Construction of knock-out mutant of vhh in Vibrio harveyi and its related biological characteristics analysis
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摘要:
哈维弧菌 (Vibrio harveyi) 是水生动物的重要病原，为研究哈维弧菌溶血素基因vhh缺失后对其生物学特性的影响，该研究利用同源重组技术构建了V. harveyi 345的vhh基因缺失突变株，并比较了野生株和突变株的生物学特性变化。结果显示，vhh基因的缺失不影响菌株的生长、胞外蛋白酶分泌、过氧化氢(H2O2)和铜离子(Cu2+)的压力感应、铁的吸收利用、15种抗生素抗性和生物膜形成等生物学特性，但会导致菌株游动和涌动显著增强；另发现，vhh基因虽然在野生菌株内高表达，对绵羊红细胞却未表现出溶血活性。结果表明该基因负调控着菌株的运动能力。该研究为认识哈维弧菌vhh基因功能研究提供新的资料。
Abstract:Vibrio harveyi is an important pathogen of aquatic animals. In order to study the biological characteristics of the strain after the absence of hemolysin gene vhh, the knock-out mutant of vhh in V. harveyi was constructed by homologous recombination technique. Moreover, the biological characteristics of the wild type strain and the mutant strain were compared. The results show that the deletion of vhh gene did not affect the growth of the strain, neither the secretion of extracellular protease, the stress response to H2O2 and Cu2+, the uptake and utilization of iron, and the 15 antibiotics resistance and biofilm formation, but it caused the strain to swim and surge significantly. In addition, although vhh was highly expressed in the wild type strain, the strain did not show hemolytic activity. The results indicate that vhh negatively regulates the bacterial motility. The study provides novel information for understanding the function of vhh gene in V. harveyi.
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哈维弧菌 (Vibrio harveyi) 呈短杆状，为革兰氏阴性菌，能够感染无脊椎动物[1]、脊椎动物以及人类[2]。它是海水养殖动物的常见致病菌，曾引起点带石斑鱼 (Epinephelus coioides)[3]、中国花鲈 (Lateolabrax maculatus)[4]等多种鱼类大量死亡，造成巨大经济损失[5]。哈维弧菌黏附在宿主表面后会产生生物膜，在多种毒力因子参与下入侵到宿主体内，引起发病[6]。目前发现，哈维弧菌的毒力因子包括细胞外产物、膜蛋白、生物膜、黏附素及多种分泌系统等[7]。
溶血素 (Hemolysin) 是细菌的一种重要毒力因子，其能溶解宿主红细胞膜，导致红细胞内容物溢出，引起溶血现象，在感染过程中发挥重要作用[8]。弧菌溶血素主要包括热稳定性直接溶血素 (Tdh)、热稳定性溶血素 (δ-Vph)、热不稳定性溶血素 (Tlh) 和E1 Tor溶血素 (HlyA)[9]。哈维弧菌溶血素 (Vhh) 是Tlh家族的成员[10]，它是一种单体蛋白，分子量约为44.3 kD[11]，具有溶血磷脂酶活性[12]。Vhh的氨基酸序列与副溶血弧菌 (V. parahemolyticus)Tlh溶血素[13]、创伤弧菌 (V. vulnificus) 磷脂酶VpL (Genbank AF291424)、拟态弧菌 (V. mimicus) 卵磷脂酶(pHL)[14]和霍乱弧菌 (V. cholerae) 卵磷脂酶(Lec)[15]的序列相似性分别为85.6%、75.6%、65.3%和64.3%。
国内外学者对Vhh做了相关的功能研究，Bai等[11]纯化了Vhh蛋白，研究其对牙鲆 (Paralichthys olivaceus) 鳃细胞和红细胞的影响；Zhong等[12]通过大肠杆菌 (Escherichia coli) 表达Vhh，研究了不同温度和pH对其溶血活性、磷脂酶活性、细胞毒性及对鱼体致病性的影响。上述研究集中在体外活性检测，仍缺乏对vhh基因在菌体内作用机制的认识。本研究通过同源重组方法构建哈维弧菌vhh基因缺失突变株，并分析缺失株相关的生物学特性，为进一步了解vhh的基因功能提供基础资料。
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株、质粒和引物
哈维弧菌V. harveyi 345、自杀质粒pSW7848[16]、大肠杆菌E. coli Π3813[17]以及大肠杆菌E. coli GEB883[18]保存于本实验室；本研究所用菌株和质粒见表1，引物见表2。
