Degradation of Porphyra haitanensis polysaccharide by ultrasonic assisted hydrogen peroxide method and its antioxidant activity analysis
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摘要: 该试验比较了超声波法、过氧化氢法、超声波辅助过氧化氢法降解坛紫菜 (Porphyra haitanensis) 多糖的效果，最后以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼 (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH) 自由基清除率为指标，通过单因素和正交试验优化了超声波辅助过氧化氢法降解坛紫菜多糖的工艺。对比了降解前后多糖的抗氧化活性，并分析了其与分子量、结构特征及理化性质等的相关性。结果表明，在过氧化氢体积分数10%、温度65 ℃、超声波辅助2.5 h条件下，该多糖降解前后DPPH自由基清除率的半抑制浓度 (Half maximal inhibitory concentration, IC50) 由9.37 mg·mL−1降为1.71 mg·mL−1；凝胶渗透色谱结果显示分子量由大于670 kD降为235 835 D；傅里叶红外光谱表明多糖特征吸收峰依旧存在；高效液相色谱分析发现单糖组成大致相同，糖醛酸质量分数有所降低；理化性质显示硫酸基质量分数增高，3,6-内醚半乳糖质量分数明显降低。因而超声波辅助过氧化氢法可较好地降解坛紫菜多糖，并可改善理化性质及结构特征进而增强抗氧化活性，为低分子量多糖的制备及构效关系分析提供依据。Abstract: We have compared the degradation effects of ultrasonic method, hydrogen peroxide method and ultrasound-assisted hydrogen peroxide method on Porphyra haitanensis polysaccharide, and finally optimized ultrasonic assisted hydrogen peroxide degradation of polysaccharides by single factor and orthogonal test, using DPPH scavenging rate as the index. Meanwhile, we compared the antioxidant activity of polysaccharides and analyzed its correlation with molecular mass, structural characteristics and physicochemical properties. The results show that the IC50 (Half maximal inhibitory concentration) of DPPH scavenging reduced from 9.37 mg·mL−1 to 1.71 mg·mL−1 under the conditions of 10% hydrogen peroxide, 65 ℃ and 2.5 h. Gel permeation chromatography shows that the molecular mass of polysaccharide decreased from more than 670 kD to 235 835 D before and after degradation. FT-IR shows that the absorption peaks of the polysaccharide did not change. The monosaccharide composition was almost the same with PMP column derivatization according to HPLC analysis, while the content of uronic acid decreased. Moreover, the Sulfate-group content increased but the 3,6-endogalactose content