黄鳝生长差异基因发掘及其调控机制初步研究

霍欢欢, 刘瑜, 周秋白, 郭枫, 隗黎丽, 彭墨, 张燕萍, 陈文静

霍欢欢, 刘瑜, 周秋白, 郭枫, 隗黎丽, 彭墨, 张燕萍, 陈文静. 黄鳝生长差异基因发掘及其调控机制初步研究[J]. 南方水产科学, 2020, 16(1): 1-8. DOI: 10.12131/20190176
引用本文: 霍欢欢, 刘瑜, 周秋白, 郭枫, 隗黎丽, 彭墨, 张燕萍, 陈文静. 黄鳝生长差异基因发掘及其调控机制初步研究[J]. 南方水产科学, 2020, 16(1): 1-8. DOI: 10.12131/20190176
shu
HUO Huanhuan, LIU Yu, ZHOU Qiubai, GUO Feng, WEI Lili, PENG Mo, ZHANG Yanping, CHEN Wenjing. Primary study on differentially expressed genes screening of Monopterus albus and their regulation mechanism[J]. South China Fisheries Science, 2020, 16(1): 1-8. DOI: 10.12131/20190176
Citation: HUO Huanhuan, LIU Yu, ZHOU Qiubai, GUO Feng, WEI Lili, PENG Mo, ZHANG Yanping, CHEN Wenjing. Primary study on differentially expressed genes screening of Monopterus albus and their regulation mechanism[J]. South China Fisheries Science, 2020, 16(1): 1-8. DOI: 10.12131/20190176
shu

黄鳝生长差异基因发掘及其调控机制初步研究

  • 1.

    江西农业大学动物科学技术学院，江西 南昌 330045

  • 2.

    江西省水产科学研究院，江西 南昌 330045

基金项目: 国家特色淡水鱼产业体系建设专项资金 (CARS-46)；国家自然科学基金项目 (31360641)
详细信息
    作者简介:

    霍欢欢 (1986—)，男，博士，讲师，从事鱼类营养及免疫研究。E-mail: hhh16430@163.com

    通讯作者:

    周秋白 (1965—)，男，博士，教授，从事鱼类营养研究。E-mail: zhouqiubai@163.com

  • 中图分类号: S 917.4

Primary study on differentially expressed genes screening of Monopterus albus and their regulation mechanism

  • 1.

    College of Animal Science and Technology, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China

  • 2.

    Jiangxi Fisheries Research Institute, Nanchang 330045, China

摘要

    摘要
  • 摘要: 为揭示黄鳝 (Monopterus albus) 生长相关基因的调控机制，对相同亲本具有显著性生长差异的黄鳝肝脏进行了转录组测序分析。结果显示，转录组测序共得到19 149个基因，其中差异基因598个，差异基因中有303个基因显著上调，295个显著下调。KEGG通路分析发现，598个差异基因分属262条通路中，其中有38条通路显著富集。GO功能注释发现，与生长相关的差异基因有7个，分别为col1α1、nkx6.1、nnos、plexina4、igfbp1、pcgf1和h3.3，这些基因表达水平的变化可能对黄鳝神经、内分泌和消化系统的发育及生理活动产生了调节作用从而影响了黄鳝的生长。结合KEGG通路分析发现，col1α1所在的利什曼病通路和nnos所在的精氨酸和脯氨酸代谢通路富集显著，说明其对黄鳝生长具有重要调节作用。
    Abstract: In order to reveal the regulatory mechanism of growth related genes in eels (Monopterus albus), we carried out a transcriptome sequencing analysis on the liver of the eels that had significant growth difference with the same parent. A total of 19 149 genes were obtained by transcriptome sequencing, among which 598 were differentially expressed (303 and 295 were significantly up-regulated and down-regulated, respectively). KEGG pathway analysis shows that 598 differentially expressed genes belonged to 262 pathways, among which 38 pathways are significantly enriched. The GO functional annotation reveals that the seven differentially related genes were col1α1, nkx6.1, nnos, plexina4, igfbp1, pcgf1and h3.3, and variation in the expression levels of these genes had regulated the development and physiological activities of the nervous system, endocrine system and digestive system of the eels, which then affected their growth. Combined with KEGG pathway analysis, it is found that the leishmaniasis pathway, in which col1α1 is located, and the arginine and proline metabolic pathway, in which nnos is located, are significantly enriched, revealing their important influence on the growth of eels.
    • HTML全文