表 1 本研究所用菌株和质粒Table 1. Strains and plasmids used in this study菌株、质粒
Strain, plasmid相关特征
Relevant characteristics来源
Source菌株 Strain V. harveyi 345 分离自中国南部沿海患病石斑鱼肾脏 NCBI database CP025537.1-CP025540.1 V. harveyi 345-Δvhh V. harveyi 345缺失vhh基因 本文构建 E. coli Π3813 lacIQ，thi1，supE44，endA1，recA1，hsdR17，gyrA462，zei298::Tn10[Tc]，ΔthyA::erm-pir116；自杀质粒pSW7848的中间宿主； 文献[17] E. coli GEB883 大肠杆菌野生株K12 ΔdapA::ermpir RP4-2 ΔrecAgyrA462，zei298::Tn10；接合作用供体菌 文献[18] 质粒 Plasmid pSW7848 氯霉素抗性；自杀质粒，R6K起点，复制需要Pir蛋白，具ccdB毒性基因 文献[16] pSW7848-Δvhh 氯霉素抗性；包括vhh的上下游同源臂 本文构建 表 2 本研究所用引物Table 2. Primers used in this study引物
Primer序列 (5'–3')
Sequence用途
ApplicationpSW7848-F GTCTGATTCGTTACCAATTATGACAAC 扩增pSW7848片段 pSW7848-R GAATTCGATATCAAGCTTATCGATAC vhh-UP-F aagcttgatatcgaattcTACCGTGAGCGTTGTTATTAC 扩增vhh上游片段 vhh-UP-R ctctggatGATTCACTCTCTGTGATGATTATC vhh-DOWN-F gagtgaatcATCCAGAGCAACACGGTTTTG 扩增vhh下游片段 vhh-DOWN-R ttggtaacgaatcagacAAGATTGATGTTTTCTATTGAGACACAAAAG Del-check-pSW7848-F TCACTGTCCCTTATTCGCACC 验证pSW7848重组质粒是否构建成功 Del-check-pSW7848-R CTGCTTTTGAGCACTACCCG Δvhh-check-F TTGAAAGTTGAACGCGGTAC 检验vhh基因是否敲除成功 Δvhh-check-R GAGGTATGTCTTGAGAGGTCAA gyrA-354-F AGGTGTTCGCGGTATGAAGC 荧光定量管家基因gyrA扩增 gyrA-354-R CGTTGGGTATTCCGCTAGTTC uvrA-354-F ATCGTGGTGACATTCGCGTT 荧光定量管家基因uvrA扩增 uvrA-354-R TCGCAAGCTCTTCACGTACC recA-354-F TGCACGTTCTGGTGCTATTG 荧光定量管家基因recA扩增 recA-354-R AGCTTACGCATCGCTTGAGA k14645-354-F ATAACGCCTTTGATGCCTTCC 荧光定量vhh上游基因k14645扩增 k14645-354-R AACGATCTGAGTGGTAACCGAGT vhh-F CACTTATGTCCGCTGCTGGTAC 荧光定量vhh基因扩增 vhh-R CTTGAAAGAAACCGAACTCCAC na-F CAGAAATCACTAAGCGAGCGACAT 荧光定量vhh下游基因na扩增 na-R GTGCGTTTAACTCATCCAACAAGG 1.1.2 主要试剂
大肠杆菌E.coli Π3813生长所需的2'-Deoxythymidine (Thy) 以及用于铁离子吸收测试的2-2'-联吡啶 (2,2'-Dipyridyl，DIP)，购自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；反转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) 和荧光定量反应试剂盒TB GreenTM Premix Ex TaqTM Π (Tli RNaseH Plus)，购自TaKaRa Bio Ine (日本)；抗生素纸片，购自杭州天和微生物试剂有限公司；PBS缓冲液，购自赛默飞世尔 (苏州) 仪器有限公司；脱纤维棉羊红细胞，购自北京索莱宝科技有限公司。
1.1.3 主要培养基
LB (Luria-bertani) 培养基购自广东环凯生物科技有限公司。1 L LB含胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠 (NaCl) 10 g。1 L固体培养基含琼脂15 g。在LB培养基基础上将NaCl质量浓度提高到30 g·L−1即配制得到LBS (Luria-bertani-salt) 培养基。
1.2 方法
1.2.1 vhh基因序列分析
将本实验室V. harveyi 345基因组测序获得的vhh基因 (CU052_24955)ORF序列[19]进行BLAST分析，选取其在不同细菌中的同源序列进行多序列比对，并用MEGA 7.0软件采用NJ邻接法构建系统进化树。
1.2.2 vhh缺失株的构建
构建vhh缺失株参考Deng等[20]的方法并进行了相关修改，vhh的序列在NCBI数据库下载 (登陆号CU052_24955)，扩增线性化自杀质粒pSW7848使用引物对pSW7848-F/R，扩增上下游同源臂片段使用引物对vhh-UP-F/R和vhh-DOWN-F/R，等温组装线性化质粒片段和上下游同源臂片段，对重组自杀质粒进行PCR和测序检测使用引物对Del-check-pSW7848-F/R，组装成功的质粒大小约为5.3 kb，将其命名为pSW7848-Δvhh。然后重组自杀质粒pSW7848-Δvhh通过接合作用将供体菌大肠杆菌GEB883-pSW7848-Δvhh送入到受体菌哈维弧菌野生株V. harveyi 345。基于自杀质粒pSW7848在哈维弧菌中不能复制，具有氯霉素抗性，毒性基因ccdB能够在受阿拉伯糖诱导后表达的特点，使用氯霉素筛选后，重组质粒和哈维弧菌基因组上的vhh上下游同源臂的相同片段发生第一次同源重组；使用阿拉伯糖进行第二次筛选，其发生第二次同源重组，最终获得vhh缺失株，将其命名为V. harveyi 345-Δvhh。重组自杀质粒构建和同源重组筛选缺失突变株流程见图1。
