生物絮团系统因具有水处理效果好、蛋白质利用效率高，并且能够提高水产养殖生物免疫力等特点，已成为国内外的研究热点^[1-2]。目前，国内应用生物絮团技术进行水产养殖的研究开始由实验阶段过渡到中试规模的养殖实验^[3-4]。现有的生物絮团培养方式大多是外加碳源提高水体碳氮比 (C/N)至15~20，富集培养异养微生物，通过异养微生物的同化作用和异养硝化作用去除水体有害氮素^[5-7]。

利用异养微生物调控养殖水体需投入大量碳源，Avnimelech^[8]通过饲料蛋白溶失率、微生物同化效率和碳源含碳量计算出投喂1 kg饲料(30%~45% 粗蛋白)转化的总氨氮(total ammonia nitrogen，TAN)被微生物同化成为微生物蛋白需要添加465.0~697.5 g碳源(含碳量50%)，首次将C/N在水产养殖中的应用量化。在高密度水产养殖系统中，若按照上述公式计算碳源投加量，在养殖后期必定需要每日投加大量碳源，并且需要不间断补充纯氧并定期去除悬浮固体才能保证养殖水体充足的溶解氧(DO)^[9]。

目前，Cohen等^[6]研究证实生物絮团养殖系统中，不仅会发生异养细菌同化作用，也会发生自养细菌硝化作用，这2种途径都能够有效地将有毒性的氨氮转化，使养殖水体水质环境变得可控。Ray和Lotz^[10]研究发现硝化型生物絮团系统的总悬浮固体物(total suspended solids，TSS)含量的增长速度明显低于异养系统，而且整个培养过程不需要添加碳源，耗氧量也少于异养生物絮团系统。实际上，自养硝化细菌的硝化活性比异养菌高10³~10⁴倍，具有较高的氮降解能力^[11-12]。近年来，有研究者提出定向驯化自养硝化型生物絮团，以期减少碳源添加和DO消耗，节约经济成本^[13]。

因此，为培养出无须外加碳源的“自养型”生物絮团，本研究通过接种养殖废水排污口底泥，添加一定比例的碳源和氮源驯化富集培养异养生物絮团，随后在驯化培养性能稳定的异养生物絮团基础上，通过梯度减少碳源添加培养硝化型生物絮团。并通过高通量测序考察了生物絮团菌群结构、多样性变化及其相关物种的丰富度。

1.   材料与方法

1.1   异养生物絮团驯化培养及富集

本实验选用中国水产科学研究院南海水产研究所深圳试验基地养殖废水排污口底泥(黑色淤泥状态，微臭)，过滤去除大颗粒砂砾。残留污泥呈黑色，轻微臭味，用适量海水稀释(实验所用海水均经漂白粉消毒、除氯后使用，盐度33)。每天投加东丸石斑鱼配合饲料和红糖，饲料与红糖质量比约为1∶1，C/N约为10∶1 (饲料粗蛋白质量分数≥47%，红糖含碳量38.64%)。驯化培养过程中全天曝气，保持DO平均值为4~5 mg·L⁻¹，以碳酸氢钠调整pH不低于7.2。驯化采用圆柱形培养桶(60 L，直径0.5 m)，底部放置小型造浪泵，使水体充分混合搅拌。待水体出现絮状污泥，去除底部沉降的黑色淤泥以及大颗粒固体，重新搅拌、曝气，富集培养异养生物絮团。设定污泥龄(sludge retention time，SRT)为20 d^[14]。光学显微镜(Nikon YS100，日本)下观察异养生物絮团形态。

1.2   硝化型生物絮团的定向培养

取性能良好、结构稳定的异养生物絮团20 L驯化培养硝化型生物絮团，絮团质量浓度为5 000 mg·L⁻¹。实验前采用消毒海水将生物絮团清洗4~5次，并停止投加饲料粉末，红糖饥饿处理12 h。实验过程中每天向絮团中投加配合饲料粉末12 g，有机氮负荷约为9 g·(kg·d)⁻¹，红糖投加质量梯度变化为8 g (C/N≈15∶1)、6 g (C/N≈11.25∶1)、4 g (C/N≈7.5∶1)、2 g (C/N≈3.75∶1)、0 g，每个质量梯度持续7 d。实验中保持水体平均DO为4~5 mg·L⁻¹，持续搅拌，每天排出适量絮团，补充海水，保持水体絮团质量浓度约为5 000 mg·L⁻¹。

