自20世纪80年代后期，三唑磷农药在海水贝类养殖中被广泛用作清涂、清塘药剂，大大提高了贝类的养殖产量^[1]。三唑磷农药在水产养殖业中的使用范围和强度不断增大，且农药施用不规范，已对海洋生态环境造成了潜在威胁^[2]，并可通过食物链对人类健康构成潜在风险。国内海洋生态环境中的三唑磷农药污染日益引起人们的关注。舟山市某水产养殖场施用三唑磷农药20 d后其水体中三唑磷残留量高达0.11 mg·L^−1[1]，九龙江表层水中三唑磷残留量也高达1.055 μg·L^−1[2]。由于三唑磷在水环境中具有较高的稳定性和较长的半衰期^[3]，三唑磷污染对水生生物可产生明显的毒性效应，主要包括神经毒性^[4-5]、生殖发育毒性^[6-7]、免疫毒性^[8]以及氧化损伤效应等^{[5, 9-10]}。三唑磷对稻褐飞虱 (Nilaparvata lugens) 和灰飞虱 (Laodelphax striatellus) 的产卵具有明显的刺激作用^[11]；三唑磷作用下翡翠贻贝 (Perna viridis) 卵巢中几种与生殖调控相关基因的表达被显著诱导^[12]。以上研究表明三唑磷农药具有一定的环境雌激素效应。

在贝类生态毒理学研究中，研究者往往忽略了雌、雄个体毒理效应的性别差异性。近年来，关于内分泌干扰污染物毒理效应的性别差异研究逐渐成为生态毒理学领域关注的热点，已有多篇文献报道了典型溴系阻燃剂2,2',4,4'-四溴联苯醚 (BDE 47)、四溴双酚A (TBBPA)、多环芳烃以及重金属锌等污染物毒性效应的性别差异^[13-16]，研究表明同种海洋贝类不同性别对同一污染物的毒性响应存在明显差异。Zhang等^[17]研究也发现，三唑磷对雌、雄翡翠贻贝性腺代谢组的毒性效应具有明显的性别特异，三唑磷作用下翡翠贻贝卵巢能量代谢和渗透压调节紊乱，而在精巢中只发生能量代谢异常。污染物对生物体作用的早期预警信号通常表现为体内生化反应异常，其中氧化应激作为污染物作用的主要效应之一，常被用作生物标记物来监测环境污染^[18]。因此，本研究从氧化损伤效应入手，研究了三唑磷对雌、雄翡翠贻贝毒性效应的性别差异。

1.   材料与方法

1.1   实验样品及处理

实验所用翡翠贻贝采自深圳大鹏湾养殖网箱，选取壳长6~7 cm的翡翠贻贝个体进行实验。实验开始前，翡翠贻贝在充气海水中驯养2周 [ 海水盐度32±1，pH 8.2±0.1，温度 (28±0.5) ℃，溶解氧 (6.6±0.5) mg·L⁻¹]，日换水100%，并定时投喂小球藻藻液。根据笔者前期三唑磷对翡翠贻贝急性毒性的实验结果^[12]，设定本研究三唑磷农药对翡翠贻贝慢性毒性试验质量浓度为35 μg·L⁻¹ [1/100 96 h 半致死浓度 (LC₅₀)]。20%三唑磷乳油农药购自浙江新农化工有限公司，并用丙酮稀释配置母液。实验设溶剂对照组 (0.001%丙酮) 和三唑磷农药暴露组。每个30 L的玻璃缸中含25 L净化海水并投放20只翡翠贻贝，三唑磷暴露期间培养条件与翡翠贻贝驯养阶段一致。实验持续15 d，每日投喂小球藻并定时更换含有相应浓度三唑磷农药的新鲜海水 (日换水100%)。暴露15 d后，每组分别随机采集6只雌贝 (性腺为橙黄色或橘红色) 和雄贝 (性腺为乳白色) 解剖取其鳃组织，冷冻于液氮中用于酶活性分析。

