遍布的对虾池塘养殖排出的废水会补充海域的营养物质，同时贝类粪便、假粪等溶出营养盐以及水体自身有机体的分解等，因而茅尾海虽然Chl a含量普遍较低，但营养盐含量却不低甚至出现2次预警。此外，在潮汐和河流的相互作用下，河口附近站位的环境状况会出现较强的波动，在Iwq上则表现为这些站位在四季的标准差较大，而非河口区站位的四季标准差则普遍较低。
2.2 大鹏澳环境质量评价
大鹏澳是大亚湾西南部的一个半封闭式浅海小内湾，潮汐性质为不正规半日潮，海水交换条件较差，主要潮流方向为西南—东北，没有大的淡水河流注入，海域生态环境主要受养殖活动和潮汐的影响。该海域的养殖模式主要是鱼类网箱养殖 (面积约40 hm2)和牡蛎延绳式平挂吊养 (约100 hm2)，目前有部分渔排已转型开展海上旅游业，养鱼以观赏为主要目的[25]，而牡蛎吊养分两季：冬苗1—2月下海，当年7—8月收获；夏苗7—8月下海，翌年1—2月收获；由于担心台风对生产的破坏，夏苗挂养规模一般仅为冬苗的1/3[26]。
大鹏澳周年调查 (表2)，春、夏季时的环境状况均为中等，而秋、冬季均为良好。其中秋季的Iwq远低于其余3个季节，仅为1.34，其余3季数值相近，分别为夏 (1.79)、冬 (1.84)、春季(1.91)。按照先级别后数值的判断依据，四季的环境状况以秋季最优，冬季次之，夏季居第三，春季最差。除秋季外，其余3个季节均出现预警因子，其中春季PO4-P预警，夏季DO和PO4-P预警，而冬季Chl a预警，显示该海域在这3个季度水体趋于富营养化，发生赤潮的风险较高；而夏季甚至出现了优先预警因子DO，表明此时养殖场生态环境严重恶化，养殖生物受到危害的风险极高。本次的研究结果与2001—2008年的情形[16]存在明显差异，当时沉积物硫化物、有机碳是常见的预警因子，而水体氮、磷营养盐虽在部分站位出现警兆但未成为整个海域的预警因子，而从2007年开始很多养殖户逐步把重心转向休闲渔业，网箱养鱼逐渐失去主导地位，而牡蛎的养殖规模则变化不大。随着春、夏季水温升高以及台风的出现，沉积物中营养盐的溶出增强，同时牡蛎滤食作用使海域浮游植物生长繁殖受到一定程度的抑制 (表现为春、夏季Chl a质量浓度为3.41、1.60 mg·m−3)，浮游植物对营养盐的下行控制减弱，因而PO4-P出现预警。夏季时海水温度全年最高 (29.76 ℃)，鱼类呼吸作用加剧，养鱼废物和沉积物的氧化分解将明显降低海水中溶解氧的浓度[25]，因而DO出现预警。秋季时水温下降且天气情况稳定，沉积物溶出减弱，而此时挂养的牡蛎尽管规模不如春季大但普遍长势较好，因而秋季海域环境质量状况最好，不但没有因子出现预警，且Chl a水平为年度最低。而在冬季调查时，海域各站Chl a质量浓度偏高 (8.14~12.00 mg·m−3)，半数站位 (D1—D3、D7、D9) 甚至超过10 mg·m−3，显示水体处于较高的富营养化水平[27]，此时正处于牡蛎收获和投苗的时段，且冬季风大，海域受到的人为及自然扰动均较大，沉积物中的营养盐通过再悬浮补充到水体中，促进了浮游植物的生长繁殖，而此时新投放的苗种滤水能力有限，因而海域Chl a浓度出现预警，这种情形在2003年12月亦有出现[16]。
图2 (左图)显示，同一站位的Iwq在一年四季中波动明显，全部站位的Iwq均以秋季最低，过半数站位 (D1—D3，D8—D10)以春季Iwq最高，而D4—D6则以夏季最大，D7则是冬 (1.84)、春季 (1.82)共占高位。由此可见，对照区 (D1—D3)和牡蛎挂养区 (D7—D10)的环境状况类似，Iwq最大值普遍出现在春季，Iwq数值的季节变化趋势也相似，基本都是春>冬>夏>秋季。网箱区 (D4—D6)的Iwq变化有别于其他站位，该区域Iwq在夏季出现最高值，春季次之，秋季最低；分析其原因，主要是夏季这3个站位的DO水平偏低 (<4.5 mg·m−3)而沉积物硫化物水平较高，从而拉高了Iwq的数值。图2 (右图)显示，10个站位的均值相近，四季变幅的站间差异小 (仅D3变幅略低于其他9个站)，这可能与调查区域小而站点布设较密有关。此外，大鹏澳为一弱潮流港湾，潮流速度一般只有10 cm·s−1[28]，冬季涨潮流只影响大鹏澳的北部海域，而本研究的站位布设于南部；夏季涨潮流通过大鹏澳西侧进入南部调查区域，但也只是产生弱的往复流，因而本研究调查区域受潮流的影响不大，这是大鹏澳10个站位环境状况差异小的另一个可能原因。