1.3   数据测定方法

每天投加饲料前测定水体DO、温度和pH，取水样监测水体氨氮、亚硝酸盐氮、化学耗氧量 (COD_Mn)质量浓度。每个实验均设置3个重复。

水体DO、温度和pH采用WTW (Multi 3620，Germany)检测，氨氮(次溴酸盐氧化法)、亚硝酸氮(萘乙二胺分光光度法)和COD_Mn (碱性高锰酸钾法)均参照《海洋监测规范　海水分析》(GB 17378.4—2007)进行测定。

1.4   样品采集

生物絮团样本取自上述定向培养反应器。取样时间为驯化培养实验结束时，氨氮不高于0.1 mg·L⁻¹，亚硝酸盐氮不高于0.2 mg·L⁻¹，絮团沉降体积指数(sludge volume index，SVI)不高于150 mL·g⁻¹。采集新鲜絮团样品置于离心管中，即刻使用冷冻离心机离心，3 000 r·min⁻¹离心2 min，去除上清液，使用Parafilm封口膜封管盖，立即用生物冰袋冷冻送检。

1.5   基因组DNA提取和Illumina PE250测序

利用EZNA Stool DNA Kit试剂盒提取生物絮团细菌DNA，1%琼脂糖凝胶电泳进行检测；采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase试剂盒进行PCR扩增，将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物，Tris_HCl洗脱；2%琼脂糖电泳检测；将PCR产物用QuantiFluor^TM -ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)进行检测定量，之后按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合；构建Illumina PE250文库，确定文库合格后，用Illumina PE250测序。

1.6   测序结果处理与分析

1) Illumina PE250高通量测序的原始下机数据首先需要根据barcode得到所有样品的有效序列；然后对reads的质量进行质控过滤；根据PE reads之间的overlap关系，将成对的reads拼接成一条序列；最后按照barcode和引物序列拆分得到每个样本的优质序列，并在过程中根据正反barcode和引物方向校正序列方向，采用denovo和reference结合的方式去除嵌合体(Usearch软件和Gold数据库)；2)使用QIIME (vsesion 10 http://drive5.com/uparse/)，按照97%相似水平下的OTU进行归并和划分，将丰度低于全样本测序总量0.001% OTU去除，选取每个OTU中分度最高的序列作为OTU代表序列；然后将每个OTU代表序列与Greengenes数据库(SILVA)进行比对，得到OTU各分类等级水平的注释比例和物种相对丰度，为避免由于测序深度不同造成偏差，对各样品数据以数据量最少的样品为标准进行均一化处理；3)采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，并分别在各个分类水平(域、界、门、纲、目、科、属、种)统计各样本的群落组成；使用QIIME软件(vsesion 10)，获取各样本在门、纲、目、科、属5个分类水平上的丰度分布表。

2.   结果

2.1   异养生物絮团驯化培养

异养生物絮团驯化培养过程中，絮团结构变化较为明显，从最初细碎、黑色的底泥逐渐驯化形成黄褐色絮状结构。图1所示为驯化培养24 d的异养生物絮团，生物絮团呈黄褐色，上清液清澈透明，泥水界面清晰，沉降性能良好；镜检有大量菌胶团，以丝状菌为骨架，非丝状菌填充其中，结构密实，同时可以观察到线虫等原生动物，生物絮团组成结构完整。絮团浓度增长较快，经过24 d的驯化培养，质量浓度增至5 193 mg·L⁻¹。

图  1  异养生物絮团照片

a. 沉降异养生物絮团; b. 异养生物絮团光学显微镜镜检图(100×)

Figure  1.  Pictures of heterotrophic bio-floc

a. sedimentation of heterotrophic flocs; b. microscopic examination of heterotrophic flocs (100×)

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异养生物絮团培养过程的氨氮和亚硝酸盐氮呈先升高后下降的趋势(图2)。${\rm{NH}}_{\rm{4}}^{\rm{ + }}{\rm{ {\text {-}} N}}$和亚硝酸盐氮在前7 d变化较为明显，氨氮和亚硝酸盐氮分别由0.03 mg·L⁻¹和0.01 mg·L⁻¹迅速上升至峰值(3.10 mg·L⁻¹和8.43 mg·L⁻¹)。之后氨氮和亚硝酸盐氮一直保持较低浓度，氨氮的质量浓度保持在0.1 mg·L⁻¹以下，亚硝酸盐氮在0.1 mg·L⁻¹上下波动。异养生物絮团系统COD_Mn在1~10 d变化明显，呈先上升后下降的趋势，最高达58.80 mg·L⁻¹，与氨氮和亚硝酸盐氮的变化趋势相一致。SVI在驯化培养期间保持相对稳定，最高不超过52 mL·g⁻¹，在8~24 d的培养过程中，SVI能维持在35~50 mL·g⁻¹。综上，接种底泥的异养生物絮团，在第7天即可出水稳定，保持系统中较低的氨氮和亚硝酸盐氮浓度，24 d后异养生物絮团可驯化成熟。

