Extraction and antioxidant activity of protein from Grateloupia livida
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摘要:
该研究以舌状蜈蚣藻 (Grateloupia livida)为原料，以蛋白质提取率为指标，探究不同破壁技术对舌状蜈蚣藻蛋白质的提取效果，并通过单因素分析和正交试验对超声波辅助水提法进行工艺优化，所得蛋白质经硫酸铵盐析法粗提纯后考察其体外抗氧化能力。结果显示，溶胀法、反复冻融法、珠磨法的最高蛋白质提取率分别为 (29.66±0.86)%、(24.52±0.04)%、(26.52±0.79)%，均低于超声波辅助水提法；超声波辅助水提法提取舌状蜈蚣藻蛋白质的最佳工艺为：液料比160 mL·g−1，超声全程时间60 min，超声功率1 440 W，pH 6.0，此条件下蛋白质提取率可达58.16%；舌状蜈蚣藻粗蛋白质量浓度在1~8 mg·mL−1内均具有较强抗氧化活性，其质量浓度为8 mg·mL−1时的还原力为0.43±0.01，对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼 (DPPH)自由基的半数清除浓度 (IC50)为4.00 mg·mL−1，对2,2'-二氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸) (ABTS)自由基的IC50为3.96 mg·mL−1。
Abstract:With Grateloupia livida as the raw material and protein extraction rate as the index, we explored the effect of different wall-breaking techniques on their protein extraction, and optimized the ultrasonic-assisted water extraction by single-factor analysis and orthogonal test. The antioxidant activity of the crude protein that was purified by ammonium sulfate salting-out was evaluated. Results show that the highest protein extraction rate of the swelling method, freeze-thawing method and bead milling method was (29.66±0.86) %, (24.52±0.04) % and (26.52±0.79) %, respectively, all lower than those of ultrasonic-assisted water extraction method. The best optimal conditions of extracting protein from Grateloupia livida by ultrasonic assisted water extraction (the protein extraction rate could reach 58.16%) are as follows: liquid-to-solid ratio of 160 mL·g−1, total ultrasonic time of 60 min, ultrasonic power of 1440 W and pH of 6.0. The crude protein had strong antioxidant activity at the concentration of 1−8 mg·mL−1 (its reducing power at 8 mg·mL−1 was 0.43±0.01), and the IC50 of DPPH free radicals and ABTS free radicals are 4.00 mg·mL−1 and 3.96 mg·mL−1, respectively.