2.3 白沙湾环境质量评价
白沙湾位于汕头南澳岛东北部，三面环岛，湾口朝北，潮汐为不规则半日潮，潮差大，平均潮差1.68 m。该湾受外海风浪等的影响较小，且无大的河流注入，是发展海水养殖的良好场所，现已形成以牡蛎、龙须菜和网箱养殖为主的养殖格局。随着海水增养殖业的迅速发展，海域污染加重，海洋生态系统结构和功能出现恶化的趋势[29]。
白沙湾的周年调查，4个季度生态环境均为中等 (表2)，其中夏、秋、冬季均出现DIN、PO4-P预警，春季为PO4-P、Chl a预警，显示该海域在调查的4个季度其水体富营养化，发生赤潮风险的可能性较高。曹会斌[30]2008年的逐月调查显示该海域DIN、PO4-P年均值分别为0.44、0.028 mg·m−3，本研究结果表明目前影响白沙湾水质的主要因子为DIN、PO4-P (四季均值分别为0.79、0.07 mg·m−3)，海域氮、磷营养盐含量均已超出《海水水质标准》的Ⅳ类，约比2008年增长了1倍。适量的营养盐能促进浮游植物的生长繁殖，春季的氮、磷含量相比其他三季均为最低 (绝对质量浓度不低，为0.24、0.03 mg·m−3)，随着春季水温的升高，海域浮游植物出现爆发性增长，表现为除B8、B9外的其余8个站位Chl a质量浓度均超过10 mg·m−3，B7更高达22.08 mg·m−3，水体处于明显的富营养化状态；同时浮游植物光合作用消耗大量营养盐，对海域氮、磷浓度起下行控制作用，因而浮游植物生物量很高的春季，海域营养盐浓度相对较低；夏、秋、冬三季DIN含量均超Ⅳ类，PO4-P在夏、冬季超Ⅳ类，尽管营养盐含量很高，但浮游植物生物量并不高，可能是超量的营养盐抑制了浮游植物的生长[31]。表2中四季的Iwq分别为春 (1.64)、夏 (2.98)、秋 (2.21)、冬季 (2.82)，生态环境等级均为中等；综合判断四季环境状况的优劣，以春季环境质量最好，秋季次之，夏季最差。
图2 (左图)显示，各调查站位在四季的Iwq均很分散，显示不同季节环境差异明显。全部站位春季的指数均为四季最低，大部分站位夏季的指数均为四季最高，冬季各站指数普遍高于秋季。单纯就Iwq而言，大小趋势为夏>冬>秋>春季。夏季，龙须菜已经收割完毕，在较高的水温 (28.15 ℃)下鱼类呼吸耗氧加剧，底质有机物氧化分解耗氧量增大[32]；同时由于水温过高，浮游植物数量下降 (Chl a均值4.83 mg·m−3，显著低于春季的12.99 mg·m−3)，对营养盐的消耗有限；加上夏季粤东上升流[33]为该海域输入外源营养盐，这些影响在该季表现为海域PO4-P四季最高，DO最低，因而夏季Iwq高。冬季调查时水温仅13.70 ℃，浮游植物生长缓慢 (冬季Chl a质量浓度为0.93 mg·m−3，为四季最低值)，消耗氮、磷营养盐较少，加上东北季风搅动海水使沉积物中营养盐释放[34]，致使该季营养盐含量高 (冬季DIN四季最高，PO4-P仅次于夏季)，因而Iwq较高。秋季，适宜的水温 (21.88 ℃)使鱼类生长迅速，摄食能力增强，养殖户加大投饵力度造成大量残饵以及鱼类排泄物进入水体[35]，海域DIN水平高 (1.00 mg·L−1)；同时受季风影响，海水透明度四季最低 (0.6 m)，因而秋季Iwq亦不低。春季，由于水温适中因而龙须菜生长较快，对氮磷营养盐吸收速率高 (表现为海区氮、磷均为四季最低)，同时浮游植物大量繁殖，海域DO、SD均为全年最高，这些均导致Iwq降低；尽管春季时Chl a数值很高，但该因子在Iwq的计算中所占权重不大，因而春季Iwq显著低于其他三季。