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图 1 重组自杀质粒构建和缺失突变株筛选流程AU. 上游；AD. 下游Figure 1. Recombinant suicide plasmid construction and deletion mutant screening processAU. Up stream；AD. Down stream1.2.3 vhh基因及其上下游基因转录水平分析
挑取野生株V. harveyi 345和突变株V. harveyi 345-Δvhh于28 ℃、200 r·min–1振摇培养16 h过夜，稀释至OD600为0.01，培养至对数早期 (OD600=0.5)。RNAiso Plus裂解细菌，提取总RNA，并将其进行反转录。利用SYBR Premix Ex TaqTM Π进行荧光定量PCR扩增，特异性引物 (表2) 分别检测vhh上游丝氨酸蛋白酶基因K14645、溶血素基因vhh和vhh下游未知功能基因na的表达水平，3个管家基因 (recA、uvrA和gyrA) 作为内参。对每个单菌落进行3次技术重复，通过2−ΔΔCT方法[21]分析各基因的相对表达量。
1.2.4 菌株生长测试
将V. harveyi 345和缺失突变株V. harveyi 345-Δvhh的单克隆分别接种至LBS液体培养基，于28 ℃、200 r·min–1振摇培养16 h过夜，稀释1 000倍于无菌锥形瓶中，在相同条件下培养，利用分光光度计 (BIO-RADSmart-SpecTM Plus) 测定不同时间点下细菌的OD600，绘制生长曲线。
1.2.5 对绵羊红细胞的溶血活性测定
同1.2.4过夜培养菌液，1 500 r·min–1离心5 min，弃上清。加PBS洗涤，离心后弃上清，重复两次。用PBS配置成4%绵羊红细胞悬液。参照Takahiro等[22]方法稍作改变，将过夜培养的V. harveyi 345和V. harveyi 345-Δvhh用PBS洗涤并调到吸光度OD600为3.0。取50 μL菌液加入到500 μL 4%脱纤维棉羊红细胞中，混匀后放置28 ℃孵育5 h。然后12 000 r·min−1离心1 min，取200 μL上清液测OD600，分别加入PBS和ddH2O作为阴性和阳性对照，溶血活性以样品相对于阳性对照OD600比值表示。
1.2.6 游动性和涌动性测试
同1.2.4过夜培养菌液，用LBS培养基将其调整到吸光度OD600为3.0，取3 μL点样到含0.3%琼脂和1.5%琼脂的LBS平板上测试其游动性及涌动性，进行3次技术重复，放置28 ℃分别培养16 h和24 h，记录菌斑直径。
1.2.7 胞外蛋白酶分泌测试
同1.2.4过夜培养菌液，同1.2.6调整培养液吸光度，取3 μL点样到LBS平板 (含1.5%脱脂奶粉) 上，进行3次技术重复，放置28 ℃培养24 h，测量菌落直径以及蛋白质透明分解圈直径，蛋白质透明分解圈直径与菌落直径的比值表示蛋白酶的分泌能力。
1.2.8 对过氧化氢(H2O2)、铜离子(Cu2+)抗性及对铁离子的吸收测试
参照Deng等[23-24]的方法，稍作改变，同1.2.4过夜培养菌液，同1.2.6调整培养液吸光度，用LBS培养基将其稀释到最高倍数108，取3 μL点样到3种LBS平板 [分别含有0.000 2% H2O2、0.2 mmol·L–1 硫酸铜(CuSO4)和120 μmol·L–1 DIP] 上，不含添加剂的LBS平板作为对照，放置28 ℃培养24 h。查看各平板上的菌株生长情况。
1.2.9 抗生素的敏感性测试
同1.2.4过夜培养菌液，取600 μL于10 mL 0.9%生理盐水中，全部倾入平板中润湿培养基表面，弃去菌液，静置10 min，将各抗生素纸片置于晾干的平板上，放置28 ℃培养24 h，记录抑菌圈直径。
1.2.10 生物膜测试
同1.2.4过夜培养菌液，同1.2.6调整培养液吸光度，生物膜测试参考顾丹[25]的方法，取50 μL菌液接种到装有5 mL的LBS液体培养基的无菌玻璃试管中，放置28 ℃培养48 h后，加入200 μL结晶紫染色5 min，将菌液倒掉并用水反复冲洗几次，加入200 μL 33%冰乙酸溶解结晶紫，充分溶解后，吸取200 μL至96孔板，利用酶标仪 (SUNRISE吸光酶标仪) 在600 nm处测定其吸光值。
1.2.11 数据处理与分析
利用软件IBM SPSS Statistics 19统计分析实验数据，显著性差异用P<0.05表示。
2. 结果
2.1 vhh系统进化
哈维弧菌V. harveyi 345溶血素基因vhh片段大小为1 257 bp，编码419个氨基酸；将vhh核苷酸序列与其他弧菌溶血素核苷酸序列用MEGA7.0构建NJ系统进化树 (图2)。结果显示哈维弧菌V. harveyi 345 (vhh) 和哈维弧菌V. harveyi GDH 11388 (vhhA)、哈维弧菌V. harveyi ATCC 35084 (vhhB) 同源性最高，聚为一支，与创伤弧菌V. vulnificus (vpl)、溶藻弧菌V. alginolyticus R4 (tlh) 和霍乱弧菌V. cholerae (lec) 均有较高的同源性，但与霍乱弧菌V. cholerae (hlyA) 同源性较低。
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图 2 利用MEGA 7.0构建的vhh基因的核苷酸序列系统进化树Figure 2. Phylogenetic tree of nucleotide sequence of vhh gene by MEGA 7.02.2 构建vhh缺失突变株