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蜈蚣藻属隶属于红藻门、杉藻目、海膜科，主要包括舌状蜈蚣藻 (Grateloupia livida)、带形蜈蚣藻 (G. turuturu)、繁枝蜈蚣藻 (G. filicina)、披针形蜈蚣藻 (G. lanceolata)、对枝蜈蚣藻 (G. didymecladia) 等。研究表明，蜈蚣藻中含有氨基酸、蛋白质、糖类、萜类等多种生物活性成分[1-3]。近年来，关于蜈蚣藻来源的糖类研究较多，已被证明具有抗菌[4]、抗氧化和抗凝血[5]等多种功能活性，但对蜈蚣藻蛋白质的研究较少。舌状蜈蚣藻中氨基酸组成比例均衡，必需氨基酸含量 (EAA) 占总氨基酸含量 (TAA) 的42.58%，必需氨基酸与非必需氨基酸的比值 (EAA/NEAA) 为74.15%，符合WHO/FAO推荐的理想蛋白质模式[6]；繁枝蜈蚣藻的藻红蛋白可有效增强大鼠原代星形胶质细胞的抗氧化损伤能力[7]，以上研究结果均表明蜈蚣藻来源的蛋白质为优质蛋白质。
为高效提取大型海藻中的蛋白质，破碎其刚性细胞壁至关重要。常见的破壁技术包括溶胀法、珠磨法、超细剪切法、反复冻融法、超声波法等[8-10]。该试验以舌状蜈蚣藻为原料，考察溶胀法、珠磨法、反复冻融法和超声波辅助水提法等技术对舌状蜈蚣藻蛋白质提取效率的影响，分析舌状蜈蚣藻粗蛋白质的体外抗氧化能力，以期为舌状蜈蚣藻的进一步开发利用提供技术支持和理论参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与试剂
舌状蜈蚣藻采收于广东省汕头市南澳岛，置于60 ℃烘箱中烘干至恒质量，粉碎至过120目筛的粉末状，−20 ℃密封保存。自动凯氏定氮法测得其蛋白质的质量分数为 (22.34±0.19)% (以干基计)。
氢氧化钠、浓硫酸、盐酸、硫酸钾、硫酸铜、硫酸铵、无水乙醇、铁氰化钾、三氯乙酸 (TCA)、三氯化铁 (FeCl3·6H2O)、磷酸氢二钠 (Na2HPO4·12H2O)、磷酸二氢钠 (NaH2PO4·2H2O)等试剂均为分析纯；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼 (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH，美国Sigma公司)；2,2'-二氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸) [2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic)，ABTS，上海麦克林生化科技有限公司]；BCA试剂盒 (南京建成生物工程研究所)。
1.2 试验仪器
试验仪器有DHG-9145型电热恒温鼓风干燥箱 (上海一恒科技有限公司)；BioTek全自动酶标仪 (美国Bio-Tek公司)；JY99-ⅡDN超声波细胞破碎仪 (上海沪析实业有限公司)；Delta320精密pH计[梅特勒-托利多仪器 (上海)公司]；SPX-3K30高速冷冻离心机 (德国Sigma公司)；BS224S型精密电子天平 (德国Sartorius公司)。
1.3 试验方法
1.3.1 工艺流程
称取适量舌状蜈蚣藻粉末，按一定液料比加水悬浮并搅拌均匀，在一定条件下进行破壁处理，粗提液于6 000 r·min−1、4 ℃下离心15 min，上清液即蛋白提取液，测定其中蛋白质的质量，并计算蛋白质提取率。向其余蛋白提取液中加硫酸铵至饱和度达65%，离心后取沉淀进行透析脱盐，经冷冻干燥得舌状蜈蚣藻粗蛋白质。
蛋白质提取率的计算见公式 (1)，其中舌状蜈蚣藻原料中总蛋白质的质量测定参考GB 5009.5—2016；蛋白提取液中蛋白质的质量使用BCA试剂盒 (比色法)进行测定。
$$ \begin{array}{c} {\text{蛋白质提取率}}= \\ \dfrac{{{\text{蛋白提取液中蛋白质的质量}}\left( {{\rm{mg}}} \right)}}{{{\text{原料中总蛋白质的质量}}\left( {{\rm{mg}}} \right)}} \times 100 {\text{%}} \end{array} $$ (1) 1.3.2 破壁技术