图2 (右图)显示，B3、B4的年均值略高于其他站位，而B8则最低。B3、B4为网箱养殖区，网箱投饵以及水流受阻，使该区域的生态环境较差，具体表现为Iwq高于其他站位，而同为网箱养殖的B2，由于靠近贝藻混养区，投饵产生的污染物可被附近B1站养殖的紫菜吸收一部分，因而其环境状况较好；此外，B3、B4均被周围的陆地环绕，且鱼排过于拥挤致水流不通畅也是造成其环境较差的原因，并且靠近B4的B5为近岸非养殖区，不能对B4的污染物起减轻作用。位于白沙湾最南端的B8是贝藻混养区，调查时发现其底质很细腻；该站位置最靠南，海流或潮流对其环境影响不大，而静水条件下龙须菜吸收营养盐的量明显高于流水状态[36]；这些影响表现为该站各指标的年均值，DO、SD均为海域最高，而DIN、PO4-P为海域低值，因而其Iwq年均值最低。而B11—B13由于缺少了Iwq最低的春季数据，其年均值实际上是夏、秋、冬三季的均值，因而数值相对较高。图中还显示，各站的标准差都很大，多数站位的标准差超过均值的一半，说明白沙湾环境状况不稳定，季节变化明显。
2.4 3个海湾环境质量比较
比较3个亚热带海湾在2011—2012年的四季环境质量状态 (图3)，春季Iwq以大鹏澳略高，茅尾海与白沙湾数值很接近；夏季则是白沙湾处于最高位，而茅尾海与大鹏澳几乎重合；秋、冬两季均是白沙湾数值最高，3个海域的数值拉开差距。四季调查，除大鹏澳在秋、冬季为良好，其余均为中等。按先级别后Iwq的判定原则，夏、秋、冬三季均以白沙湾的环境质量最差，春季则是大鹏澳的最差；秋、冬两季均是大鹏澳的质量最好而茅尾海居中，春季茅尾海和白沙湾状态相似，夏季则是茅尾海和大鹏澳差别小。图3还显示，春季3个海域的Iwq差别小，而其余季节这3个海域的状态指数差距大。
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图 3 3个海域四季综合水质标识指数比较G表示生态评级为良好Figure 3. Comparison of Iwq index of four seasons in three sea areasG. good level图3显示，白沙湾的Iwq季节差异显著，夏、冬季的数值明显高于春、秋季，其中夏季站位间的数值差异很大 (变化范围1.80~3.33)，其余三季站间差异不大。大鹏澳秋季的指数略低，其余三季数值相近，而站间差距亦以夏季最大。茅尾海四季指数均值差异小，而站间差异在夏、冬季均较大。可见，3个海湾在夏季时站间差异均为四季最大，说明夏季调查时海域环境质量状况不稳定。
2.5 白沙湾2011—2018年环境质量评价
由于2005年南澳县龙须菜优良品种选育成功，白沙湾龙须菜产量从2005年 (2 398 t)至2011年 (27 217 t)增长了10倍 (数据引自南澳县渔业统计年报)，该湾养殖模式也逐渐从以网箱养鱼、养殖贝类为主发展为龙须菜套养、贝类单养、贝藻混养等多种模式[12]。对白沙湾开展持续调查，可以了解大型藻类养殖对海域生态环境的改善作用，为更好地推广藻类养殖提供科学依据。
由于2013—2018年在白沙湾开展的持续调查只包含了表1中的5个水质参数 (DO、SD、DIN、PO4-P、Chl a)，为便于可比性，在这一小节中对2011—2012年评价及Iwq的计算与2013—2018年保持一致。由于只有5个水质指标，表1中单个站位生态环境等级的评价标准修改为：DO指标必须为良好，其余4项指标中，无1项指标为较差，且最多允许1项为中等 (G)；DO指标必须为良好或中等，其余4项中有3项的状况等级是中等 (M)；DO指标为差，或2项以上的状况等级是较差 (B)。
图4显示，白沙湾13个站在2011—2018年共14个航次的调查中，除了201111 (13站)、201202 (13站)、201208 (12站)的绝大多数站位的Iwq均大于2.0以外，其余航次的多数站位Iwq均普遍低于2.0。其中明显区别于同航次多数站位的有201408的B3 (DO浓度太低致Iwq略高)、201205的B4 (PO4-P含量较高拉高了该站的Iwq)、201705的B5 (调查时该站发生赤潮，Chl a很高，拉高了Iwq)、201208的B8 (DIN、PO4-P含量均明显低于同航次的其他站位致使Iwq较低)。
