Gender differences in neurotoxicity and oxidative damage of triazophos on Perna viridis
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摘要:
文章以具有环境指示功能的翡翠贻贝 (Perna viridis) 为研究对象，首次研究了三唑磷对其神经毒性和氧化损伤效应的性别差异性。实验测定了35 μg·L−1[1/100 96 h 半致死浓度 (LC50)]三唑磷慢性暴露15 d后雌、雄翡翠贻贝鳃组织中乙酰胆碱酯酶 (AchE) 和几种抗氧化指标的变化特征。结果显示，三唑磷作用15 d后雌性翡翠贻贝鳃组织中AchE活力无明显变化，而雄性个体中AchE活力被显著抑制。几种抗氧化指标对三唑磷暴露也表现出一定的性别差异，其中超氧化物歧化酶 (SOD) 和过氧化氢酶 (CAT) 活力在雌、雄翡翠贻贝鳃组织中均被显著抑制，丙二醛 (MDA) 均显著升高。谷胱甘肽硫转移酶 (GST) 活力和还原型谷胱甘肽 (GSH) 含量变化则表现出明显的性别差异，仅雄性翡翠贻贝GST活力和GSH含量有显著性变化。综上，三唑磷农药对翡翠贻贝鳃组织表现出明显的神经毒性和氧化损伤效应，其中雄性翡翠贻贝对三唑磷暴露的响应更为敏感。
Abstract:We studied the gender differences of the neurotoxicity and oxidative damage effects of triazophos on Perna viridis that has function of environmental indicator for the first time. The changes of acetylcholinesterase (AchE) and several antioxidant indices in gill tissues of male and female were determined after 15 d of chronic exposure to 35 μg·L−1 (1/100 96 h LC50). The results show that there was no significant change in the AchE activity in female's gill tissue after being treated with triazophos for 15 d, while the AchE activity in male was significantly inhibited. The activities of superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) in gill tissues of both male and female were significantly inhibited, and the malondialdehyde (MDA) content was significantly increased. The activity of glutathione S-transferase (GST) and the content of reduced glutathione (GSH) showed significant gender differences. Only the GST activity and GSH content in male had significant changes. In conclusion, triazophos shows obvious neurotoxicity and oxidative damage effects on gill tissue of P. viridis, and the male was more sensitive to triazophos exposure.
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Keywords:
- Perna viridis /
- Triazophos /
- Neurotoxic effect /
- Oxidative stress /
- Gender difference
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马氏珠母贝 (Pinctada martensii) 又称合浦珠母贝，是我国南方海水珍珠养殖的主要品种。珍珠自古以来就记载有美容、抗衰老、抗氧化等功效。目前，已有相关以马氏珠母贝肉为基料提取各种功效 (如抗氧化、提高免疫力、抗炎等) 组分的研究[1-4]；而有关珠母贝黏液中活性功效物质的研究尚未见报道。珠母贝黏液是马氏珠母贝在珍珠形成过程中其外套膜不断分泌的液体，黏度较高，该黏液促使珍珠质形成，存在于软体和贝壳之间[5]。因此，基于黏液与珍珠形成的密切关系，探索黏液中可能存在的一些功能物质将极大促进资源的充分利用。水产动物体表黏液的物质构成及生化功能最早在鱼类中有报道，主要含有黏多糖、糖蛋白、水解性酶类，而双壳类的体表黏液细胞的类型与分布与鱼类较为相似[5]。珠母贝黏液是其产出优质珍珠的关键，其中糖蛋白可能起到重要作用[5]。
糖蛋白是由糖类和蛋白质或多肽以共价键连接构成的化学物质，动植物、微生物和病毒均含有糖蛋白[6-8]。糖蛋白是一类重要的具有生物活性的 物质，郁迪等[9]研究发现菲律宾蛤仔 (Ruditapes philippinarum) 糖蛋白质量浓度达30 mg·mL−1时癌细胞抑制率高达72.49%，具有一定的抗肿瘤作用；陈淑敏等[10]提取出的曼氏无针乌贼 (Sepiella japonica) 缠卵腺抗菌糖蛋白对大肠杆菌 (Escherichia coli) 及金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) 具有显著抑菌效果；糖蛋白还具有降血脂、降血糖、抗氧化、增强免疫调节等功能[11-14]。因此，本研究对马氏珠母贝黏液中的糖蛋白进行提取、分离纯化，并对其抗氧化活性进行评价，以期为探索马氏珠母贝黏液相关功效物质提供理论基础数据。
1. 材料与方法
1.1 材料与试剂
原料预处理：将从雷州市珍珠贝养殖场购置的马氏珠母贝肉与其黏液进行分离过滤，将黏液分装于250 mL塑料瓶中，−20 ℃冻藏备用。Sephacryl S-200 High Resolution (GE Healthcare Bio-Science)；2,2-联苯基-1-苦基肼基(DPPH，上海麦克林生化科技有限公司)；牛血清蛋白 (Bovine serum albumin, BSA，GENVIEW)；Folin-酚甲Ⅰ、Folin-酚Ⅱ、Folin-酚乙、预染蛋白Marker (10~245 kD，北京鼎国昌盛生物技术责任有限公司)；考马斯亮蓝染色液、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液 (5×)、电泳液 (Tris‒Gly, Powder)、凝胶配制试剂盒、Protein Ladder (10~200 kD，非预染)，碧云天生物技术；无水乙醇、氯化钠 (NaCl)、抗坏血酸、30%过氧化氢、冰醋酸、氢氧化钠、葡萄糖、苯酚、硫酸、盐酸 (HCl)、三羟甲基氨基甲烷 (Tris)、硫酸亚铁 (七水)、水杨酸钠、焦性没食子酸均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
PS-40A超声波清洗机 (济南鑫贝西生物技术有限公司)；FDU-1100真空冷冻干燥机 (东京理化器械株式会社)；LD-50G-D超纯水机 (重庆利迪实验仪器设备有限公司)；CR22GⅡ高速冷冻离心机 (日立工机株式会社)；BSA124S-CW型电子天平 (赛多利斯科学仪器有限公司)；SHB-B95A型循环水式多用真空泵 (郑州长城科工贸有限公司)；JIDI-20R型台式高速冷冻离心机 (广州吉迪仪器有限公司)；BS-100A自动部分收集器、HL-2型数字恒流泵 (上海青浦沪西仪器厂)；JY5002电子天平 (上海衡平仪器仪表厂)；DK-98-Ⅱ型电热恒温水浴锅 (天津市泰斯特仪器有限公司)；UV-2550型紫外分光光度计 (日本岛津公司)；DYY-8C型电泳仪 (北京六一生物科技有限公司)。