1) 溶胀法[11]。控制液料比100 mL·g−1，以蒸馏水作溶剂浸泡蜈蚣藻粉末，于4 ℃冰箱中溶胀，溶胀时间分别为1、2、3、4、5、6 d。2) 反复冻融法[12]。控制液料比100 mL·g−1，取适量蜈蚣藻粉，加蒸馏水悬浮于离心管中，−20 ℃冻结2 h，采用室温流水解冻，冻融次数分别为1、2、3、4、5次。3) 珠磨法。控制液料比100 mL·g−1，称取适量蜈蚣藻粉，加蒸馏水悬浮于离心管中，加入4颗质量规格相同的钢珠 (质量为0.89 g)，于超高能量研磨仪中震荡研磨20 min，频率分别为10、20、30、40、50 Hz。4) 超声波辅助水提法[13]。控制液料比100 mL·g−1，称取适量蜈蚣藻粉，加蒸馏水悬浮，提取液pH调至7.0，设置超声发生时间4 s、间隔时间4 s、超声功率900 W，超声全程20 min。
1.3.3 超声波辅助水提法单因素试验设计
在一定液料比、pH、功率、时间下，进行超声波辅助水提舌状蜈蚣藻蛋白质的单因素试验，试验过程中超声波发生时间与间隔均为4 s。固定超声功率900 W，pH 7.0，超声全程30 min，考察液料比 (80、100、120、140、160、180、200 mL·g−1) 对蛋白质提取率的影响；固定液料比100 mL·g−1，超声功率900 W，超声全程30 min，考察pH (3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0) 对蛋白质提取率的影响；固定液料比100 mL·g−1，pH 7.0，超声全程30 min，考察超声波功率 (180、360、540、720、900、1 080、1 260、1 440、1 620 W) 对蛋白质提取率的影响；固定液料比100 mL·g−1，超声功率900 W，pH 7.0，考察超声处理全程时间 (10、20、30、40、50、60、70 min) 对蛋白质提取率的影响。每组试验重复3次，取平均值。由于提取过程中仪器变幅杆逐渐发热，提取液局部迅速升温，易引起蛋白质变性，因此，试验过程中采用4 ℃循环水进行水浴，使提取液保持较低温度。
1.3.4 正交试验优化
基于单因素试验结果，设定pH (A)、超声功率 (B)、超声全程时间 (C)的变化范围及中心点值，通过L9(34)正交试验优化提取工艺参数，正交试验因素水平见表1。
表 1 正交试验因素水平表Table 1. Table of orthogonal test factors水平
Level因素 Factor (A) 超声全程时间
Total ultrasonic time/min(B) pH (C) 超声功率
Ultrasonic power/W1 50 6.0 1 080 2 60 7.0 1 260 3 70 8.0 1 440 1.3.5 舌状蜈蚣藻粗蛋白质体外抗氧化性研究
1) 还原力的测定。参考王晓慧等[14]的方法并稍作修改。将舌状蜈蚣藻粗蛋白质配制成质量浓度分别为1、2、4、6、8 mg·mL−1的样品溶液。按V (pH 6.6、0.2 mol·L−1的磷酸缓冲盐溶液)∶V (样品)∶V (1%铁氰化钾)=1∶1∶1向1 mL样品溶液中加入试剂，涡旋混匀后于50 ℃水浴20 min，再加入1 mL 10%的三氯乙酸，10 000 r·min−1、4 ℃条件下离心10 min。取1 mL上清液，加1 mL去离子水和0.2 mL 0.1%的三氯化铁，50 ℃水浴10 min，测700 nm处吸光度。空白对照组以去离子水代替样品。2) DPPH自由基清除率的测定。参考Tkaczewska等[15]的方法，并稍作修改。将舌状蜈蚣藻粗蛋白配制成质量浓度分别为1、2、4、6、8 mg·mL−1的样品溶液。向1 mL待测样品溶液中加入1 mL 0.2 mmol·L−1 DPPH溶液 (无水乙醇溶解)，充分混匀后，室温条件下避光反应30 min，检测517 nm波长处的吸光度，记为A1。空白组以无水乙醇代替DPPH溶液，吸光度记为A2；对照组以样品溶剂代替待测样品，吸光度记为A0。按公式 (2)计算DPPH自由基清除率。