图5显示，除201111、201202、201208这3个航次Iwq较高且等级均为较差外，其余航次的Iwq均低于2.0且等级为中等或良好。2011、2012年时白沙湾水环境质量状况相对较差，4次调查共3个指标出现8次一般预警，分别为PO4-P (201111、201202、201205、201208)、DIN (201111、201202、201208)、Chl a (201205)；2013年之后明显改善，预警频率显著下降，仅出现1次DO优先预警 (201408)、2个指标4次一般预警：Chl a (201504、201605、201808)及PO4-P (201305)。由于水体DIN、PO4-P含量显著下降，使Iwq明显降低，相关文献亦证实白沙湾在2013年之后氮、磷营养盐含量较低[37]，龙须菜的大规模养殖吸收并带走水体中的营养物质可能是主要原因。有研究证实，在富营养化海域栽培大型海藻，可以对赤潮藻类产生竞争抑制，改善水质[38]。
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图 5 白沙湾2011—2018年各航次调查的综合水质标识指数均值及评级Figure 5. Average Iwq index of Baisha Bay and its level in 2011–20183. 讨论
3.1 主要污染物分析
为了提高评价的准确性和管理效率，很多现行的评价方法都会在状态和质量元素的基础上，把评价对象的生态环境质量状态划分类别[8]。同时，人们已充分认识到预警因子对即将发生的环境影响或对人类产生压力的预测的必要性[8]。根据表2，3个海湾四季调查的结果显示：入选养殖海域综合分级评价与预警方法的5个水环境因子均发生预警，分别是DO、SD、DIN、PO4-P、Chl a。图6显示，PO4-P在3个海湾均出现了预警 (7次)，在白沙湾更是四季都发生预警，且白沙湾PO4-P的Pi年均值达3.83，为3个海湾年均值最高者；大鹏澳在春、夏季出现PO4-P警兆，这两季的Pi均在4.0左右；茅尾海冬季航次PO4-P预警，但Pi明显低于大鹏澳和白沙湾。DIN预警4次：在茅尾海的夏季和白沙湾的夏、秋、冬三季均发生预警，且白沙湾DIN的Pi年均值大于4.0。Chl a作为浮游植物生物量的一个重要指标，分别在大鹏澳 (冬)和白沙湾 (春)各出现一次预警，表明在某些季节浮游植物大量繁殖，有发生赤潮的危险。茅尾海夏季海水透明度偏低，SD出现预警；大鹏澳夏季出现DO预警。在这5个因子中，DO、SD属优先预警，其余3个属一般预警，可见优先预警因子只是偶尔出现，但要引起重视。夏季时 (丰水期)茅尾海北部河流输入的泥沙影响了海水的透明度，同时带来丰富的营养盐，但同期调查的Chl a数值并不高 (2.14 mg·m−3)，DIN虽然预警但其Pi并不特别高 (3.20)，笔者认为，茅尾海夏季水体存在一定的富营养化风险；相比之下，白沙湾夏季预警因子DIN、PO4-P的Pi更大，Chl a质量浓度 (4.83 mg·m−3)更高，其富营养化风险更大。需要引起注意的是，大鹏澳夏季出现DO警兆，主要是因为网箱区的3个站位 (D4—D6)其DO质量浓度介于4.10~4.45 mg·L−1，均低于4.50 mg·L−1的预警值，因而出现预警，这显示夏季时大鹏澳网箱区生态环境严重恶化；日本在1999年颁布的“水产养殖可持续发展法”中规定的网箱养殖场DO必须大于3.6 mg·L−1[39]，尽管这3个网箱区站位在夏季的DO值大于该规定值，但2001年6月和2004年10月[16]、2009年9—11月和2010年6—7月 (未发表数据)该片海域均出现低于4.5 mg·L−1甚至低于3.6 mg·L−1的DO低值，表明大鹏澳养殖场生态环境恶化已有十多年的历史，亟需引起养殖场主和海域使用管理者的重视。