1.3 实验方法
1.3.1 珠母贝黏液糖蛋白的粗提
将黏液解冻后，于4 ℃下6 000 r·min−1离心15 min，取上清液。分别用直接醇沉法、盐提醇沉法、水提醇沉法得到3种黏液糖蛋白的粗品，计算得率。公式为：
$$W{\rm{ = }}\dfrac{m}{M}{\rm{ \times 100{\text{%}} }}$$ (1) 式中W表示糖蛋白粗品得率；m表示糖蛋白粗品质量 (g)；M表示马氏珠母贝黏液冻干粉质量 (g)。
直接醇沉法粗品 (Direct alcohol precipitation sample, DAS) 提取[15]：取200 mL黏液加入90%乙醇至体积分数为70%，4 ℃静置18 h，于4 ℃下7 000 r·min−1离心15 min，取沉淀，于空气中静置挥发乙醇后，真空冷冻干燥24 h后得到DAS。
盐提醇沉法粗品 (Salt extraction and alcohol precipitation sample, SAS) 提取[16-18]：取200 mL黏液加入0.2 mol·L−1NaCl溶液使质量体积比为1∶16，于4 ℃下静置12 h，4 ℃，7 000 r·min−1离心20 min取上清液，加乙醇至70%，4 ℃静置醇沉 12 h后，于4 ℃下7 500 r·min−1离心20 min，取沉淀冷冻干燥24 h，得到SAS。
水提醇沉法粗品 (Water extraction and alcohol precipitation sample, WAS) 提取[19]：取200 mL黏液加水在质量体积比1∶20下50 ℃水浴6 h，4 ℃下7 000 r·min−1离心20 min，取上清液加乙醇至70%，4 ℃静置18 h后，4 ℃、7 500 r·min−1离心20 min，取沉淀，冷冻干燥24 h，得到WAS。
1.3.2 糖、蛋白质含量测定
总糖含量测定采用苯酚硫酸法，参考张金豫等[20]稍作修订，分别取0.1 mg·mL−1的葡萄糖标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL于试管中并用水补足1 mL，各加入6%苯酚1 mL，再加入5 mL浓硫酸 (H2SO4) 后迅速摇匀，静置10 min后，沸水浴15 min取出，冷水浴30 min，于490 nm处测定吸光值，以葡萄糖质量 (mg)为横坐标，吸光度 (A) 为纵坐标，绘制标准曲线。测得该标准曲线方程为y=10.057x+0.098 5，R2=0.998 3。取0.5 mg·mL−1的粗品样品1.0 mL于试管中，参照以上步骤测定样品吸光度。取0.3 mg·mL−1的纯化品样品1.0 mL于试管中，参照以上步骤测定吸光度。可溶性蛋白质含量测定采用Folin-酚法[21]，于试管中分别加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，0.25 mg·mL−1的BSA，加蒸馏水至1 mL，加入5 mL试剂甲，混匀，室温静置10 min，加入0.5 mL的试剂乙后立即摇匀，室温放置30 min，于500 nm处比色测定吸光度，以BSA质量 (mg) 为横坐标， A为纵坐标，绘制标准曲线。测得该标准曲线方程为y=1.569 8x+0.062 8，R2=0.998 8。取0.3 mg·mL−1粗品样品1.0 mL于试管中，按以上方法测定样品吸光度。取0.2 mg·mL−1纯化品样品1.0 mL于试管中，按以上方法测定吸光度。
根据测定所得粗品的糖及蛋白质含量，计算粗品的糖、蛋白质得率，公式为：
$$w{\rm{ = }}\dfrac{{{m_{\rm{1}}}}}{M}{\rm{ \times 100 {\text{%}} }}$$ (2) 式中w表示糖蛋白粗品的糖或蛋白质得率；m1表示粗品的糖或蛋白质含量 (g)；M表示马氏珠母贝黏液冻干粉质量 (g)。
1.3.3 糖蛋白的分离纯化
选择最佳糖蛋白粗品提取方法后，将该粗品溶于水，于4 ℃、10 000 r·min−1离心10 min，取上清液Sephacryl S-200柱层析法进行分离纯化。