decreased obviously. Therefore, the ultrasonic assisted hydrogen peroxide method can degrade P. haitanensis polysaccharides and improve the antioxidant activity. The results provide references for the preparation of low molecular mass polysaccharides and analysis of structure-activity relationship.
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消化管是动物体内负责食物消化和吸收的主要器官，它由多层结构组成，从内向外依次为黏膜层、黏膜下层、肌层和外膜层[1-2]。肠道作为消化管重要的组织结构，不仅是吸收营养物质的重要器官，还是消化酶工作的主要场所。而消化酶活性直接影响着鱼类的消化吸收能力，可在一定程度上反映机体的消化情况[3]，对饲料利用率和鱼类生长性能存在潜在影响[4]。抗氧化酶活性则反映机体氧化应激损伤程度[5]，机体受到不同应激源或者缺乏抗氧化分子时，促氧化剂 (即活性氧) 过量会导致抗氧化酶活性变化。此外，肠道菌群参与鱼体的营养物质消化吸收，可促进宿主生长，是宿主黏膜屏障防御的重要组成部分[6-7]。因此，研究肠道组织结构、消化酶、抗氧化酶及肠道菌群对鱼类生长发育和健康养殖具有重要意义。
秦岭细鳞鲑 (Brachymystax tsinlingensis Li, 1966) 隶属于鲑形目、鲑科、细鳞鲑属，为中国特有的陆封型冷水性肉食鱼类，主要栖息在水流湍急、水质清澈的山涧溪流中[8-14]。受自然环境和人为活动影响，秦岭细鳞鲑栖息范围萎缩，分布海拔升高，种群数量锐减，个体小型化趋势明显，1988年被列入国家II级重点保护野生动物 [15-18]。为有效保护和恢复其资源，中国学者先后开展了秦岭细鳞鲑亲本驯化、人工繁育和增殖放流等研究，现已系统掌握了秦岭细鳞鲑人工繁育技术并成功获得子二代苗种[19-26]，有效遏制了资源衰减速度，为秦岭细鳞鲑资源养护和利用奠定了基础。并于2023年入选农业农村部2022年十大特色水产种质资源名录，具备产业发展潜力。
然而，本研究团队在开展秦岭细鳞鲑人工繁育及资源增殖过程中发现，其子代和野生群体生长发育差异明显，尤其在摄食和环境应激等方面较为突出。目前，有关秦岭细鳞鲑的研究主要针对其遗传分布[11]、基础生理特征及组织形态[27-28]，以及对外界应激的响应机制[26,29-31]等方面，但不同生境及驯养方式下秦岭细鳞鲑肠道组织结构、消化酶、抗氧化酶及肠道菌群特征等尚未见报道。为此，本研究围绕秦岭细鳞鲑子二代和野生群体亚成体的生长发育及摄食消化特征等问题，通过组织学和高通量测序等技术手段探究其肠道结构、生理变化及微生物组成特征等，为其人工繁育及驯养过程中饲养方式和环境选择提供参考，有利于提升秦岭细鳞鲑的规模化繁育及资源养护成效。
1. 材料与方法
1.1 实验材料与样本采集
秦岭细鳞鲑子二代 (Bt) 亚成体来源于陕西省太白县秦岭细鳞鲑人工繁育试验基地 (陕西省秦岭细鳞鲑原种场)，是2021年4月对2016年繁育的子一代亲本催产孵化所得。驯养期间每日投喂2次 (06:00、18:00) 人工配合饲料 (质量分数：粗蛋白≥40%，粗脂肪≥12%，粗纤维≤5%，粗灰分≤14%，水分≤10%，赖氨酸≥2.4%，总磷≥0.9%)；野生群体 (WBt) 亚成体来自陕西太白湑水河珍稀水生生物国家级自然保护区(以溪流中小鱼、虾等为食)，暂养于亲本池1周 (期间以投喂活饵料黄粉虫为主)。实验时随机选取Bt [体长 (15.40±0.82) cm，体质量 (51.50±11.90) g，n=6]和WBt [体长 (18.17±2.57) cm，体质量 (85.68±34.85) g，n=6]。水质参数用YSI ProPlus多参数水质仪测定，水温为 (13.66±1.89) ℃，pH为7.08±0.16，溶解氧质量浓度为 (7.56±0.83) mg·L −1。
用75% (φ) 乙醇对鱼体进行全面消毒后，置于无菌条件下采集样品。具体操作包括：1) 采集每尾鱼的肠道组织样本 (n=6)于4% (φ) 多聚甲醛中固定，4 ℃保存，用于组织结构观察；2) 采集肠道内容物 (生理盐水冲出后收集)，置于液氮中保存，用于菌群多样性检测；3) 采集前肠和后肠置于液氮中保存，用于肠道组织消化酶、丙二醛含量及抗氧化酶活性检测。生化分析和菌群多样性每2个样本混为1管，每组3个重复。
