我国热带典型海草床潜在致病菌群落结构及其毒力基因丰度的空间特征

邓益琴; 刘松林; 冯娟; 江志坚

doi:10.12131/20200068

我国热带典型海草床潜在致病菌群落结构及其毒力基因丰度的空间特征

1.
中国水产科学研究院南海水产研究所/广东省渔业生态环境重点实验室/农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室，广东广州 510300
2.
中国科学院南海海洋研究所热带海洋生物资源与生态重点实验室，广东广州 510301

基金项目: 国家自然科学基金项目 (31902415, 41806147)；广东省自然科学基金项目 (2019A1515011833)；中国水产科学研究院南海水产研究所中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助 (2019TS04)；中国水产科学研究院基本科研业务费专项资金 (2019ZD0707)；广东省渔业生态环境重点实验室开放基金 (FEEL-2017-5)

详细信息

作者简介:
邓益琴 (1990—)，女，博士，助理研究员，从事鱼类细菌病及防治技术研究。E-mail: yiqindd@126.com

通讯作者:
冯　娟 (1973—)，女，博士，研究员，从事鱼类细菌病及防治技术研究。E-mail: jannyfeng@163.com

中图分类号: Q 89
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出版历程
- 收稿日期: 2020-04-06
- 修回日期: 2020-05-07
- 录用日期: 2020-05-31
- 网络出版日期: 2020-09-27
- 刊出日期: 2020-10-08

Spatial characteristics of potential pathogenic bacteria community structure and their virulence gene abundance in typical tropical seagrass meadows of China

1.
South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences/Guangdong Provincial Key Laboratory of Fishery Ecology and Environment/Key Laboratory of South China Sea Fishery Resources Exploitation & Utilization, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Guangzhou 510300, China
2.
South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences/Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology, Guangzhou 510301, China

摘要

摘要:
该研究利用16S rRNA扩增子测序技术分析了中国热带 (新村、黎安、潭门) 典型海草床水体潜在致病菌的群落结构，通过选择性培养基分析可培养弧菌和肠球菌的丰度，进一步利用定量PCR分析弧菌 (Vibrio) 和肠球菌 (Enterococcus) 典型毒力基因含量。结果发现，新村、黎安海草床水体潜在致病菌与潭门有显著差异；可培养弧菌和肠球菌及其典型毒力基因vhh、toxR、aspA、esp和gelE均呈现新村>黎安>潭门的趋势，而弧菌典型毒力基因ctxA、tlh、trh和vvp呈现黎安>新村>潭门的趋势。新村和黎安较高的人类活动强度如营养负荷，可能是导致其海草床致病菌和毒力基因丰度较高的重要原因，而新村和黎安的差异可能与不同的人类活动方式有关。
- 海草床 /
- 潜在致病菌 /
- 弧菌 /
- 肠球菌 /
- 典型毒力基因
Abstract:
In this study, 16S rRNA gene sequencing was used to analyze the community structure of potential pathogenic bacteria in the typical tropical (Xincun, Li'an, Tanmen) seagrass meadows of the South China Sea. The abundances of Vibrio and Enterococcus were counted by selective medium analysis, and their typical virulence genes abundances were quantified by quantitative PCR. The results show that the putative bacterial pathogens in Xincun and Li'an clustered and then separated from those of Tanmen. Abundances of cultured Vibrio and Enterococcus, and the typical virulence genes contents of vhh, toxR, aspA, esp, and gelE followed a descending order of Xincun>Li'an>Tanmen, while the contents of Vibrio typical virulence genes of ctxA, tlh, trh, and vvp followed a descending order of Tanmen>Xincun> Li'an. Higher intensity human activities, such as nutrient load, probably are responsible for the higher abundance of pathogens and virulence genes of seagrass meadows in Xincun and Li'an, while the differences between Xincun and Li'an may be attributed to different types of human activities.
- Seagrass meadow /
- Potential pathogens /
- Vibrio /
- Enterococcus /
- Typical virulence gene

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海草床生态系统是近岸海域生产力极高的生态系统，虽然仅占全球海洋面积的0.2%，但却贡献了全球海洋1%的净初级生产力^[1]。海草床是许多经济鱼类和无脊椎动物的重要育幼场所，比沿岸其他生境具有更高的水生动物幼体生物量和密度^[2]。此外，全球50%的人口都居住在距离海洋100 km范围内^[3]。近年来，海草床能够清除水体潜在致病菌，从而降低水生动物及人类患病风险的能力被逐渐认识^[4-5]。研究表明，沿岸海草床生态系统能够使水体潜在致病菌的生物量下降50%，并使人类和水生动物患病风险下降超过一半^[4]。因此，海草床作为沿岸海域潜在致病菌的重要屏障，与水生动物和人类健康密切相关。