  • 近年来，为了满足人们对海产品与日俱增的需求，海水养殖规模不断扩大，养殖环境恶化日趋严重，导致病害频发，成为海水养殖可持续发展的瓶颈问题[1-3]。哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是一种革兰氏阴性菌，广泛分布于海洋环境中，是海水养殖动物的重要致病菌，给海水养殖业造成了巨大损失[4-6]。抗生素因其起效快、效果好等优点，成为防治海水养殖动物病害的常用药[7]。然而由于抗生素存在病菌耐药、环境污染和药物残留等负面影响，必须科学合理使用[8-9]。中草药具有抗菌、抗病毒、抗虫、抗应激、增加食欲、提供营养、促进生长和增强免疫力等多重功效；且因中草药为天然药物，在机体内容易消除、在环境中容易降解、毒副作用小，具有很好的开发前景。然而中草药一般具有起效慢、作用温和、对突发性疾病的控制力弱等缺点，因而应用受限[10]。已有研究表明中草药富含活性成分，部分活性成分本身就具有抗菌活性，或可以增强抗生素的抗菌活性[11]。因此，将中草药联合低剂量抗生素进行应用，可降低两者用量、降低病原菌耐药机率和药物残留风险，两者共同应用于水产养殖动物病害，被认为是最有前途的水产动物病害防控手段之一[12]。然而，并非所有的中草药与抗生素之间都存在协同作用，为了更好地将中草药联合抗生素应用于水产动物病害防控中，研究其交互作用非常必要[13-14]。

    响应面法(RSM)常用于工艺条件优化[15-16]。RSM在合理的实验设计下，能以最少的实验点数，获取最大限度的实验信息，其采用多元二次回归法作为函数估计的工具，研究各因素间对考察指标(响应值)的交互影响，精确地描述各因素和响应值之间的关系。乌梅(Fructus mume)是由双子叶植物药蔷薇科植物梅的干燥近成熟果实加工而成[17]。已有研究表明乌梅提取液具有显著的抗哈维氏弧菌活性[18-20]，本文在采用琼脂扩散法确认乌梅水提液体外抗哈维氏弧菌活性的基础上，采用全组合方法初步筛选与乌梅水提液具有协同效应的抗生素，然后采用中心组合实验设计方法(CCD)结合RSM，分析乌梅水提液与抗生素对哈维氏弧菌的抑制活性，以确定乌梅水提液与抗生素之间的最佳配比，为乌梅联合抗生素防治弧菌病提供实验依据。

    1.   材料与方法

    1.1   实验原料、试剂与仪器

    乌梅购于海南源安隆药品超市；强力霉素、金霉素和土霉素购于宁波瑞源生物科技有限公司(粉剂，HPLC≥99.8%)；链霉素和新霉素购于北京拜尔迪生物技术公司(粉剂，HPLC≥99.8%)，四环素购于Sigma公司(粉剂，HPLC≥99.8%)；哈维氏弧菌为本实验室分离鉴定和保存。

    液体培养基(g·L–1)为酵母粉1、蛋白胨5、氯化钠(NaCl ) 30、牛肉膏3，用1 mol·L–1的氢氧化钠(NaOH)或盐酸(HCl)调节pH至7.5；半固体培养基(上层培养基)由液体培养基中加入1%的琼脂粉制备而成；固体培养基(下层培养基)由液体培养基中加入2%的琼脂粉制备而成。

