Molecular cloning and multifunction exploration of CFSH gene in Penaeus monodon
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摘要:
该研究通过RACE (Rapid-amplification of cDNA ends) 法克隆并获得斑节对虾 (Penaeus monodon) 甲壳动物雌性激素 (Crustacean female sex hormone, CFSH) 基因PmCFSH的开放阅读框(ORF)及3'非编码区(UTR)，预测编码214 氨基酸(aa)的蛋白，其含有信号肽和1个与免疫应答相关的白介素17E (IL-17E) 结构域。qRT-PCR结果显示，PmCFSH基因在各个组织中均有表达，其中在腹神经组织中的表达量最高；从受精卵时期到仔虾期的表达量呈逐渐上升趋势，其中在仔虾期表达量最高；在卵巢发育Ⅱ—Ⅳ期，随卵巢发育成熟表达量逐渐升高；革兰氏阴性菌和阳性菌均能上调PmCFSH基因的表达量，其中鳃组织PmCFSH在哈维氏弧菌 (Vibrio harveyi) 感染后第3小时和金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) 刺激后第12小时达到表达高峰；而肝胰腺PmCFSH在哈维氏弧菌感染后第3小时和金黄色葡萄球菌刺激后第48小时达到表达高峰。研究表明，PmCFSH基因不仅参与幼体发育以及性腺成熟的调控，对细菌的应激也具有免疫应答响应，体现了激素的“多功能性”现象。
Abstract:We cloned the ORF and 3'UTR of PmCFSH [Crustacean female sex hormone (CFSH) gene of Penaeus monodon] by RACE (Rapid-amplification of cDNA ends) method. It encodes a protein of 214 aa which contains a signal peptide and an interleukin 17E (IL-17E) domain relating to immune response. The qRT-PCR results showed that PmCFSH was expressed in various tissues, among which the highest expression level was found in the abdominal nerve tissue. The expression level gradually increased from fertilized egg stage to larval stage, and reached the maximum at larval stage. During the ovarian development Stage II to IV, it gradually increased as the ovary matured. Both Gram-negative and positive bacteria could increase the PmCFSH expression which was maximum in gill at 3rd hour after Vibrio harveyi infection and 12th hour after Staphylococcus aureus stimulation, while that in hepatopancreas reached the maximum at 3rd hour after V. harveyi infection and 48th hour after S. aureus stimulation. The study reveals that PmCFSH gene not only participates in the regulation of larval development and gonad maturity, but also has an immune response to bacterium, reflecting the "multifunction" of hormones.
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Keywords:
- Penaeus monodon /
- CFSH /
- Gene expression /
