Establishment of a sex identification method for black tiger shrimp (Penaeus monodon) in embryonic and early postembryonic development based on an InDel molecular marker
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摘要:
为分辨斑节对虾 (Penaeus monodon) 发育早期的性别，利用改良的插入/缺失 (InDel) 标记追踪了从受精卵、无节幼体、溞状幼体、糠虾幼体、仔虾后1 d (PL1)、仔虾后30 d (PL30)及亚成虾个体的性别，建立了测序和荧光定量PCR熔解曲线的检测方法。结果表明，InDel标记可扩增获得雌雄特异性序列，用测序法判定亚成虾性别的结果与外部观察结果一致，准确率达100%，对受精卵、无节幼体、溞状幼体及糠虾幼体均可得到雌雄特异性序列；进而建立了基于SYBR Green实时荧光定量PCR (Quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR) 熔解曲线的快速鉴定斑节对虾性别的方法，其中雄性特异序列的熔解温度 (Melting temperature, Tm)为 (79.10±0.10) ℃，雌性为 (78.45±0.20) ℃，通过特异的熔解曲线可准确区分PL30、亚成虾和无节幼体Ⅵ期个体，准确率可达96.3%以上。
Abstract:In order to distinguish the sex of Penaeus monodon at embryonic and early stages of postembryonic development, we collected the individuals of fertilized eggs, Nauplii larvae, Zoea larvae, Mysis larvae, PL1 (1 day post-larvae), PL30 (30 day post-larvae) and subadults, tracked them by an improved Insertion/Deletion (InDel) marker, then established the detection methods of sequencing and fluorescence quantitative PCR. The results indicate that a sex-specific sequences could be obtained by this method. The result of sex discriminating of subadult shrimps by sequencing method (accuracy rate of 100%) was consistent with that by external observation method. Sex-specific sequences could be amplified from the samples of fertilized eggs, Nauplii larvae, Zoea larvae, Mysis larvae and post-larvae. Furthermore, we explored a rapid discriminating method based on the melting curve of qRT-PCR (Quantitative real-time polymerase chain reaction) with SYBR Green, and the value of melting temperature (Tm) of sex-specific sequences was (79.10±0.10) ℃ for male and (78.45±0.20) ℃ for female. The sex of individuals of PL30, subadults and Nauplii lavae at Stage VI could be distinguished by the specific melting curve accurately, with an accuracy rate over 96.3%.
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Keywords:
- Penaeus monodon /
- Sex identification /
- InDel marker /