    1.2   实验方法

    1.2.1   乌梅水提液样品制备

    乌梅在80 ℃烘箱中干燥2 h，去核，研钵研碎，过40目筛，称5.0 g于250 mL具塞三角瓶中，加50 mL去离子水，浸润30 min，沸水浴提取30 min，8 000 r·min–1离心10 min，取上清过0.22 μm微孔滤膜，制成药物质量浓度为1 g·mL–1的乌梅水提液样品。

    1.2.2   体外抗哈维氏弧菌活性测定

    菌悬液的制备：冻存的哈维氏弧菌转移至液体培养基中，30 ℃、 150 r·min–1培养24 h，按1‰接种量接入新液体培养基中，30 ℃、150 r·min–1培养16 h，按此条件再传一代，培养液3 000 g离心10 min，收集菌体，用无菌生理盐水重悬菌体并将其OD600 nm调整至0.8 (活菌数约为2.82×108 CFU·mL–1)，制成菌悬液。

    抗哈维氏弧菌体外抑菌活性测定参考Tramer和Flower[21]。将固体培养基湿热灭菌后，趁热倒入培养皿中，每个培养皿15 mL，平放静置冷凝，按体积分数2%接种量将菌悬液接入低于50 ℃未冷凝的半固体培养基中，然后倒入含冷凝的固体培养基培养皿中，每个培养皿10 mL，摇匀，平放静置冷凝。用直径5 mm打孔器在双层培养基上均匀打3个孔，在每个孔中加60 μL样品液，30 ℃培养16 h，用游标卡尺测量抑菌圈直径，每个样品平行测3次，取平均值作为该样品的抑菌圈直径。

    标准曲线绘制。按表1设计浓度，制备6个等比浓度梯度的乌梅水提液和抗生素标准溶液，琼脂扩散法测定其抑菌圈直径，以浓度对数为横坐标(C)，抑菌圈直径为纵坐标(Y，cm)，绘制标准曲线。

    表  1  各药物的标准方程及其参数
    Table  1.  Standard functions and parameters of each drug
    药物名称
    drug    		标准曲线
    standard curve    		质量浓度范围/mg·mL–1
    range of concentration    		R2
    乌梅水提液 F. mume water extractY=8.688 0lgC−5.799 020~1000.939 6
    四环素 tetracyclineY=7.088 0lgC+18.893 80.07~0.520.986 9
    土霉素 oxytetracyclineY=5.400 1lgC+14.388 40.03~0.580.961 9
    强力霉素 deoxytetracyclineY=3.927 2lgC+15.835 60.10~1.550.935 5
    金霉素 aureomycinY=3.667 4lgC+16.121 00.03~0.580.991 4
    新霉素 neomycinY=7.116 0lgC+15.598 00.10~0.800.941 0
    链霉素 streptomycinY=10.134 1lgC+15.950 40.15~0.650.927 4
    下载: 导出CSV 
    | 显示表格
    1.2.3   全组合方法考察乌梅水提液与抗生素间交互作用

    乌梅水提液与抗生素进行一一复合，乌梅和抗生素药物浓度与抑菌圈直径间的相关曲线回归方程分别为Y=A1lgC+B1和Y=A2lgC+B2，复合液中乌梅水提液和抗生素的浓度分别为C1和C2，未复合时，两种药物在该两个浓度下的抑菌圈直径分别为Y1=A1lgC1+B1和Y2=A2lgC2+B2，而乌梅水提液抑菌圈直径达Y2时其浓度为${C_3}=10^{[({Y_2} - {B_1})/{A_1}]}$；抗生素抑菌圈直径为Y1时药物浓度为C4=$ 10^{[({Y_1}-{B_2})/{A_2}]}$；假设乌梅水提液和抗生素复合后不存在交互作用，则其抑菌圈直径范围应该介于Y3=A1lg(C1+C3)+B1和Y4=A2lg(C2+C4)+B2区间，如果抑菌圈直径小于Min(Y3，Y4)，则乌梅水提液和抗生素间存在交相抑制作用；而其抑菌圈直径大于Max(Y3，Y4)，则A和B药物存在交互促进作用，促进率为[Y–Max(Y3,Y4)]/Max(Y3, Y4)×100%。

