Establishment of a sex identification method for black tiger shrimp (Penaeus monodon) in embryonic and early postembryonic development based on an InDel molecular marker
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摘要:
为分辨斑节对虾 (Penaeus monodon) 发育早期的性别，利用改良的插入/缺失 (InDel) 标记追踪了从受精卵、无节幼体、溞状幼体、糠虾幼体、仔虾后1 d (PL1)、仔虾后30 d (PL30)及亚成虾个体的性别，建立了测序和荧光定量PCR熔解曲线的检测方法。结果表明，InDel标记可扩增获得雌雄特异性序列，用测序法判定亚成虾性别的结果与外部观察结果一致，准确率达100%，对受精卵、无节幼体、溞状幼体及糠虾幼体均可得到雌雄特异性序列；进而建立了基于SYBR Green实时荧光定量PCR (Quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR) 熔解曲线的快速鉴定斑节对虾性别的方法，其中雄性特异序列的熔解温度 (Melting temperature, Tm)为 (79.10±0.10) ℃，雌性为 (78.45±0.20) ℃，通过特异的熔解曲线可准确区分PL30、亚成虾和无节幼体Ⅵ期个体，准确率可达96.3%以上。
Abstract:In order to distinguish the sex of Penaeus monodon at embryonic and early stages of postembryonic development, we collected the individuals of fertilized eggs, Nauplii larvae, Zoea larvae, Mysis larvae, PL1 (1 day post-larvae), PL30 (30 day post-larvae) and subadults, tracked them by an improved Insertion/Deletion (InDel) marker, then established the detection methods of sequencing and fluorescence quantitative PCR. The results indicate that a sex-specific sequences could be obtained by this method. The result of sex discriminating of subadult shrimps by sequencing method (accuracy rate of 100%) was consistent with that by external observation method. Sex-specific sequences could be amplified from the samples of fertilized eggs, Nauplii larvae, Zoea larvae, Mysis larvae and post-larvae. Furthermore, we explored a rapid discriminating method based on the melting curve of qRT-PCR (Quantitative real-time polymerase chain reaction) with SYBR Green, and the value of melting temperature (Tm) of sex-specific sequences was (79.10±0.10) ℃ for male and (78.45±0.20) ℃ for female. The sex of individuals of PL30, subadults and Nauplii lavae at Stage VI could be distinguished by the specific melting curve accurately, with an accuracy rate over 96.3%.
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Keywords:
- Penaeus monodon /
- Sex identification /
- InDel marker /
- Quantitative real-timePCR /
- Melting curve /
- Early development
