小新月菱形藻(Nitzschia closterium f. minutissima)属于硅藻门、羽纹纲、双菱形目、菱形藻科、菱形藻属，其体积小、繁殖速度快，对环境有较强的适应力，细胞内富含多不饱和脂肪酸，是水产经济动物良好的生物饵料，拥有庞大的市场需求^[1]。

小新月菱形藻的规模化培养是其开发和应用的关键，常见的微藻培养系统可分为开放式和封闭式。传统饵料微藻培养主要采用开放式培养，这种培养方式构建简单、成本低廉且操作简便，但存在易受污染、培养条件不稳定、水分蒸发较快等缺点。封闭式培养具有条件容易控制、不易污染、光能和二氧化碳(CO₂)利用率较高等突出优点，利于进行微藻高密度培养，主要可分为管道式、平板式、柱式、搅拌式及浮式薄膜袋等^[2-4]。微藻大规模培养的藻种都是采用一级或二级培养的藻液，在微藻培养环境中会有大量细菌存在，这些细菌参与藻际环境中的物质循环，促进有机物质转化，改善藻类培养水环境^[5-6]，同时细菌也会对藻类生长及物质积累产生影响，进而影响藻类培养效果^[7-10]。

管式光反应器培养系统具有光照表面积大，结构可调节性强以及CO₂吸收路径长等特点，广泛应用于微藻产率和光合效率的提高，以及生物活性物质的积累等方面^[11-15]，但在微藻培养过程中对藻际菌落的变化关注较少。因此，本研究通过比较小新月菱形藻在新型负压光反应器及传统开放式培养环境中微藻生长及pH、溶解氧的变化情况，同时利用16S rDNA高通量测序技术，分析在培养过程中藻际菌群的结构变化，旨在从藻密度、菌落结构及水质环境的角度综合评价2种方式培养小新月菱形藻的效果，为负压光生物反应器在微藻培养与应用方面提供科学依据。

1.   材料与方法

1.1   负压光生物反应器

400 L负压光生物反应器为Φ 6 cm×200 cm管式光生物反应器(温州光语生物科技有限公司定制生产)，包括盘旋式主体管道(通过支架固定在地面上，主体管道的两端为具有垂直高度差的较低端和较高端)，以及驱动管道内部液体流动的气体动力循环装置，该装置通过管道高度差及气体动力循环装置驱动液体流动，气体管道上设置串联定时控制的电磁阀和气泵(结构见图1)。负压光生物反应器内部参数见表1。

图  1  负压光生物反应器示意图

Figure  1.  Sketch of negative pressure photobioreactor

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表  1  负压反应器内部参数

Table  1.  Internal parameters of negative pressure photobioreactor

直流电压/V DC voltage	负载电流/A load current	功率/W power	流量/L·min−1 flow		相对真空度/kPa relative vacuum
			峰值流量	平均流量
24	<0.8	<19.2	20	13	≈ −60

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1.2   藻种和培养基

小新月菱形藻藻种由上海光语生物科技有限公司提供，采用改良的f/2培养基 {硝酸钾(KNO₃) 100 g·L^–1，乙二胺四乙酸(Na₂EDTA) 20 g·L^–1，磷酸二氢钾(KH₂PO₄) 10 g·L^–1，柠檬酸铁(FeC₆H₅O₇) 3 g·L^–1，硫酸锰(MnSO₄) 0.2 g·L^–1，尿素[CO(NH₂)₂] 10 g·L^–1，硅酸钠(NaSiO₃) 20 g·L^–1，维生素B₁与B₁₂每支10 L各1支}。

1.3   实验设计

反应器真空抽气与停顿时间(min)比设置为3∶1，双侧光照，光照强度为(3 000±200) lx，光暗周期比为12 h∶12 h，培养温度为(15±1) ℃。传统开放式培养采用100 L塑料桶持续曝气培养。2种培养模式都采用处于指数增长期的同一来源藻种进行室内培养，每种培养模式设置3个平行组，初始接种密度为(23.6±0.1)×10⁴个·mL^–1，培养周期为14 d，培养方式为一次性培养。

