A preliminary study on identification of age of Portunus trituberculatus by gastric mill
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摘要:
三疣梭子蟹 (Portunus trituberculatus) 是中国重要的经济物种，对其进行年龄鉴定有利于其种群资源的评估和管理。该研究对三疣梭子蟹的胃磨进行制片处理，初步探讨了胃磨鉴龄的可行性。三疣梭子蟹胃磨由5个部分 (前幽门骨、外幽门骨、尾贲门骨、轭贲门骨和翼贲门骨)组成，依据前人研究结果选取外幽门骨和尾贲门骨进行切片观察。结果显示，三疣梭子蟹胃磨微结构由4个部分 (蜡质层、外角质层、钙化层和膜层)组成，用于年龄鉴定的生长纹主要存在于钙化层中。利用7个生长方程拟合三疣梭子蟹生物学数据与生长纹数目的关系，结合赤池信息量准则(AIC)得出甲长与甲宽呈线性函数关系、甲宽与体质量呈幂函数关系；体质量与胃磨生长纹数目的关系适用于Gompertz模型，甲长、甲宽与胃磨生长纹数目的关系则更适用于v-B生长模型。即胃磨生长纹可以作为甲壳类年龄鉴定的材料，但由于实验样本偏小型化，后续需要延长时间跨度进一步验证。
Abstract:Portunus trituberculatus is an important economic species in China, and age identification is beneficial to its population resources assessment and management. We discussed the feasibility of gastric mill age identification by gastric mill of P. trituberculatus. The gastric mill was composed of five parts (propyloric ossicle, explyloric ossicle, urocardiac ossicle, zygocardiac ossicle and pterocardiac ossicle). According to the results of previous studies, we selected the explyloric ossicle and urocardiac ossicle for section observation. The results show that the gastric mill microstructure of P. trituberculatus consisted of four parts: wax layer, exocuticle, calcified layer and membranous layer. The growth lines that can be used for research mainly existed in endocuticle. We used seven growth equations to fit the relationship between biological data and the number of growth lines of gastric mill. Combining with AIC method, it is concluded that there are a linear function relation between carapace length and carapace width and a power function relation between carapace width and body mass; the relationship between body mass and the number of growth lines in the gastric mill is applicable to the Gompertz growth model, while that amang carapace length, carapace width and the number of growth lines in the gastric mill is more applicable to the v-B growth model. Thus, the growth lines of gastric mill can be used as the material for Crustacean age identification. However, due to the fact that the samples tend to be miniaturized, the time span needs to be extended for further verification.