潜在致病菌的生物量及其毒力决定了人类和水生动物的患病风险^[6-7]，并常作为生态健康的重要指标。潜在的海洋致病菌广泛存在于沿岸生境水体，常见的主要有肠球菌 (Enterococcus)、弧菌 (Vibrio)、气单胞菌 (Aeromonas)、希瓦氏菌 (Shewanella)、爱德华氏菌 (Edwardsiella)、沙门氏菌 (Salmonella)、弯曲杆菌 (Campylobacter) 和耶尔森氏菌 (Yersinia) 等^[8-10]。沉积物和近岸沙滩是水体潜在致病菌的主要来源^[11-12]。同时，人类活动如生活污水排放、农业和畜牧业污水排放和网箱养殖等都会向沿岸海域释放大量的潜在致病菌^[9]。

20世纪以来，受人类活动和气候变化的影响，全球约有30%的海草床生境消失且近几十年消失速度急剧上升，从每年0.9%升至7%，严重削弱了海草床去除水体致病菌的能力^[13]。本研究利用高通量测序技术分析了我国热带典型海草床生态系统水体的微生物群落结构，并确定其潜在致病菌的结构特征，同时通过选择性培养基分析可培养弧菌和肠球菌的丰度，进一步利用定量PCR分析弧菌和肠球菌典型毒力基因的含量，从而探讨我国热带典型海草床潜在致病菌群落结构及其毒力基因丰度的空间特征，为评估海草床降低人类和水生动物患病风险能力对环境变化的响应提供科技基础，并为海草床的保护提供科学依据。

1. 材料与方法

1.1 研究区域与样品采集

2018年4月，对位于海南岛东海岸线的新村湾 (109°59'42''E, 18°24'03''N)、黎安港 (110°3'18''E, 18°24'46''N) 和潭门港 (110°38'22''E, 19°15'04''N) 3处热带典型海草床进行实地调查。这3处海草床均以海菖蒲 (Enhalus acoroides) 和泰来草 (Thalassia hemprichii) 混合生长为主。根据前期对这3处海草床的调查，营养盐负荷趋势为新村>黎安>潭门，这主要是因为这些海草床网箱养殖和其他人类活动的强度不同^[14-15]。在每片海草床设置4个海水采样点，相邻2个采样点之间的距离约为1~1.5 km。退潮时在每个取样点采集3 L海水 (水深约60 cm)，平均分成3份，分别进行下述分析。

1.2 DNA提取，PCR扩增与16S rRNA测序

取1 L海水用无菌过滤泵经0.22 μm聚醚砜膜 (Supor-200, Pall) 过滤。用CTAB法从滤膜中提取总基因组DNA。用1%琼脂糖凝胶检测DNA浓度和纯度。根据浓度，用无菌水稀释DNA至1 ng·μL⁻¹。扩增16S rRNA基因V3—V4区，用GeneJETTM凝胶提取试剂盒 (Thermo Scientific，美国) 纯化混合PCR产物。测序文库根据Ion Plus片段文库试剂盒 (Thermo Scientific，美国) 的操作说明构建。文库质量通过Qubit@2.0荧光计 (Thermo Scientific，美国) 进行评估。最后，扩增子文库在北京诺禾致源生物信息科技有限公司的Ion S5TM XL平台上进行测序，得到400~600 bp的单端reads结果。

1.3 潜在致病菌群落结构分析

将标签和引物序列从单端reads中切断。根据Cutadapt质量控制过程^[16]对原始序列进行质量过滤。然后利用UCHIME算法检测并去除嵌合序列^[17]。使用Uparse软件^[18]将clean序列分为操作分类单元 (Operational taxonomic unit, OTU)。根据序列最少的样本，将OTUs丰度均一化。利用Silva数据库，基于Mothur算法对每个OTU的代表序列进行筛选及分类学注释^[19]。在查阅文献的基础上，整理获得属水平人和动物的潜在致病菌。