调节上样样品的可溶性蛋白质质量浓度至3~ 4 mg·mL−1，上样体积为4 mL，填料柱高70 cm (层析柱φ1.7×80 cm)，流动相为0.05% NaCl，流速1 mL·min−1，每5 mL收集1管，于280 nm波长下测吸光值，同时采用苯酚硫酸法于490 nm 下测吸光值，做出洗脱曲线，收集所需组分，冷冻 干燥24 h，得到直接醇沉纯化品 (Direct alcohol precipitation and purification sample, DAPS)[22]。
1.3.4 SDS-PAGE电泳
粗品的电泳：将DAS、SAS、WAS同时进行SDS-PAGE电泳，配制样品质量浓度为4 mg·mL−1，上样体积为10 μL，Maker体积为7 μL，12%分离胶，5%浓缩胶。起始电压为80 V，进入分离胶后电压为120 V[23]。电泳结束后采用考马斯亮蓝染色液染色1 h，10%冰醋酸脱色液脱色2 h后，结果拍照分析。
纯化品的电泳：调整样品质量浓度为2 mg·mL−1，上样体积为8 μL，Maker体积为8 μL，10%分离胶，5%浓缩胶。参照以上方法进行电泳。
1.3.5 抗氧化活性测定
分别配制质量浓度为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·mL−1的VC (阳性对照)、最佳提取方法糖蛋白粗品、糖蛋白纯化品。
羟基自由基 (·OH) 清除能力测定：参考黄来珍等[17]的方法并进行一定改进，于各试管中加入0.15 mol·L−1的硫酸亚铁 (FeSO4) 溶液1 mL及2 mmol·L−1的水杨酸钠溶液1 mL，再加入2 mL的样液，混匀，加入6 mmol·L−1过氧化氢(H2O2)溶液1 mL启动反应，于37 ℃下水浴1 h，于510 nm处测得吸光度Ai1； 蒸馏水代替H2O2测得Aj1；蒸馏水代替样液测得A01，计算自由基清除率公式为：
$$ \cdot {\rm{OH}}{\text{清除率}} = \frac{{{\rm{[A}}{{\rm{0}}_{\rm{1}}} - {\rm{(A}}{{\rm{i}}_{\rm{1}}} - {\rm{A}}{{\rm{j}}_{\rm{1}}}{\rm{)]}}}}{{{\rm{A}}{{\rm{0}}_{\rm{1}}}}}{\rm{ \times 100}}\% $$ (3) 超氧阴离子自由基 (·O2 −) 清除能力测定：采用邻苯三酚法，参考张金豫等[20]及常飞等[24]的方法并略修改，于各试管中加入pH 8.2的Tris-HCl缓冲液 (25 ℃预热) 4.5 mL，再加入1 mL的样液及4.5 mmol·L−1邻苯三酚溶液(25 ℃预热， 10 mmol·L−1 HCl配制) 0.5 mL，混匀，25 ℃ 静置6 min后，加入2~3滴8 mol·L−1 HCl终止反应，于320 nm处测得吸光度Ai2；蒸馏水代替邻苯三酚测得Aj2；蒸馏水代替样液测得A02。计算清除能力公式为：
$$ \cdot {\rm{O}}_2^ - {\text{清除率}}{\rm{ = }}\frac{{{\rm{[A}}{{\rm{0}}_{\rm{2}}} - {\rm{(A}}{{\rm{i}}_{\rm{2}}} - {\rm{A}}{{\rm{j}}_{\rm{2}}}{\rm{)]}}}}{{{\rm{A}}{{\rm{0}}_{\rm{2}}}}}{\rm{ \times 100 {\text{%}} }}$$ (4) DPPH自由基清除能力测定：参考Noumi等[25]的方法。于各试管中加入0.1 mmol·L−1 DPPH乙醇溶液2 mL，再加入2 mL样液，混匀后放置黑暗处30 min，于517 nm处测得吸光度Ai3；蒸馏水代替DPPH测得Aj3；蒸馏水代替样品测得A03。测定清除能力的公式为：
$${\rm{DPPH}}{\text{清除率}} = \frac{{{\rm{[A}}{{\rm{0}}_{\rm{3}}} - {\rm{(A}}{{\rm{i}}_{\rm{3}}} - {\rm{A}}{{\rm{j}}_{\rm{3}}}{\rm{)]}}}}{{{\rm{A}}{{\rm{0}}_{\rm{3}}}}}{\rm{ \times 100 {\text{%}}}}$$ (5) 1.3.6 实验数据分析