扩增得到的线性化质粒片段大小约3.3 kb，上下游同源臂片段大小均约为1 kb (图3-a、图3-b)，等温组装质粒线性化片段和上下游同源臂片段后，PCR扩增出2 307 bp的片段 (图3-c)，重组质粒pSW7848-Δvhh构建成功。重组自杀质粒上的vhh上下游同源臂片段通过接合作用与野生株V. harveyi 345的vhh上下游同源臂片段发生两次同源交换，这可能使染色体上的vhh缺失，利用引物对Δvhh-check-F/R分别对野生株和vhh缺失株进行PCR检测，电泳结果分别出现1 658 bp和628 bp两条带 (图3-d)，测序发现vhh序列成功缺失，获得vhh缺失突变株。
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图 3 pSW7848 PCR线性片段 (a)、vhh上下游同源臂片段 (b)、重组自杀质粒的PCR鉴定扩增片段 (c) 及vhh缺失株的PCR鉴定 (d)M1. DNA Marker DL5 000；1. pSW7848线性片段；M2. DNA Marker DL2 000；2/3. vhh上/下游片段；M3. DNA Marker DL5 000；4. 重组子 pSW7848-Δvhh检测片段；M4. DNA Marker DL2 000；5. 野生株V. harveyi 345；6. vhh候选突变株Figure 3. Linearized segment of pSW7848 (a), upstream and downstream homologous segments of vhh (b), segment of identification of recombinant suicide vector by PCR (c) and identification of vhh deletion mutant by PCR (d)M1. DNA Marker DL5 000; Lane 1. Linearized segment of pSW7848; Lane M2. DNA Marker DL2 000; Lane 2/3. Up/down segments of vhh; Lane M3. DNA Marker DL5 000; Lane 4. Segment of identification of the recombinant suicide vector by PCR; Lane M4. DNA Marker DL2 000; Lane 5. Wild type V. harveyi 345; Lane 6. Deletion candidate of vhh2.3 vhh基因缺失对邻近基因的表达影响
为研究vhh基因的缺失对邻近基因的mRNA相对表达量的变化，检测上游丝氨酸蛋白酶基因k14645、溶血素基因vhh和下游未知功能基因na。突变株V. harveyi 345-Δvhh的vhh基因未表达，与野生株V. harveyi 345相比，表达差异极显著 (P<0.01)，k14645和na基因的表达与野生株相比，差异不显著 (P>0.05，图4)。结果显示，vhh基因缺失不影响邻近基因的表达。
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图 4 k14645、vhh和na在哈维弧菌V. harveyi 345和V. harveyi 345-Δvhh中的相对表达量Figure 4. Relative expression of k14645, vhh and na in V. harveyi 345 and V. harveyi 345-Δvhh2.4 vhh对哈维弧菌在LBS培养基中生长的影响
在LBS培养基中，vhh缺失株与野生株生长曲线几乎重合，缺失株的生长相对野生型无显著差异 (P>0.05，图5)。
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图 5 哈维弧菌V. harveyi 345和V. harveyi 345-Δvhh的生长曲线Figure 5. Growth curves of V. harveyi 345 and V. harveyi 345-Δvhh2.5 vhh基因缺失对哈维弧菌溶血活性的影响
阳性对照对绵羊红细胞的溶血百分比为100%，阴性对照几乎没有发生溶血，均与预期结果一致。通过比较哈维弧菌菌株对绵羊红细胞的溶血百分比，发现野生株V. harveyi 345和突变株V. harveyi 345-Δvhh均无溶血活性，并且突变株相对野生株对绵羊红细胞的溶血百分比差异不显著 (P>0.05，图6)。
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图 6 哈维弧菌V. harveyi 345和V. harveyi 345-Δvhh的溶血活性测试Figure 6. Hemolytic activity test of V. harveyi 345 and V. harveyi 345-Δvhh2.6 vhh对哈维弧菌运动性的调控
野生株V. harveyi 345在0.3%琼脂LBS平板上没有游动，在1.5%琼脂LBS平板上也无涌动，但是突变株V. harveyi 345-Δvhh在这两种平板上均表现出明显的游动及涌动，其游动与涌动菌落直径明显变大，相对野生株差异极显著 (P<0.01，图7-a、图7-b)。
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图 7 哈维弧菌V. harveyi 345和V. harveyi 345-Δvhh在0.3%和1.5%琼脂LBS平板上的运动性 (a) 和统计分析 (b)Figure 7. Motility of V. harveyi 345 and V. harveyi 345-Δvhh on 0.3% and 1.5% LBS agar plates (a) and statistical analysis (b)2.7 vhh对哈维弧菌胞外蛋白酶分泌的影响