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图 6 3个海域四季调查的预警因子的单因子指数SP. 春；SU. 夏；AU.秋；WI. 冬Figure 6. Pi index of early warning factors of four seasons in three sea areasSP. Spring; SU. Summer; AU. Autumn; WI. Winter水体缺氧和沉积环境严重恶化是中国海水鱼类网箱养殖面临的主要风险，缺氧导致死鱼，底泥通过溶出影响水体的各项理化因子。此外，投饵式养殖使水体氮磷营养盐含量升高，使水体富营养化并提高了赤潮发生概率。当这些因子超过预警标准时，养殖生态环境恶化，直接或间接地对养殖鱼类和底栖动物造成危害[40]。本研究期间3个海湾出现的5个预警因子均属水环境部分，而沉积环境的2个因子均未出现预警，但对养殖生物影响最大的缺氧状况出现在夏季的大鹏澳网箱养殖区，表明夏季大鹏澳养殖环境有恶化迹象，而茅尾海和白沙湾的生态环境质量的主要问题是富营养化风险。3个海湾四季调查预警因子出现的次数分别为春 (3次)、夏 (6次)、秋 (2次)、冬季 (4次)，总体上夏、冬季各海湾的生态环境质量相对较差，而春、秋季较好，这与表1的结果较为一致。表1显示，夏、冬季这3个海湾均有因子发生预警，春、秋季有部分海湾不但没发生预警，甚至环境评级为良好。尽管如此，白沙湾在四季均存在富营养化的风险，而茅尾海和大鹏澳在部分季节可能出现富营养化，表明这3个亚热带养殖海湾中营养物质的含量已达到需要警惕的程度。
3.2 Iwq的分布特征
由南至北，随着纬度增加，调查站位四季的Iwq差距也显著增大，表明季节更替对海湾环境的影响亦趋明显。茅尾海M8站在夏、冬两季的Iwq明显低于该海域同期调查的其他站位，主要原因是该站位的SD数值高使该指标的Pi低，从而降低了该站位的Iwq，M8位于茅尾海中部，北部河流以及从南部湾颈进入的潮流在此产生的影响可能均很弱或相互抵消，因而SD数值高；而M10—M11在夏季SD相当低，夏、冬季PO4-P含量很高，从而明显拉高了这两站的Iwq，夏季茅岭江输入大量泥沙降低了河口区的透明度，同时输入大量磷营养盐，冬季时河流输入虽然减少但影响仍在，同时沉积物中储存的营养盐释放出来，因而丰、枯水季节M10—M11的PO4-P含量均较其他站位偏高。大鹏澳各站Iwq年均值差异小，网箱区的站位 (D4—D6)略高，而邻近D4的D3虽处于对照区但其Iwq年均值亦较高，可能是受网箱养殖的影响。白沙湾的B8的年均Iwq明显低于该海域的其他站位，主要是该站夏季的Iwq特别低所引起的，而夏季该站的DIN、PO4-P含量为海域最低且与其余站位差距较大，可能是由于该站的藻类养殖吸收了大部分的营养盐所致，同时其所处位置受海流、潮流影响不大，因而这两个指标的Pi相比之下就偏低；与深圳大鹏澳一样，白沙湾也是网箱区的Iwq略高于其他区域。
比较这3个海域Iwq值在一年四季中的变化，发现淡水河流的注入以及四季的更替对Iwq的影响较大，同时养殖方式、养殖生物对局部区域的影响亦不可忽视。白沙湾开口宽阔，向北面朝东海，水体交换能力强，同时处于粤东上升流的影响范围，湾内网箱养殖约有30年，贝藻养殖10多年；大鹏澳是大亚湾西南一小内湾，水交换能力差，网箱养殖约30年，贝类吊养约20年；茅尾海主要受河流注入的影响，湾内有中等规模的贝类养殖，河口区分布着大片红树林。3个海湾四季的生态环境质量总体上以茅尾海最好，大鹏澳居中，白沙湾最差。
本研究发现，所使用的Iwq在不同级别之间的可比性不确定，如大鹏澳四季的评价级别和Iwq分别为春 (M，1.91)、夏 (M，1.79)、秋 (G，1.34)、冬季 (G，1.91)，显然冬季的Iwq高于夏季，但级别却是冬季良好而夏季中等；站位间进行比较时也出现了类似的情况 (Iwq略)。Iwq是针对河流水质综合评级而提出的方法[18]，养殖海域综合分级评价方法[16]则是以海湾养殖环境为对象的，本文把两者结合使用，在参数的选择和标准的划分方面可能还存在不完善的地方，需要后续改进。
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图 1 环保酵素无菌上清液对水产病原菌的生长抑制作用
Figure 1. Inhibitory activity of sterile supernatant of garbage enzyme against aquatic pathogens