$$ {\rm{DPPH}}{\text{自由基清除率}} = \left( {1 - \frac{{{{{A}}_1} - {{{A}}_2}}}{{{{{A}}_0}}}} \right) \times 100{\text{%}} $$ (2) 3) ABTS自由基清除率的测定。参考de Meneaes peixoto等[16]的方法，并稍作修改。用体积分数为50%的甲醇溶液配制7 mmol·L−1的ABTS溶液，将其与2.45 mmol·L−1的过硫酸钾溶液按体积比1∶1混合，室温避光放置12~16 h后形成ABTS储备液。使用前将该储备液稀释至734 nm波长处吸光度为0.70±0.02，得到ABTS工作液。向1 mL不同浓度的样品中加入4 mL ABTS工作液，混匀后避光反应10 min，在734 nm处测定吸光度A1；空白组以去离子水代替样品，在734 nm处测定吸光度A0；对照组以体积分数为50%的甲醇溶液代替ABTS工作液，在734 nm处测定吸光度A2。按公式 (3)计算ABTS自由基清除率。
$$ {\rm{ABTS}}{\text{自由基清除率}} = \left( {1 - \frac{{{A_1} - {A_2}}}{{{A_0}}}} \right) \times 100{\text{%}} $$ (3) 1.3.6 数据统计与分析
对试验测定所得的数据使用SPSS 22.0软件进行数据分析，选择单因素方差分析法(ANOVA，Turkey检验)进行显著性检验 (P<0.05为差异显著)；利用Excel 2016整理试验数据并绘图。各试验均重复3次，试验结果取平均值。
2. 结果与分析
2.1 不同破壁技术提取舌状蜈蚣藻蛋白质效果的比较
随溶胀时间延长，蛋白质提取率先上升后下降 (图1-a)。可能是由于溶胀时间逐渐延长，渗透压的存在使藻细胞壁吸水到一定程度时胀破，继续溶胀，其破坏程度增加，蛋白质逐渐溶出，溶胀时间为5 d时蛋白质提取率达到最大值 (29.66±0.86)%。而继续延长溶胀时间，会因溶液过饱和引起蛋白质沉降[17]，导致蛋白质提取率下降。
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图 1 不同破壁技术对蛋白质提取率的影响Figure 1. Effect of different wall-breaking techniques on extraction rate of protein冻融2 h时，随冻融次数的增加，细胞内反复形成冰粒，引起细胞壁破裂程度增大，蛋白质提取率逐渐增大，冻融次数达到冻融3次时，蛋白质提取率为 (23.38±0.11)%，但冻融3次之后蛋白质提取率增加不明显 (图1-b)。考虑到试验成本及便捷性，反复冻融次数为3次较佳。
蛋白质提取率随研磨频率加强而增大，但增长幅度较小，频率达到30 Hz时蛋白质提取率已达到 (24.70±0.44)%，频率为50 Hz时蛋白质提取率也仅增大为 (26.52±0.79)% (图1-c)。这表明，钢珠碰撞对细胞壁的破坏作用有限，有限时间内高强度珠磨也无法较大程度地破坏细胞壁，导致蛋白质溶出率低。
比较表2中4种破壁技术，在各方法的较佳条件下，珠磨法和反复冻融法的蛋白质提取率较低，且反复冻融法操作烦琐，不适合进行大规模试验；细胞溶胀法提取率较高，但时间太长；与其他方法相比，超声波辅助水提法仅处理20 min的蛋白质提取率就可达到 (32.72±0.32)%，且与其他破壁技术存在显著性差异 (P<0.05)，具有时间短、效率高等优点[1]。因此，超声波辅助水提法是从舌状蜈蚣藻中提取蛋白质的合适方法。通过进一步优化超声波破碎法的试验条件，能获得较高蛋白质提取率，较大程度地提高对舌状蜈蚣藻原料的利用率。
表 2 不同破壁技术提取舌状蜈蚣藻蛋白质的效果Table 2. Effects of different wall-breaking techniques on extraction rate of protein from G. livida$\overline {\mathit{\boldsymbol{X}}}{\bf \pm {{SD}}} $ 破壁技术
Wall-breaking technique温度
Temperature时间
Time蛋白质提取率
Extraction rate of protein/%细胞溶胀法 Swelling method 4 ℃ 5 d 29.66±0.86b 反复冻融法 Freeze-thawing method −20 ℃和室温 2 h，5次 24.52±0.04c 珠磨法 Bead milling method 室温 20 min 26.52±0.79c 超声波辅助水提法 Ultrasonic-assisted water extraction 4 ℃循环水浴 20 min 32.72±0.32a 注：同列中不同字母间存在显著性差异(P<0.05) Note: Values with different letters within the same column indicate significant difference (P<0.05). 2.2 超声波辅助水提法单因素试验