- Quantitative real-timePCR /
- Melting curve /
- Early development
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银鲳(Pampus argenteus)隶属鲈形目、鲳科、鲳属[1]，分布于印度洋和太平洋西部。中国沿海均有分布，主要产地位于东海北部和黄海南部[2]，因其肉质鲜嫩，且无肌间刺而深受消费者的欢迎，开展人工繁殖可以解决日益增长的市场需求。在人工繁育过程中，环境因素是制约银鲳人工规模化养殖的一个难点。在众多环境因素中，温度和盐度是主要的制约因子。迄今为止，施兆鸿等[3]、张晨捷等[4-5]已研究了银鲳在盐度胁迫下的各项生理生化指标的变化规律，但尚未见到有关银鲳在温度胁迫下的各项机能反应的报道。因此研究银鲳在温度胁迫下代谢酶活力、血清离子浓度及鳃和肾脏离子酶活力的变化具有现实意义。
温度是影响鱼类生长和代谢最重要的环境因子之一。由于自然界存在季节更替、气候变化等环境的改变，鱼类生活的环境温度经常出现节律性或突发性的变动[6]。因此，研究短周期温度波动对鱼类的影响具有重要意义。鱼类会通过调节营养代谢、离子平衡以应对环境的变化，减少自身的损伤，使机体在环境胁迫下保持相对稳定的平衡状态。谷草转氨酶(GOT)、谷丙转氨酶(GPT)、碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、乳酸脱氢酶(LDH)是鱼类营养代谢的关键酶类，这些酶类的活力变化可以反映出鱼体代谢水平的高低及生理状态。此外，研究发现鱼类血清中的离子在机体营养代谢、体液渗透压调节以及维持酸碱平衡过程中起着重要作用[7-9]。ATP酶是一类分布广泛的膜结合蛋白酶，其中Na + /K +-ATP酶是维持细胞内高钾(K +)低钠(Na +)的重要离子酶，而Ca2+ /Mg2+-ATP酶是维持细胞内低钙(Ca2+)水平的离子酶[10]，通过测定Na + /K +-ATP酶、Ca2+/Mg2+-ATP酶的活力以及Na +、Ca2+的浓度变化，能够深入探究鱼类机体内环境的稳定性、平衡性以及由环境改变而引起的损耗程度。该研究以银鲳幼鱼为材料，分别设计了低温胁迫和高温胁迫，分析了温度胁迫对银鲳幼鱼代谢酶活性、血清离子浓度及鳃和肾脏离子酶活性的影响，旨在探明银鲳幼鱼对温度胁迫的反应，以为银鲳人工养殖中的温度调控提供参考依据。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
实验用银鲳幼鱼取自东海水产研究所于2014年自行繁育的银鲳幼鱼，实验在上海市水产研究所江苏启东市的实验基地进行。选取规格均一[平均叉长为(9.1±1.1)cm，平均体质量为(18.8±7.2)g]、体表无伤的银鲳幼鱼作为实验材料。
1.2 饲养管理与实验设计
实验用水采用经网滤、暗沉淀后的天然海水，日换水量为50% · d-1。盐度28±0.5，pH 7.9±0.5，溶解氧6~8 mg · L-1，水温为27 ℃，24 h不间断充气。定时观察水质和鱼活动情况。
实验设计22 ℃、27 ℃和32 ℃ 3个温度梯度，以27 ℃为对照组，每个梯度3个重复，每个重复20尾，组间个体无显著差异(P＜0.05)。实验开始将180尾实验用鱼放入3个27 ℃水泥池内，暂养4 d，再将180尾实验用鱼随机分配到9个2.5 m×2.5 m的水泥池。并采用广东日升牌(CW-2500A)冷热水机进行水温调节。实验分别在第0、第12、第24和第48小时取样。
1.3 样品采集及酶液制定
实验期间各实验组均不投食，每个重复随机抽取3尾，每实验组9尾，用200 mg · L-1的MS-222作快速深度麻醉，麻醉后，置于冰盘上采用尾静脉采血，血样于4 ℃冰箱中静置12 h，在4 ℃条件下3 500 r · min-1离心20 min制备血清，上清液移置-70 ℃冰箱中保存备用，血液抽取完毕后，立即解剖取鳃、肝脏和肾脏，样品置于-20 ℃保存，用于生化分析。
酶液制定。将鳃瓣、肝脏或肾脏在匀浆介质[pH 7.4，0.01 mol · L-1Tris-HCl，0.000 1 mol · L-1EDTA-2Na，0.01 mol · L-1蔗糖，0.8%NaCl]中剪碎，用匀浆机15 000 r · min-1研磨制成匀浆。之后在4 ℃下离心15 min，取上清液检测指标。
1.4 检测指标
血清、肝脏、鳃和肾脏检测的指标是GPT、GOT、AKP、ACP、LDH、Na+、K+、Ca2+、氯(Cl-)、Na+/K+-ATP酶、Ca2+/Mg2+-ATP酶。上述指标的测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，具体实验方法见说明书。其中总蛋白采用南京建成考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒，血清离子浓度分析采用全自动生化分析仪(日立7600型)测定。