    1.2.4   CCD和RSM方法考察乌梅水提液与抗生素间交互作用

    乌梅水提液与1.2.3筛出的与其存在协同作用的抗生素作为考察因素，进行CCD设计实验，然后以抑菌圈直径作为响应值，进行RSM分析，分析各因素对响应值的影响和各因素之间的交互作用，以寻找各因素之间的最优配比。

    2.   结果

    2.1   标准曲线的绘制

    按照1.2.2的标准曲线绘制方法，绘制乌梅水提液、四环素、土霉素、强力霉素、金霉素、新霉素和链霉素的标准曲线，各标准曲线及其参数见表1。由表可知，各标准曲线的相关系数(R2)高于0.927 4，表明各药物的浓度对数与抑菌圈直径呈较好的线性关系，可根据标准曲线计算其浓度范围内各药物的抑菌圈直径。

    2.2   全组合实验考察乌梅水提液与抗生素之间的交互作用

    采用1.2.3全组合实验设计方法考察乌梅水提液与6种抗生素对哈维氏弧菌的交互作用，它们的复合方案、估算的抑菌圈直径范围和实际测量值见表2。由表可知乌梅水提液与四环素、土霉素、强力霉素和金霉素之间有显著的交互促进作用，与新霉素和链霉素之间有显著的交互抑制作用。

    表  2  全组合实验结果
    Table  2.  Experimental design and results of combination of F. mume water extract and antibiotics
    抗生素
    antibiotics    		质量浓度/mg·mL–1
    concentration    		抑菌圈直径范围/mm
    inhibitory zone diameter    		相互促进效率/%
    synergism efficiency
    乌梅水提液
    F. mume water extract    		抗生素
    antibiotics    		估算值
    predicted value    		测量值
    actual value
    四环素 tetracycline500.1313.43~13.8315.47±0.0611.88
    土霉素 oxytetracycline0.2712.05~12.9316.60±0.0828.37
    强力霉素 deoxytetracycline0.2013.23~14.1816.27±0.0914.73
    金霉素 aureomycin0.1313.01~14.0216.32±0.0716.35
    新霉素 neomycin0.2012.04~12.5010.64±0.09−
    链霉素 streptomycin0.2011.53~11.96 8.35±0.04−
    　注：− 表示无交互促进作用
    　Note: − indicates no synergism effect.
    下载: 导出CSV 
    | 显示表格

    2.3   响应面法考察乌梅水提液与抗生素间的交互作用

    表2的结果显示对乌梅水提液抗菌活性的促进作用由高到低为土霉素>金霉素>强力霉素>四环素，选择促进效率最强的前3种抗生素(土霉素、金霉素和强力霉素)与乌梅水提液进行复合，进行四因素三水平的CCD实验，其因素水平见表3，设计方案与实验结果见表4。

    表  3  乌梅水提液与抗生素复合CCD设计因素水平表
    Table  3.  Factors and levels of CCD for combination of F. mume water extract and antibiotics mg·mL–1
    水平
    level    		乌梅水提液 (X1)
    F. mume water extract     		土霉素 (X2)
    oxytetracycline     		金霉素 (X3)
    aureomycin     		强力霉素 (X4)
    deoxytetracycline
    –1150.060.050.02
    0300.090.080.04
    1450.120.110.06
    下载: 导出CSV 
    | 显示表格
    表  4  CCD设计方案及其实验结果
    Table  4.  Design and results of CCD
    序号
    No.    		X1X2X3X4Y/mm序号
    No.    		X1X2X3X4Y/mm
    1–1 –1 0016.96±0.021501–1 017.06±0.07
    2–1 10016.66±0.0316011016.81±0.09
    31–1 0016.51±0.1417–1 0–1 016.53±0.16
    4110017.20±0.1318–1 01016.33±0.08
    500–1 –1 16.67±0.041910–1 016.85±0.05
    600–1 116.92±0.0720101017.21±0.09
    7001–1 16.72±0.05210–1 0–1 15.83±0.04
    8001117.01±0.04220–1 0116.97±0.08
    9–1 00–1 16.67±0.0623010–1 17.33±0.12
    10–1 00116.55±0.0324010116.59±0.08
    11100–1 16.87±0.0825000016.61±0.08
    12100116.79±0.0726000016.68±0.05
    130–1 –1 016.55±0.0927000016.66±0.04
    140–1 1016.47±0.08
    下载: 导出CSV 
    | 显示表格