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长体圆鲹(Decapterus macrosoma)，又名长身圆鲹，隶属于鲈形目、鲹科、圆鲹属，主要分布于中国南海、印度尼西亚、澳洲和日本南部沿海等地[1]。长体圆鲹在中国南海分布较广，是南海灯光围网渔业的主要捕捞对象，具有较高的经济价值[2-5]。目前，国内外学者关于长体圆鲹的研究主要集中在生长繁殖[6]和资源评估[7-8]方面，与种群遗传和分子标记相关的研究报道较少。微卫星标记仅见翟云等[9]开发蓝圆鲹微卫星标记中获得5个跨物种通用标记可于用长体圆鲹，并无专门针对长体圆鲹开发的微卫星标记。种群遗传信息的匮乏，将大大影响对其资源的评估和长期有效的管理。
微卫星分子标记因是共显性标记，具有多态性高、变异性强、数据易统计等突出优点[10]，广泛应用于海洋生物遗传结构及遗传多样性分析[11-12]。但由于微卫星标记通用性较差，常常具有极强的种属特异性。鱼类微卫星标记开发中多以二核苷酸重复为主[13-15]，普遍认为它们具有较高的遗传变异[16]，但是也有部分学者研究认为三、四核苷酸重复位点较二核苷酸重复具有更高的筛选效率和多态性[17-19]。
本研究通过RAD-Seq高通量测序方法开发长体圆鲹二、三核苷酸微卫星分子标记，并对测试群体进行多样性分析，同时比较二、三核苷酸的筛选效率和多态性差异，旨在为长体圆鲹种群遗传结构及遗传多样性分析提供技术基础，并为该资源的评估和管理提供帮助。
1. 材料与方法
1.1 样品采集与基因组DNA提取
长体圆鲹样品采集于中国南海中沙群岛东部海域，共35尾。剪取部分肌肉样品加入无水乙醇保存。每个样品剪取少量肌肉组织，使用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(天根，北京) 提取基因组DNA，0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量，−20 ℃保存备用。
1.2 高通量测序与引物合成
使用HiSeq2000高通量测序仪(Illumina，USA) 对长体圆鲹基因组DNA进行RAD-seq (测序服务由广州基迪奥生物科技有限公司提供)，经生物信息学搜索出微卫星位点[20]。使用Premier 5.0软件在重复单元侧翼序列上选择性设计出112条引物，主要参数为：G-C含量为40%~60%，引物长度为18~25 bp，退火温度为45~60 ℃，预期产物长度180~320 bp。送上海英潍捷基贸易有限公司合成引物。
1.3 引物筛选与分型检测
选取3个样本混合成的基因组DNA为模板，优化PCR反应条件，对引物进行首轮筛选，琼脂糖电泳检测是否能扩增出稳定且均一的目的片段。之后选取8尾个体的基因组DNA作为模板，使用三引物法[21]，利用M13荧光接头引物进行PCR扩增，扩增产物送华大基因公司经毛细管电泳进行等位基因分型，检测引物是否具有多态性。PCR反应体系为15 μL，其中包括10×PCR Buffer 1.5 μL，2.5 mmol·L–1 MgCL2 1.2 μL，2 mmol·L–1 dNTPs 2 μL，M13正向引物(10 μmol·L–1) 0.2 μL，M13反向引物(10 μmol·L–1) 0.6 μL，M13通用荧光引物(10 μmol·L–1) 0.5 μL，Taq酶(5 U·μL–1) 0.15 μL，DNA模版1 μL，加双蒸水至15 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，55~60 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；94 ℃变性45 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，8个循环；72 ℃延伸30 min。
1.4 长体圆鲹群体遗传学评价
使用35尾长体圆鲹个体的基因组DNA为模板，对通过筛选的微卫星标记的种群遗传学特征进行评价。PCR反应体系和条件、等位基因分型方法如上。使用软件Genepop 4.0[22]对每个标记的种群遗传学特征值进行计算，包括等位基因数(Na)、表观杂合度(Ho)和期望杂合度(He)，进行“哈迪-温伯格”平衡(HWE)检验和连锁不平衡检测，并对P值进行Bonferroni校正。使用Cervus 3.0.7[23]软件计算多态信息含量(PIC)。
2. 结果
2.1 高通量测序结果与微卫星位点分析
RAD-seq高通量测序共获得长体圆鲹基因组原始数据2.06 G，GC含量为41.43%，Q30达93.05%。说明测序结果质量较好，可用于后续分析。搜索后共获得微卫星序列58 180条，一至六核苷酸重复微卫星位点70 508个，其中二核苷酸重复微卫星位点最多(37 646个)，占总数的53.39% (表1)，说明二核苷酸重复为主要的微卫星类型。二核苷酸重复微卫星位点共有4种重复类型，4种类型重复微卫星数量相差较大，AC/GT类有29 754个，占二核苷酸重复的68.4%；AG/CT类有6 487个，占17.2%；AT/TA有1 340个，占3.6%；GC/CG仅有65个，占0.17%。
表 1 长体圆鲹基因组中不同类型SSR统计Table 1. Different types of SSR statistics in D. macrosoma genome重复单元