1.5 数据分析
所得数据以平均值±标准差(X±SD)表示，实验结果用SPSS 19.0软件进行统计与分析，运用单因素方差分析急性温度胁迫后银鲳幼鱼各项检测指标，先进行方差齐性检验，不满足方差齐性时，对数据进行自然对数或平方根转换，采用Duncan′s检验进行多重比较，P＜0.05即认为有显著性差异。运用Excel 2010绘制图表。
2. 结果
2.1 GPT
急性温度胁迫下肝脏GPT活性仅在32 ℃实验组有变化，呈波浪式下降趋势，在第48小时下降到最小值(P＜0.05)，且与对照组差异显著(P＜0.05)(图 1-Ⅰ)；22 ℃和32 ℃实验组血清中GPT活性变化相反，前者呈上升趋势，后者则呈下降趋势，且分别在第48和第12小时达到最大值和最小值(P＜0.05)(图 1-Ⅱ)。在第12、第24和第48小时，实验组GPT与对照组出现显著性差异(P＜0.05)。
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图 1 急性温度胁迫对银鲳幼鱼肝脏和血清谷丙转氨酶活性的影响图柱上方不同小写字母表示同一实验组不同时间的差异显著(P＜0.05)，不同大写字母表示同一时间段内不同实验组之间差异显著(P＜0.05)，后图同此Figure 1. Effect of acute temperature stress on GPT activities in liver and serum of juvenile P.argenteusDifferent small letters above the bar graph indicate significant difference at different time (P < 0.05);capital letters indicate significant difference among experimental groups at the same time (P < 0.05). The same case in the following figures.2.2 GOT
急性温度胁迫下22 ℃实验组肝脏GOT活性呈先下降后上升趋势，而32 ℃实验组则先下降后上升，再下降，2个实验组均在第24小时升高到最大值；第12小时实验组与对照组差异显著(P＜0.05)；第48小时32 ℃实验组与其余2个处理组差异显著(P＜0.05)(图 2-Ⅰ)。血清GOT活性仅在32 ℃实验组有变化，呈先下降后上升趋势，在第12小时下降到最小值，第48小时上升至最大值(P＜0.05)；第12和第24小时32 ℃实验组均与对照组差异显著(P＜0.05)(图 2-Ⅱ)。
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图 2 急性温度胁迫对银鲳幼鱼肝脏和血清谷草转氨酶活性的影响Figure 2. Effect of acute temperature stress on GOT activities in liver and serum of juvenile P.argenteus2.3 AKP
急性温度胁迫后22 ℃实验组随时间延长，AKP活性逐渐升高，在第48小时升高至最大值；32 ℃实验组则呈下降趋势，在第12小时下降至最小值(图 3-Ⅰ)。第12小时实验组与对照组差异显著(P＜0.05)；在第24和第48小时，32 ℃实验组与对照组出现显著性差异(P＜0.05)。
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图 3 急性温度胁迫对银鲳幼鱼血清碱性磷酸酶、酸性磷酸酶和乳酸脱氢酶活性的影响Figure 3. Effect of acute temperature stress on AKP, ACP and LDH activities in serum of juvenile P.argenteus2.4 ACP
急性温度胁迫后血清中ACP活性在实验组中均呈上升趋势，22 ℃实验组在第24小时达到峰值，32 ℃实验组在第48小时达到峰值(P＜0.05)。第24和第48小时22 ℃实验组与对照组出现显著性差异(P＜0.05)(图 3-Ⅱ)。
2.5 LDH
急性温度胁迫下血清LDH活性在22 ℃实验组出现波浪式变化，即先下降后上升，在第12小时下降到谷值，在第48小时又达到峰值，且高于初始值(P＜0.05)；32 ℃实验组LDH活性不随时间的变化而变化(P>0.05)(图 3-Ⅲ)。
2.6 Na+
急性温度胁迫条件下22 ℃实验组Na+浓度出现上升趋势，在第48小时上升至最大值(P＜0.05)；32 ℃实验组Na+浓度未出现显著性差异(P>0.05)。第48小时22 ℃实验组与对照组差异显著(P＜0.05)(图 4-Ⅰ)。