    以抑菌圈直径作为响应值(Y)，各药物的浓度编码值作为变量，采用SAS RSREG程序对实验结果进行RSM分析实验，回归模型如式：

    Y=16.648 3+0.142 5X1+0.197 8X2−0.001 3X3+0.063 0X4+0.064 9X12+0.246 3X1X2+0.139 0X1X3+0.008 8X1X4+0.040 6X22−0.042 5X2X3−0.473 3X2X4+0.063 4X32+0.008 0X3X4+0.039 4X42

    模型的相关系数(R2)为0.827 6，说明响应值82.76%的信息量由所选变量引起，采用F检验法对模型进行显著性检验，其Pr>F值为0.009 4，表明模型显著可靠，采用F检验法对模型中各项系数进行显著性检验，结果见表5，由表可知，在设计的浓度范围内，乌梅水提液(X1)和土霉素(X2)的浓度对抑菌圈直径影响显著，土霉素的浓度对其影响为极显著，而金霉素(X3)和强力霉素(X4)在低浓度范围内对抑菌圈直径的影响并不显著。乌梅水提液与土霉素之间(X1X2)存在显著协同作用，而乌梅水提液与金霉素(X1X3)、强力霉素(X1X4)之间的相互促进作用不显著。土霉素与金霉素组合(X2X3)以及土霉素与强力霉素组合(X2X4)在模型中系数为负，表明土霉素与金霉素和强力霉素之间均存在拮抗作用，且X2X4的F检验结果呈极显著水平(Pr>F值小于0.01)，金霉素和强力霉素对响应值的促进作用并不显著(Pr>$F_{(X_3)} $和Pr>$F_{(X_4)} $值均大于0.10)，所以考虑复合时不添加金霉素和强力霉素。图1~图6为两两药物之间的交互作用响应曲面图，可以直观地观察到两两药物对响应值的影响；由图1可知Y沿着(–1，–1)至(1，1)直线剧增，表明乌梅水提液与土霉素存在显著的交互促进作用，图2和图3也呈图1类似趋势，但它们两两因素之间的交互促进作用不如图1显著；图4和图5的响应曲面为凹曲面，且它们的至高点位于(–1，1)和(1，–1)区域，表明土霉素与金霉素、强力霉素之间存在交互抑制作用，图4的响应曲面相对平缓，表明土霉素和金霉素之间的交互抑制不是很显著，图5中(1，1)区域的响应值显著低于(–1，1)和(1，–1)区域，表明土霉素与强力霉素之间存在显著抑制作用；图6整个响应曲面都很平缓，表明金霉素和强力霉素对响应值的影响不显著。