1.4   测定方法

1.4.1   藻细胞数目测定及溶解氧、pH测定

每天取藻液，用血球计数板法进行计数，并使用水质监测仪AZ86031对藻液溶解氧及pH进行监测。

1.4.2   微藻的比生长速率测定

根据公式μ=ln(N₂/N₁)/(t₂−t₁)计算细胞比生长率，公式中N₂与N₁分别为t₂和t₁时的细胞密度。

1.4.3   细菌总DNA提取及多样性分析

在培养第1、第7、第10和第14天，将藻液通过0.22 μm滤膜抽滤得到的细菌样品于–80 ℃ 保存，使用AT、BT、CT、DT代表开放式培养第1、第7、第10、第14天藻液菌落样品；AC、BC、CC、DC代表反应器培养第1、第7、第10和第14天藻液菌落样品，AT1、AT2、AT3代表3组平行。采用Bacterial DNA Extraction Mini Kit试剂盒提取样品的总基因组DNA，针对16S rRNA基因V3~V4区域构建文库，通过Illumina MiSeq (Illumina，PE300，San Diego，CA，USA)进行双端测序(广州吉瑞基因有限公司)。

1.4.4   数据处理及分析

使用R语言及QIIME(1.9.1)分别对α多样性指数与花瓣图等进行分析，并作出稀释曲线；基于Brary-Curtis样本间距离矩阵用于PCoA (principal coordinates analysis)可视化图展示β多样性；其他数据使用Excel 2007和SigmaPlot 12.5软件进行分析作图，使用SPSS 17.0软件中Duncan多重比较法进行单因素方差分析，以“平均值±标准差$\left( {\overline X\pm{\rm{SD}}} \right)$”表示，P<0.05表示差异性显著。

2.   结果

2.1   小新月菱形藻细胞生长变化

2种不同培养方式藻密度变化曲线见图2-a。在负压式光生物反应器和开放式培养模式下，藻密度均呈上升趋势，并在培养第14天分别达到藻密度最大值1.33×10⁷个·mL^–1和8.36×10⁶个·mL^–1，负压式光生物反应器培养藻密度明显高于开放式培养，且提前达到平台期。在反应器和开放式培养下藻细胞比生长率均呈现出短暂下降后上升的趋势，分别在第8和第6天达到最大比生长率0.41和0.35，然后缓慢下降至0.3，整个培养过程中反应器内藻细胞比生长率一直高于开放式培养(图2-b)。

图  2  小新月菱形藻密度与比生长率变化

Figure  2.  Variation of density and specific growth rate of Nitzschia closterium f. minutissima

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2.2   不同培养环境下藻液pH与溶解氧变化

不同培养方式下pH变化见图3-a。在培养第1~第6天，2种培养方式pH均呈缓慢增加的趋势，维持在8~8.5；第7~第9天，反应器中pH迅速升高到10.0，最后稳定在10.3；而开放式培养中pH则缓慢上升至9.0，2种培养系统中pH变化都与藻密度呈显著正相关(P<0.01，R_反 ²=0.967 4，R_开 ²=0.970 4)。溶解氧与pH变化趋势相反(图3-b)，两者呈显著负相关(P<0.01，R_反 ²=0.991 3，R_开 ²=0.741 2)，培养第1~第8天溶解氧都维持在8.5~9.0 mg·L^–1，但反应器中溶解氧在第9天迅速下降至7.0 mg·L^–1，然后缓慢下降至6.5 mg·L^–1，而开放式培养下溶解氧没有明显变化。