- Multifunction /
- Development /
- Stress
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鱼类在水体中的生命活动会受到不同环境的影响，水中的溶解氧浓度变化对鱼类有至关重要的影响。水中溶解氧质量浓度在4.0 mg·L−1以上时，鱼类可以正常生长发育；低于1.0 mg·L−1时，大部分鱼类会出现浮头现象[1]。水中溶解氧浓度降低，不仅使鱼类呼吸和摄氧能力下降[2]，还会影响鱼类细胞的存活和信号传递[3]，并直接影响其产卵、交配、生长、发育等一系列生命活动[4]，严重时还会出现死亡，破坏种群内部的动态平衡。
斑马鱼 (Danio rerio) 具有易繁殖、发育快等优点[5]，一直作为模式生物用于生物医学研究[6-7]。作为模式生物，斑马鱼的应激调节功能、心血管系统功能等与人类高度相似[8-9]。鳃是鱼类重要的黏膜免疫器官和呼吸器官，在鱼类低氧适应研究中常作为主要的研究对象，如低氧胁迫下鳃组织中热休克蛋白的研究[10]，草鱼 (Ctenopharyngodon idellus) 在低氧胁迫下鳃的差异蛋白质组学及热休克诱导[11]，低氧胁迫对卵形鲳鲹 (Trachinotus ovatus) 鱼体鳃器官的影响[12]等。
miRNAs可以通过调控其靶基因的表达水平从而参与细胞的各类进程，并参与许多关键的生理进程与病理过程[13]。已有多项研究表明，miRNAs是植物和动物面临环境胁迫作出响应的关键调节剂，一些miRNAs可以通过调控基因表达，恢复或重建新的表达程序，从而增强细胞对胁迫的耐受性[14]。低氧是生物常常面临的一种胁迫，目前已有一些应对低氧胁迫miRNAs的报道。如缺氧性神经胶质瘤来源的外泌体通过信号转导和转录活化因子3 (STAT3) 和核因子κB (NF-κB) 途径靶向端粒重复结合因子2 (terf2ip)，传递microRNA-1246诱导M2巨噬细胞极化[15]。miR-204可以作用于血管内皮生长因子 (vegf) 的3'-UTR区，是一个内源性的vegf表达调控因子。miR-204通过基因网络调控应答低氧胁迫[16]。miR-126-5p可以作为一种新型的miRNA，在缺氧条件下靶向白细胞介素17 (IL-17A) 来调节大鼠心肌细胞 (H9c2) 的活力和凋亡[17]。
热休克蛋白 (Heat shock proteins, HSPs) 是生物在面对环境中的物理、化学、生物等刺激发生应激反应后大量产生的，常被称为应激蛋白[18]。热休克蛋白是生物体内最古老的分子之一。生物体为抵御环境变化所带来的刺激，会减少其他正常蛋白的合成，同时增加HSP的合成以应对环境的变化，帮助生物体恢复正常[10]。因此本文在对常氧和低氧胁迫下的斑马鱼鳃组织进行小RNA组测序的基础上，进一步筛选可能与低氧胁迫相关的micRNAs，并用其对热休克蛋白基因进行了靶基因预测，以期进一步挖掘斑马鱼的低氧适应机制。
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验试剂
small RNA分离试剂盒，DEPC水 (生物生工有限公司)，氯仿 (24∶1)，Trizol 试剂，异丙醇，无水乙醇 (吉泰生物公司)。
1.1.2 实验器材
研磨棒、EP管、超净工作台、冰块、移液器、各类枪头、剪刀、镊子、锡纸均购买于上海生物生工有限公司，低氧驯化箱 (长沙华晓电子科技有限公司定制)，离心机，旋涡仪 (德国Eppendorf有限公司)。
1.2 方法
1.2.1 样本低氧处理
将本实验室培养的多代斑马鱼分别置于1.0 mg·L−1的低氧驯化箱中，保持该浓度进行低氧胁迫，同时保留6.7 mg·L−1的溶解氧质量浓度作为常氧对照组。在使用1.0 mg·L−1的溶解氧质量浓度进行低氧胁迫时，发现2周后斑马鱼不再出现浮头的现象，推测经2周低氧胁迫后其逐渐适应了低氧环境。故采用低氧驯化2周后的斑马鱼与常氧下的斑马鱼进行比对。低氧胁迫2周后，取出常氧/低氧条件下的斑马鱼，每个溶解氧质量浓度下取样本15尾 (体长3~4 cm)，解剖取出两组样本的鳃组织，备用。
1.2.2 高通量测序和生信分析