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海湾是陆地与海域相接的半封闭海域，受陆地和人类活动影响显著，随着近年来海水养殖、海洋工程和滨海旅游等行业的发展以及城镇化的快速推进，海湾生态环境发生了显著变化[1-4]。海湾食物网结构随着生态环境的变化产生了哪些改变，其主要渔业生物营养级如何变化，尚了解不多，尤其是华南海域。华南海域生境类型多样，地形地貌、经济发展水平和海域生态环境状况差别显著。海陵湾和陵水湾是华南地区的两个重要海湾，分别位于广东西部和海南南部。近年来两个海湾的海水水质[5]、沉积物[6]和浮游生物[7]等均发生了显著变化，但关于这2个海湾食物网营养结构特征的研究仍十分欠缺，仅见于海南新村湾海草床中主要鱼类及大型无脊椎动物食物来源的研究[8]。
在食物网研究中，稳定同位素技术的使用日益普遍，根据加拿大342 种鱼的营养级分析结果[9]，发现稳定同位素法得出的结果与胃含物分析法无显著差异，证明了用稳定同位素技术研究鱼类营养级的可靠性。由于碳稳定同位素比值在捕食者和食物间变化很小，平均富集0~1‰，故可用于区分食物来源和贡献量[10]；氮稳定同位素比值在捕食者和食物间通常能富集3‰左右，可用来确定生物在食物网中的营养位置[11-12]。在长江口和南黄海春季拖网渔获物营养级的研究[13]中发现，生物资源种类的营养级存在空间和生物种类差异，显示出渔业生物营养级对生境差异的响应。华南典型海域主要渔业生物营养级对生境差异有哪些响应特征，有待进一步了解。本研究应用稳定同位素技术分析了华南典型海湾主要渔业生物的碳、氮稳定同位素组成和营养结构，以期能了解渔业资源群落结构和食物网对生态环境变化的响应，为科学认知人类活动影响下的海湾生态系统演化规律提供基础数据。
1. 材料与方法
1.1 样品采集
2个海湾的定点底拖网调查站位见图1。拖网船均系当地渔民渔船，网口高4 m﹑宽5 m，网囊网目3 cm×3 cm。所有渔获样品均进行现场低温冷冻保存。带回实验室后随机选取主要的渔业生物进行取样分析。
1.2 样品处理与分析
1.2.1 环境样品
现场使用5 L有机玻璃采水器采集水样，温度和盐度由YSI (556 MPS) 多参数水质测量仪测得。营养盐分析均参照Liu等[14]的方法，使用Lachat QC8500 流动注射比色法测定营养盐。
1.2.2 生物样品
鱼类样品取其背部白色肌肉，蟹类去壳取第一螯足肌肉，头足类取胴体肌肉。所有样品经冷冻干燥48 h后，研磨过筛 (80目)，最后置于干燥器中保存。
所有样品的δ13C和δ15N均在中国科学院水生生物研究所分析完成。样品的稳定同位素分析仪器为Finnigan delta plus和Flash EA1112联用仪，为了保证测试结果的准确性，每测试10个样品后加测一个标准样，并且对个别样品进行2~3次的复测，样品δ13C和δ15N分析精度为±0.2‰。
碳、氮稳定同位素值计算公式：
δ=[(Rsample/Rstandard) −1]×1 000
式中δ代表碳、氮同位素 (δ13C和δ15N)；Rsample表示所测样品的同位素比值 (13C/12C或15N/14N)；Rstandard是国际上通用的标准物的重轻同位素丰度之比，碳稳定同位素标准物为美洲拟箭石 (PDB)，氮稳定同位素标准物为大气氮。
1.3 数据分析
根据Layman等[15]提出的构建δ13C-δ15N二维坐标系来代表群落的营养生态位，本文选取6种度量参数：δ15N差值 (NR)，表示营养层次和多样性水平；δ13C差值 (CR) 表示摄食来源多样性水平；总面积 (TA)，表示食物网中营养多样性的总程度；平均离心距离 (CD)，表示食物网中营养多样性平均水平；平均最邻近距离 (NND)，表示群落的整体密度；平均最邻近距离标准差 (SDNND)，表示营养生态位分布范围水平。在这6种参数中，前4种参数 (NR、CR、TA和CD) 用来反映营养结构多样性，后2种参数 (NND和SDNND) 用来研究营养冗余度。参数数值通过MATLAB软件进行计算。
2. 结果
2.1 环境特征
海陵湾水环境要素主要由丰头河的陆源冲淡水及外海水控制，其夏季平均水温略高于陵水湾 (表1)，但盐度低于陵水湾。陵水湾与新村港相通，因此其水环境质量既受南海海水影响，又受新村港影响。近年来，由于陵水湾新村港内养殖面积激增，养殖污水、船坞废水及生活污水的大量排放，致海域内水质变差。陵水湾总溶解无机氮平均浓度是海陵湾的6倍多，而溶解无机磷平均浓度也是海陵湾的3倍多。
表 1 海陵湾和陵水湾海水环境参数特征Table 1. Characteristics of environmental parameters of Hailing Bay and Lingshui Bay${ {\overline {\mathit{\boldsymbol{X}}}}}{\bf \pm {{SD}}}$ 参数
parameter海陵湾
Hailing Bay陵水湾
Lingshui Bay水温/℃
temperature29.71±1.20 29.61±0.83 盐度
salinity34.53±1.06 35.37±0.29 溶解无机磷/mg∙L−1