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图 4 急性温度胁迫对银鲳幼鱼血清纳离子、钾离子、钙离子和氯离子浓度的影响Figure 4. Effect of acute temperature stress on Na+, K+, Ca2+ and Cl- contents in serum of juvenile P.argenteus2.7 K+
急性温度胁迫下，22 ℃实验组血清K+浓度呈上升趋势，在第48小时上升到最大值(P＜0.05)；32 ℃实验组则先上升后下降，第24小时上升到最大值，第48小时再次下降，但高于初始值(P＜0.05)。第12小时2个实验组差异显著；第48小时22 ℃实验组与对照组差异显著(P＜0.05)(图 4-Ⅱ)。
2.8 Ca2+
3个组的血清Ca2+浓度在急性温度胁迫后均有变化。22 ℃实验组出现缓慢上升后再缓慢下降的趋势，在第12小时上升至峰值，第48小时下降至谷值，且差异显著(P＜0.05)(图 4-Ⅲ)；32 ℃实验组呈先上升后下降的趋势，即先在第12小时上升至峰值，而后微降(P＜0.05)。第12小时实验组与对照组出现显著性差异(P＜0.05)。
2.9 Cl-
22 ℃实验组Cl-浓度出现缓慢上升趋势，第48小时上升到最大值(P＜0.05)；32 ℃实验组出现波浪式变化，即先缓慢下降，再急速上升，最后又下降，且在第24小时上升到最大值，第48小时又回落，但大于初始值(P＜0.05)(图 4-Ⅳ)。第48小时22 ℃实验组与对照组差异显著(P＜0.05)。
2.10 Na + /K +-ATP酶
急性温度胁迫下22 ℃实验组银鲳幼鱼鳃的Na + /K +-ATP酶活性随着时间的推移，未出现显著性变化(P>0.05)(图 5-Ⅰ)；32 ℃实验组随着时间的延长，出现下降趋势，在第48小时下降到最小值(P＜0.05)；对照组也出现了缓慢下降的趋势，且也在第48小时下降到最小值(P＜0.05)。第12和第48小时2个实验组差异显著(P＜0.05)。肾脏Na + /K +-ATP酶活性32 ℃实验组随着时间的延长，未出现显著性变化(P>0.05)(图 5-Ⅱ)；22 ℃实验组随着时间的推移，出现先升高后降低的趋势，在第24小时升高到最大值，第48小时有所回落，但大于初始值(P＜0.05)。
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图 5 急性温度胁迫对银鲳幼鱼鳃和肾脏Na+/K+-ATP酶活性的影响Figure 5. Effect of acute temperature stress on Na+/K+-ATPase activities in gill and kidney of juvenile P.argenteus2.11 Ca2+ /Mg2+-ATP酶
鳃Ca2+ /Mg2+ -ATP酶活性在22 ℃实验组和32 ℃实验组均出现先下降后升高的趋势，前者在第12小时下降到谷值，第24小时回升，但小于初始值(P＜0.05)，而后者则在第24小时下降到谷值，第48小时回升，且小于初始值(P＜0.05)(图 6-Ⅰ)；对照组出现下降趋势，第48小时下降到最小值(P＜0.05)。第48小时22 ℃实验组和对照组出现显著性差异(P＜0.05)。肾脏Ca2+ /Mg2+ -ATP酶活性22 ℃和32 ℃实验组均出现先升高后下降趋势，且均在第24小时升高到峰值，在第48小时下降至最低值(P＜0.05)(图 6-Ⅱ)；第24和第48小时实验组均与对照组差异显著(P＜0.05)。
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图 6 急性温度胁迫对银鲳幼鱼鳃和肾脏Ca2+/Mg2+-ATP酶活性的影响Figure 6. Effect of acute temperature stress on Ca2+/Mg2+-ATPase activities in gill and kidney of juvenile P.argenteus3. 讨论