1.2   三唑磷作用下翡翠贻贝鳃组织中酶活力测定

取出各组翡翠贻贝鳃组织，加9倍匀浆缓冲液 (50 mmol·L⁻¹磷酸缓冲液、1 mmol·L⁻¹ DDT、l mmol·L⁻¹ EDTA和150 mmol·L⁻¹ KCl) 匀浆，匀浆混合物在4 ℃，2 500 r·min⁻¹离心10 min，取其上清液于−80 ℃保存，用于测定组织蛋白、乙酰胆碱酯酶 (AchE)、谷胱甘肽硫转移酶 (GST)、超氧化物歧化酶 (SOD) 和过氧化氢酶 (CAT) 酶活力以及还原型谷胱甘肽 (GSH) 和丙二醛 (MDA) 含量。

总蛋白质量分数：使用考马斯亮蓝染色法测定。以牛血清白蛋白为标准蛋白，绘制标准工作曲线。

AchE参考Ellman等^[19]的方法，以碘化乙酰胆碱为底物测定。活力单位定义为：每毫克组织蛋白在37 ℃保温6 min，水解反应体系中1 μmol底物为1个AChE活力单位。

GST参考Moron等^[20]的方法。活力单位定义为每毫克组织蛋白在37 ℃反应1 min扣除非酶促反应，使反应体系中GSH浓度降低1 μmol·L⁻¹为1个酶活力单位。

SOD采用黄嘌呤氧化酶法测定^[21]。活力单位定义为每毫克组织蛋白在1 mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为1个SOD活力单位。

CAT基于CAT会分解过氧化氢，通过检测过氧化氢的含量来测定CAT的活力^[22]。活力单位定义为每毫克组织蛋白每分钟分解1 μmol的过氧化氢 (H₂O₂ )的量为1个CAT酶活力单位。

GSH参考Moron等^[20]的办法测定。

MDA利用硫代巴比妥酸反应物法测定^[23]。

GST、SOD和CAT 的测定结果用U·mg⁻¹(蛋白质)表示。GSH和MDA含量以质量摩尔浓度(μmol·g⁻¹)表示。以上指标均采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒进行测定。

1.3   数据处理

所有实验数据以“平均数±标准差 (${\overline X } \pm {\rm SD} $)”表示，采用SPSS 13.0软件，经单因素方差分析 (One-way ANOVA) 比较丙酮对照组与三唑磷暴露组之间是否存在显著性差异，P<0.05视为差异显著。

2.   结果与分析

2.1   三唑磷对雌、雄翡翠贻贝AchE 活力的影响

AchE是有机磷农药的作用靶标酶，也是用于评价水生生物对神经毒性化合物暴露效应的一种重要生物标志物，是有机磷农药污染的有效诊断工具^[24]。有机磷类污染物的致毒机理主要为其磷酰基与AchE活性部分共价结合形成磷酰化胆碱酯酶，从而失去分解乙酰胆碱的能力，使细胞内乙酰胆碱含量蓄积从而加剧抑制AchE活力，使中枢神经系统及胆碱能神经过度兴奋，并引发一系列的异常表现 (取食降低、行动缓慢、躲避天敌能力减弱等)^[25]。目前AchE已被广泛应用于各种贝类生态毒理学研究中，如斑马纹贻贝 (Dreissena polymorpha)^[26]、褐贻贝 (P. perna)^[27]、紫贻贝 (Mytilus galloprovincialis)^[28]、菲律宾蛤仔 (Ruditapes phillippinarum)^[29]和红树牡蛎 (Crassostrea rhizophorae)^[30]等。Choi等^[29]观察到甲硫醚、毒死蜱和二嗪磷对菲律宾蛤仔外套膜中AchE的抑制作用，其活性显著降低至对照组的35%~67%；Doran等^[31]研究也发现2 mg·L⁻¹毒死蜱暴露96 h后，一种淡水贝类Amblema plicata外套膜中AChE酶活力显著降低至对照组的40%~60%。