图  3  不同培养环境pH与溶解氧变化

Figure  3.  Change of pH and dissolved oxygen in different culture environments

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2.3   测序结果分析

通过Illumina MiSeq测序得到875 782条有效序列，平均每个样品有36 490条有效序列，每个样品平均GC (%)为52%。以97%相似性水平为标准划分可操作分类单元(operational taxonomic unit, OTU)，对样品进行随机抽样，以抽取的测序数据量与对应的物种数构建稀释曲线(图4)。当每个样品测序数量都达到5 000条序列时，曲线增长缓慢，说明测序深度完全满足统计分析要求，能够准确反映样品序列。

图  4  藻液菌群可操作分类单元数稀释曲线

Figure  4.  OTUs dilution curve of microflora in algae solution

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2.4   藻液菌群群落结构变化

2.4.1   门水平细菌

藻液中的优势种为蓝藻细菌门、变形菌门和拟杆菌门。藻接种初期，拟杆菌(50.65%)和变形杆菌(43.99%)为主要优势菌，随着培养时间增加，变形杆菌和蓝细菌所占比例增大，2种培养方式菌落变化趋势相同，但在培养第14天，反应器中蓝细菌所占比例(43.74%)明显高于开放式培养(12.85%)，变形杆菌(29.24%)所占比例明显降低(图5)。

图  5  藻液菌群门水平优势细菌

Figure  5.  Dominant bacteria in algae solution at phylum level

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2.4.2   属水平细菌

根据所有样品在属水平的物种丰度信息，选取相对丰度排名前9的属，在菌属水平上对第1、第7、第10和第14天藻液的菌群结构及分布进行统计分析(图6)。结果显示，培养第1天，反应器与开放式培养的优势菌属均为Leadbetterella、Phaeodactylibacter和Sulfitobacter，相对丰度分别为16.82%和16.3%、6.08%和7.67%、5.09%和4.04%；培养第7天，反应器与开放式培养分别为Hoeflea (11.36%)、Sulfitobacter (6.89%)、Leadbetterella (4.21%)和Hoeflea (12.89%)、Leadbetterella (7.67%)、Sulfitobacter (3.57%)；培养第10天，反应器与开放式培养优势菌属分别为Leadbetterella (5.94%)、Sulfitobacter (3.77%)、Hoeflea (2.52%)和Hoeflea (7.19%)、Leadbetterella (6.81%)、Sulfitobacter (2.92%)；培养第14天，反应器与开放式培养则分别以Roseibaca (8.66%)、Phaeodactylibacter (3.55%)、Roseibacillus (1.54%)和Hoeflea (8.83%)、Leadbetterella (2.35%)、Marivita (2.05%)为优势菌属。

图  6  藻液菌群属水平优势细菌

Figure  6.  Dominant bacteria in algae solution at genera level

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2.5   藻液菌群多样性差异比较

基于所有样品OTU数绘制成的花瓣图显示(图7)，8组样品共有OTU 67个，其中BT组特有OTU 2个，表明从花瓣图中看出各组间差异不明显。通过Chao1、ACE、Shannon和Simpson指数对各个样品的细菌丰度和多样性进行评估(表2)，发现2种培养方式在培养不同时期Chao1与ACE指数没有显著性差异，但Shannon和Simpson指数显著下降(P<0.05)，提示在小新月菱形藻培养过程中，菌群多样性呈下降趋势。

图  7  藻液菌群花瓣图

Figure  7.  Petal diagram of microflora in algae solution

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表  2  不同培养环境藻液菌群α多样性指数比较

Table  2.  α diversity index of microflora in algae solution in different breeding environments