1.4 可培养弧菌和肠球菌分析

分别用TCBS琼脂 (BD，美国)^[20]和Slanetz-Bartley选择性琼脂 (广东环凯微生物科技有限公司)^[21]确定海草床水体中可培养弧菌和肠球菌的丰度。将100 μL海水直接吸入以上2种平板后，用无菌涂布棒涂布均匀；同时将10和100倍稀释后的100 mL海水用无菌过滤泵经0.22 μm聚醚砜膜 (Supor-200, Pall) 过滤，并将滤膜放置于以上2种平板。TCBS琼脂平板在 (28.0±1.0)℃下孵育18~24 h，Slanetz-Bartley选择性琼脂平板在 (37.0±1.0)℃下孵育18~24 h，然后计数。根据不同稀释浓度平板生长情况，选取合适的稀释倍数，即每个平板生长克隆数为30~500个，根据稀释倍数计算海草床水体 (CFU·mL⁻¹) 中弧菌和肠球菌的丰度。

1.5 弧菌和肠球菌典型毒力基因的定量PCR分析

水体DNA样品准备同1.2。根据浓度，用无菌水稀释DNA至10 ug·μL⁻¹。选取弧菌和肠球菌典型毒力基因 (表1)：ctxA、tlh、trh、vvp、vhh、toxR、aspA、esp和gelE。根据基因序列，利用primer 5设计特异性引物。利用Roche LightCycler480Ⅱ实时荧光定量PCR仪 (Roche，德国)，使用SYBR^® Premix Ex Taq™ II (Tli RNaseH Plus) (TaKaRa，日本) 对水体DNA中的各典型毒力基因进行荧光定量分析。以16S rRNA基因为内参，用2^−△△Ct法计算各基因的相对含量。

表 1 本研究所用引物序列

Table 1. Primer sequences used in this study

引物名称 Primer name	引物序列 Primer sequence	基因描述 Gene characterization
16S rRNA-F	TGTGTAGCGGTGAAATGCG	内参
16S rRNA-R	CATCGTTTACGGCGTGGAC	16S核糖体基因
ctxA-F	TTTGTTAGGCACGATGATGGAT	霍乱弧菌
ctxA-R	ACCAGACAATATAGTTTGACCCACTAAG	霍乱毒素A亚基基因
tlh-F	GAAAGCGCCTCAGTTTAAG	副溶血弧菌
tlh-R	ACTCGTTCATCTCAAGCACT	不耐热溶血毒素基因
trh-F	GACTAYTGGACAAACCGAAAC	副溶血弧菌耐热性溶血毒素
trh-R	ACYGTYATATAGGCGCTTAACC	相关的溶血毒素基因
vvp-F	TCTCGGTCTTATGCTTGTTGCA	创伤弧菌
vvp-R	TCGGAGACGGACACCATTTC	金属蛋白酶基因
vhh-F	GGGCAGAAAATCCAGACGGC	哈维弧菌
vhh-R	GTAGGAGAAACGGTTATCGGCTGC	溶血毒素基因
toxR-F	CGCCAGCAGTGGAGTTAGAA	溶藻弧菌
toxR-R	TAATGACACGCGGTAGCCAG	转录调控因子基因
aspA-F	GAAGGCGGTCAGCTACAGC	弧菌
aspA-R	GTTGTAAACGTAGTTTTCGCAAACTTC	碱性丝氨酸蛋白酶基因
esp-F	GCGGGAACAGGTCACAAAGC	肠球菌
esp-R	TTCATCTTTCGCGATTAATTTACTTGAATC	表面蛋白基因
gelE-F	ACACCAACAGGAAAAACGTATGC	肠球菌
gelE-R	TTCATTCAAGGCACCTGATTGTC	明胶酶基因

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1.6 统计分析

利用PRIMER 6 & PERMANOVA+^[22]软件，基于各样品中潜在致病菌相对含量得到Bray-Curtis距离矩阵。基于Bray-Curtis距离矩阵进行初步的单向排列多元方差分析 (PERMANOVA)、主坐标分析 (pCoA) 和相似率分析 (SIMPER)，解析不同海草床水体致病菌群落结构的差异以及差异的主要来源。采用SPSS 19.0软件对不同海草床水体可培养弧菌和肠球菌数量及其典型毒力基因含量进行单因素方差分析 (One-way ANOVA)，P<0.05被认为差异显著。