上述每个样品进行3次平行实验 (n=3)，实验数据采用Excel 2010软件做图分析，采用SPSS Statistics 19.0 软件进行One-Way ANOVA显著性差异分析，P<0.05表示差异显著。
2. 结果与分析
2.1 3种不同糖蛋白粗提方法比较
从总得率、蛋白质及糖得率比较3种方法的提取效果，结果见图1。DAS的总得率为(24.59±0.78)%，远高于SAS [(6.19±0.81)%]及WAS [(1.68±0.55)%] (P<0.05)；测得WAS中可溶性蛋白质含量 (79.03±0.61)%远高于SAS [(42.82±1.00)%]及DAS [(25.46±0.79)%] (P<0.05)；DAS、SAS、WAS的糖质量分数分别为 (3.67±0.16)%、(4.40±0.58)%、(4.00±0.51)%，无显著性差异 (P>0.05)。
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图 1 3种糖蛋白粗品提取方法比较同一指标中不同字母表示不同样品间的显著性差异 (P<0.05)，后图同此Figure 1. Comparison of three crude glycoprotein extraction methodsDifferent letters indicate significant difference among different samples with the same indicators (P<0.05). The same case in the following figures.直接醇沉法中，糖蛋白未经过盐、水等的提取，乙醇直接将糖蛋白连同非糖、非蛋白质成分一起沉淀下来从而使DAS总得率相对较高，相同质量的黏液原料中可提取出的可溶性蛋白质及总糖的得率分别为 (6.26±0.20)%和 (0.90±0.04)%，均远高于WAS [(1.33±0.01)%和(0.07±0.01)%]以及SAS [(2.65±0.07)%和(0.27±0.03)%] (P<0.05)。水提醇沉法提取糖蛋白粗品的总得率远低于其他两种方法 (P<0.05)。由于水提可最大限度地溶出糖蛋白而不破坏其稳定性，糖蛋白所含有的多糖具有亲水性使其易溶于水[26]，但是由于除水溶性蛋白外还有盐溶性蛋白，因此，WAS蛋白质含量虽较高但总得率较低，该结果与范秀萍等[19]的研究结果一致。而盐提醇沉法中，因NaCl具有的盐离子与蛋白质部分结合具有保护蛋白质使其不易变性的特点[26]，使糖蛋白在稀盐溶液中溶解度相对较高，优选适当pH及盐浓度条件可进一步提高盐提效果，因此SAS总得率因此高于WAS。与珍珠贝肌肉提取糖蛋白所采用的硫酸铵沉淀法[3]相比较，本研究的得率较低，这可能与原料本身所含的糖蛋白浓度有关，由于黏液本身为液体性状，含水量较高，因此相对提取率偏低。
综上，相同质量黏液，DAS的蛋白质、糖得率远高于SAS和WAS (P<0.05)，提取效果较好。因此，优选直接醇沉法进行糖蛋白粗提。
2.2 SDS-PAGE电泳图谱分析
研究发现提取方式不同可能导致提取糖蛋白组成存在差异[17]。李敏等[15]发现不同方法提取黄芪糖蛋白的SDS-PAGE图谱存在明显的差异，张洪梅等[27]分析SDS-PAGE图谱发现不同方法提取的蝉花粗蛋白的蛋白种类差异显著。由图2结果可见3种糖蛋白粗品的图谱无明显差异。其中，WAS在15~20 kD、>70 kD处均有较深条带，其条带颜色在<30 kD的区域相对较深，说明WAS蛋白质分子量相对较小的部分含量较高；SAS的条带在>30 kD的区域较为明显，说明SAS所提取出的蛋白质的分子量相对较大的部分含量较高；DAS除在15~20 kD区间条带颜色相对较浅外，其余区域的条带特征与WAS和SAS无明显差异。