dissolved inorganic phosphorus0.005±0.001 0.016±0.006 溶解无机氮/mg∙L−1
dissolved inorganic nitrogen0.023±0.009 0.153±0.077 2.2 渔业生物碳氮稳定同位素值
海陵湾共分析了14种渔业生物的稳定同位素值 (表2)，其中鱼类12种﹑蟹类2种。δ13C介于−16.41‰~−13.97‰，均值为 (−15.36±0.62)‰，其中丽叶鲹 (Alepes djedaba) 的δ13C最低，少鳞 (Sillago japonica) 的δ13C最高；δ15N变化从短尾小沙丁 (Sardinella sindensis) 的12.94‰到多齿蛇鲻 (Saurida tumbil) 的16.7‰，均值为(15.53±0.94)‰。
表 2 海陵湾主要渔业生物的稳定同位素比值 (δ13C和δ15N) 和取样体长 (L)Table 2. Stable isotope signature (δ13C and δ15N) and length (L) for major fishery species in Hailing Bay种
species碳稳定同位素/‰
δ13C氮稳定同位素/‰
δ15N长度 (L)/mm
length多齿蛇鲻 Saurida tumbil −15.35 16.70 45~278 丽叶鲹 Alepes djedaba −16.41 15.90 74~90 平鲷 Rhabdosargus sarba −15.50 15.58 95~115 细鳞䱨 Terapon jarbua −15.92 16.09 51~120 汉氏棱鳀 Thryssa hamiltonii −15.61 16.19 89~157 六指马鲅 Polydactylus sextarius −15.02 16.17 120~127 长棘鲾 Leiognathus fasciatus −14.78 15.73 58~85 少鳞 Sillago japonica −13.97 16.48 111~140 南方䲗 Callionymus meridionalis −15.32 15.29 82~98 斑头舌鳎 Cynoglossus puncticeps −15.73 15.97 92~123 短尾小沙丁 Sardinella sindensis −15.52 15.23 106~115 黄斑篮子鱼 Siganus canaliculatus −16.12 13.71 98~146 远海梭子蟹 Portunus pelagicus −14.96 13.635 13~70 红星梭子蟹 Portunus sanguinolentus −14.82 14.69 26~59 范围/‰ range −16.41~−13.97 12.94~16.7 − 平均值/‰ $ \overline X \pm {\rm{SD}} $ −15.36±0.62 15.53±0.94 − 陵水湾共分析了15种渔业生物的稳定同位素值 (表3)，其中鱼类11种、蟹类2种和头足类2种。δ13C介于−19.8‰~−15.35‰，均值为 (−17.44±1.21)‰，其中黄斑篮子鱼 (Siganus canaliculatus) 的δ13C最低，锈斑蟳 (Charybdis feriatus) 的δ13C最高；δ15N介于10.91‰～15.57‰，均值为 (13.78±1.31) ‰，其中带鱼 (Trichiurus lepturus) 拥有最高的δ15N。
表 3 陵水湾主要渔业生物的稳定同位素比值 (δ13C 和 δ15N) 和取样体长 (L)Table 3. Stable isotope signature (δ13C and δ15N) and length (L) for major fishery species in Lingshui Bay种类
species碳稳定同位素/‰
δ13C氮稳定同位素/‰
δ15N长度 (L)/mm
length多齿蛇鲻 Saurida tumbil −17.44 14.63 113~215 二长棘犁齿鲷 Evynnis cardinalis −17.20 14.77 72~189 短尾大眼鲷 Priacanthus macracanthus −18.15 10.91 70~84 长尾大眼鲷 Priacanthus tayenus −16.80 14.29 132~134 竹䇲鱼 Trachurus japonicus −18.15 13.54 110~159 花斑蛇鲻 Saurida undosquamis −18.09 13.18 49~121 日本鳗鲡 Anguillidae japonica −15.60 15.14 280~322 篮圆鲹 Decapterus maruadsi −18.44 13.97 103~169 黄斑篮子鱼 Siganus canaliculatus −19.80 11.41 167~176 刺鲳 Psenopsis anomala −18.24 