本研究中低浓度三唑磷慢性暴露胁迫15 d后，雌性翡翠贻贝鳃组织中AchE酶活力略有降低 (P>0.05)，而雄性翡翠贻贝鳃中AchE活力则被显著抑制 (P<0.05)，为丙酮对照组的79.43% (图1-a)。多项研究显示三唑磷农药对生物体内乙酰胆碱酯酶活力的抑制作用^{[4-5, 32-33]}。如Wang等^[4]研究表明三唑磷可抑制鲤 (Cyprinus carpio) 体内AchE活性，且随作用剂量和暴露时间的增加抑制作用逐渐增强；Liu等^[5]报道三唑磷可抑制金鱼 (Carassius auratus) 各组织内AchE活性，尤其是脑组织低至对照组的33.3%。本研究中，三唑磷农药作用15 d后雄性翡翠贻贝鳃组织中AchE活力表现出明显的抑制作用，表明三唑磷农药暴露对翡翠贻贝具有明显的神经毒性，且雄性翡翠贻贝鳃组织中AchE对三唑磷农药的暴露响应更敏感。刘海涛等^[34]研究发现雄性家蚕 (Bombyx mori) 对有机磷农药辛硫磷的LC₅₀高于雌性家蚕，且辛硫磷作用后雄蚕中肠中AchE活性降低，雌蚕AchE活性升高，雌雄间差异明显^[35]。这可能与有机磷农药在不同性别生物体中的代谢差异有关，郑波等^[36]研究发现螨胺磷在雄性大鼠中更容易被清除。目前尚未见有三唑磷农药对同种生物不同性别个体体内AchE活力影响差异的报道，本研究首次关注了此种性别差异，对研究生物标志物的性别特异性具有一定意义。

图  1  三唑磷对雌、雄翡翠贻贝鳃组织中乙酰胆碱酯酶、谷胱甘肽硫转移酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活力以及还原型谷胱甘肽、丙二醛含量的影响

*. P<0.05

Figure  1.  Effects of triazophos exposure on activities of AchE, GST, SOD and CAT, and contents of GSH and MDA in gills of female and male P. viridis

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2.2   三唑磷对雌、雄翡翠贻贝氧化损伤效应

外源物质对生物体造成氧化应激，主要是由于污染物作用下细胞内产生大量活性氧类物质 (ROS) 和细胞内抗氧化能力之间的不平衡造成^[37]。生物体细胞内抗氧化酶活力和抗氧化物质含量的变化能直观反映有机体的抗氧化状态，因此可作为判断机体氧化损伤程度的生物标志物。本研究中在三唑磷农药作用下，雌性翡翠贻贝鳃组织中GST活力略微降低(P>0.05)，而雄性个体鳃组织中GST活力显著降低 (P<0.05)，为对照组的81.67% (图1-b)。另外，35 μg·L⁻¹三唑磷农药作用15 d后，雌、雄翡翠贻贝鳃组织中SOD和CAT活力均显著降低 (P<0.05)，为对照组的70%~82.68% (图1-c、图1-d)。由此可见 GST活力在雄性翡翠贻贝鳃组织中对三唑磷的响应更敏感，而 SOD和CAT两种抗氧化酶对三唑磷的暴露响应则无明显性别差异性。GST 是生物体解毒酶系的重要组成成员，主要催化生物体内各种化合物与GSH 的共价结合。SOD和CAT是细胞内抗氧化防御系统的第一道防线，SOD催化细胞内氧自由基 ($\rm{O}_2^{^ -} $·) 转化为H₂O₂和氧气 (O₂)，随后CAT则催化H₂O₂为H₂O和O₂^[10]。本研究中GST、SOD和CAT酶活力显著降低，这可能是因为三唑磷对翡翠贻贝细胞的氧化损伤已经超过了细胞本身的承受能力，大量活性氧产物得不到有效清除，削弱了抗氧化酶的活力，甚至从转录翻译水平抑制了抗氧化酶基因的表达^[38]。Wang等^[10]研究三唑磷对斑马鱼 (Danio rerio) 的氧化损伤效应，发现斑马鱼脑组织和肝脏中的SOD和CAT活力显著升高。然而，也有研究表明三唑磷作用后金鱼体内的SOD和CAT活力却显著降低^[5]。无论抗氧化酶活性增加还是下降，均表示机体内生成了大量的活性氧产物，生物体抗氧化防御系统的正常功能已被扰乱。