水体温度可以影响鱼类的生长、营养的消化吸收、鱼体成分、肝脏内的代谢酶类活性等[11-12]。鱼类为适应环境温度的变化，会对鱼体代谢酶类的活性进行调整[13]。转氨酶与动物体内蛋白质代谢、糖代谢及脂代谢有关，其活性大小通常被认为是肝脏功能正常与否的标志[14-16]。GPT和GOT是广泛存在于动物线粒体中的重要氨基酸转氨酶，其中GPT主要分布于肝脏，而GOT则主要分布于心肌细胞[17]。在通常情况下，由于细胞膜的屏障作用，血清中这2种酶的浓度很低[18]，但是当鱼体受到外界刺激时，肝脏和心肌细胞受损，细胞膜的通透性增加，大量的GPT和GOT渗入血液中，导致血液中这2种酶的活性增强，而肝脏和心肌细胞中酶的浓度减小[19]。此实验低温组GPT在肝脏没有变化，而在血清中浓度升高；高温组肝脏和血清中的变化相同，均出现下降趋势，因此此实验GPT并未出现与理论相符的变化趋势，这可能是由于急性温度胁迫使银鲳幼鱼产生了应激反应，使得细胞膜通透性加大，肝脏受损。同时，此实验低温胁迫下鱼类血清及肝脏中GPT的变化规律与KUMAR等[20]、刘波等[21]的研究不同，究其原因，可能是实验鱼类的不同导致。低温组，GOT活性在肝脏出现先下降后上升的趋势，但差异不显著，而在血清中没有变化，说明低温胁迫对银鲳幼鱼的心肌细胞造成的损伤并不严重，这与刘波等[22]的实验结果不同；在高温组，胁迫时间达到48 h，GOT活性出现了与理论相符的变化趋势，并且与KUMAR等[20]、桂丹和刘文斌[17]的研究结果一致，说明高温胁迫对银鲳幼鱼心肌细胞产生了损害。
LDH同GOT一样，分布于心肌细胞中，在医学上亦将GOT和LDH称为“心肌酶”[23]。在此实验中，LDH在低温实验组具有浓度上升的趋势，可能是由于低温胁迫刺激了银鲳幼鱼的心肌细胞，使心肌收缩力加强，血液循环速度加快[24]，代谢能力增强，细胞膜通透性加大，最终导致血清中LDH浓度上升。高温实验组未产生变化，结合GOT的变化趋势，说明急性温度胁迫对银鲳幼鱼心肌细胞产生了影响。LDH在高温实验组没有出现变化，这可能与实验过程中的饥饿处理以及外界其他环境因素有关。
AKP和ACP是2种重要的代谢调控酶，广泛分布于动植物及微生物体内，在动物代谢过程中发挥着不可替代的作用。这2种酶类是非特异性磷酸水解酶，能催化磷酸单酯的水解，打开磷酸酯键，释放磷酸离子[25]，促使磷酸基团的转移反应，这对动物的生存具有重要意义[21]。此外，AKP和ACP在机体生长代谢、保持内环境稳定以及维持机体健康方面亦具有重要的作用，且其功能作用受到生长阶段、营养状况、疾病及环境变化的影响[26-28]。AKP是一种膜结合蛋白，可维持体内适宜的钙磷比例[29]。此实验中AKP在低温处理组出现上升趋势，这可能是由于在低温胁迫下，银鲳幼鱼增加了脂类代谢水平，而AKP与肠内脂质代谢有关，因此血清中AKP浓度增加；在高温处理组，AKP浓度下降，这可能是因为在高温胁迫下，皮质醇促进脂肪降解，因此AKP浓度下降。ACP在实验组均出现上升趋势，说明在急性温度胁迫下，肝脏等组织细胞膜通透性增加，这促使ACP从组织中渗透到血清。
血清离子是维持细胞新陈代谢、酸碱平衡以及调节体液渗透压的重要因子[24, 30]。硬骨鱼类Na+的浓度与pH呈负相关，其浓度的变化可导致鱼类体液酸碱度发生改变，并且可诱发鱼类死亡；K+失衡可使细胞膜破裂，并可能导致细胞死亡[24]；Cl-浓度往往随着Na +和K +的变化而变化[7]。此实验中低温胁迫组Na +、K +和Cl-的浓度均呈上升趋势，这与冀德伟等[31]的研究报道不同(其研究指出K +浓度下降，而Na +和Cl-浓度升高)；陈超等[7]研究了低温胁迫对七带石斑鱼(Epinephelus septemfasciatus)幼鱼血清生化指标的影响，发现各离子成分均未有显著变化，这亦与此实验结果不同。其原因可能是银鲳幼鱼细胞膜的渗透压调节功能下降，细胞膜通透性增加，从而使得细胞内液流入血液中，引起离子浓度的变化[32]。Ca2 +浓度呈现先上升后下降的趋势，可能是因为低温胁迫初期细胞膜通透性增加，因此Ca2 +浓度在血清中增加，但是随着时间的延长，银鲳幼鱼机体代谢能力降低，肌肉的兴奋性下降，所以Ca2 +浓度下降。在高温胁迫组，4种血清离子的变化各不相同，这说明高温胁迫后，银鲳幼鱼的肝脏、肾脏、心肌和鳃等组织都出现了不同程度损伤，阻碍了机体的正常新陈代谢，最终导致体液内环境稳态遭破坏，因此细胞膜通透性增加，并使得血清中4种离子出现了不同程度的变化。
在众多的环境因素中，除了盐度以外，外界环境温度也可以影响海水鱼类的渗透压平衡及细胞膜的通透性[33]。ATP酶是一类分布广泛的膜结合蛋白，鳃和肾脏是硬骨鱼类中负责执行ATP酶调控的两大重要器官。ATP酶不仅参与生物体的物质转运[34]、能量代谢及氧化磷酸化等生理生化过程，而且还可与细胞膜上磷脂结合，从而影响细胞膜的其他功能[35]，因此也是一项评价环境胁迫下鱼体机能的生物学指标。ATP酶活性的下降将影响鱼体的生理功能，因为这能引起细胞膜结构的破坏[26]，损害线粒体膜及质膜，从而影响生物体自身正常的代谢活动[36]。Na +/K +-ATP酶活性在离子转运过程中发挥着重要作用，其可通过主动跨膜转运细胞内外的Na +与K +，从而维持细胞内外的离子平衡[37]。此实验中鳃内的Na + /K +-ATP酶活性在低温组没有变化，高温组则出现下降趋势；Ca2 + /Mg2 +-ATP酶活性在2个实验组进行至第48小时均出现降低趋势，这与KONG等[38]的实验结果相似。实验结果表明急性温度胁迫损伤了银鲳幼鱼的鳃，并导致其代谢紊乱。肾脏中2种ATP酶活性在高温胁迫和低温胁迫下皆发生了较大的改变，且两者之间存在差异，表明急性温度胁迫损害了银鲳幼鱼的肾脏，致使其代谢活动发生紊乱，严重危害银鲳幼鱼的健康。