vhh缺失后，在1.5%脱脂奶粉LBS平板上，胞外蛋白酶透明分解圈与野生株一致，缺失株胞外蛋白酶的分泌相对野生株无显著差异 (P>0.05)，说明两者具有相同的胞外蛋白酶分泌能力 (图8-a、图8-b)。
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图 8 哈维弧菌V. harveyi 345和V. harveyi 345-Δvhh在LBS+1.5%脱脂奶粉平板上胞外蛋白酶的分泌 (a) 和统计分析 (b)内箭头指向菌斑边缘，外箭头指向蛋白酶分泌圈边缘Figure 8. Extracellular protease activities of V. harveyi 345 and V. harveyi 345-Δvhh mutant on LBS agar plates containing 1.5% skimmed milk (a) and statistical analysis (b)The inner arrow points to the edge of the plaque, and the outer arrow points to the edge of the proteolytic ring.2.8 对H2O2、Cu2+抗性以及对铁离子的吸收测试
在添加有H2O2、CuSO4以及DIP的3种LBS平板上，随着稀释倍数增加，突变株和野生株菌落数均减少，到108稀释倍数时，菌落数明显变少；两者对H2O2、CuSO4抗性以及铁离子的获取无显著差异 (图9)。
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图 9 哈维弧菌V. harveyi 345和V. harveyi 345-Δvhh对过氧化氢、硫酸铜以及铁离子螯合剂2-2'-联吡啶的敏感性Figure 9. Sensitivity to H2O2, CuSO4 and DIP of wild type and vhh mutant on LBS plateⅠ. V. harveyi 345；Ⅱ. V. harveyi 345-Δvhh2.9 vhh对哈维弧菌抗生素敏感性的影响
野生株和突变株均对利福平、多西环素、万古霉素等5种抗生素耐药，对呋喃唑酮、阿莫西林、氯霉素等6种抗生素敏感。突变株对氟苯尼考敏感，而野生株则表现中介敏感，但两者的抑菌圈直径差异不显著 (P>0.05)；野生株对妥布霉素、庆大霉素和红霉素均敏感，而突变株都表现为中介敏感，两者的抑菌圈直径差异不显著 (P>0.05，表3)。
表 3 哈维弧菌V. harveyi 345和V. harveyi 345-Δvhh对各抗生素抗性Table 3. Antibiotics resistance of V. harveyi 345 and V. harveyi 345-Δvhh抗生素
Antibiotic浓度
Concentration/(μg·片−1)抑菌圈直径 Size of inhibition zone/mm V. harveyi 345 V. harveyi 345-Δvhh 利福平 Rifampin 5 7.89±0.60/R 7.89±0.78/R 多西环素 Doxycycline 30 7.11±0.33/R 7.00±0.00/R 万古霉素 Vancomycin 30 0.00/R 0.00/R 复方新诺明 Compound sulfamethoxazole 1.25 0.00/R 0.00R 四环素 Tetracycline 30 0.00/R 0.00/R 妥布霉素 Tobramycin 10 14.67 ±1.32/S 13.22±0.97/I 氟苯尼考 Florfenicol 30 17.22±0.67/I 16.78±2.05/S 庆大霉素 Gentamicin 10 15.67±1.32/S 14.89±1.69/I 呋喃唑酮 Furazolidone 100 19.78±1.39/S 18.00±2.40/S 阿莫西林 Amoxicillin 20 22.56±1.67/S 21.00±1.32/S 氯霉素 Chloramphenicol 30 22.22±0.97/S 21.89±1.05/S 红霉素 Ergomycin 15 23.44±0.53/S 21.22±1.79/I 麦迪霉素 Medicamycin 30 19.11±0.33/S 19.00±1.12/S 环丙沙星 Ciprofloxacin 5 32.33±1.32/S 32.22±0.83/S 诺氟沙星 Norfloxacin 10 28.00±1.12/S 29.33±0.50/S 注：S. 敏感；I. 中敏；R. 耐药 Note: S. Susceptible; I. Intermediate; R. Resistance 2.10 vhh对哈维弧菌生物膜形成的影响
野生株V. harveyi 345和突变株V. harveyi 345-Δvhh在玻璃试管中静置培养，发现两者管壁上都形成了少量生物膜，并且结晶紫染色后的管壁上出现宽度几乎一样的染色圈；统计分析结果显示，突变株V. harveyi 345-Δvhh的生物膜形成量略微高于野生株V. harveyi 345，但两者的生物膜形成能力并无显著差异 (P>0.05，图10-a、图10-b)。
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图 10 哈维弧菌V. harveyi 345和V. harveyi 345-Δvhh的生物膜形成能力.a-1、a-2分别为V. harveyi 345、V. harveyi 345-Δvhh培养液；a-3、a-4分别为结晶紫染色；b. 定量结晶紫染色后聚苯乙烯微量滴定板，OD600测定生物膜形成量Figure 10. Biofilm formation ability of V. harveyi 345 and V. harveyi 345-Δvhha-1 and a-2 are V. harveyi 345 and V. harveyi 345-Δvhh culture, respectively; a-3 and a-4 are crystal violet stainings; b. Quantitative crystal violet stained polystyrene microtiter plate; OD600 determination of biofilm formation3. 讨论