14.00 130~145 带鱼 Trichiurus lepturus −17.30 15.57 118~212 看守长眼蟹 Podophthalmus vigil −15.96 12.74 40~53 锈斑蟳 Charybdis feriatus −15.35 15.07 51~80 杜氏枪乌贼 Loligo duvauceli −18.31 13.74 30~200 日本无针乌贼 Sepiella japonica −16.73 13.78 34~222 范围/‰ range −19.8~−15.35 10.91~15.57 − 平均值/‰ $ \overline X \pm {\rm{SD}}$ −17.44±1.21 13.78±1.31 − 2.3 营养结构
基于δ13C-δ15N的双位图，并根据双位图计算出基于稳定同位素量化的营养结构的群落范围指标 (表4)。结果表明2个海湾的食物链长度和食物来源广泛度均不高。
表 4 典型海域食物网营养结构Table 4. Trophic structure of food web in typical sea areas区域
area年份
year总面积
TA平均离心距离
CD平均最邻近距离
NND平均最邻近距离标准差
SDNNDδ13C差值
CRδ15N差值
NR海陵湾
Hailing Bay2015 5.10 0.93 0.55 0.35 2.44 3.06 陵水湾
Lingshui Bay2015 11.18 1.49 0.60 0.54 4.45 4.66 海州湾[16]
Haizhou Bay2014 13.00 1.37 0.61 0.64 3.70 6.40 海州湾[16]
Haizhou Bay2015 7.15 1.36 0.42 0.24 1.70 6.04 南海西南陆架区[17]
southwestern continental shelf of South China Sea2013 5.8 1.0 0.37 0.43 3.4 4.3 海陵湾CR和NR分别为2.44和3.06，TA约为5.1，CD为0.93，显示出海陵湾主要渔业生物营养结构多样性较低。NND和SDNND分别为0.55和0.35，表明海陵湾食物网营养冗余较高 (图2)。
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图 2 海陵湾主要生物种类的碳、氮稳定同位素比值Figure 2. δ13C and δ15N values of major species in Hailing Bay陵水湾的CR和NR分别为4.45和4.66，TA约为11.18，CD为1.49，显示出陵水湾营养结构多样性较低，但好于海陵湾。NND和SDNND分别为0.60 和0.54，表明陵水湾食物网营养冗余较高，但冗余程度低于海陵湾 (图3)。
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图 3 陵水湾主要生物种类的碳、氮稳定同位素比值Figure 3. δ13C and δ15N values of major species in Lingshui Bay与海州湾和南海西南陆架区相比，海陵湾和陵水湾均呈现出食物链长度不足的特征，TA、CD、NND、SDNND均相差不大，处于较低水平，说明这些海湾和近海区域均存在食物链长度不足、捕捞压力大、食物网营养结构冗余的现象 (表4)。
3. 讨论
3.1 生态环境差异和人类活动对渔业生物碳氮同位素的影响
浮游生物等基础饵料生物δ13C和δ15N的变化，通过捕食者的摄食影响到鱼类，进而传递到整个食物网[18]。许思思等[19]分析了近50年来渤海捕捞渔获物资源结构的变化特征及影响因素，指出营养盐的变化会改变浮游植物的群落结构，导致渔业资源结构的改变。陵水湾渔业生物CR高于海陵湾，可能与陵水湾物质输入导致渔业生物食物来源更广泛有关。陵水湾内存在大量的水产养殖，陆源输入营养物质也较多[20]，因此陵水湾渔业生物的CR高于海陵湾，但整体CR均不高。
陵水湾渔业生物NR值和TA值都高于海陵湾，显示陵水湾较海陵湾食物链更长，多样性水平更高。以3.4‰作为一个营养级的氮稳定同位素富集度来计算，陵水湾渔业生物营养级级距仅为1.37，而海陵湾主要渔业生物营养级级距小于1，说明陵水湾和海陵湾均处于高营养级生物较少、食物网受干扰较多 (捕捞活动造成高营养级生物损失) 的状态。
3.2 主要渔业生物不同发育阶段碳氮稳定同位素值变化
渔业生物随着个体生长，食性会发生变化，渔业生物可选择和利用的食物来源更多样；摄食会趋向于高营养层次的生物，从而改变其营养级，占据更多的营养层次[21-24]，如南海鸢乌贼 (Symplectoteuthis oualaniensis) δ15N随胴长增加变化显著，呈指数增长[25]。本研究中，主要渔业生物在不同发育阶段δ15N 和δ13C 发生变化。以陵水湾多齿蛇鲻和日本无针乌贼(Sepiella japonica)为例，由于取样体长有较大差异，δ15N和δ13C均随体长增加而增大，其中多齿蛇鲻和日本无针乌贼δ15N分别变化了1.42‰和2.78‰。以3.4‰作为一个营养级的氮稳定同位素富集度来计算[11]，多齿蛇鲻和日本无针乌贼的营养级分别变化了0.42和0.82；而δ13C分别变化了0.19 ‰和0.86‰，表明随着多齿蛇鲻和日本无针乌贼的生长发育，其食物来源发生了改变。由此可见，陵水湾主要渔业生物在不同发育阶段食性发生变化，营养级亦随之变化。