1.2 苏木素-伊红染色切片
对样本进行逐级脱水、石蜡包埋处理并切片，通过二甲苯脱蜡，苏木素-伊红 (HE) 染色，待风干后封片，用光学显微镜 (Nikon 80i) 观察。使用ImageJ软件测量肠道肌层厚度、绒毛高度及宽度，各项分别重复计数90次。
1.3 生化分析
准确称取肠道样本0.1~0.2 g，按质量 (g)∶体积 (mL) =1∶10加入预冷生理盐水，高速研磨仪处理，2 500 r·min−1离心10 min，取上清测定。选取总蛋白酶、胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶为消化酶标志物；丙二醛为抗氧化物质的标志物，超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶为抗氧化防御系统的标志物。采用南京建成生物公司试剂盒中的考马斯亮蓝法 (试剂盒型号：A045-2-1) 检测总蛋白浓度，紫外比色法 (试剂盒型号：A080-2) 检测胰蛋白酶活性，比色法 (试剂盒型号：A054-1-1) 检测脂肪酶活性，淀粉-碘比色法 (试剂盒型号：C016-1-1) 检测淀粉酶活性，硫代巴比妥酸法 (试剂盒型号：A003-1-1) 检测丙二醛含量，比色法 (试剂盒型号：A084-1-1) 检测过氧化氢酶活性，比色法 (试剂盒型号：A005-1-2) 检测谷胱甘肽过氧化物酶活性，WST-1法 (试剂盒型号：A001-3-2) 检测超氧化物歧化酶活性，用752N紫外分光光度计 (上海仪电分析仪器有限公司) 测定吸光度。
1.4 16S rRNA高通量测序
实验样本用干冰保存运输至上海美吉生物公司进行16S rRNA高通量测序，用Mag-Bind® Stool DNA 试剂盒 (Omega，美国) 提取DNA，NanoDrop 2000测定DNA浓度和纯度，1% (w) 琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，基于Illumina MiSeq测序平台扩增16S rRNA，扩增引物为338F：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG；806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT；采用Pro Taq，20 μL反应体系，扩增后的样品用Illumina Hiseq 3000平台 (PE300) 测序。根据引物Barcode序列，从下机数据中拆分出各样品测序数据，通过Flash 1.2.11及Qiime 1.9.1软件对数据进行过滤、拼接，并利用Fastp 0.19.6对其进行质控，通过Mothur 1.30.2进行Alpha多样性分析，用Uparse11对所有样品序列进行可操作分类单元 (Operational Taxonomic Units, OTU) 聚类，物种的注释基于SILVA数据库的RDP classifier。基于OTU进行多种多样性指数分析；基于OTU聚类分析结果对OTU进行指数分析，以及测序深度检测；基于分类学信息，在各个分类水平上进行群落结构的统计分析。
1.5 数据处理与分析
实验数据均以“平均值±标准差 ($\bar x $±s)”表示，使用SPSS 26.0软件进行群体间单因子方差分析 (One-way ANOVA)，通过独立样本t检验进行群体间分析，显著性水平α为0.05。
2. 结果
2.1 子二代与野生群体肠道组织结构特征
组织学显微观测结果显示，Bt和WBt肠道组织结构均由黏膜层、黏膜下层、肌层和浆膜4层构成，且均具有肠腺结构 (图1)。
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图 1 秦岭细鳞鲑子二代和野生群体肠道组织结构 (200×)注：a. 子二代群体 (Bt)；b. 野生群体 (WBt)。Figure 1. Intestinal tissue structure of second filial generation population and wild population of B. tsinlingensis Li, 1966 (200×)Note: a. Second filial generation population (Bt); b. Wild population (WBt).Bt和WBt中，肠道绒毛高度分别为 (339.35±93.45)和 (405.46±19.47) μm (p>0.05)，绒毛宽度分别为 (81.86±8.77) 和(101.54±9.33) μm (p>0.05)，肠道肌层厚度分别为 (133.19±19.12) 和(207.80±28.94) μm (p<0.05，图2)。