提取RNA样本，按照NucleoZOL试剂盒进行。将所提取的RNA进行电泳检测。检测后将EP管放入−80 ℃冰箱进行保存。将上述常氧和低氧下斑马鱼鳃组织提取后检测合格的RNA[19]，按照small RNA分离试剂盒的方法，分别进行small RNA的分离。将提取的small RNA进行纯化，运用荧光光度计进行定量，上机检测测序得到原始测序结果。为保证数据的质量，对原始数据进行处理。去除低质量的reads (N比例大于10%的reads、有5'接头污染的reads、无3'接头序列和插入片段的reads、3'接头序列以及polyA/T/G/C的reads) 后得到的clean small RNA reads数。其中大多数小RNA的长度为21~23 nt。对于该物种的ncRNA注释，若有该物种小RNA的注释信息，就用该物种ncRNA注释所测的small RNA。若没有该物种的信息，则选择Rfam数据库中rRNA、tRNA、snRNA和 snoRNA来注释测序所得的small RNA。
1.2.3 靶基因预测
本实验室前期通过对低氧、常氧条件下鳃组织的转录组比较分析发现，常氧低氧条件下斑马鱼鳃中一共筛选获得28个显著差异表达的热休克蛋白基因，包括表达量显著下调基因12个，显著上调基因16个[12]。对miRNAs 测序和斑马鱼鳃转录组进行关联分析。针对低氧胁迫和常氧条件下斑马鱼鳃中显著差异表达的miRNAs，对实验室前期筛选获得的28个差异热休克蛋白基因进行靶基因的预测分析。miRNAs的靶基因预测使用TargetScanFish (http://www.targetscan.org/fish_62/)、miRanda (http://www.microrna.org/microrna/home.do) 2个网站同时进行。
2. 结果
2.1 低氧与常氧下斑马鱼鳃的小RNA测序
常氧和低氧斑马鱼鳃样本的小RNA组测序分别产生6 995 009和6 662 504 bp的原始数据。去除低质量的数据后分别得到6 585 748和5 941 304 bp的clean data。
常氧与低氧小RNA序列比对后获得了相应结果，获得饼状图 (图1)。根据饼图比例分析，可以看出，其中常氧的miRNA约占整个small RNA总数量的40%。而低氧的约占20%。提示与常氧相比，低氧胁迫下的miRNA有降低的趋势 (图1)。
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图 1 常氧与低氧中鳃组织miRNA占小RNA的比例Figure 1. Proportion of miRNA in whole small RNAs sequence in normoxic and hypoxic gill tissues2.2 低氧/常氧下鳃组织的差异miRNAs分析
根据测序结果，首先排除tRNA、rRNA等小分子的RNA。利用归一化法对比低氧胁迫斑马鱼与常氧斑马鱼中同一个miRNA的表达差异量。利用火山图呈现差异miRNAs的整体分布情况。结果显示，低氧/常氧条件下的斑马鱼鳃间一共筛选出差异表达的miRNAs共32个 (图2)。使用校正后的显著水平 (P) 和差异倍数 (Fold change) 2个水平进行评估，设置显著差异表达miRNAs的筛选条件为P<0.01和 |log2(fold change)|>1。
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图 2 常氧和低氧鳃组织差异miRNAs火山图Figure 2. miRNAs volcano map of difference between normoxic and hypoxic gill tissues针对32个差异miRNAs，同时使用 |log2FC|≥1，P<0.05，且表达量≥50作为临界值，从低氧和常氧的比较中，一共鉴定获得低氧与常氧条件下显著差异表达的15个miRNAs。其中，13个miRNAs在低氧胁迫斑马鱼鳃中的表达量显著上调、2个miRNAs (miR-455-3p、miR-125b-5p) 的表达量显著下调。图3为显著差异表达miRNAs的聚类。
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图 3 常氧和低氧鳃组织差异miRNAs聚类图Figure 3. miRNAs clustering map of difference between normoxic and hypoxic gill tissues2.3 差异miRNAs靶向热休克蛋白基因的预测结果
针对前期筛选获得的低氧胁迫与常氧条件下显著差异表达的28个热休克蛋白基因 (包括12个表达量显著下调的hsp基因、16个显著上调的hsp基因)[11]进行靶基因预测，结果显示，7个显著差异表达的miRNAs可以靶向9个热休克蛋白基因。图4显示出单个miRNA靶向热休克蛋白基因的数量。