GSH是一种非酶抗氧化剂，能调节氧化应激诱导的脂质过氧化，从而对细胞内产生的氧化损伤提供二级保护^[10]。本研究中雌性翡翠贻贝鳃组织中GSH含量略微减少 (P>0.05)，而雄性翡翠贻贝鳃组织中GSH含量则显著升高 (P<0.05，图1-e)。雌、雄翡翠贻贝GSH含量对三唑磷的暴露有非常明显的性别差异，雌性翡翠贻贝中GSH含量降低，而雄性个体中GSH含量显著升高，表明雄性翡翠贻贝对环境的适应性更强，能促使细胞内生成更多的GSH用于缓解三唑磷农药引起的氧化损伤效应。此外，脂质过氧化也是氧化应激的生物标志物之一，主要通过测定细胞内MDA含量来进行评估。本研究中三唑磷作用15 d后，雌、雄翡翠贻贝鳃组织中MAD含量均显著升高，分别为对照组的1.29倍和1.54倍 (图1-f)。研究显示沼蛙 (Rana limnocharis) 蝌蚪在三唑磷胁迫下，MDA含量随三唑磷浓度的增加和时间的延长而显著升高^[39]。类似结果在斑马鱼中也有发现，其肝脏和脑组织中MDA含量随三唑磷浓度升高和暴露时间延长而增加^[10]。MDA含量能反应生物体脂质过氧化的程度，本研究中翡翠贻贝体内MDA含量显著升高，表明三唑磷农药对雌、雄翡翠贻贝均造成了明显的氧化损伤。雄性翡翠贻贝体内MAD含量变化倍数高于雌性，表明三唑磷暴露对雄性翡翠贻贝造成的氧化损伤作用更强。

三唑磷暴露显著影响了翡翠贻贝鳃中抗氧化指标 (SOD、CAT和GSH) 的活力和含量，MDA含量显著升高，表明三唑磷对翡翠贻贝鳃组织造成了明显的氧化损伤效应。雌、雄翡翠贻贝SOD和CAT活力对三唑磷胁迫的响应较为一致，无明显的性别差异，而GST活力、GSH和MDA含量变化则表现出明显的性别差异，这三者在雄性翡翠贻贝中对三唑磷暴露响应更敏感。类似的研究在福建牡蛎 (C. angulate) 中也有发现，在重金属锌 (Zn)作用下雄性性腺SOD和CAT活力在整个暴露过程中一直被强烈抑制，而这些酶的活性在雌性性腺中却逐渐恢复，推测雌、雄牡蛎对Zn胁迫的氧化损伤效应也不相同^[15]。双酚A作用下酶活分析显示福建牡蛎雄性与雌性性腺的抗氧化酶活性经抑制后逐步上调，但雌性个体上调更快^[16]。此外，性别差异响应在栉孔扇贝 (Chlamys farreri) 中也有发现，雄性扇贝肝胰腺抗氧化系统对多环芳烃䓛的暴露响应比雌性更敏感，相应的雌性扇贝受到的氧化损伤程度更严重^[40]。由此可见，内分泌干扰类污染物对海洋贝类的氧化胁迫效应具有明显的性别差异；这种性别差异可能与雌、雄个体自身的生物学差异有关。本研究中雌性翡翠贻贝鳃组织中GSH含量显著高于雄性 (图1-c)，而高含量的GSH对外源刺激所引发的氧化应激具有较好的缓冲作用，从而可能导致雌性翡翠贻贝鳃组织中GSH含量在三唑磷暴露后没有显著变化。此外，吉成龙^[41]的研究也发现与正常雄紫贻贝鳃组织代谢谱相比，雌紫贻贝鳃中谷氨酸盐、亚牛磺酸水平高，而精氨酸水平低。雌、雄紫贻贝鳃组织中有 58 个蛋白丰度存在差异，其中雄紫贻贝的鳃组织中的细胞骨架蛋白、代谢相关酶以及应激相关的蛋白种类及水平高，推测雄紫贻贝具有更强的抗应激能力。

综上，本研究首次关注了三唑磷农药对海洋贝类神经毒性和氧化损伤效应的性别差异，今后在贝类生态毒理学研究和生物标志物筛选中，性别是应被充分考虑的一个重要因子，其对指示环境污染具有重要价值。