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图 2 秦岭细鳞鲑子二代和野生群体肠道绒毛高度、宽度及肌层厚度分析注：“*”表示子二代和野生群体肌层厚度存在显著性差异 (p<0.05)。Figure 2. Analysis of intestinal villus height, width and muscle layer thickness of second filial generation population and wild population of B. tsinlingensis Li, 1966Note: "*" represents a significant difference in muscle thickness between Bt and WBt (p<0.05).2.2 子二代和野生群体肠道消化酶活性比较
消化酶活性检测结果显示，WBt总蛋白浓度、淀粉酶和脂肪酶活性均高于Bt，但未达到显著性水平 (p>0.05)；而胰蛋白酶活性Bt [(8 827.63±1 388.95) U·mg−1]高于WBt [(4 042.31±3 357.46) U·mg−1] (p>0.05) (图3)。
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图 3 秦岭细鳞鲑子二代和野生群体肠道消化酶、抗氧化酶活性及丙二醛含量注：“*”表示子二代和野生群体超氧化物歧化酶活性存在显著性差异 (p<0.05)。Figure 3. Intestinal digestive enzyme activity, antioxidant enzymes and malondialdehyde of between second filial generation population and wild population of B. tsinlingensis Li, 1966Note: "*" represents a significant difference in superoxide dismutase activities between Bt and WBt (p<0.05).2.3 子二代和野生群体肠道丙二醛含量及抗氧化酶活性比较
WBt和Bt肠道中的丙二醛含量、过氧化氢酶活性及谷胱甘肽过氧化物酶活性等指标的差异不显著(p>0.05)；而Bt超氧化物歧化酶活性 [(213.45±10.70) U·mg−1] 显著高于WBt [(149.86±33.20) U·mg−1] (p<0.05) (图3)。
2.4 子二代和野生群体肠道菌群多样性特征
2.4.1 16S rRNA基因测序结果分析
运用Usearch进行聚类划分OTU。如图4-a 所示，Shannon指数反映样品中菌群多样性指数，随着序列数量的增加，Shannon指数趋于平缓，表明样本测序数据量足够，且能反映各样本不同测序数量时的微生物多样性。图4-b中，Coverage指数用于评估抽样的完整性，反映测序的深度，指数越接近于1，表示本研究测序深度基本覆盖样品中所有物种。
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图 4 秦岭细鳞鲑子二代和野生群体肠道菌群Shannon曲线和 Coverage曲线Figure 4. Shannon curves and Coverage curves of intestinal flora of second filial generation population and wild population of B. tsinlingensis Li, 19662.4.2 肠道微生物Alpha多样性
Alpha多样性反映了物种丰富度和均匀度 (表1)，肠道微生物的 Chao、Shannon、Simpson和Coverage指数表明Bt和WBt肠道菌群的相似度高，且无显著性差异 (p>0.05)。
表 1 秦岭细鳞鲑子二代和野生群体肠道微生物多样性指数Table 1. Intestinal microbial diversity index of second filial generation population and wild population of B. tsinlingensis Li, 1966样本