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图 4 差异miRNAs靶基因数量统计分析Figure 4. Statistical analysis of number of differential miRNAs target genes表达量显著下调的miR-455-3p可以靶向2个显著上调的热休克蛋白基因 (表1)。表达量显著上调的miRNAs (dre-miR-194a、dre-miR-155、dre-miR-130c、dre-miR-9、dre-miR-29a、dre-miR-96-5p) 可以靶向7个显著下调的热休克蛋白基因 (表2)。
表 1 斑马鱼低氧与常氧鳃中下调的miRNAs靶基因预测Table 1. Prediction of down-regulated miRNAs target genes in hypoxic and normoxic gills of D. reriomiRNA名称
miRNA name靶基因
Gene binding结合位点
Site目标区域的预测配对
Predicted pairing of target regiondre-miR-455-3p hspa14 935—941 
dnajb6b 1157—1163 
1829—1835 
表 2 斑马鱼低氧与常氧鳃中上调miRNAs靶基因预测Table 2. Prediction of up-regulated miRNAs target genes in hypoxic and normoxic gills of D. reriomiRNA名称
miRNA name靶基因
Gene binding结合位点
Site目标区域的预测配对
Predicted pairing of target regiondre-miR-194a hspa12a 2262—2268 
dnajc5aa 4114—4120 
hspb7 1644—1650 
hsp70.3 245—251 
dnajb2 3834—3840 
dre-miR-155 hspa12a 2771—2777 
hspg2 3611—3617 
hspa13 308—314 
903—910 
dnajb2 1484—1490 
3420—3426 
dre-miR-130c hspa12a 3219—3225 
4709—4715 
dnajb2 920—926 
dre-miR-9 dnajc5aa 2348—2354 
dnajb2 5033—5039 
dre-miR-29a hspg2 2832—2839 
dre-miR-96-5p dnajb2 2290—2296 
5045—5051 
5094—5100 
2.4 差异miRNAs靶向的热休克蛋白基因富集分析
针对差异miRNAs靶向的热休克蛋白基因进行富集分析发现，富集到的生物过程功能前6条通路主要与发育相关，包括dnajb6b和hspg2两个靶基因 (图5)。低氧胁迫的斑马鱼鳃中表达量显著上调的miR-455-3p靶向dnajb6b，而hspg2同时受到2个上调的miRNAs (miR-155和miR-29a) 调控。差异miRNAs靶向的热休克蛋白基因富集的前20条通路主要涉及的基因除了上面提及的2个miRNAs外，还包括miR-194a和miR-130c同时靶向的hspb7。
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图 5 差异miRNAs靶向的热休克蛋白基因GO富集Figure 5. GO enrichment of differential miRNAs-targeted heat shock protein genes3. 讨论
本研究发现了在缺氧反应中差异表达的15个miRNAs，13个miRNAs在低氧胁迫的斑马鱼鳃中表达量上调，2个miRNAs的表达显著下调。也有研究表明，在下调的miRNAs中，miR-125b-5p的靶基因rps3a通过在翻译机制中发挥调节作用以抑制细胞凋亡[20]；而在上调的miRNAs中，mir-192可以通过靶向E盒结合锌指蛋白基因 (Zeb2) 来保护肝脏免受氧化应激诱导的损伤，增强肝脏的低氧耐受性[21-22]。在人类细胞中，miR-29b的上调可以靶向TNF受体相关因子5 (TRAF5) 保护心肌细胞免受缺氧诱导的细胞凋亡[23]。miR-29b在调节细胞凋亡中显示出重要作用[24]。另外，小鼠中miR-216b可以作用于自噬相关蛋白13基因 (Atg13)，且使缺氧条件下细胞的自噬减少，并减少细胞的凋亡[25]。