组别 treatment		多度涵盖估计量 Ace	丰富度 Chao1	香农指数 Shannon	辛普森指数 Simpson
开放式培养 open culture	第1天 AT	71.9±2.21	71.6±1.18	4.23±0.08a	0.91±0.01a
	第7天 BT	75.5±3.57	76.1±5.44	3.59±0.23ab	0.82±0.03ab
	第10天 CT	73.1±5.78	75.2±8.50	3.03±0.04b	0.71±0.02b
	第14天 DT	75.9±4.05	74.7±3.62	3.30±1.02ab	0.75±0.17ab
反应器培养 reactor culture	第1天 AC	77.6±2.60	80.9±10.5	4.25±0.22a	0.91±0.01a
	第7天 BC	73.4±1.96	72.8±2.00	3.87±0.20a	0.86±0.02a
	第10天 CC	77.2±2.94	81.0±3.46	2.98±0.02b	0.69±0.01b
	第14天 DC	71.1±4.36	73.2±5.01	2.78±0.29b	0.74±0.07b
注：同列数据上标不同字母表示平均值差异显著 (P<0.05) Note: The data in the same column with different superscripts are significantly different (P<0.05).

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采用PCoA进行主坐标分析，对组间差异进行比较，其中PC1贡献值为41.92%，PC2贡献值为38.1%，贡献值总计为80.02%，可以用来解释大部分变量信息。图8显示在藻类接种初始阶段，2种培养系统中菌落结构相近但与其他时期样品的菌落结构差异较大，在培养的第7、第10天以及开放式培养的第14天样品中菌落结构较为相似，但在反应器培养的第14天菌落结构与其他样品组出现明显差异。

图  8  藻液菌群PCoA分析

Figure  8.  Principal coordinates analysis of microflora in algae solution

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3.   讨论

微藻培养效果主要受藻种、外界环境因素和培养方式等因素影响^[16]，光生物反应器中影响微藻生长的因素主要有光照、温度、pH、CO₂、溶解氧及水动力学等，其中光照是最主要的影响因子^[17]。石娟和潘克厚^[18]使用三角瓶在日光灯下培养小新月菱形藻，发现其生长的最适光照强度为5 000~10 000 lx，在光照强度约为5 000 lx时达到最大生长率0.392；梁英等^[19]在光照强度为5 000 lx、温度为15 ℃条件下培养小新月菱形藻最大藻密度可达到1.0×10⁷个·mL^–1。本实验接种藻种为同一来源，采用自然光照及白炽灯共同光源，光照强度在3 000 lx，室内温度为(15±1)℃条件下，负压反应器中培养最大藻密度和比生长率为1.33×10⁷个·mL^–1和0.41，明显优于开放式培养与其他研究成果，很可能由于负压光生物反应器采用双侧光照，管径小，玻璃材质的管壁透光性好，光照均一性好，光照效率显著提高，而且该反应器使用气体动力驱动藻液混合和循环，负压压力小，对藻细胞的剪切力小，减小了对藻体细胞的损伤^[20-21]，因而促进了微藻的快速生长，提高了培养密度，缩短了培养周期。

水体中pH变化可以反映藻类生长状态。游亮等^[22]研究发现藻类培养过程中，藻类生长与水环境中pH相关。pH升高意味着植物光合作用增强，CO₂利用率增加，水体中CO₂减少^[23]，不同藻种对pH耐受性不同，已有研究人员发现一种可以在高pH (>10)下生长的微藻(Chlorella sorokiniana)，这种微藻在不补充外源CO₂情况下，仍能保持较高的生物量与脂含量^[24]。在本实验中，pH随藻密度增加而上升，在反应器中pH最终上升至10.3，较开放式培养明显升高，进一步表明在负压光生物反应器培养环境下，小新月菱形藻光合作用得到加强，光合效率提高。此外，小新月菱形藻在pH大于10的环境中仍能持续生长，说明其对高pH的耐受性较强。