SampleAlpha多样性指数
Alpha diversity indexChao Shannon Simpson Coverage 子二代群体 Bt 477.32±399.40 2.28±1.15 0.27±0.13 0.99±0.00 野生群体 WBt 1 192.90±511.56 3.58±1.72 0.19±0.25 0.99±0.00 2.4.3 肠道微生物Beta多样性
如图5所示，秦岭细鳞鲑同群体中各样本聚集，不同样本间Beta多样性明显区分。基于Unweighted_UniFrac和Weighted_UniFrac分析，两群体间均无显著性差异 (p>0.05)。
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图 5 秦岭细鳞鲑子二代和野生群体肠道微生物PCoA分析注：a. 基于Unweighted_UniFrac结果；b. 基于Weighted_UniFrac结果。Figure 5. Intestinal microbial PCoA analysis of second filial generation population and wild population of B. tsinlingensis Li, 1966Note: a. Based on unweighted_UniFrac results; b. Based on Weighted_UniFrac results.2.4.4 子二代和野生群体肠道微生物组成和相对丰度分析
Bt和WBt肠道内共检测出2 356个OTUs，其中Bt特有的OTUs为353个，占比为15%；WBt特有的OTUs为1 359个，占比为58%；两者共有的OTUs为644个，占比为27% (图6)。
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图 6 秦岭细鳞鲑子二代和野生群体肠道菌群OTU数量对比维恩图Figure 6. Comparison of OTU numbers in intestinal flora by Venn diagram between second filial generation and wild population of B. tsinlingensis Li, 1966从分类水平上对Bt和WBt肠道菌群相对丰度进行分析。结果显示，在门水平上，Bt和WBt的菌群组成均以变形菌门和厚壁菌门为主。在纲水平上，Bt的优势菌为γ变形菌纲 (33.69%)、α变形菌纲 (23.26%)、芽孢杆菌纲 (16.6%) 和梭菌纲 (16.38%)，WBt的优势菌为γ变形菌纲 (29.8%)、α变形菌纲 (20.65%)、芽孢杆菌纲 (20.54%) 和放线菌纲 (12.51%)；Bt优势菌梭菌纲丰度高于WBt，WBt优势菌放线菌纲丰度高于Bt。在目和科水平上，Bt检出产气单胞菌，而WBt未检出。在属水平上，Bt检出产气单胞菌属 (Aeromonas)，WBt则检出哈夫尼亚菌科肥杆菌属 (Hafnia-Obesumbacterium)；其中Bt的优势菌属为产气单胞菌属、狭义梭菌属_18 (Clostridium_sensu_stricto_18) 和鞘氨醇单胞菌属 (Novosphingobium)，WBt优势菌属为耶尔森氏菌属 (Yersinia) 和ZOR0006。在种水平上，Bt检出芽孢杆菌 (Bacillus anthracis_g_Bacilus) 和鲁氏不动杆菌 (Acinetobacter lwoffii)，WBt检出蜂房哈夫尼菌 (Hafnia alver) (图7)。
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图 7 秦岭细鳞鲑子二代和野生群体肠道菌群在门、纲、目、科、属、种水平上的相对丰度Figure 7. Relative abundance of gut microbiota in second filial generation population and wild population of B. tsinlingensis Li, 1966 on Phylum, Class, Order, Family, Genus and Species levels使用BugBase分析细菌表型，从而预测不同群体间肠道微生物种群的功能和表型差异性。本研究中，BugBase将细菌表型分为7类，包括革兰氏阴性、好氧、革兰氏阳性、移动元件、潜在致病性、厌氧和兼性厌氧。其中，Bt中的革兰氏阴性、好氧、移动元件、潜在致病性和兼性厌氧菌的相对丰度高于WBt，而WBt中的革兰氏阳性和厌氧菌的相对丰度高于Bt，但这些差异均未达到显著性水平 (p>0.05) (图8)。