    图  1  Y=f $({X_1},{X_2})$的响应面图和等高线图
    Figure  1.  Responsive surfaces and contours of Y=f $({X_1},{X_2})$
    下载: 全尺寸图片 幻灯片
    图  2  Y=f $({X_1},{X_3})$的响应面图和等高线图
    Figure  2.  Responsive surfaces and contours of Y=f $({X_1},{X_3})$
    下载: 全尺寸图片 幻灯片
    图  3  Y=f $({X_1},{X_4})$的响应面图和等高线图
    Figure  3.  Responsive surfaces and contours of Y=f $({X_1},{X_4})$
    下载: 全尺寸图片 幻灯片
    图  4  Y=f $({X_2},{X_3})$的响应面图和等高线图
    Figure  4.  Responsive surfaces and contours of Y=f $({X_2},{X_3})$
    下载: 全尺寸图片 幻灯片
    图  5  Y=f $({X_2},{X_4})$的响应面图和等高线图
    Figure  5.  Responsive surfaces and contours of Y=f $({X_2},{X_4})$
    下载: 全尺寸图片 幻灯片
    表  5  RSM统计分析结果
    Table  5.  Statistical results of RSM analysis
    来源
    source    		自由度
    df    		平方和
    SS    		均方差
    MS    		FPr>F
    X110.243 70.243 76.953 80.021 7
    X210.469 70.469 713.402 7 0.003 3
    X310.000 00.000 00.000 60.980 7
    X410.047 60.047 61.359 20.266 3
    X1210.022 40.022 40.640 60.439 1
    X1X210.242 60.242 66.921 90.021 9
    X1X310.077 30.077 32.205 50.163 3
    X1X410.000 30.000 30.008 70.927 1
    X2210.008 80.008 80.251 20.625 3
    X2X310.007 20.007 20.206 20.657 9
    X2X410.895 90.895 925.565 5 0.000 3
    X3210.021 40.021 40.611 30.449 5
    X3X410.000 30.000 30.007 30.933 3
    X4210.008 30.008 30.236 00.635 9
    模型 model142.018 10.144 14.113 60.009 4
    线性项 linear40.761 00.190 35.429 10.009 9
    平方项 quadratic40.033 60.008 40.239 60.910 5
    交互项 cross product61.223 50.203 95.819 20.004 8
    残差 error120.420 50.035 0
    失拟项 lack of fit100.417 60.041 828.793 5 0.034 0
    净误差 pure error20.002 90.001 5
    总和 total262.438 6
    下载: 导出CSV 
    | 显示表格
    图  6  Y=f $({X_3},{X_4})$的响应面图和等高线图
    Figure  6.  Responsive surfaces and contours of Y=f $({X_3},{X_4})$
    下载: 全尺寸图片 幻灯片

    综上所述，采用模式搜索法对响应模型最优化配方进行搜索，结果显示，在模型可预测范围内，V(乌梅水提液)∶m(土霉素)∶m(金霉素)∶m (强力霉素)的最佳配比为45∶0.12∶0.00∶0.00 (mg·mL–1)，在此最佳复合配比方案下，模型预测其抑菌圈直径(Y )为18.54 mm。

    2.4   验证实验

    按照2.3中的乌梅水提液与抗生素复合配比方案V (乌梅水提液)∶m (土霉素)∶m (金霉素)∶m (强力霉素)=45∶0.12∶0.00∶0.00 (mg·mL–1)，模型预测最佳配比的复合物抑菌圈直径为18.54 mm，琼脂扩散法3次平行检测最佳复合物的抑菌圈直径为(19.03±0.07) mm，相对误差2.6%，表明该方法确实可行。

    3.   讨论

    据报道，乌梅提取液有显著的体外抗哈维氏弧菌活性[18-20]，其最小抑菌浓度(MIC)为12.5~25.0 mg·mL–1，本研究采用琼脂扩散法检测其MIC低于20 mg·mL–1(乌梅水提液标准曲线最低浓度值)，与文献报道基本相符。中草药与抗生素协同防治水产动物疾病，可降低病原菌耐药机率及药物残留风险和毒副作用，然而必须在全面了解两者间交互作用的基础上，才可以将两者科学合理地联合应用[22-23]。目前常采用的方法有棋盘法、时间-杀菌曲线(time-killing)法和琼脂扩散法。棋盘法因采用微孔板作为病原菌培养容器，培养容量小，病原菌生长受外界因素干扰大，结果准确度难以得到保障，且仅限于考察两两药物之间的交互作用[24-25]；而时间-杀菌曲线法则较为费时费力[12,26]。为此本研究采用操作简便、结果可靠的琼脂扩散法首先考察两两药物之间的交互作用[27]，结果显示四环素类抗生素土霉素、金霉素和强力霉素均对乌梅水提液的体外抗哈维氏弧菌活性具有促进作用，而氨基糖苷类抗生素链霉素和新霉素对乌梅水提液的体外抗哈维氏弧菌活性存在拮抗作用。