repeat unit微卫星数量/个
number of microsatellite占比/%
ratio一核苷酸 mono-nucleotide 8 184 11.61 二核苷酸 di-nucleotide 37 646 53.39 三核苷酸 tri-nucleotide 13 960 19.80 四核苷酸 tetra-nucleotide 7 741 10.98 五核苷酸 penta-nucleotide 2 255 3.20 六核苷酸 hexa-nucleotide 722 1.02 合计 total 70 508 100.00 2.2 PCR引物设计和筛选
选取112条二、三核苷酸重复序列设计引物，其中二核苷酸重复为81对，三核苷酸重复为31对。经过筛选后，共有27对引物通过筛选(表2)，27对引物扩增的序列中18个位点为二核苷酸重复，重复次数为9~14次；8个位点为三核苷酸重复，重复次数为6~10次。二核苷酸重复位点检出效率为22.2%，三核苷酸重复位点检出效率为25.8%。
表 2 27对长体圆鲹微卫星引物信息Table 2. Information of 27 pairs of primers in D. macrosoma位点
locus引物序列 (5'−3')
primer sequence重复单元
repeat motif退火温度/℃
annealing temperature期望长度/bp
allele sizeDma03 F:CCACGCCTATTGAGTTACAGA (CA)9 60 186 R:GAGCCAGTGGATGAACAGAGT Dma07 F:GCCCCTGTGGGTGTGTGA (CA)9 60 225 R:GGGTGGTGGGTTCGGTTT Dma12 F:GAACCAGTGCCTACAATAGA (AC)9 60 243 R:CTGCTCACGGTAAGTCCA Dma15 F:ACAGGAAGGAACAGGACAG (TG)10 55 254 R:TATTGAAGTGAAAAAGCCG Dma22 F:CGCTGTTGAAATGAAGAAGA (GT)10 60 317 R:AGTGATGTCGCCTCATAAAT Dma23 F:AAACTGAGGGCGAGATAGAGG (AC)10 55 190 R:CCACAGGCTGAGTAAACCAAC Dma26 F:ATCCCATTCACCGACATAG (TG)10 58 258 R:CTGTGGTATCGTTCCCTGT Dma28 F:TGATTGGCTTCTACTCTGC (AC)10 55 281 R:AGTGGCTTGTTTGACTCTTAT Dma36 F:GGATGTAGTGAAGAGGGGAG (GT)11 55 239 R:CACAATCAGTGTTATGGCAG Dma38 F:GCCAATAAAGGCAAACAGT (CA)11 60 227 R:ATCCGAGACAAAGACATACAA Dma39 F:AGTGTGCTGACTTTTCTCTG (CA)11 55 241 R:TTATTGTTTGTTGTCTGGGT Dma45 F:CTCCTTTTTCTTCTTCCTCT (CA)11 60 281 R:CTACCTGCTCTTCAACTCAT Dma51 F:TGACAGCCTCCACTACTCC (GA)12 55 225 R:GCTAACCAGACACGCAAA Dma54 F:AAAGCCCATCTGTCTCGT (GT)12 60 202 R:TGTTTCAGTCCGTTCCTG Dma58 F:TCAAGAGGGAGTGGGAGC (AC)12 58 279 R:TCAAATGGGTGTTTAGCG Dma64 F:GCTCAGACTGCGTGGACA (TG)13 55 314 R:GCTGGTGAACAACAGGACA Dma72 F:TTCCGCAGGCATAAAAAC (CT)13 58 301 R:CCAAGGTCCGCTACACTA Dma76 F:TTCTCGCTGACCTGCTTG (TG)14 55 253 R:GCGTCCTCGTCGTCTTTC Dma81 F:GAGACACGGTCAGAAAACA (TGC)6 60 216 R:GGAAGTAGGACTCTAGGGG Dma82 F:CTGTCACTCCATTCCTATTCC (GTT)6 58 244 R:CCTACATTTGTGCTTTTGTTC Dma83 F:CTCTAAAGCCGACCTAACC (CTT)6 58 239 R:TGTCTCAACACAGCGAAAC Dma84 F:AAACTAACTCATCACCAG (TGT)6 55 283 R:AAACGACAGGAACTCAAT Dma85 F:CTCACTTTGACCCAACCAG (AGG)6 55 256 R:CCTTTCACCGAGACACCAG Dma131 F:TGCGGATGGGTGGTAGTGT (GGT)8 55 208 R:ATTGCTGGTAGTCGGTGGC Dma132 F:CCCAGTGAGACCAGAACCA (GCT)8 55 268 R:GACCCGTAGACAGGAGAGT Dma135 F:GTTGTTGTTTTTTTCCTT (GCA)9 55 301 R:CATCAGTCTGGCTTTATA Dma145 F:ACGATACAGCAGCCGAAG (TCA)10 60 197 R:AGTGATGTCGCCTCATAAAT 2.3 微卫星标记的种群遗传学评价