综上所述，在急性温度胁迫下，银鲳幼鱼的代谢系统、排泄系统、血液循环系统及渗透压调节机制等均受到了不同程度的损伤，因此在实际生产操作中，应尽量避免急性温度胁迫或降低胁迫的时间和频率等，以保证银鲳幼鱼的健康生长。
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图 1 斑节对虾性别特异基因组序列
阴影表示雌雄特异的单个碱基和雌虾特有的6 bp插入序列
Figure 1. Sex-specific genome sequence of P. monodon
The insertion in female shrimp and specific bases in both sexes are shaded.
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图 2 斑节对虾亚成虾雌雄个体测序结果
a. 雌虾测序结果；b. 雄虾测序结果；红框表示雌雄特异的单个碱基和雌虾特有的6 bp插入序列
Figure 2. Sequencing results of female and male P. monodon subadult
a. Sequencing results of female shrimp; b. Sequencing results of male shrimp. Insertion in female shrimp and specific bases in both sexes are in red frames.
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图 3 斑节对虾雌、雄亚成虾实时荧光定量熔解曲线及熔解峰
a. 雌虾熔解曲线及熔解峰；b. 雄虾熔解曲线及熔解峰；c. 雌、雄虾熔解曲线及熔解峰对比
Figure 3. Melting curve and melting peak of quantitative real-time PCR of female and male P. monodon subadults
a. Melting curve and melting peak of female shrimps; b. Melting curve and melting peak of male shrimps; c. Comparison of melting curve and melting peak between female and male shrimps
表 1 InDel标记引物
Table 1 Primers of InDel marker
引物
Primer序列 (5'–3')
SequenceSex-InDel-F TAAAGATCCTATTTTCAAATGC Sex-InDel-R CGAGGGAATGTCACTTTG 
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表 2 斑节对虾性别鉴定方法的比较
Table 2 Comparison of different methods for sex identification of P. monodon
% 鉴定方法
Identification method受精卵
Zygote无节幼体Ⅰ−Ⅴ期
Nauplii I−V无节幼
体Ⅵ期
Nauplii
VI溞状
幼体
Zoea
larvae糠虾
幼体
Mysis
larvae仔虾后
1 d
PL1仔虾后
30 d
PL30雌性亚
成虾
Female subadult雄性亚
成虾
Male subadult外部观察
External observation吻合率 − − − − − − − 100 100 InDel标记测序法
InDel marker sequencing成功率 100 100 100 100 100 100 100 100 100 InDel标记实时荧光定量熔解曲线分析
Melting curve of InDel marker by quantitative real-time PCR扩增
成功率0 86 100 90 80 90 100 96.7 90 吻合率 0 63 100 89 63 56 100 96.6 96.3 注：−. 不能鉴别个体性别 Note: −. The sex can not be identified.
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