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图 8 秦岭细鳞鲑子二代和野生群体肠道菌群表型预测Figure 8. Phenotypic prediction of gut microbiota in second filial generation population and wild population of B. tsinlingensis Li, 19663. 讨论
3.1 子二代和野生群体肠道组织结构特征
肠道是消化吸收的重要场所，且在鱼类的营养摄取、免疫调节、病原菌抑制等方面发挥着重要功能[32]。本研究显示，Bt和WBt肠道均由黏膜层、黏膜下层、肌层和外膜4层结构组成，与大西洋鲑 (Salmo salar)[33-34]、球状濑鱼 (Ballan wrasse)[35]、石斑鱼 (Totoaba macdonaldi)[36]等肠道结构一致。有研究表明肠腺组织能增大肠道吸收面积，促进营养物质吸收[19]，而本研究中Bt和WBt的肠道组织中均有肠腺结构，与Xiong等[14]、卿素珠等[27]的研究结果不同，与左愈臻等[37]的研究结果相似，这可能是秦岭细鳞鲑长期适应贫营养环境的进化特征。此外，肠道绒毛高度或上皮厚度等组织参数是鱼类肠道健康状况的指标[38]，本研究中2个群体的肠道绒毛高度、宽度均无差异，但WBt肠道肌层厚度显著高于Bt，这可能与Bt长期投喂人工饲料，从肉食性鱼类经人工驯养发生了适应性转变，而WBt的食物一直以水生动物及活饵料等为主，食性未发生转化有关。研究发现，鳜 (Siniperca chuatsi)活饵料组的肠壁厚度大于人工饲料组[39]，且肠道肌层厚度有利于增强蠕动能力[40-41]，进而利于摄食消化效率提升，这说明肉食性鱼类肠道组织和结构变化与食饵类型紧密相关。
3.2 子二代和野生群体肠道消化酶活性
消化酶活性对饲料利用率和生长性能有潜在影响[4]，能反映水生动物消化生理的基本特征[42]。Jiao等[43]研究发现肉食性鱼类肠道酶活性高于其他食性鱼类。秦岭细鳞鲑为典型的肉食性鱼类，在人工繁育过程中，Bt在育苗阶段初期投喂丰年虫和水蚯蚓，后以人工配合饲料驯食；野生群体则以溪流中的水生生物及黄粉虫为食，推测摄食对象是导致两者酶活性差异的主要原因。此外，淀粉酶能促进淀粉分解，脂肪酶有利于脂质分解，胰蛋白酶可作用于部分蛋白类物质分解[44]。本研究中Bt肠道总蛋白浓度、淀粉酶和脂肪酶活性低于WBt，而胰蛋白酶活性相反。从酶活性的角度分析，WBt对食物的消化吸收能力优于Bt，说明在秦岭细鳞鲑养殖过程中过早转食或长期投喂人工饲料会降低其肠道的消化吸收能力，这直接体现在消化酶的单一性增强而整体活性下降上。
3.3 子二代和野生群体肠道丙二醛含量及抗氧化酶活性
氧化应激是自由基的产生和清除不平衡引起的，这种不平衡通常会导致细胞和器官受损，鱼类健康状况不佳[45]。丙二醛含量是氧化应激程度的重要指标，而谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶本质上属于第一线防御抗氧化剂，其功效和作用对于整个抗氧化剂防御方法至关重要[6,46]。本研究发现，WBt肠道中的丙二醛含量较高，且其超氧化物歧化酶活性显著低于Bt。有研究表明，丙二醛含量升高时，鱼体受到氧化应激损伤[47]。由此可见，WBt的氧化应激损伤比Bt严重，这揭示WBt在人工驯养环境下会使其应激增强并因此受到损伤，但所产生的相关应激机制仍需进一步探究。
3.4 子二代和野生群体肠道菌群分析
肠道微生物群由内源和外源两部分组成，内源微生物群在维持机体黏膜免疫、抵抗感染、维持机体能量平衡和营养供给等方面起重要作用[48]。一般而言，淡水鱼类的肠道菌群以拟杆菌门、蓝藻门、厚壁菌门和变形菌门为优势菌群[49]，而海洋鱼类如大西洋鲑的优势菌群则为变形菌门、厚壁菌门、梭菌门和放线菌门[50]；海洋草食性哺乳动物的肠道菌群以变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和梭菌门、蓝藻门为主[51]；与之相比，本研究秦岭细鳞鲑的优势菌类型更少且较为单一。黄曼曼等[28]研究显示肠道菌群有变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门和放线菌门；Ma等[29]研究发现肠道菌群有厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门、蓝藻门、绿杆菌门和放线菌门，而本研究Bt和WBt在门水平上有变形菌门、厚壁菌门、放线菌门、蓝藻门和拟杆菌门，两者菌群占比差异明显。需要强调的是，WBt除放线菌门和拟杆菌门的相对丰度低于Bt外，其他菌群的相对丰度均高于Bt，这可能是由于人工驯养环境和摄食饵料等双重因素的影响，导致肠道菌群在类型和相对丰度上发生了变化。