使用1个采集自南海东南部海域的长体圆鲹群体对筛选合格的微卫星标记进行种群遗传学评价。所有27个标记在测试群体中共检测到285个等位基因，等位基因数为5~17，Ho为0.342 9~0.857 1，平均为0.631 7；He为0.538 3~0.911 8，平均为0.7968。PIC为0.497~0.886，平均为0.780 9 (表3)，表明开发的微卫星位点具有较高的多态性。共有19个标记等位基因频率符合“哈迪-温伯格”平衡。连锁不平衡检测表明各位点间无连锁不平衡现象。
表 3 长体圆鲹微卫星标记的种群遗传学特征Table 3. Characteristics of microsatellite loci in D. macrosoma位点
locusN Na Ho He PHWE PIC Dma03 35 8 0.857 1 0.790 9 0.042 0 0.746 0 Dma07 35 9 0.771 4 0.855 9 0.553 4 0.825 0 Dma12 34 11 0.685 7 0.816 6 0.106 4 0.809 0 Dma15* 35 14 0.542 9 0.911 8 0.000 0 0.890 0 Dma22* 32 14 0.485 7 0.813 2 0.000 0 0.864 0 Dma23 34 17 0.714 3 0.864 8 0.003 3 0.868 0 Dma26* 34 14 0.428 6 0.869 1 0.000 0 0.870 0 Dma28 35 11 0.742 9 0.837 7 0.035 3 0.803 0 Dma36 35 9 0.685 7 0.786 3 0.054 5 0.743 0 Dma38* 34 12 0.628 6 0.851 2 0.000 0 0.849 0 Dma39* 33 12 0.514 3 0.782 0 0.000 0 0.793 0 Dma45 34 12 0.771 4 0.847 8 0.139 2 0.844 0 Dma51* 31 12 0.485 7 0.784 5 0.000 0 0.859 0 Dma54 35 15 0.771 4 0.900 6 0.139 0 0.878 0 Dma58 34 12 0.771 4 0.845 6 0.449 7 0.843 0 Dma64* 31 13 0.428 6 0.788 3 0.000 0 0.865 0 Dma72 35 8 0.628 6 0.713 9 0.155 7 0.659 0 Dma76 35 12 0.685 7 0.908 1 0.003 6 0.886 0 Dma81 35 8 0.628 6 0.795 0 0.045 7 0.752 0 Dma82 35 5 0.485 7 0.538 3 0.023 6 0.497 0 Dma83* 34 8 0.342 9 0.705 8 0.000 0 0.674 0 Dma84 35 7 0.542 9 0.704 8 0.005 9 0.649 0 Dma85 35 8 0.828 6 0.747 8 0.876 9 0.704 0 Dma131 35 9 0.628 6 0.717 6 0.646 6 0.661 0 Dma132 35 8 0.657 1 0.746 6 0.365 5 0.692 0 Dma135 34 10 0.742 9 0.840 5 0.241 8 0.835 0 Dma145 34 7 0.600 0 0.749 3 0.077 4 0.725 0 注：N. 有效样品数；Na. 等位基因数；Ho. 表观杂合度；He. 期望杂合度；PHWE. “哈迪-温伯格”平衡显著性检验P值；PIC. 多态信息含量；*. 经Bonferroni校正后显著背离“哈迪-温伯格”平衡 (校正P<0.001 85) Note: N. effective number of samples; Na. number of alleles; Ho. observed heterozygosity; He. expected heterozygosity; PHWE. Hardy–Weinberg probability test; PIC. polymorphism information content; *. significant deviation from HWE after Bonferroni's correction (adjusted P-value<0.001 85) 3. 讨论
3.1 高通量测序发掘微卫星序列的技术优势