高海拔人群中的miR-210-3p水平与红细胞计数以及血红蛋白和血细胞比容显示出强正相关性，被认为是人类适应高海拔地区生活的重要miRNA[26]。miR-194过表达可以保护缺氧诱导的人肾皮质近曲小管上皮细胞 (HK-2) 损伤[27]。miR-155被发现在低氧条件下促进内皮细胞的血管生成[28]。人参皂甙 (GS-Rb1) 可以增加mir-29a的表达量，保护缺氧的心肌细胞[29]。大鼠中Hif-1α诱导的miR-9上调在缺氧期间有助于肺动脉平滑肌细胞的表型调节[30]，miR-96-5p已知有抑制细胞凋亡的功能[31]。miR-1可能在转录后水平直接或间接调控HSP90aa1和HSP90b1。过表达miR-1后缺氧复氧的HSP90蛋白及其亚型90aa1和90b1表达水平更低，结合之前的结果提示miR-1可能在心肌缺氧复氧中调控HSP90[32]。在高血压心肌肥厚的早期代偿阶段，心肌miR-378表达的下降使其对内源性HSF1转录后抑制作用减弱，进而对HSF1的代偿性升高发挥了重要的调控作用[33]。可见，miRNAs在低氧条件下在其他器官起着抑制细胞凋亡，增强器官的低氧耐受性，保护细胞免受缺氧带来的损伤等一系列功能。因此，本研究筛选出的低氧和常氧之间差异表达的miRNAs很可能在低氧适应机制中起重要作用。已知生物体在面对环境变化时会通过改变蛋白或者调节mRNAs的翻译以适应环境，本实验室已经发表过低氧胁迫下鳃组织相关热休克差异蛋白基因，验证了一些热休克蛋白基因应对低氧胁迫的作用[11]。因此，本研究利用筛选到的斑马鱼低氧与常氧状态下差异表达的15条miRNAs对28个热休克蛋白基因[11]进行靶基因预测，再结合miRNAs与预测的mRNAs的表达呈负相关这一特性，对预测的靶基因进行分析。
热休克蛋白被认为与正常和异常的胚胎发育密切相关。低氧胁迫下，低表达的miR-455-3p通过同时靶向提高hspa14和dnajb6b的表达，有可能增强了生物体的发育和机体保护，进而增强对低氧的适应。本研究发现，miR-194a同时靶向5个热休克蛋白基因 (hspa12a、dnajc5aa、hspb7、hsp70.3、dnajb2)；而miR-155可以同时靶向4个热休克蛋白基因 (hspa12a、hspg2、hspa13、dnajb2)。本研究还发现，热休克蛋白基因dnajb2同时受到5个miRNAs调控。基因dnajb2是HSP70的伴侣调节剂，主要在神经系统中表达[34]。等距遗传性运动神经病 (dHMN) 是一组罕见的遗传性神经肌肉疾病，其特征是在没有感觉症状的情况下会影响腓骨肌肉的萎缩，dnajb2是23个与dHMN有关的基因之一，主要从dnajb2起始[35]。可以推测，5个miRNAs靶向抑制dnajb2基因的表达，有可能减轻了对低氧环境下生物体神经系统的伤害。
Hspa14可能是肢体发育的相关基因[36]，在成年斑马鱼中进行无偏见的诱变筛选，确定了dnajb6b是心肌病的新型遗传修饰剂[37]。缺乏热休克蛋白基因hspg2可减轻在低氧中引起的动脉高压[38]。另外，在靶向的热休克蛋白基因GO功能富集前20条通路中，均有hspg2的参与。miR-155和miR-29a同时靶向hspg2，很可能通过抑制hspg2的表达来降低低氧胁迫下引起的动脉高压，增强对低氧环境的适应。
综上，本研究结合常氧与低氧下差异表达的miRNAs和热休克蛋白基因的关联分析，为探究鱼类低氧适应机制提供了新的研究思路。
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图 1 PmCFSH cDNA序列及其氨基酸序列
黑色划线部分为转录组测序序列，其他部分为RACE扩增得到的序列；起始密码子 (ATG)、终止密码子 (TAA) 和加尾信号(AATAAA)用红色下划线标注，磷酸化位点用黑色方框标注；黄色阴影部分为信号肽位置，PolyA尾用灰色背景表示
Figure 1. Nucleotide and deduced amino acid sequences of PmCFSH
The black underlined part is the transcriptome sequencing sequence, and the other parts are the sequences obtained by RACE amplification. The start codon (ATG), termination codon (TAA) and the end of the signal (AATAAA) are shown with the red lines; phosphorylation sites are shown in black frame. Signal peptide is highlighted in yellow, and the sequence of poly A is highlighted in gray.