2.2.1 液料比对蛋白质提取率的影响
随液料比增加，舌状蜈蚣藻蛋白质的提取率呈现先上升后下降的变化趋势，但各处理组不存在显著性差异 (P>0.05，图2-a)。液料比较小时溶液黏度大，藻粉在水中不均匀分布，体系中的传质效率低；随液料比逐渐增大，藻粉与水的接触面积增大，溶液黏度逐渐降低，分子扩散效率增大，在此过程中蛋白质溶出率升高，提取率也逐渐增大。当液料比增大至160 mL·g−1时，蛋白质提取率达到最大值 (37.57±0.42)%，而继续增大液料比却导致蛋白质提取率下降。这是由于接近发出空化气泡的变幅杆部位的细胞会被破坏，而距离超声波发出位置较远处的细胞局部能量通量较小[18]，细胞未被分解，未能释放蛋白质。因此，选择160 mL·g−1为提取舌状蜈蚣藻蛋白质的最适液料比。
2.2.2 pH对蛋白质提取率的影响
单因素方差分析显示各处理组存在显著性差异 (P<0.05，图2-b)，pH介于3.00~5.00，蛋白质提取率较低，这是由于提取液中大多数蛋白质的等电点为酸性，此时已溶出的蛋白质之间发生静电排斥作用，向杂质中聚集沉降。pH介于5.00~7.00，蛋白质提取率上升速率较快，提取液pH为7.00时蛋白质提取率已达到较大值 (39.54±0.19)%。而pH继续增大，蛋白质提取率的增幅趋于平缓。考虑到碱性环境中蛋白质可能发生胱赖反应，影响蛋白质性质[19]，因此在后续试验中可选择pH 6.00~8.00作为舌状蜈蚣藻蛋白质提取的较佳pH范围。
2.2.3 超声功率对蛋白质提取率的影响
随着超声波功率的增大，舌状蜈蚣藻的蛋白质提取率先迅速升高后迅速下降，单因素方差分析显示各处理组存在显著性差异 (P<0.05，图2-c)。超声波功率较低时，无法产生空化效应，对舌状蜈蚣藻细胞壁的破坏作用不足，对蛋白质的促溶效果不佳，故蛋白质提取率较低；随着超声波功率的增大，空化作用愈渐增强，且大功率超声波引起溶液升温，加快了溶液内的分子运动速率，促进分子相互碰撞，使蛋白质提取率升高，并在超声功率增大至1 260 W时达到最大值 (38.71±0.79)%。但功率继续增大时，超声波强度过高，导致溶液内压力过大、温度过高，使藻粉表面张力与溶液的黏度系数降低，同时降低了空化阈值，导致空化气泡不能及时破裂，大量空化气泡的存在削弱了空化效应[20-21]，最终引起蛋白质提取率下降。综合选择超声功率介于1 080~1 440 W内较佳。
2.2.4 超声处理的全程时间对蛋白质提取率的影响
随超声全程时间的延长，舌状蜈蚣藻蛋白质提取率先缓慢上升再迅速上升，超声全程时间为60 min时，蛋白质提取率达最大值 (60.58±1.34)%，超声全程时间超过60 min后蛋白质提取率迅速下降 (图2-d)。单因素方差分析显示各处理组存在显著性差异 (P<0.05)。这与于娇等[22]的实验结果接近，其利用超声波破碎法提取坛紫菜 (Porphyra haitanensis)蛋白质的最佳超声处理时间为52 min，超过此时间，蛋白质提取率反而下降。原因在于超声波作用一段时间后藻细胞壁被破碎到一定程度，蛋白质逐渐溶出；继续延长全程时间，超声波产生的机械效应会改变细胞膜的通透性[23]，加速蛋白质的溶出，此时蛋白质提取率迅速上升；而超声波处理时间过长时则会引起已溶出的蛋白质发生猝灭、降解，导致蛋白质提取率下降。因此，选择50~70 min为舌状蜈蚣藻提取的较佳破碎时间。
2.3 正交试验分析
综合单因素试验结果，按1.3.4方法进行正交试验，以蛋白提取率为评价指标，试验设计及结果见表3。极值R显示，各因素在试验范围内对舌状蜈蚣藻蛋白质提取率的影响主次顺序为A (超声全程时间)>B (超声功率)>C (pH)。方差分析结果表明，因素A (超声全程时间)对蛋白质提取率具有极显著影响，因素B (超声功率)和因素C (pH)对蛋白质提取率具有显著影响 (表4)。各因素的理论最优组合为A2B3C1，该条件与正交试验设计中蛋白质提取率最高的实际最优组合相同。因此，舌状蜈蚣藻蛋白质提取的最佳条件为A2B3C1，即超声全程时间60 min，超声功率1 440 W，pH 6.0，此条件下蛋白质提取率可达58.16%。