2. 结果

2.1 海草床水体潜在致病菌群落结构的空间特征

16S rRNA扩增子鉴定得到19个对人、鱼、无脊椎动物和哺乳动物等致病的潜在致病菌属，总潜在致病菌依次占新村、黎安和潭门总细菌群落的(0.54±0.22)%、(0.44±0.08)%和(0.48±0.04)%，且不同区域之间总潜在致病菌相对丰度无显著差异 (One-way ANOVA, P>0.05，表2)。其中丰度前6的属为弓形杆菌属 (Arcobacter)、拟杆菌属 (Bacteroides)、弧菌属、黄杆菌属 (Tenacibaculum)、假交替单胞菌属 (Pseudoalteromonas) 和肠球菌属，占总潜在致病菌组成的81.33%~87.28% (表2)。PERMANOVA分析显示，不同海草床之间潜在致病菌群落结构组成差异显著 [Pseudo-F=1.9322, P (perm)=0.037]。主成分分析表明，新村和黎安的潜在致病菌相对聚合，并通过PCO1轴与潭门的潜在致病菌分开 (图1)。进一步SIMPER分析显示，丰度前6的属对不同海草床之间的潜在致病菌群落结构的差异贡献总量超过50%，依次为56.54% (新村 vs 黎安)、66.17% (新村 vs 潭门) 和67.45% (黎安 vs 潭门) (图2)。假交替单胞菌属潭门含量显著高于新村和黎安 (One-way ANOVA，F=8.364，P=0.009)。其他的潜在致病菌属，尽管不同海草床间相对丰度无显著差异 (One-way ANOVA，所有P>0.05)，但弓形杆菌属和黄杆菌属在新村和黎安的平均丰度远大于潭门；而拟杆菌属在新村和黎安的平均丰度远小于潭门；3个海草床水体中弧菌属和肠球菌属的平均相对丰度差异不明显 (表2)。

表 2 属水平海草床水体各潜在致病菌的相对丰度

Table 2. Relative abundance of each potential pathogens of seagrass meadows at genus level

分类系统 Taxonomy	新村 Xincun	黎安 Li'an	潭门 Tanmen	感染有机体 Infection organism	参考文献 References
弓形杆菌属 Arcobacter	22.96±19.39^A	11.50±4.78^A	2.29±0.36^A	人、鱼	[23]
拟杆菌属 Bacteroides	7.26±1.01^A	9.02±1.02^A	14.37±7.90^A	人	[24]
肠球菌属 Enterococcus	2.39±0.37^A	2.43±0.40^A	2.63±0.44^A	人、鱼	[24]
嗜血杆菌属 Haemophilus	1.77±0.51^A	1.86±0.21^A	2.48±0.21^A	人	[24]
弧菌属 Vibrio	7.73±2.59^A	5.58±1.21^A	6.92±2.06^A	人、鱼、无脊椎动物	[25]
黄杆菌属 Tenacibaculum	6.44±3.50^A	8.97±3.24^A	0.29±0.23^A	人、鱼	[26]
假交替单胞菌属 Pseudoalteromonas	0.72±0.46^A	0.81±0.20^A	12.17±3.91^B	无脊椎动物	[27]
链球菌属 Streptococcus	0.67±0.25^A	0.95±0.19^A	0.76±0.30^A	人、鱼	[28]
发光杆菌属 Photobacterium	1.91±1.72^A	0.57±0.28^A	2.63±1.60^A	人、鱼	[29]
芽孢杆菌属 Bacillus	0.14±0.14^A	0.00±0.00^A	2.00±2.00^A	人、鱼、无脊椎动物	[26, 30]
铜绿色假单胞菌属 Pseudomonas	0.10±0.10^A	0.91±0.84^A	0.00±0.00^A	人、鱼、无脊椎动物	[30]
分枝杆菌属 Mycobacterium	0.14±0.14^A	0.67±0.61^A	0.53±0.26^A	人、鱼、哺乳动物	[31]
噬细胞菌属 Cytophaga	1.29±1.29^A	0.00±0.00^A	0.00±0.00^A	无脊椎动物	[32]
盐单胞菌属 Halomonas	0.43±0.25^A	0.14±0.14^A	0.29±0.12^A	人、鱼	[33]
黄杆菌属 Flavobacterium	0.00±0.00^A	0.53±0.32^A	0.10±0.10^A	鱼	[34]
军团菌属 Legionella	0.29±0.17^A	0.00±0.00^A	0.00±0.00^A	人	[35]
弗朗西斯氏菌属 Francisella	0.05±0.05^A	0.00±0.00^A	0.10±0.10^A	人、鱼	[36]
微球菌属 Micrococcus	0.14±0.14^A	0.00±0.00^A	0.00±0.00^A	无脊椎动物	[37]
嗜冷杆菌属 Psychrobacter	0.00±0.00^A	0.10±0.10^A	0.00±0.00^A	人	[38]
注：单因素方差分析结果，其中不同的字母(A, B) 代表差异性显著，相同的字母代表差异性不显著 Note: The results of One-way ANOVA. Different letters (A, B) indicate significant difference, and the same letters indicate no significant difference.