多种细菌可分泌溶血素，该物质能破坏宿主红细胞膜，造成细胞内容物溢出，导致溶血现象[26]。在作用机理上，可把溶血素分为成孔蛋白和磷脂酶[27]。其中以Tdh为代表的成孔溶血素常以可溶形式分泌，通过组装成跨膜孔发挥其催化作用；而磷脂酶具有两亲性质，作用类似去垢剂分子，直接作用细胞膜，使磷脂分子水解，导致细胞膜损伤。Bai等[11]证实，哈维弧菌溶血素Vhh是溶血磷脂酶，属于脂肪酶家族。本研究发现，哈维弧菌野生株及vhh缺失突变株对绵羊红细胞均没有溶血活性，这与Rattanama等[28]的研究类似，其在哈维弧菌分离株中均检测到vhh基因，但部分菌株并未表现出溶血活性。类似的，Fan等[29]发现部分具有完整hlyA基因的霍乱弧菌对绵羊红细胞也未表现出溶血活性，向非溶血性霍乱弧菌中转入hlyA过表达质粒，这些菌株则出现溶血活性，暗示HlyA分泌正常。这些结果说明，在非溶血性菌株中，hlyA基因不表达或表达量太低。本研究的vhh基因转录水平较高，但翻译水平未知，对绵羊红细胞也不表现溶血活性，推测可能存在Vhh蛋白未翻译或者翻译但分泌不正常，具体机制仍需进一步阐明。
胞外蛋白酶主要是金属蛋白酶或丝氨酸蛋白酶，他们能催化蛋白质水解成氨基酸等多种有机物质用于病原体的生长和繁殖，加速其扩散到宿主组织中，在感染过程中发挥重要作用[30]。本研究溶血素基因vhh的缺失并未导致哈维弧菌胞外蛋白酶活性的改变，暗示vhh基因可能不影响胞外蛋白酶的分泌。
应激反应是细菌对外界环境的响应，它能帮助细菌个体感知种群中其他细胞的状态并做出反应，增强细菌防御不利环境的能力。氧化应激是细菌在海洋环境中可能遇到的情况，细菌本身代谢和侵染宿主过程中会产生大量活性氧物质 (ROS)，这些ROS分子可能会损害病原体本身，致病菌为了能生长繁殖和成功定植宿主，必须要有一套有效的氧化应激系统来清除这些有害分子，比如产生抗氧化剂过氧化氢酶，该酶将H2O2转化为H2O和O2来对其进行解毒[31]。Chen等[32]报道溶藻弧菌 (V. alginolyticus) 超氧化物歧化酶B基因sodB缺失突变体对H2O2更加敏感，这说明sodB基因的缺失降低了溶藻弧菌对外界环境中氧化自由基的防御能力，即sodB正调控抗氧化剂的分泌。本研究中vhh基因的缺失并没有改变哈维弧菌对H2O2的耐受力。过量的铜离子催化大量羟基自由基的形成，对细胞产生毒性，摄铁系统也是哈维弧菌重要致病因子之一[25]。本研究发现vhh基因未改变对铜离子的耐受能力和对铁离子的吸收利用能力。细菌为适应复杂多变的环境而形成生物膜，生物膜由蛋白质、核酸、脂质和胞外多糖组成，可有效帮助细菌抵抗环境中的不利因素[33]。当致病菌定植在宿主表面后，为使其不受宿主免疫系统和抗生素的影响而形成大量生物膜，提高病原体感染宿主的能力[34]。鞭毛介导的运动帮助细菌附着在宿主细胞表面，促进其形成生物膜[35]。本实验发现vhh基因的缺失提高了哈维弧菌的运动性，但没有改变其生物膜的形成能力，暗示哈维弧菌运动性可能与其生物膜的形成无关。
抗生素是抑制或杀死细菌生长繁殖的化学物质，大多数是由细菌合成的天然化学武器，可杀死周围环境中的其他微生物并保持细菌体内平衡[36]。大多数抗生素通过抑制细胞壁合成、破坏细胞膜完整性、防止DNA、RNA和蛋白质合成以及阻断细胞基本代谢途径而发挥抑菌作用。滥用抗生素会导致细菌产生耐药性[37]，这是细菌对抗菌药物的自然反应，是适应环境的一种表现。Das等[36]发现某些rRNA甲基转移酶的缺乏会引起细菌产生抗生素耐药性，并且rulC基因缺失后能显著提高霍乱弧菌和其他肠道病原体对克林霉素、利奈唑胺和泰妙菌素的耐药性。本实验发现vhh基因不会显著影响哈维弧菌对所测试抗生素的耐药性，表明vhh不参与调控哈维弧菌对这些抗生素的耐药过程。
细菌能够独立响应环境，通过包括鞭毛和菌毛在内的物理附属物游动。细菌运动的机制主要取决于它的鞭毛数量及其在细胞表面的分布[38]。哈维弧菌具有两套鞭毛系统[39]，一套主要由一根能够在液体环境中泳动的极性鞭毛组成；另一套由多根侧生鞭毛组成，使细菌能在固体表面上进行群集运动。鞭毛结构由大量严格受调控的基因编码，上游基因编码调节运动的转录激活因子，中游基因编码鞭毛输出系统和钩基体结构成分，下游基因编码鞭毛细丝、动力形成器和趋化信号转导蛋白[40]。Yang等[41]证实哈维弧菌群体感应 (Quorum sensing，QS) 不仅能调节鞭毛中下游基因，还可调节鞭毛上游转录激活因子flaK，说明哈维弧菌QS能通过控制鞭毛转录因子的表达来调控运动。本研究vhh基因缺失株运动能力增强，暗示vhh可能通过作用于QS系统，降低了鞭毛合成相关基因的表达，从而负调控哈维弧菌的运动性。细菌胞外聚合物 (EPS) 由多糖、蛋白质和脂质等组成，这种基质可以帮助细胞抵抗干旱、抗生素、重金属和紫外线辐射等不利环境因素，据报道运动性与EPS的分泌能力呈负相关[42]。本研究vhh基因缺失引起菌株运动性增强，暗示vhh基因可能正调控EPS的分泌，下一步将分析哈维弧菌野生株和vhh缺失突变株鞭毛合成及QS系统相关基因的表达，并量化EPS的分泌，以期为探究哈维弧菌溶血素基因vhh与运动性之间的联系提供新证据。
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图 1 重组自杀质粒构建和缺失突变株筛选流程
AU. 上游；AD. 下游
Figure 1. Recombinant suicide plasmid construction and deletion mutant screening process
AU. Up stream；AD. Down stream