图  2  异养生物絮团驯化阶段氨氮、亚硝酸氮和化学耗氧量变化

Figure  2.  Dynamic changes of ${\rm{NH}}_{\rm{4}}^{\rm{ + }}{\rm{ {\text{-}} N}}$, ${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}{\rm{ {\text{-}} N}}$ and COD_Mn with heterotrophic biofioc at acclimatization stage

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2.2   硝化型生物絮团定向培养

向异养生物絮团系统中梯度减少碳源投加，实验中红糖添加每个梯度均持续7 d。培养过程中前25 d，系统水质处于相对稳定状态，氨氮一直处于较低水平，大部分时间趋近于0，最高仅为0.01 mg·L⁻¹；亚硝酸盐氮浓度略有波动，后期快速降低并趋于稳定(图3)。前25 d COD_Mn同样较为稳定，在50 mg·L⁻¹上下波动；随着碳源投加量减少，系统出水COD_Mn质量浓度逐渐降低，最小值为23.52 mg·L⁻¹。第13~第32天，由于水体中碳源减少，异养菌活性受到抑制，部分异养菌死亡。随着驯化进行(第29~第32天)，异养菌逐渐适应碳源投加量，活性恢复，水体中COD_Mn缓慢下降。

图  3  硝化型生物絮团氨氮、亚硝酸盐氮和化学耗氧量变化

Figure  3.  Dynamic changes of ${\rm{NH}}_{\rm{4}}^{\rm{ + }}{\rm{ {\text -} N}} $, ${\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}{\rm{ {\text -} N}} $ and COD_Mn with nitrifying biofloc

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2.3   絮团微生物群落

图4为原始污泥和硝化型生物絮团的菌群分布对比，可以看出原始污泥生物多样性丰富，共检测到56类，119纲，606属。在门水平上，变形杆菌门是其主要优势菌群，占菌群总数量的55.26%，其次是拟杆菌门、浮霉菌门和绿硫菌门，分别占13.91%、6.49%和3.28%。硝化型生物絮团中检测到24类，39纲，252属，其中拟杆菌门是优势菌群，占46.62%，其次是变形杆菌门、绿硫菌门和浮霉菌门，分别占30.07%、9.86%和6.08%。

图  4  原始污泥与硝化型生物絮团的菌群分布 (门层级)

A. 原始污泥；B. 硝化型生物絮团

Figure  4.  Bacterial composition at Phylum level of original sludge and nitrifying bio-flocs (at Phylum level)

A. original sludge; B. nitrifying biological flocculent

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表1中列出了原始污泥与硝化型生物絮团中硝化细菌的属水平丰度，可以看出氨氧化细菌(AOB)在原始污泥和硝化型生物絮团中种类都较少，仅存在Nitrosomonas (亚硝化单胞细菌属)，氨氧化细菌丰度在硝化型生物絮团中较原始污泥略有增加。亚硝酸盐氧化细菌在原始污泥中种类较多，但相对丰度普遍较低；而亚硝酸盐氧化细菌种类在硝化型生物絮团中较单一，仅有Nitrococcus (硝化球菌属)和Nitrincolaceae-uncultured，但Nitrococcus较原始污泥具有较高的相对丰度，可达0.45%。

表  1  原始污泥与硝化型生物絮团中硝化细菌的属水平丰度

Table  1.  Relative abundance of nitrifying bacteria at Genus level of original sludge and nitrifying bioflocs %

硝化细菌属分类 nitrifying bacteria genera axonom		原始污泥 original sludge	硝化型生物絮团 nitrifying bio-flocs
亚硝酸盐氧化细菌 NOB	海螺菌属 Nitrincola	0.01	0.00
	硝化球菌属 Nitrococcus	0.02	0.45
	硝化刺菌属 Nitrospina	0.02	0.00
	Nitrincolaceae-unclassified	0.01	0.00
	Nitrincolaceae-uncultured	0.02	0.01
	硝化螺菌属 Nitrospira	0.05	0.00
氨氧化细菌 AOB	亚硝化菌属 Nitrosomonas	0.06	0.10