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图 1 基于Bray-Curtis距离矩阵的潜在致病菌群落的主成分分析

Figure 1. Principal co-ordinates analysis (pCoA) ordination of potential pathogenic microbial community data based on Bray-Curtis distance

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图 2 丰度前6的潜在致病菌属对不同海草床水体潜在致病菌群落结构的差异贡献率

Figure 2. Dissimilarity contribution rate of top six potential pathogenic genera to community structure of potential pathogenic bacteria in different seagrass meadows

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2.2 海草床水体可培养弧菌和肠球菌的空间特征

弧菌和肠球菌选择性培养基筛选结果发现：1) 弧菌在新村、黎安和潭门海草床水体依次为 (1 045±654) CFU·mL⁻¹、(305±35) CFU·mL⁻¹、(75±490) CFU·mL⁻¹，不同海草床间无显著差异 (P>0.05)，但平均值所呈趋势为新村>黎安>潭门 (图3-a)；2) 肠球菌在新村、黎安和潭门海草床水体含量依次为(525±492) CFU·mL⁻¹、(10±6)CFU·mL⁻¹、(3±3) CFU·mL⁻¹，不同海草床间无显著差异 (P>0.05)，但平均值呈现趋势为新村>黎安>潭门 (图3-b)。

图 3 不同海草床水体可培养弧菌 (a) 和肠球菌 (b) 丰度

Figure 3. Abundance of Vibrio (a) and Enterococcus (b) in different seagrass meadows

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2.3 海草床水体典型毒力基因含量的空间特征

定量分析结果表明，尽管不同海草床间各典型毒力基因含量无显著差异 (P>0.05)，但平均值显示ctxA、tlh、trh和vvp呈现趋势为黎安>新村>潭门 (图4)；vhh、toxR、aspA、esp和gelE呈现趋势为新村>黎安>潭门 (图5，图6)。

图 4 弧菌典型毒力基因ctxA、tlh、trh 和vvp在不同海草床水体中的相对含量

Figure 4. Relative abundance of Vibrio typical virulence genes ctxA, tlh, trh and vvp in different seagrass meadows

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图 5 弧菌典型毒力基因vhh、toxR 和aspA 在不同海草床水体中的相对含量

Figure 5. Relative abundance of Vibrio typical virulence genes vhh , toxR and aspA in different seagrass meadows

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图 6 肠球菌典型毒力基因esp和gelE在不同海草床水体中的相对含量

Figure 6. Relative abundance of Enterococcus typical virulence genes esp and gelE in different seagrass meadows

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3. 讨论

我国热带典型海草床水体中发现并鉴定出19个属的潜在致病菌，少于Lamb等^[4]在印度尼西亚斯密蒙德群岛海草水体中鉴定出的42个属的潜在致病菌，但是潜在致病菌总含量 (<1%) 则与Lamb等^[4]的结果类似。此外，不到1%的海草床水体潜在致病菌含量远低于相应区域约24%的海草床沉积物潜在致病菌含量^[39]。研究表明，沉积物中的病原菌丰度可高达水体的100倍^[40-41]，这表明海草床可能通过捕获水体悬浮颗粒物，进而将水体中的病原菌沉降到沉积物中^[42]。