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图 2 自制环保酵素无菌上清液对嗜水气单胞菌攻毒斑马鱼的保护作用
**. 组间数据有显著差异 (P<0.01)
Figure 2. Protective effect of sterile supernatant of home-made garbage enzyme on Danio rerio challenged with A. hydrophila
**. Very significant difference between different columns (P<0.01).
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图 3 不同温度 (a)、蛋白酶 (b) 和pH (c) 处理后对酵素的抑菌效果
不同字母表示有显著性差异 (P<0.05)
Figure 3. Effect of heating (a), protease (b) and pH (c) on inhibitory activity of home-made garbage enzyme against aquatic pathogens
Different letters indicate significant differences (P<0.05).
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图 4 自制环保酵素发酵菌株bj001的菌落和菌体形态
a. bj001菌落形态；b. bj001菌体在光学显微镜下的形态 (放大倍数10×100)
Figure 4. Colony and cell morphology of fermentation strain bj001 from home-made garbage enzyme
a. Colony morphology of bj001; b. Morphological characteristics of bj001 cells under light optical microscope (Magnification 10×100)
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图 5 基于ITS序列构建的库德毕赤酵母bj001系统发育树
Figure 5. Phylogenetic tree of P. kurdii bj001 constructed based on ITS sequence
表 1 自制环保酵素无菌上清液对水产病原菌的致死作用
Table 1 Lethal effects of sterile supernatant of home-made garbage enzyme against aquatic pathogens
病原菌
Pathogen酵素体积分数 Enzyme volume fraction/% 17.0 16.5 16.0 15.5 15.0 14.5 14.0 13.5 13.0 12.5 12.0 11.0 10.0 嗜水气单胞菌 245 A. hydrophila 245 − − − − − − − − − − − + + 轮虫弧菌 SP-1 V. rotifer SP-1 − − − + + + + + + + + + + 哈维氏弧菌 SP-1 V. harveyi SP-1 − − − + + + + + + + + + + 坎氏弧菌 SP-1 V. candida SP-1 − − − + + + + + + + + + + 注：+. 平板上有菌落生长；−. 无菌落 Note: +. Growth of bacterial colony on agar; −. No colony 
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