有研究表明，芽孢杆菌可以改善肠道菌群紊乱问题[52]，放线菌属于纤维素降解菌[53]，嗜热菌与低温下幼苗越冬过程有关[54]，而拟杆菌作为肠道共生体，对病原体提供保护，为肠道其他微生物提供营养[55-57]。本研究中菌在纲水平上，WBt中除芽孢杆菌纲、放线菌纲、拟杆菌纲和嗜热油菌纲的相对丰度低于Bt外，其他菌的相对丰度均高于Bt，表明WBt的肠道消化吸收能力更强，健康状态更好。Bt的优势菌属为产气单胞菌属、狭义梭菌属_18和鞘氨醇单胞菌属，其中产气单胞菌会引发肠炎[58]；梭杆菌具有降解多糖和蛋白质、缓解肠道炎症以及增强对致病菌的抵抗力等作用，有助于维持肠道内稳态[59]；鞘氨醇单胞菌的碳代谢为机体次级代谢产物合成提供关键中间产物、能量和还原力等，而氮代谢为细胞生长提供营养成分和组成成分[60]。WBt的优势菌属为耶尔森氏菌属和ZOR0006，耶尔森氏菌是冷水性鲑科鱼类的常见致病菌，可导致鲑鳟鱼肠炎红嘴病[61]。Bt在种水平上检出芽孢杆菌和鲁氏不动杆菌，而不动杆菌的增加会引发肠内分泌细胞的形态改变和营养不敏感状态，从而导致代谢性疾病发生[62]；WBt在种水平上检出蜂房哈夫尼菌，其是一种条件致病菌，易感染虹鳟等鲑鳟鱼类，产生体表出血及炎症反应[63]。上述结果表明， WBt虽对环境应激有较强的耐受性，但其炎症致病率较高。此外，通过BugBase微生物表型预测发现，Bt和WBt的革兰氏阴性菌相对丰度最高，而Bt的革兰氏阴性菌的相对丰度大于WBt；且Bt潜在致病性菌占比高于WBt。由此可知，Bt肠道菌群整体稳定性较差，证实其致病风险较高，但WBt在生长发育速度和摄食能力等方面却有明显优势，这与长期人工繁育和资源养护的观测结果相似，尤其是在早期生活史阶段更为突出。
Alpha多样性和Beta多样性是评估群落结构的重要参数[64-65]。本研究中Alpha多样性分别用Chao、Shannon、Simpson和Coverage指数来判定，在Coverage指数被测出的菌群概率一致情况下，WBt特有的OTUs数量多于Bt。综合分析表明Bt在物种丰富度及群落多样性上均低于WBt，而不同群体和驯养方式下Bt和WBt被分为2个亚群，但Beta多样性判定不同群体间肠道微生物无明显差异，表明肠道微生物的物种分割程度较低。Kononova等[66]研究发现鱼类栖息地环境的改变会引起其肠道核心微生物群的变化，通常野生群体的栖息环境较养殖环境复杂多样，会直接影响其肠道菌群的多样性和丰度，本研究结果也证实了自然栖息环境利于秦岭细鳞鲑的生长发育，并且有助于提升其亚成体的抗应激能力。
4. 结论
综上所述，秦岭细鳞鲑子二代和野生群体消化系统具有明显差异，其中野生群体的肠道肌层厚度，肠道消化和吸收能力以及显著菌群丰度均高于子二代群体，但其肠道抗氧化能力弱于子二代群体，推测由两者所处生境及生存方式不同所致，主要体现在自然环境摄食活饵料及生境空间阈等均宽于人工养殖环境。因此，现阶段秦岭细鳞鲑更宜结合仿生态环境进行规模化繁育，有利于促进秦岭细鳞鲑高质量繁育，并提高资源养护效率。
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图 1 多糖质量浓度、过氧化氢体积分数、温度、时间对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼清除率的影响
a—e字母相同表示不同条件下差异不显著 (P>0.05)，不同则表示差异显著 (P<0.05)
Figure 1. Effect of polysaccharide concentration, hydrogen peroxide volume fraction, temperature and time on DPPH scavenging rate
a–e indicate insignificant difference under different conditions (P>0.05), while different letters indicate significant difference (P<0.05).