在海洋微藻的藻际环境中，变形杆菌与拟杆菌是较为常见的优势细菌，与赤潮的发生息息相关^[25-27]。本实验环境中，优势细菌主要有拟杆菌门、蓝细菌门及变形杆菌门，且变形杆菌门与蓝细菌门所占比例随培养时间逐渐增大，蓝细菌是微藻主要的黏附细菌，在藻类生长的不同时期差异性较大^[28-29]，在负压光反应器培养的最后阶段，蓝细菌突然增加，推测其骤增的原因是蓝细菌在高pH环境中处于竞争优势^[30]。在属水平上，培养前期出现的优势细菌主要有Leadbetterella、Sulfitobacter和Hoeflea，关于Leadbetterella的报道较少，但有报道表明使用反应器培养好氧活性污泥时，当直接减少曝气时Leadbetterella占主要优势，不利于形成稳定的菌落结构，认为与Leadbetterella吸收细菌胞外蛋白有关^[31]。Sulfitobacter的成员在海洋中普遍存在，可以与很多海洋生物共生，参与亚硫酸(H₂SO₃)的氧化及硝酸盐(NO₃ ^–)还原等过程^[32-34]。本实验条件下，Leadbetterella与Sulfitobacter菌属所占比例随培养时间逐渐减小，很可能是由于细菌在有机物及营养盐竞争过程中细菌受到了微藻的抑制。Hoeflea菌属常存在于海洋沉积物中或与甲藻共生，适合生存的pH为6~9^[35-37]。而在负压反应器内Hoeflea所占比例明显低于开放式培养，很可能是由于过高的pH抑制了Hoeflea生长。

玫瑰杆菌(Roseobacter)是一类典型的好氧不产氧的光合细菌，广泛分布于海洋中，可以在有氧条件下以有机物、硫化物或氨(NH₃)等作为供氢体，通过细菌叶绿素捕获光能进行光合作用但并不释放氧气(O₂)，这种代谢类型使其在碳限制情况下也能进行生长^[38]。本实验后期，负压反应器中玫瑰杆菌属所占比例明显增加，溶解氧含量明显下降，这可能与光生物反应器具有更好的光照效率有关，有利于玫瑰杆菌属细菌的生长，而玫瑰杆菌在生长和代谢过程中又消耗了大量的溶解氧，导致负压光生物反应器中藻液的溶解氧下降。很多玫瑰杆菌类群中的细菌与藻类建立了互惠互利的共生关系，附着在浮游植物细胞上的玫瑰杆菌可直接接触溶解有机物(DOM)和二甲基巯基丙酸(DMSP)，这些物质可以用来合成一种或多种生物活性分子，以加强玫瑰杆菌的结合。此外，玫瑰杆菌对藻类生长也是必不可少的，其可以产生维生素B₁₂、铁结合物等藻类生长所必需的物质^[39-40]，因此，在负压反应器内藻细胞维持较高的密度，很可能与玫瑰杆菌为优势细菌有关。

本实验显示细菌多样性呈显著性下降，这与杨小茹等^[41]的研究结果相似，塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)在指数末期细菌多样性低于延滞期和稳定期。在藻类培养的不同阶段，细菌群落差异性较大，王剑等^[42]在研究条纹环沟藻(Gyrodinium instriatum)菌落结构时，发现在藻类衰亡期菌落结构与其他时期差异较大，这是由于产生了大量有溶藻功能的不动杆菌属(Acinetobacter)。在负压反应器培养的第14天菌落结构与其他样品组出现明显差异，玫瑰杆菌成为优势菌，玫瑰杆菌的出现预示着藻类迅速增长，关于菌群结构变化对微藻生长的调控作用值得进一步探讨。

4.   结论

1)负压光生物反应器可以提高光照效率，有利于小新月菱形藻生长，缩短其培养时间，适用于微藻高密度培养。藻液的pH随藻密度而升高，两者呈显著正相关(P<0.05)，且在负压光生物反应器中pH明显高于开放式培养。负压光生物反应器内培养藻液的溶解氧随培养时间而明显下降，而开放式桶培养藻液的溶解氧较为稳定，略有下降。

2)在微藻培养过程中菌落的多样性下降，在负压光生物反应器内，培养后期菌落结构与其他样品组出现明显差异，蓝细菌与玫瑰杆菌成为优势细菌。玫瑰杆菌成为优势种预示着藻际菌群的稳定或藻类的增长，且很可能是导致负压光生物反应器内培养藻液的溶解氧下降的主要原因。