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3.   讨论

生物絮团系统具有高效、环保等优势，能够有效控制养殖水质，实现饵料营养的循环利用，在水产养殖水处理中被广泛应用^[15-16]。目前，生物絮团的培养方式多样，直接接种养殖污泥^[17]和利用养殖废水富集培养微生物^[18]是2种比较常见的方法。如李朝兵等^[18]利用池塘养殖废水，外加糖蜜作为碳源控制合适的C/N，17 d形成生物絮团。邓吉朋等^[19]在养殖斑节对虾(Penaeus monodon)过程中泼洒糖蜜培养生物絮团，仅3 d就有絮团生成，但性能不稳定，且含有较多杂质，实际应用对水体DO要求高。杨义飞等^[20]接种污水处理厂活性污泥，采用人工配置的污水作为营养液培养16~24 d，活性污泥才进入成熟稳定期，处理效果达到最好。但采用上述2种驯化方法生物絮团性能提升缓慢，培养周期长。本研究选取养殖废水排污口底泥为接种污泥，以石斑鱼配合饲料粉末和红糖为氮、碳源，驯化培养第7天出水水质即可稳定，保持系统中较低的氨氮和亚硝酸盐氮浓度(图2)。

从原始污泥的微生物组成可以看出，原始污泥中共检测到56类，119纲，606属，生物多样性丰富。在门水平上，变形菌门和拟杆菌门是其主要的优势菌群，与谭洪新等^[13]培养的异养生物絮团的主要优势菌群 (变形菌门和拟杆菌门) 相一致。同时，原始污泥中还检测到几种硝化细菌。因此，排污口底泥作为原始污泥驯化培养异养生物絮团具有良好的微生物菌群基础，可以更加快速地驯化培养具有良好水处理效果的异养生物絮团。

以性能良好的异养生物絮团为基础，逐渐减少碳源添加，定向培养硝化型生物絮团。培养前期，系统中氨氮和亚硝酸盐氮浓度出现小范围波动，但都维持在较低水平，COD_Mn浓度逐渐降低。随后，随着碳源投加量的逐渐减少，系统中氨氮和亚硝酸盐氮浓度变化剧烈，推测可能因为碳源的减少，部分异养细菌死亡，生物絮团细菌群落结构发生变化^[21-22]，生物絮团浓度下降，脱氮能力受到影响，但是随着后续驯化，生物絮团逐渐适应了碳源投加量，浓度缓慢升高，这与谭洪新等^[13]的研究结果相同。

与原始污泥的生物组成相比，硝化型生物絮团结构较单一，其系统中检测到24类，39个纲，252属。这主要是由于碳源减少，大量异养微生物消亡，生物絮团微生物多样性受到影响，菌群结构也产生较大差异^[23-25]。在门水平上，原始污泥和硝化型生物絮团的主要优势菌群都是变形菌门和拟杆菌门；在属水平上，原始污泥的优势菌群是Gammaproteobacteria (γ-变形杆菌属)、Bacteroidia和Deltaproteobacteria (δ-变形杆菌属)，而硝化型生物絮团的优势菌群是Bacteroidia (拟杆菌属)、Gammaproteobacteria和Anaerolineae (厌氧绳菌属)。构成生物絮团的细菌种类中，变形菌与拟杆菌在数量上占优势，对清除污水中的有机物发挥重要作用^[25-28]。

原始污泥和硝化型生物絮团在硝化细菌种类和相对丰度也具有较大差异。原始污泥中的硝化细菌种类较多，共有7个属，其中Nitrincolaceae-unclassified和Nitrincolaceae-uncultured相对丰度较高。而硝化型生物絮团系统中硝化细菌则比较单一，共3个属，除Nitrincolaceae-uncultured外，其余2个属相对丰度都有明显提高，尤其是Nitrococcus相对丰度达到0.45%。硝化球菌属是亚硝酸盐氧化菌(NOB)的主要优势菌属，参与氧化亚硝酸盐氮成为硝酸盐氮过程^[29]。从高通量测序结果可知，随着碳源减少，硝化细菌总体丰度逐渐增加，且氨氮和亚硝酸盐氮浓度逐渐降低并趋于稳定，标志着成熟的硝化型生物絮体被成功驯化。

此外，在原始污泥与硝化型生物絮团中均检测到弧菌存在。弧菌是引起养殖生物细菌性疾病的最重要病原菌之一，流行面积广，发病率高，给养殖业造成了巨大危害^[30-31]。在原始污泥中弧菌相对丰度为0.16%，而经过驯化培养的硝化型生物絮团中弧菌数量大幅降低，相对丰度仅为0.08%，有研究表明成熟的生物絮团能够有效抑制弧菌生长^[32-35]，因此，硝化型生物絮团的驯化成熟过程能够抑制弧菌的生长，这非常有利于硝化型生物絮团在实际生产中的应用。

4.   结论

综上，养殖废水排污口底泥具有良好的微生物菌群结构基础，作为原始污泥可快速驯化培养得到性能良好的异养生物絮团，为养殖前期的水处理提供有效的解决手段；同时通过减少碳源投加量，在较短时间内可定向培养获得硝化型生物絮团，既能有效控制养殖后期水质，又能降低养殖成本，提高养殖利润。