传统微卫星标记开发方法耗时长、花费高、技术难度大。以磁珠富集法为例，标记开发过程中基因组DNA浓度、接头连接效率、富集过程中的杂交温度以及洗脱条件的控制等因素都会影响微卫星筛选的效率[24-25]，且最终获得的有效微卫星序列仅几百条[26-27]。相比较而言，高通量测序技术开发微卫星标记，省略了建库、克隆、筛选等，只需提取基因组DNA测序，利用生物信息学手段可直接获取微卫星序列，通常是传统方法获得微卫星序列数目的几百倍[15,28-29]，具有高效、便捷、准确的特点，能够满足短时间内大批量微卫星位点的开发需求，比如连锁图谱构建、QTL定位等[30-31]。
本次RAD-seq高通量测序共获得长体圆鲹基因组原始数据2.06 G，GC含量为41.43%，测序质量Q30达93.05%；共获得微卫星序列58 180条，一至六核苷酸重复微卫星位点70 508个。说明测序质量稳定高效，并获得了数量庞大、类型丰富的长体圆鲹微卫星序列，可用于后续长体圆鲹微卫星标记的大规模开发和相关遗传学研究。
3.2 不同核苷酸重复微卫星位点比较
本次高通量测序结果表明在长体圆鲹微卫星位点中二核苷酸重复为主要重复类型，AC/GT类重复数量最为丰富，GC/CG重复较为少见。此结果与大量水产动物微卫星位点研究结果相一致[32-34]，差异仅在于比例多少，以及除二核苷酸重复占主要地位外其他核苷酸重复的含量差异。熊良伟等[33]对中华鳑鲏(Rhodeus sinensis)微卫星的分析中，二核苷酸占总微卫星位点的53.59%，其次为单核苷酸重复，二核苷酸重复中AC/GT类占60.63%，GC/CG仅占0.32%。在裸体异鳔鳅鮀 (Xenophysogobio nudicorpa)中[32]，二核苷酸重复占总微卫星位点比例高达83.15%，AC/GT类重复占49.36%，GC/CG重复仅有4个。
多数鱼类开发的微卫星标记以二核苷酸重复为主，但研究表明，在人类基因组中三核苷酸重复序列与遗传疾病的发生有关，并且具有较高的多态性和遗传稳定性[35]。部分学者对三、四核苷酸重复微卫星标记的研究结果存在差异。房祖业等[28]对大刺鳅 (Mastacembelus armatus) 二、三、四核苷酸重复微卫星标记的筛选发现二核苷酸重复较三、四核苷酸重复具有更高的筛选效率和多态性；鲁翠云等[17]、谭照君等[18]、李文升等[19]的研究认为三、四核苷酸具有更高的多态性和分型效果。长体圆鲹二、三核苷酸的筛选效率分别为22.2%和29.0%，PIC分别为0.827 4和0.687 7 (表4)。就筛选效率而言，三核苷酸重复略高于二核苷酸重复，但二者相差不大。PIC为衡量种群遗传变异程度的重要指标[36]，二核苷酸重复多态性明显高于三核苷酸重复。本文中长体圆鲹二核苷酸重复筛选效率低于三核苷酸重复，但多态性二核苷酸重复明显高于三核苷酸重复。因此，筛选效率和多态性的差异可能由种属差异或其他多种因素导致。
表 4 长体圆鲹二、三核苷酸重复微卫星标记的比较Table 4. Comparison on di- and trinucleotide-repeated microsatellite loci in D. macrosoma序列
sequence引物数
primer number重复次数
repeat number筛选效率
efficiencyPIC 二核苷酸重复
di-nucleotide-repeated18 9~14 22.2% 0.827 4 三核苷酸重复
tri-nucleotide-repeated9 6~10 29.0% 0.687 7 通过筛选的27对引物中18个位点为二核苷酸重复，重复次数为9~14次不等；9个位点为三核苷酸重复，重复次数为6~10次不等，符合Ellegren[37]提出的真核生物微卫星位点重复大部分在30次重复以下。但Ellegren[37]认为二核苷酸重复以15~19次为主，本文中高通量测序获得的二核苷酸重复主要在6~15次。基于Weber[38]的研究结果，重复次数高的微卫星在种群中表现出的多态性较高，龚小玲等[39]对澳洲鳗鲡 (Anguilla australis) 进行标记开发时发现，微卫星重复序列的重复次数过高会影响PCR效果，应选择居中的重复次数为宜。长体圆鲹二核苷酸重复PIC为0.827 4，具有较高多态性，表明选择6~15次的二核苷酸重复是合适的。
3.3 微卫星标记的种群遗传学特征
群体杂合度的高低反映了群体在多个基因座上的遗传变异及群体遗传多样性丰富度[19]。本研究中长体圆鲹中沙群体的平均Ho为0.631 7，平均He为0.796 8，说明长体圆鲹该群体的遗传多样性较高。平均Ho和He存在差异，说明存在杂合子缺失或者纯合子过剩的情况。PIC也是衡量群体遗传多样性的重要指数，Botstein等[36]认为基因标记PIC>0.5为高度多态位点，0.25<PIC<0.5为中度多态位点，PIC<0.25为低度多态性位点，通常不作为遗传多样性分析。本文中长体圆鲹位点除1个为中度多态外，其他位点均为高度多态位点。表明开发所得的长体圆鲹微卫星标记在中沙群体中具有较好的遗传稳定性和丰富的遗传多样性。
在所有27个位点中有8个位点偏离了“哈迪-温伯格”平衡，这些位点不适合进一步的遗传分析。近亲杂交、无效等位基因、种群退化和自然选择等因素皆可能导致微卫星位点偏离HWE[15]。
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图 1 三疣梭子蟹胃磨结构展开示意图
Figure 1. Schematic diagram of gastric mill structure of P. trituberculatus