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图 2 3种糖蛋白粗品SDS-PAGE电泳图1. 水提醇沉法粗品；2. 盐提醇沉法粗品；3. 直接醇沉法粗品; 4. 蛋白质分子量标准(kD)Figure 2. SDS-PAGE electrophoresis of three crude glycoproteins1. WAS; 2. SAS; 3. DAS; 4. Protein marker综合分析图1、图2的结果，直接醇沉法可提取出的糖及蛋白质含量最高，且DAS蛋白质组成与SAS、WAS无明显差异，其粗提效果相对较好，选择DAS进行进一步分离纯化。
2.3 Sephacryl S-200柱层析法纯化结果
DAS经洗脱后，在280 nm处蛋白质主要呈现3个峰 (图 3)。在490 nm处糖呈现的峰数较多。其中，第一个主峰在280 nm及490 nm处均有最大吸光值，且重合性好，收集此主峰部分，冷冻干燥后得到白色粉末DAPS，其溶解性好。测得DAPS的总糖质量分数为 (22.72±0.26)%，可溶性蛋白质质量分数为 (71.18±0.62)%。图3-b结果显示DAPS分子量集中在245 kD处，分子量较大。李雨哲等[3]从马氏珠母贝肌肉中提取分离纯化的糖蛋白分子量为11.2 kD，两者差别较大，说明珍珠贝黏液中的功效组分与肌肉功效成分本身仍存在明显差异，对珍珠贝黏液作进一步的拓展研究非常必要。
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图 3 DAS纯化结果a. DAS的Sephacryl S-200柱层析洗脱曲线；b. DAPS的SDS-PAGE电泳图；1. 直接醇沉纯化品；2.蛋白质分子量标准 (kD)Figure 3. Purification results of DASa. Elution curve of Sephacryl S-200 columnchromatography about DAS; b. SDS-PAGE electrophoresis of DAPS; 1. DAPS; 2. Protein marker2.4 抗氧化活性分析
2.4.1 ·OH清除能力
研究表明，·OH不仅能与生物大分子产生反应引起细胞损伤，还会促进活性氧的生成而引起组织的氧化损伤[28]。图4-a结果显示，在质量浓度介于0.1~1.0 mg·mL−1时，DAS和DAPS清除·OH的能力随着浓度的增大而显著提升 (P<0.05)。在0.1 mg·mL−1质量浓度下，DAS和DAPS的·OH清除率分别为 (65.70±0.19)%和(66.34±0.90)%，两者清除·OH的能力显著优于同浓度的VC [(46.88±1.13)%] (P<0.05)。在0.1~0.6 mg·mL−1范围内，DAPS清除·OH的能力与DAS无显著性差异 (P>0.05)，可能由于DAS中除含有DAPS外还含有其他清除·OH的物质，如多糖、疏水性氨基酸等，而多糖、氨基酸本身也具有较强抗氧化性[29-30]。当DAS及DAPS的质量浓度达到0.8 mg·mL−1时，两者的·OH清除率均已高于90%，说明黏液中含有的糖蛋白具有很强的·OH清除能力。张金豫等[20]研究大鲵 (Andrias davidianus) 黏液糖蛋白时发现，其纯品质量浓度达到1.0 mg·mL−1时，·OH清除率低于50%。显然，不同来源的糖蛋白对·OH的清除能力存在显著性差异。据报道，多糖分子可通过与·OH结合形成稳定基团从而直接终止自由基链反应，多糖的单糖组成、分子量、糖苷键及理化性质对其·OH清除活性有一定影响[31]，糖蛋白对·OH清除能力的差异性可能与其糖链的多样性相关。
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图 4 羟自由基 (a)、超氧阴离子自由基 (b) 和DPPH自由基 (c) 清除能力Figure 4. Scavenging activities of hydroxyl radical (a), superoxide anion free radical (b) and DPPH free radical (c)2.4.2 ·O2 −清除能力