尽管潜在致病菌总的相对丰度在不同海草床水体之间无显著差异，但是其群落结构组成在不同的海草床水体之间差异显著，并且主坐标分析中PCO1轴将新村和黎安与潭门分开。此外，丰度前6的属占总潜在致病菌组成的80%以上，并且对不同海草床之间的潜在致病菌群落结构的差异贡献总量超过50%。其中弓形杆菌属和黄杆菌属在新村和黎安的平均丰度远大于潭门；拟杆菌属和假交替单胞菌属在新村和黎安的平均丰度远小于潭门；而弧菌属和肠球菌属的平均相对丰度在3个海草床水体中差异不明显。潜在致病菌生物量在沿岸水体中呈现显著的季节变化^[43]，而影响沿岸海域潜在致病菌季节变化的主要因素为温度、盐度、pH、溶解氧、浑浊度和太阳辐射^{[8, 43-44]}，例如，弧菌生物量与温度呈显著正相关^[44]。此外，C、N、P等营养负荷导致海草床浮游植物、底栖藻类、附生藻类和大型藻类的爆发^[45]，影响潜在致病菌生长或为其中间宿主提供重要食物来源，从而改变潜在致病菌的生物量。例如，Allison 等^[46]在加拿大东南部沿岸区域研究发现，在高营养负荷区域的浮游植物、大型藻类丝藻属 (Ulothrix speciosa) 和孔石莼 (Ulva lactuca) 生物量分别是低营养负荷区域的1.8、40和670倍，而Michael 等^[47]研究发现，底栖微藻表面的微生物是珊瑚礁致病菌的重要来源。因此，温度、盐度、pH、溶解氧、浑浊度、太阳辐射以及营养负荷的差异可能造成了3处海草床区域潜在致病菌的群落结构差异。近封闭式的新村和黎安存在大量的网箱养殖及污水排放等频繁的人为活动，导致新村和黎安相对高的营养负荷；相反，潭门是相对开放式的海湾，网箱养殖和污水排放较少，营养负荷相对低^[14-15]。因此，营养负荷的差异很可能是造成新村、黎安和潭门潜在致病菌群落结构差异的主要原因。

弧菌被发现广泛分布在海洋环境中，其中许多种类既是引起海洋生物病害的重要病原菌，也是造成人类食物中毒和肠道急性传染病等的重要致病菌，已成为海洋环境中人兽感染的主要风险源^[48]。肠球菌是肠道的常驻菌，具有极大的酸碱、温度、渗透压和氧气适应范围^[49-50]，是医院获得性继发感染的主要原因^[51]。本研究发现，尽管弧菌和肠球菌 (被培养+未被培养) 总平均相对丰度在3处海草床水体中差异不明显，但是被培养的弧菌和肠球菌在新村的含量显著高于黎安和潭门，并呈现新村>黎安>潭门的趋势。弧菌和肠球菌均被报道在营养负荷增强时显著增加^[52-53]。这是因为营养负荷导致水体中藻类丰度增加，提高了水体活性有机碳含量，而作为r-选择细菌的弧菌和肠球菌能够很好地利用活性有机碳生长繁殖^[45]。例如，吴建平等^[53]研究发现，大亚湾网箱养殖区域网箱内的可培养弧菌是网箱外的4倍，是非网箱区域的11倍。因此，弧菌和肠球菌可培养结果进一步表明，营养负荷的差异是造成新村、黎安和潭门的潜在致病菌群落结构差异的重要原因。

进一步，与弧菌和肠球菌可培养细菌数量趋势相似，弧菌典型毒力基因vhh (哈维弧菌)、toxR (溶藻弧菌) 和aspA (弧菌) 以及肠球菌典型毒力基因esp和gelE的平均含量均呈现新村>黎安>潭门的趋势。值得注意的是，弧菌典型毒力基因ctxA (霍乱弧菌)、tlh (副溶血弧菌)、trh (副溶血弧菌) 和vvp (创伤弧菌) 的平均含量呈现黎安>新村>潭门的趋势。溶藻弧菌和哈维弧菌主要感染鱼类等海洋动物，对人的感染极少，而霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌长期以来被认为是海洋环境中最严重的病原菌，它们是人类的致病菌，可引起海鲜性胃肠炎、霍乱、伤口感染和败血症等^[54-55]。ctxA、tlh、trh和vvp在黎安含量高于新村，推测霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌的数量黎安高于新村。尽管黎安的总营养负荷水平比新村低，但黎安周围人类污水和粪便等的直接排放更加剧烈，这很可能是该水域人类致病菌以及相应致病基因含量增加的主要原因。然而，具体影响机制有待深入研究。