表 3 正交试验设计和结果Table 3. Orthogonal array design and results编号
No.(A) 超声全程时间
Total ultrasonic time/min空列
Null column(B) 超声功率率
Ultrasonic power/W(C) pH 蛋白质提取率
Extraction rate of protein/%1 1 (50) 1 1 (1 080) 1 (6.0) 55.85 2 1 2 2 (1 260) 2 (7.0) 53.12 3 1 3 3 (1 440) 3 (8.0) 56.23 4 2 (60) 1 2 3 55.41 5 2 2 3 1 58.16 6 2 3 1 2 55.91 7 3 (70) 1 3 2 53.39 8 3 2 1 3 52.89 9 3 3 2 1 53.03 K1 165.2 164.65 164.65 167.04 K2 169.48 164.17 161.56 162.42 K3 159.31 165.17 167.78 164.53 R 10.17 1 6.22 4.62 因素次序 Order of factors A>B>C 最优水平 Optimal level A2B3C1 表 4 正交试验方差分析结果Table 4. Analysis of variance of orthogonal array design方差来源
Soruces of variation偏差平方和
Sj自由度
df均方
MSF 临界值
Critical value显著性
SignificanceA 17.38 2 8.690 104.24 F0.05 (2,2)=19.00 F0.01 (2,2)=99.01 ** B 6.49 2 3.245 38.18 * C 3.57 2 1.785 21 * 误差 Error 0.17 2 0.085 − 总和 Sum 27.61 8 注：**. 差异极显著 (P<0.01)，*. 差异显著 (P<0.05) Note: **. Very significant difference (P<0.01); *. Significant difference (P<0.05) 除以上各破壁技术外，目前从海藻中提取蛋白质的方法还有碱溶酸沉法、酶解法等，庞庭才等[24]利用响应面分析法对羊栖菜 (Hizikia fusifarme)蛋白质的碱溶酸沉法进行了优化，结果表明在最佳条件下羊栖菜蛋白质的提取率为28.95%，该方法试验成本低，但耗时长，提取率低，且易引起蛋白质的色泽品质劣变；施瑛等[25]优化复合酶法提取紫菜藻红蛋白的最佳提取工艺为：纤维素酶与果胶酶质量比7∶3、pH 6.8、酶解温度39 ℃、提取时间7.2 h、酶底比0.8%，此条件下蛋白质得率为2.257%，纯度达1.656，此方法可获得高纯度蛋白质，但操作复杂，提取时间长。综上所述，超声波辅助水提法具有高效、省时的优点，且能较大程度地维护蛋白质的原有品质，采用该方法提取舌状蜈蚣藻蛋白质较为合适。
2.4 抗氧化活性测定
2.4.1 还原力
图3-a显示不同浓度舌状蜈蚣藻粗蛋白质溶液的还原力，以700 nm波长下的吸光度值来表示。结果表明，舌状蜈蚣藻粗蛋白质具有一定的还原力，且随质量浓度增大，其还原力逐渐增强。当舌状蜈蚣藻粗蛋白质的质量浓度为8 mg·mL−1时，吸光度值最大为 (0.43±0.01)，此时还原力最强。
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图 3 舌状蜈蚣藻粗蛋白质的还原力、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除率、2,2'-二氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)自由基清除率Figure 3. Reducing power activity, DPPH radical scavenging rate and ABTS radical scavenging rate of crude protein from G. livida2.4.2 DPPH自由基清除率