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图 2 PmCFSH和凡纳滨对虾uncharacterized protein LOC113812164、日本囊对虾CFSH氨基酸序列多重比对
黑色划线部分为斑节对虾CFSH蛋白的IL-17结构域
Figure 2. Multiple sequence alignment on PmCFSH amino acid sequences with uncharacterized protein LOC113812164 of L. vannamei and CHSH amino acid of M. japonicus
The black lined part is the IL-17 domain of PmCFSH.
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图 4 SOPMA软件对PmCFSH蛋白质二级结构的分析结果
蓝色表示α-螺旋；绿色表示β-转角；紫色表示无规则卷曲；红色表示延伸链
Figure 4. Secondary structure of PmCFSH protein analyzed by SOPMA
Blue. α-helix; Green. β-turn; Purple. Random coil; Red. Extended strand
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图 5 CFSH结构域分布以及三维结构预测图
a. PmCFSH的结构域示图；b、c、d分别为斑节对虾CFSH、日本囊对虾CFSH1、人FSH的三维预测结构
Figure 5. PmCFSH domain distribution and three-dimensional structure prediction diagrams
a. Domain of PmCFSH; b. Three-dimensional structure of PmCFSH; c. Three-dimensional structure of MjaCFSH1; d. Three-dimensional structure of Homo FSH
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图 6 PmCFSH在各组织中的表达
图中值为“平均值±标准差” (n=3)，不同小写字母表示组间差异显著 (P<0.05)；后图同此
Figure 6. Expression of PmCFSH in different tissues
The values are $ \overline X \pm {\rm{SD}} $ (n=3). Bars with different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05). The same case in the following figure.
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图 7 PmCFSH在发育各期的表达情况
O. 受精卵；N. 无节幼体；Z Ⅰ—Z Ⅲ. 溞状幼体Ⅰ—Ⅲ期；M Ⅰ—M Ⅲ. 糠虾Ⅰ—Ⅲ期；PL. 幼虾期
Figure 7. Expression of PmCFSH during embryonic development
O. Oosperm; N. Nauplius; Z I−Z III. Zoea I−III; M I−M III. Mysis I−III; PL. Past larvae
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图 8 PmCFSH 基因在卵巢不同时期中的表达情况
Figure 8. Expression of PmCFSH at different ovarian developmental stages
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图 9 肝胰腺 (a) 与鳃组织 (b) 中PmCFSH基因受革兰氏菌刺激后的表达情况
*. 组间差异显著 (P<0.05)
Figure 9. mRNA expression levels of PmCFSH in hepatopancreas (a) and gill (b) after being challenged with different kinds of Gram bacteria
*. Significant difference between groups (P<0.05)
表 1 实验所用引物及其序列
Table 1 Primers and sequences used in this study
引物名称
Primer's name引物序列
Primer's sequencePmCFSH 3'RACE1 5'CGCTGACCGCTGCTGTGAAATC3' PmCFSH 3'RACE2 5'CGGGCTGTGGCGAGTCCATTTA3' PmCFSH 5'RACE1 5'CCGACAAGTGCGAAGCCTCAGC3' PmCFSH 5'RACE2 5'AGTGTGAGCCGCCGCATACACAC3' CFSH-qF 5'CGATCTTGACGCTGAAGGAAAA3' CFSH-qR 5'TCGTGCCGACTAAACCAATAAA3' EF-1α-F 5'AAGCCAGGTATGGTTGTCAACTTT3' EF-1α-R 5'CGTGGTGCATCTCCACAGACT3' 
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