综上所述，网箱养殖和污水排放等人类活动的影响导致沿岸营养负荷不断加剧^{[45, 56]}，从而直接增加海草床水体潜在致病菌的生物量^[7]，并增强潜在致病菌的毒力^[57]，提高疾病暴发的潜力。此外，研究表明富营养化会导致海草地上和地下生物量下降^[58]。海草地上生物量的下降会减弱其捕获水体颗粒物的能力^[59]，地下生物量的下降不利于沉积物的稳定^[60]，很可能会导致水体潜在致病菌生物量的上升。同时，海草生物量的下降会减少海草组织向水体释放抑制潜在致病菌活性的物质，可能会削弱其抑制潜在致病菌活性的能力，从而导致潜在致病菌毒力上升。然而，目前关于驱动海草床致病菌和其毒力基因变化的因子仍不明确，亟待更深入的研究。

图 1 基于Bray-Curtis距离矩阵的潜在致病菌群落的主成分分析

Figure 1. Principal co-ordinates analysis (pCoA) ordination of potential pathogenic microbial community data based on Bray-Curtis distance

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图 2 丰度前6的潜在致病菌属对不同海草床水体潜在致病菌群落结构的差异贡献率

Figure 2. Dissimilarity contribution rate of top six potential pathogenic genera to community structure of potential pathogenic bacteria in different seagrass meadows

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图 3 不同海草床水体可培养弧菌 (a) 和肠球菌 (b) 丰度

Figure 3. Abundance of Vibrio (a) and Enterococcus (b) in different seagrass meadows

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图 4 弧菌典型毒力基因ctxA、tlh、trh 和vvp在不同海草床水体中的相对含量

Figure 4. Relative abundance of Vibrio typical virulence genes ctxA, tlh, trh and vvp in different seagrass meadows

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图 5 弧菌典型毒力基因vhh、toxR 和aspA 在不同海草床水体中的相对含量

Figure 5. Relative abundance of Vibrio typical virulence genes vhh , toxR and aspA in different seagrass meadows

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图 6 肠球菌典型毒力基因esp和gelE在不同海草床水体中的相对含量

Figure 6. Relative abundance of Enterococcus typical virulence genes esp and gelE in different seagrass meadows

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表 1 本研究所用引物序列

Table 1 Primer sequences used in this study

引物名称 Primer name	引物序列 Primer sequence	基因描述 Gene characterization
16S rRNA-F	TGTGTAGCGGTGAAATGCG	内参
16S rRNA-R	CATCGTTTACGGCGTGGAC	16S核糖体基因
ctxA-F	TTTGTTAGGCACGATGATGGAT	霍乱弧菌
ctxA-R	ACCAGACAATATAGTTTGACCCACTAAG	霍乱毒素A亚基基因
tlh-F	GAAAGCGCCTCAGTTTAAG	副溶血弧菌
tlh-R	ACTCGTTCATCTCAAGCACT	不耐热溶血毒素基因
trh-F	GACTAYTGGACAAACCGAAAC	副溶血弧菌耐热性溶血毒素
trh-R	ACYGTYATATAGGCGCTTAACC	相关的溶血毒素基因
vvp-F	TCTCGGTCTTATGCTTGTTGCA	创伤弧菌
vvp-R	TCGGAGACGGACACCATTTC	金属蛋白酶基因
vhh-F	GGGCAGAAAATCCAGACGGC	哈维弧菌
vhh-R	GTAGGAGAAACGGTTATCGGCTGC	溶血毒素基因
toxR-F	CGCCAGCAGTGGAGTTAGAA	溶藻弧菌
toxR-R	TAATGACACGCGGTAGCCAG	转录调控因子基因
aspA-F	GAAGGCGGTCAGCTACAGC	弧菌
aspA-R	GTTGTAAACGTAGTTTTCGCAAACTTC	碱性丝氨酸蛋白酶基因
esp-F	GCGGGAACAGGTCACAAAGC	肠球菌
esp-R	TTCATCTTTCGCGATTAATTTACTTGAATC	表面蛋白基因
gelE-F	ACACCAACAGGAAAAACGTATGC	肠球菌
gelE-R	TTCATTCAAGGCACCTGATTGTC	明胶酶基因

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表 2 属水平海草床水体各潜在致病菌的相对丰度

Table 2 Relative abundance of each potential pathogens of seagrass meadows at genus level