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图 2 坛紫菜多糖和降解后多糖、维生素C对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基的清除效果的影响
Figure 2. Effects of PP, LPP and Vc on DPPH scavenging rate
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图 5 标准单糖及坛紫菜多糖和降解后多糖的液相色谱图
左起依次为古洛糖醛酸、甘露糖醛酸、甘露糖、核糖、鼠李糖、氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、氨基半乳糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、L-岩藻糖
Figure 5. HPLC of standard monosaccharides, PP and LPP
Mixture of standard monosaccharides, including guluronic acid, mannituronic acid, mannose, ribose, rhamnose, glucosamine, glucuronic acid, galacturonic acid, glucose, galactosamine, galactose, xylose, arabinose, L-fucose (from left to right)
表 1 单因素试验因素及水平表
Table 1 Single factor design for the experiment
因素
Factor水平
Level多糖质量浓度
Concentration of polysaccharide/(mg·mL−1)2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 过氧化氢体积比 Volume ratio/(mL·mL−1) 4%、6%、8%、10%、12% 反应温度 Reaction temperature/℃ 35、45、55、65、75 反应时间 Reaction time/h 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 
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表 2 正交试验因素及水平表
Table 2 Factors and levels used in orthogonal experiment
水平 Level 1 2 3 因素
Factor(A) 多糖浓度
Concentration of polysaccharide/(mg·mL−1)2.5 5.0 7.5 (B) 反应温度
Reaction temperature/℃55 65 75 (C) 过氧化氢体积比
Volume ratio/(mL·mL−1)6% 8% 10% (D) 反应时间
Reaction time/h1.5 2.0 2.5
下载: 导出CSV
表 3 3种降解方法的抗氧化作用和降解能力
Table 3 Antioxidant activity and degradation capacity of the three degradation methods
降解方法
Degradation method对DPPH清除率
DPPH scavenging rate/%得率
Yield/%GPC保留时间
Retention time/min分子量Mp
Molecular mass/D超声波法 Ultrasonic method 28.21±0.63b 86.08±4.13a 14.93 >670 000 过氧化氢法 Hydrogen peroxide method 30.05±0.36b 75.92±2.37b 14.97 602 661 超声波辅助过氧化氢法
Ultrasonic assisted hydrogen peroxide method48.56±1.51a 65.04±2.56c 15.20 402 065 注：同列不同上标字母表示组间差异性显著 (P<0.05)，表 6同此 Note: Different superscript letters in the same column indicated significant difference between groups (P<0.05); the same case in Tables 6
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表 4 正交试验设计及结果
Table 4 Orthogonal array design and results
序号
No.因素
FactorDPPH清除率
DPPH scavenging rate/%A B C D 1 1 1 1 1 39.45±1.20 2 1 2 2 2 56.27±0.09 3 1 3 3 3 55.54±0.09 4 2 1 2 3 47.25±0.77 5 2 2 3 1 47.10±0.56 6 2 3 1 2 57.18±0.69 7 3 1 3 2 39.20±1.41 8 3 2 1 3 55.35±0.77 9 3 3 2 1 53.90±0.98 K1 50.420 41.967 50.663 46.817 K2 50.513 52.907 52.473 50.886 K3 49.483 55.542 47.280 52.713 R 1.030 13.575 5.193 5.896
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表 5 方差分析结果
Table 5 Results of variance analysis
因素
FactorⅢ型平方和
SS自由度
df均方
MSF 显著性
SignificanceA 3.577 2 1.945 2.715 * B 129.682 2 310.934 433.895 ** C 25.342 2 41.698 58.188 ** D 48.491 2 54.665 76.282 ** 误差 Error 6.45 9 注：*. 显著性相关 (P<0.05)；**. 极显著性相关 (P<0.01) Note: *. significant at 0.05 level (P<0.05); **. very significant at 0.01 level (P<0.01)
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表 6 不同降解程度坛紫菜多糖的理化性质
Table 6 Physicochemical properties of polysaccharides in P. haitanensis at different degradation levels
样品
Sample蛋白质
Protein/%硫酸基
Sulfate-group/%3,6-内醚半乳糖
3,6-anhydrogalactose/%相对黏度
Relative viscosity分子量Mp
Molecular mass/D降解前多糖 PP 6.96±0.36a 11.25±0.89c 12.41±0.59a 5.86±0.31a >670 000 降解1.5 h多糖 LPP1 5.73±0.34b 12.24±1.11c 9.72±0.67b 4.82±0.15b 399 894 降解2.0 h多糖 LPP2 4.03±0.24c 14.32±0.96b 8.78±0.59b 3.67±0.09c 237 113 降解2.5 h多糖 LPP3 3.23±0.89c 17.51±0.28a 6.82±0.09c 3.56±0.13c 235 835
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