氧源自由基介导的自由基氧化会对DNA、脂质和蛋白质造成损伤，并对细胞的防御系统产生危害，活性氧与炎症、心血管疾病、阿尔茨海默症等多种常见疾病及退行性疾病相关，·O2 −便为活性氧之一[31]。图4-b显示，在0.1~0.8 mg·mL−1范围内，DAS清除·O2 −的能力并未随着浓度的增大而显著增强，当质量浓度达到1.0 mg·mL−1时，其抗氧化能力出现明显提升 (P<0.05)，清除率达到 (31.19±1.06)%；DAPS的·O2 −清除能力同样随着浓度的增大而增强，当其质量浓度为1.0 mg·mL−1时，清除率达到最高 [(68.61±1.65)%]。在0.1~0.8 mg·mL−1范围内，DAS、DAPS对·O2 −清除活性未表现出剂量浓度相关性，可能与浓度设定范围存在一定关系[32]。总体分析，DAS清除·O2 −的能力相对较弱，弱于同浓度的VC，当VC质量浓度达0.2 mg·mL−1时，清除率高达 (96.71±0.13)%，VC浓度达0.4 mg·mL−1时，清除率已接近100%。DAS和DAPS质量浓度要达1.0 mg·mL−1时才能表现出较强的·O2 −清除效果。黄来珍等[17]研究近江牡蛎 (Ostrea rivularis) 糖蛋白时发现用超声辅助盐浸提法提取出的糖蛋白质量浓度高达6 mg·mL−1时，对·O2 −的清除率达到最高值，也仅为40.47%。而0.1 mg·mL−1的DAPS对·O2 −清除率已高于40% [(44.03±1.18)%]，与同浓度下VC的·O2 −清除率相近(43.80±0.17)%。综上，DAS和DAPS对·O2 −均有一定的清除能力，但是相较于其清除·OH效果略显弱势。
2.4.3 DPPH自由基清除能力
DPPH自由基作为一种较为稳定的自由基，被广泛用于评价抗氧化剂的抗氧化活性。图4-c显示，当DAS质量浓度为0.1 mg·mL−1时，DPPH自由基的清除率仅有 (0.12±0.12)%，几乎不具备清除能力。随着浓度的增大，DAS和DAPS对DPPH自由基的清除率显著性提升，存在明显的剂量相关性 (P<0.05)。当质量浓度达到1.0 mg·mL−1时，DAS的DPPH自由基清除率为 (10.65±1.67)%，DAPS清除率为(11.71±0.66)%。有研究发现DPPH自由基清除活性与样品的糖及蛋白质含量有密切相关性，糖蛋白所含蛋白质在水解过程中，氨基酸和肽链的大小、组成的变化影响了其抗氧化活性，因此同一系列糖蛋白中，DPPH自由基清除活性与样品蛋白质及糖含量呈正相关[33]。该研究中DAPS的DPPH自由基清除能力显著优于DAS (P<0.05)，与本研究结果一致。与VC相比，DAS和DAPS的DPPH自由基清除能力相对较弱，当VC质量浓度为0.1 mg·mL−1时，DPPH自由基的清除率已达到 (93.20±0.87)%，随着浓度增大，VC的清除能力相近，无显著性差异 (P>0.05)。相较于·OH、·O2 −的清除能力，DAS及DAPS对DPPH自由基的清除能较弱，这可能与有效浓度选择相关，刘淑集等[34]研究翡翠贻贝(Perna viridis)糖蛋白PGFR发现，PGFR质量浓度为8 mg·mL−1时，其对羟自由基的清除率为100%；而当PGFR质量浓度高达30 mg·mL−1时，对DPPH自由基的清除率低于90%。
3. 结论
本研究结果表明，DAS的总得率、糖及蛋白质得率远高于SAS和WAS (P<0.05)，且3种糖蛋白粗品的蛋白质组成无明显差异，优选直接醇沉法提取的珍珠贝黏液糖蛋白。通过分离纯化收集蛋白和多糖高度重叠部分，获得DAPS，其分子量主要集中在245 kD。然而DAPS的纯度不高，仍需进一步优化纯化条件。体外抗氧化实验结果表明，DAS及DAPS均具有一定抗氧化活性，其中清除·OH自由基的效果尤为显著；DAS和DAPS在质量浓度为1.0 mg·mL−1时显示出较强的·O2 −清除效果，但是在低浓度范围内无剂量相关性；相较于·OH和·O2 −自由基的清除能力，DAS和DAPS对DPPH自由基的清除能力较弱。本研究从珍珠贝黏液中提取糖蛋白并评价其体外抗氧化活性，研究结果为进一步探索马氏珠母贝黏液中的功效组分提供理论基础数据。
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