分类系统 Taxonomy	新村 Xincun	黎安 Li'an	潭门 Tanmen	感染有机体 Infection organism	参考文献 References
弓形杆菌属 Arcobacter	22.96±19.39^A	11.50±4.78^A	2.29±0.36^A	人、鱼	[23]
拟杆菌属 Bacteroides	7.26±1.01^A	9.02±1.02^A	14.37±7.90^A	人	[24]
肠球菌属 Enterococcus	2.39±0.37^A	2.43±0.40^A	2.63±0.44^A	人、鱼	[24]
嗜血杆菌属 Haemophilus	1.77±0.51^A	1.86±0.21^A	2.48±0.21^A	人	[24]
弧菌属 Vibrio	7.73±2.59^A	5.58±1.21^A	6.92±2.06^A	人、鱼、无脊椎动物	[25]
黄杆菌属 Tenacibaculum	6.44±3.50^A	8.97±3.24^A	0.29±0.23^A	人、鱼	[26]
假交替单胞菌属 Pseudoalteromonas	0.72±0.46^A	0.81±0.20^A	12.17±3.91^B	无脊椎动物	[27]
链球菌属 Streptococcus	0.67±0.25^A	0.95±0.19^A	0.76±0.30^A	人、鱼	[28]
发光杆菌属 Photobacterium	1.91±1.72^A	0.57±0.28^A	2.63±1.60^A	人、鱼	[29]
芽孢杆菌属 Bacillus	0.14±0.14^A	0.00±0.00^A	2.00±2.00^A	人、鱼、无脊椎动物	[26, 30]
铜绿色假单胞菌属 Pseudomonas	0.10±0.10^A	0.91±0.84^A	0.00±0.00^A	人、鱼、无脊椎动物	[30]
分枝杆菌属 Mycobacterium	0.14±0.14^A	0.67±0.61^A	0.53±0.26^A	人、鱼、哺乳动物	[31]
噬细胞菌属 Cytophaga	1.29±1.29^A	0.00±0.00^A	0.00±0.00^A	无脊椎动物	[32]
盐单胞菌属 Halomonas	0.43±0.25^A	0.14±0.14^A	0.29±0.12^A	人、鱼	[33]
黄杆菌属 Flavobacterium	0.00±0.00^A	0.53±0.32^A	0.10±0.10^A	鱼	[34]
军团菌属 Legionella	0.29±0.17^A	0.00±0.00^A	0.00±0.00^A	人	[35]
弗朗西斯氏菌属 Francisella	0.05±0.05^A	0.00±0.00^A	0.10±0.10^A	人、鱼	[36]
微球菌属 Micrococcus	0.14±0.14^A	0.00±0.00^A	0.00±0.00^A	无脊椎动物	[37]
嗜冷杆菌属 Psychrobacter	0.00±0.00^A	0.10±0.10^A	0.00±0.00^A	人	[38]
注：单因素方差分析结果，其中不同的字母(A, B) 代表差异性显著，相同的字母代表差异性不显著 Note: The results of One-way ANOVA. Different letters (A, B) indicate significant difference, and the same letters indicate no significant difference.

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1. 材料与方法
1.1 研究区域与样品采集
1.2 DNA提取，PCR扩增与16S rRNA测序
1.3 潜在致病菌群落结构分析
1.4 可培养弧菌和肠球菌分析
1.5 弧菌和肠球菌典型毒力基因的定量PCR分析
1.6 统计分析
2. 结果
2.1 海草床水体潜在致病菌群落结构的空间特征
2.2 海草床水体可培养弧菌和肠球菌的空间特征
2.3 海草床水体典型毒力基因含量的空间特征
3. 讨论

1. 材料与方法
1.1 研究区域与样品采集
1.2 DNA提取，PCR扩增与16S rRNA测序
1.3 潜在致病菌群落结构分析
1.4 可培养弧菌和肠球菌分析
1.5 弧菌和肠球菌典型毒力基因的定量PCR分析
1.6 统计分析
2. 结果
2.1 海草床水体潜在致病菌群落结构的空间特征
2.2 海草床水体可培养弧菌和肠球菌的空间特征
2.3 海草床水体典型毒力基因含量的空间特征
3. 讨论

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我国热带典型海草床潜在致病菌群落结构及其毒力基因丰度的空间特征

作者简介: 邓益琴 (1990—)，女，博士，助理研究员，从事鱼类细菌病及防治技术研究。E-mail: yiqindd@126.com

通讯作者: 冯 娟 (1973—)，女，博士，研究员，从事鱼类细菌病及防治技术研究。E-mail: jannyfeng@163.com

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