图3-b显示不同浓度舌状蜈蚣藻粗蛋白质对DPPH自由基的清除率。舌状蜈蚣藻粗蛋白质的质量浓度从1 mg·mL−1增大到8 mg·mL−1，其DPPH自由基清除能力随浓度增大而增强；粗蛋白质的质量浓度达8 mg·mL−1时DPPH自由基清除率最大 (83.01±3.98)%；继续增大质量浓度，DPPH自由基清除率增长速率变缓。经数据分析，舌状蜈蚣藻粗蛋白质对DPPH自由基的半数清除浓度(IC50)为4.00 mg·mL−1。据文献报道，姚兴存等[26]利用凝胶柱层析纯化后的条斑紫菜 (Porphyra yezoensi)蛋白质对DPPH自由基的IC50为0.452 mg·mL−1，表明其DPPH自由基清除能力强于舌状蜈蚣藻粗蛋白质；而红藻 (Portieria hornemannii)来源藻红蛋白质量浓度为1、2、4 mg·mL−1时，对应的DPPH自由基清除率分别为 (11.84±0.2)%、(22.67±0.5)%、(29.81±1.0)%[27]，明显低于同质量浓度的舌状蜈蚣藻粗蛋白质的DPPH自由基清除率。
2.4.3 ABTS自由基清除率
图3-c显示不同浓度舌状蜈蚣藻粗蛋白质对ABTS自由基的清除率。舌状蜈蚣藻粗蛋白质质量浓度从1 mg·mL−1增大到8 mg·mL−1时，其对ABTS自由基的清除率也持续上升，从 (13.81±2.20)%增大到 (90.30±1.73)%。由此可见，舌状蜈蚣藻蛋白质对ABTS自由基的清除率剂量依赖性强。经分析，舌状蜈蚣藻粗蛋白质对ABTS自由基的IC50为3.96 mg·mL−1。在Hemlata等[28]的研究中，蓝藻 (Michrochaete)来源的藻红蛋白经连续纯化后对ABTS自由基的IC50为0.023 mg·mL−1。以上数据表明舌状蜈蚣藻粗蛋白质具有一定的ABTS自由基清除能力，但由于其中杂质较多，其ABTS自由基清除能力明显弱于纯化后的蓝藻Michrochaete来源藻红蛋白。
3. 结论
本试验以舌状蜈蚣藻为原料，比较了4种破壁技术的蛋白提取效果，并通过单因素试验、正交试验对超声波辅助水提法进行工艺优化，并测定了粗蛋白质的抗氧化活性。结果表明，与溶胀法、珠磨法和反复冻融法相比，超声波辅助水提法能快速破坏细胞壁，较大程度地促进蛋白质溶出到提取液中，可获得较高蛋白质提取率。经单因素试验及正交试验优化后，超声波辅助水提法提取舌状蜈蚣藻蛋白质的最佳条件为：液料比160 mL·g−1，超声全程时间60 min，超声功率1 440 W，pH 6.0，此条件下蛋白质提取率可达58.16%，可为舌状蜈蚣藻高值化加工提供技术支持。
舌状蜈蚣藻粗蛋白质的还原力、DPPH自由基清除能力及ABTS自由基清除能力均具有剂量依赖性，舌状蜈蚣藻粗蛋白质的质量浓度为8 mg·mL−1，还原力为0.43±0.01，DPPH自由基清除率为 (83.01±3.98)%，ABTS自由基清除率为 (90.30±1.73)%；舌状蜈蚣藻粗蛋白质对DPPH自由基和ABTS自由基的IC50分别为4.00和3.96 mg·mL−1。在后续试验中，可对舌状蜈蚣藻粗蛋白质进行进一步纯化，分离出高价值的藻胆蛋白，并对纯化后藻胆蛋白的生物活性进行探究，以期为具有良好生物活性的天然蛋白质的开发利用提供参考。
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图 1 不同破壁技术对蛋白质提取率的影响
Figure 1. Effect of different wall-breaking techniques on extraction rate of protein
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图 3 舌状蜈蚣藻粗蛋白质的还原力、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除率、2,2'-二氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)自由基清除率
Figure 3. Reducing power activity, DPPH radical scavenging rate and ABTS radical scavenging rate of crude protein from G. livida
表 1 正交试验因素水平表
Table 1 Table of orthogonal test factors
水平
Level因素 Factor (A) 超声全程时间