4. 结论
海陵湾主要渔业生物的δ13C和δ15N均显著高于陵水湾，但CR和NR低于陵水湾。陵水湾渔业生物NR和TA均高于海陵湾，表明陵水湾较海陵湾食物链更长，多样性水平较高。陵水湾渔业生物营养级级距仅为1.37，而海陵湾营养级级距小于1，说明陵水湾和海陵湾均处于高营养级生物较少、食物网受干扰较多的状态。
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图 1 斑节对虾性别特异基因组序列
阴影表示雌雄特异的单个碱基和雌虾特有的6 bp插入序列
Figure 1. Sex-specific genome sequence of P. monodon
The insertion in female shrimp and specific bases in both sexes are shaded.
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图 2 斑节对虾亚成虾雌雄个体测序结果
a. 雌虾测序结果；b. 雄虾测序结果；红框表示雌雄特异的单个碱基和雌虾特有的6 bp插入序列
Figure 2. Sequencing results of female and male P. monodon subadult
a. Sequencing results of female shrimp; b. Sequencing results of male shrimp. Insertion in female shrimp and specific bases in both sexes are in red frames.
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图 3 斑节对虾雌、雄亚成虾实时荧光定量熔解曲线及熔解峰
a. 雌虾熔解曲线及熔解峰；b. 雄虾熔解曲线及熔解峰；c. 雌、雄虾熔解曲线及熔解峰对比
Figure 3. Melting curve and melting peak of quantitative real-time PCR of female and male P. monodon subadults
a. Melting curve and melting peak of female shrimps; b. Melting curve and melting peak of male shrimps; c. Comparison of melting curve and melting peak between female and male shrimps
表 1 InDel标记引物
Table 1 Primers of InDel marker
引物
Primer序列 (5'–3')
SequenceSex-InDel-F TAAAGATCCTATTTTCAAATGC Sex-InDel-R CGAGGGAATGTCACTTTG 
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表 2 斑节对虾性别鉴定方法的比较
Table 2 Comparison of different methods for sex identification of P. monodon
% 鉴定方法
Identification method受精卵
Zygote无节幼体Ⅰ−Ⅴ期
Nauplii I−V无节幼
体Ⅵ期
Nauplii
VI溞状
幼体
Zoea
larvae糠虾
幼体
Mysis
larvae仔虾后
1 d
PL1仔虾后
30 d
PL30雌性亚
成虾
Female subadult雄性亚
成虾
Male subadult外部观察
External observation吻合率 − − − − − − − 100 100 InDel标记测序法
InDel marker sequencing成功率 100 100 100 100 100 100 100 100 100 InDel标记实时荧光定量熔解曲线分析
Melting curve of InDel marker by quantitative real-time PCR扩增
成功率0 86 100 90 80 90 100 96.7 90 吻合率 0 63 100 89 63 56 100 96.6 96.3 注：−. 不能鉴别个体性别 Note: −. The sex can not be identified.
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