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图 2 利用MEGA 7.0构建的vhh基因的核苷酸序列系统进化树
Figure 2. Phylogenetic tree of nucleotide sequence of vhh gene by MEGA 7.0
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图 3 pSW7848 PCR线性片段 (a)、vhh上下游同源臂片段 (b)、重组自杀质粒的PCR鉴定扩增片段 (c) 及vhh缺失株的PCR鉴定 (d)
M1. DNA Marker DL5 000；1. pSW7848线性片段；M2. DNA Marker DL2 000；2/3. vhh上/下游片段；M3. DNA Marker DL5 000；4. 重组子 pSW7848-Δvhh检测片段；M4. DNA Marker DL2 000；5. 野生株V. harveyi 345；6. vhh候选突变株
Figure 3. Linearized segment of pSW7848 (a), upstream and downstream homologous segments of vhh (b), segment of identification of recombinant suicide vector by PCR (c) and identification of vhh deletion mutant by PCR (d)
M1. DNA Marker DL5 000; Lane 1. Linearized segment of pSW7848; Lane M2. DNA Marker DL2 000; Lane 2/3. Up/down segments of vhh; Lane M3. DNA Marker DL5 000; Lane 4. Segment of identification of the recombinant suicide vector by PCR; Lane M4. DNA Marker DL2 000; Lane 5. Wild type V. harveyi 345; Lane 6. Deletion candidate of vhh
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图 4 k14645、vhh和na在哈维弧菌V. harveyi 345和V. harveyi 345-Δvhh中的相对表达量
Figure 4. Relative expression of k14645, vhh and na in V. harveyi 345 and V. harveyi 345-Δvhh
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图 5 哈维弧菌V. harveyi 345和V. harveyi 345-Δvhh的生长曲线
Figure 5. Growth curves of V. harveyi 345 and V. harveyi 345-Δvhh
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图 6 哈维弧菌V. harveyi 345和V. harveyi 345-Δvhh的溶血活性测试
Figure 6. Hemolytic activity test of V. harveyi 345 and V. harveyi 345-Δvhh
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图 7 哈维弧菌V. harveyi 345和V. harveyi 345-Δvhh在0.3%和1.5%琼脂LBS平板上的运动性 (a) 和统计分析 (b)
Figure 7. Motility of V. harveyi 345 and V. harveyi 345-Δvhh on 0.3% and 1.5% LBS agar plates (a) and statistical analysis (b)
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图 8 哈维弧菌V. harveyi 345和V. harveyi 345-Δvhh在LBS+1.5%脱脂奶粉平板上胞外蛋白酶的分泌 (a) 和统计分析 (b)
内箭头指向菌斑边缘，外箭头指向蛋白酶分泌圈边缘
Figure 8. Extracellular protease activities of V. harveyi 345 and V. harveyi 345-Δvhh mutant on LBS agar plates containing 1.5% skimmed milk (a) and statistical analysis (b)
The inner arrow points to the edge of the plaque, and the outer arrow points to the edge of the proteolytic ring.
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图 9 哈维弧菌V. harveyi 345和V. harveyi 345-Δvhh对过氧化氢、硫酸铜以及铁离子螯合剂2-2'-联吡啶的敏感性
Figure 9. Sensitivity to H2O2, CuSO4 and DIP of wild type and vhh mutant on LBS plate
Ⅰ. V. harveyi 345；Ⅱ. V. harveyi 345-Δvhh
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图 10 哈维弧菌V. harveyi 345和V. harveyi 345-Δvhh的生物膜形成能力.