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图 2 外幽门骨 (a)、尾贲门骨 (b) 和眼柄 (c) 微结构及生长纹
Figure 2. Microstructure and growth bands of explyloric ossicle (a), urocardiac ossicl (b) and eyestalk (c)
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图 3 雄性 (a) 与雌性 (b) 三疣梭子蟹甲长与甲宽关系图
Figure 3. Relationship between carapace length and width of male (a) and female (b) P. trituberculatus
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图 4 雄性 (a) 与雌性 (b) 三疣梭子蟹甲宽与体质量关系图
Figure 4. Relationship between carapace width and body mass of male (a) and female (b) P. trituberculatus
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图 5 185只三疣梭子蟹甲长与甲宽、甲宽与体质量关系图
Figure 5. Relationship between carapace length and carapace width, carapace width and body mass of 185 individuals of P. trituberculatus
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图 6 三疣梭子蟹甲长、甲宽、体质量与生长纹数目的关系
Figure 6. Relationship between carapace length, carapace width, body mass and growth increments of P. trituberculatus
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图 7 三疣梭子蟹预估蜕壳次数与胃磨生长纹关系拟合图
Figure 7. Relationship between estimate molting preriod and growth increments of P. trituberculatus
表 1 三疣梭子蟹样本个体基础生物学数据
Table 1 Basic biological data of gastric abrasion growth samples of P. trituberculatus
项目
Item雄蟹 Male 雌蟹 Female 甲长 CL/mm 甲宽 CW/mm 体质量 m/g 甲长 CL/mm 甲宽 CW/mm 体质量 m/g 样本量 Sample number 65 65 65 120 120 120 最大值 Maximum 99 190 365.89 97 189 363.17 最小值 Minimum 20 43 3.7 24 60 7.29 平均值 Mean 50.05 105.47 85.33 61.18 122.08 166.97 标准误 Standard error 2.27 4.17 10.16 1.47 2.67 7.10 
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表 2 7个生长模型函数拟合结果
Table 2 Seven growth model function fitting results
模型
Model甲长-生长纹个数
CL-t甲宽-生长纹个数
CW-t体质量-生长纹个数
m-tR2 AIC R2 AIC R2 AIC 线性 Linear 0.884 473.77 0.922 539.78 0.868 710.89 幂函数 Power 0.834 504.01 0.886 571.06 0.910 678.42 指数 Exponent 0.865 486.36 0.906 555.32 0.913 675.90 对数 Logarithm 0.841 500.07 0.897 562.54 0.698 780.75 逻辑斯蒂 Logistic 0.897 465.69 0.953 499.09 0.907 683.98 v-B 0.910 449.19 0.995 4 498.26 0.914 677.15 冈珀茨 Gompertz 0.870 484.63 0.949 504.56 0.922 668.93 注：加粗表示拟合结果最好 Note: Bold indicates the best fit result.
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