Total ultrasonic time/min(B) pH (C) 超声功率
Ultrasonic power/W1 50 6.0 1 080 2 60 7.0 1 260 3 70 8.0 1 440 
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表 2 不同破壁技术提取舌状蜈蚣藻蛋白质的效果
Table 2 Effects of different wall-breaking techniques on extraction rate of protein from G. livida
$\overline {\mathit{\boldsymbol{X}}}{\bf \pm {{SD}}} $ 破壁技术
Wall-breaking technique温度
Temperature时间
Time蛋白质提取率
Extraction rate of protein/%细胞溶胀法 Swelling method 4 ℃ 5 d 29.66±0.86b 反复冻融法 Freeze-thawing method −20 ℃和室温 2 h，5次 24.52±0.04c 珠磨法 Bead milling method 室温 20 min 26.52±0.79c 超声波辅助水提法 Ultrasonic-assisted water extraction 4 ℃循环水浴 20 min 32.72±0.32a 注：同列中不同字母间存在显著性差异(P<0.05) Note: Values with different letters within the same column indicate significant difference (P<0.05).
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表 3 正交试验设计和结果
Table 3 Orthogonal array design and results
编号
No.(A) 超声全程时间
Total ultrasonic time/min空列
Null column(B) 超声功率率
Ultrasonic power/W(C) pH 蛋白质提取率
Extraction rate of protein/%1 1 (50) 1 1 (1 080) 1 (6.0) 55.85 2 1 2 2 (1 260) 2 (7.0) 53.12 3 1 3 3 (1 440) 3 (8.0) 56.23 4 2 (60) 1 2 3 55.41 5 2 2 3 1 58.16 6 2 3 1 2 55.91 7 3 (70) 1 3 2 53.39 8 3 2 1 3 52.89 9 3 3 2 1 53.03 K1 165.2 164.65 164.65 167.04 K2 169.48 164.17 161.56 162.42 K3 159.31 165.17 167.78 164.53 R 10.17 1 6.22 4.62 因素次序 Order of factors A>B>C 最优水平 Optimal level A2B3C1
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表 4 正交试验方差分析结果
Table 4 Analysis of variance of orthogonal array design
方差来源
Soruces of variation偏差平方和
Sj自由度
df均方
MSF 临界值
Critical value显著性
SignificanceA 17.38 2 8.690 104.24 F0.05 (2,2)=19.00 F0.01 (2,2)=99.01 ** B 6.49 2 3.245 38.18 * C 3.57 2 1.785 21 * 误差 Error 0.17 2 0.085 − 总和 Sum 27.61 8 注：**. 差异极显著 (P<0.01)，*. 差异显著 (P<0.05) Note: **. Very significant difference (P<0.01); *. Significant difference (P<0.05)
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