a-1、a-2分别为V. harveyi 345、V. harveyi 345-Δvhh培养液；a-3、a-4分别为结晶紫染色；b. 定量结晶紫染色后聚苯乙烯微量滴定板，OD600测定生物膜形成量
Figure 10. Biofilm formation ability of V. harveyi 345 and V. harveyi 345-Δvhh
a-1 and a-2 are V. harveyi 345 and V. harveyi 345-Δvhh culture, respectively; a-3 and a-4 are crystal violet stainings; b. Quantitative crystal violet stained polystyrene microtiter plate; OD600 determination of biofilm formation
表 1 本研究所用菌株和质粒
Table 1 Strains and plasmids used in this study
菌株、质粒
Strain, plasmid相关特征
Relevant characteristics来源
Source菌株 Strain V. harveyi 345 分离自中国南部沿海患病石斑鱼肾脏 NCBI database CP025537.1-CP025540.1 V. harveyi 345-Δvhh V. harveyi 345缺失vhh基因 本文构建 E. coli Π3813 lacIQ，thi1，supE44，endA1，recA1，hsdR17，gyrA462，zei298::Tn10[Tc]，ΔthyA::erm-pir116；自杀质粒pSW7848的中间宿主； 文献[17] E. coli GEB883 大肠杆菌野生株K12 ΔdapA::ermpir RP4-2 ΔrecAgyrA462，zei298::Tn10；接合作用供体菌 文献[18] 质粒 Plasmid pSW7848 氯霉素抗性；自杀质粒，R6K起点，复制需要Pir蛋白，具ccdB毒性基因 文献[16] pSW7848-Δvhh 氯霉素抗性；包括vhh的上下游同源臂 本文构建 
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表 2 本研究所用引物
Table 2 Primers used in this study
引物
Primer序列 (5'–3')
Sequence用途
ApplicationpSW7848-F GTCTGATTCGTTACCAATTATGACAAC 扩增pSW7848片段 pSW7848-R GAATTCGATATCAAGCTTATCGATAC vhh-UP-F aagcttgatatcgaattcTACCGTGAGCGTTGTTATTAC 扩增vhh上游片段 vhh-UP-R ctctggatGATTCACTCTCTGTGATGATTATC vhh-DOWN-F gagtgaatcATCCAGAGCAACACGGTTTTG 扩增vhh下游片段 vhh-DOWN-R ttggtaacgaatcagacAAGATTGATGTTTTCTATTGAGACACAAAAG Del-check-pSW7848-F TCACTGTCCCTTATTCGCACC 验证pSW7848重组质粒是否构建成功 Del-check-pSW7848-R CTGCTTTTGAGCACTACCCG Δvhh-check-F TTGAAAGTTGAACGCGGTAC 检验vhh基因是否敲除成功 Δvhh-check-R GAGGTATGTCTTGAGAGGTCAA gyrA-354-F AGGTGTTCGCGGTATGAAGC 荧光定量管家基因gyrA扩增 gyrA-354-R CGTTGGGTATTCCGCTAGTTC uvrA-354-F ATCGTGGTGACATTCGCGTT 荧光定量管家基因uvrA扩增 uvrA-354-R TCGCAAGCTCTTCACGTACC recA-354-F TGCACGTTCTGGTGCTATTG 荧光定量管家基因recA扩增 recA-354-R AGCTTACGCATCGCTTGAGA k14645-354-F ATAACGCCTTTGATGCCTTCC 荧光定量vhh上游基因k14645扩增 k14645-354-R AACGATCTGAGTGGTAACCGAGT vhh-F CACTTATGTCCGCTGCTGGTAC 荧光定量vhh基因扩增 vhh-R CTTGAAAGAAACCGAACTCCAC na-F CAGAAATCACTAAGCGAGCGACAT 荧光定量vhh下游基因na扩增 na-R GTGCGTTTAACTCATCCAACAAGG
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表 3 哈维弧菌V. harveyi 345和V. harveyi 345-Δvhh对各抗生素抗性
Table 3 Antibiotics resistance of V. harveyi 345 and V. harveyi 345-Δvhh
抗生素
Antibiotic浓度
Concentration/(μg·片−1)抑菌圈直径 Size of inhibition zone/mm V. harveyi 345 V. harveyi 345-Δvhh 利福平 Rifampin 5 7.89±0.60/R 7.89±0.78/R 多西环素 Doxycycline 30 7.11±0.33/R 7.00±0.00/R 万古霉素 Vancomycin 30 0.00/R 0.00/R 复方新诺明 Compound sulfamethoxazole 1.25 0.00/R 0.00R 四环素 Tetracycline 30 0.00/R 0.00/R 妥布霉素 Tobramycin 10 14.67 ±1.32/S 13.22±0.97/I 氟苯尼考 Florfenicol 30 17.22±0.67/I 16.78±2.05/S 庆大霉素 Gentamicin 10 15.67±1.32/S 14.89±1.69/I 呋喃唑酮 Furazolidone 100 19.78±1.39/S 18.00±2.40/S 阿莫西林 Amoxicillin 20 22.56±1.67/S 21.00±1.32/S 氯霉素 Chloramphenicol 30 22.22±0.97/S 21.89±1.05/S 红霉素 Ergomycin 15 23.44±0.53/S 21.22±1.79/I 麦迪霉素 Medicamycin 30 19.11±0.33/S 19.00±1.12/S 环丙沙星 Ciprofloxacin 5 32.33±1.32/S 32.22±0.83/S 诺氟沙星 Norfloxacin 10 28.00±1.12/S 29.33±0.50/S 注：S. 敏感；I. 中敏；R. 耐药 Note: S. Susceptible; I. Intermediate; R. Resistance
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