    采用CCD结合RSM法考察乌梅水提液、土霉素、金霉素和强力霉素复合后两两药物间的交互作用。姚远等[28]成功采用RSM方法考察了乳酸钠、茶多酚与壳聚糖抑制铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的交互作用，发现三者对铜绿假单胞菌的抑制效果(从大到小)为乳酸钠＞壳聚糖＞茶多酚；乳酸钠和茶多酚存在明显的拮抗作用；乳酸钠和壳聚糖存在明显的协同作用；而茶多酚和壳聚糖之间交互作用不显著，并获得乳酸钠 (mg) 和壳聚糖 (mL) 最佳复合配比为62.5∶3.17。本研究结果显示土霉素、金霉素和强力霉素均与乌梅水提液在哈维氏弧菌的体外抑制活性上存在显著的协同促进作用，而土霉素分别与金霉素和强力霉素在体外抗哈维氏弧菌活性上存在显著的交互抑制作用。经过CCD结合RSM优化，获得乌梅水提液、金霉素、土霉素和强力霉素的最佳配比并根据模型给出预测值，在最佳配比方案下进行了验证实验，表明该方法确实可行。

    研究表明，乌梅主要抑菌成分为柠檬酸等有机酸类，其抗菌机制主要包括：通过破坏菌质膜内侧的磷脂酰丝氨酸，从而破坏其细胞膜系统，使细胞内容物外泄而导致细菌死亡；阻滞DNA的合成进而抑制细胞分裂；柠檬酸从转录水平降低细菌荚膜多糖生物合成从而达到抑杀菌效果[29]。四环素类抗生素通过与细菌胞内核糖体30S亚基形成可逆结合体，抑制蛋白质合成；也可通过结合线粒体70S亚基，抑制线粒体蛋白质的合成[30]。乌梅与四环素类抗生素作用机制和靶位不同，这可能是两者之间存在协同抗哈维氏弧菌的原因，然而两者的协同抗菌机制仍需进一步研究。虽然本研究结果表明乌梅水提液与四环素类抗生素具有体外协同抗哈维氏弧菌作用，但应用于防治哈维氏弧菌引发的动物疾病还需结合药物动力学与药效学等多因素进行研究。

  • 图  1   差异基因火山和统计图

    红色代表上调，蓝色代表下调，黑色代表无差异，每个点代表一个基因

    Figure  1.   Volcano-plots (a) and statistics (b) of differentially expressed genes

    Up-regulated genes are in red; down-regulated ones are in blue; black represents no difference; each dot represents a gene.

    下载: 全尺寸图片 幻灯片

    图  2   差异表达基因GO功能分类图

    1. 单生物体过程；2. 细胞过程；3. 代谢过程；4. 生物调节；5. 生物过程调节；6. 定位；7. 刺激应答；8. 发展过程；9. 多细胞生物体过程；10. 生物体细胞组成或起源；11. 信号传导；12. 正调节生物过程；13. 负调节生物过程；14；生长；15. 运动；16. 免疫系统过程；17. 行为；18多生物体过程；19. 节律过程；20. 细胞；21. 细胞部分；22. 膜；23. 膜部分；24. 细胞器；25. 复杂大分子；26. 细胞器部分；27. 细胞外区域；28. 细胞外区域部分；29. 膜封闭腔；30. 细胞连接；31. 细胞外模型；32. 超分子纤维；33. 突触；34. 突触部分；35. 结合；36. 催化活性；37. 运输活性；38. 分子功能调节；39. 信号传感活性；40. 结构分子活性；41. 分子传感活性；42. 核苷酸结合转录因子活性

    Figure  2.   GO functional classification map of differentially expressed genes

    1. Single-organism process; 2. Cellular process; 3. Metabolic process; 4. Biological regulation; 5. Regulation of biological regulation; 6. Localization; 7. Response to stimulus; 8. Developmental process; 9. Multicellular organismal process; 10. Cell compent organization or biogenesis; 11. Signaling; 12. Positive regulation of biological process; 13. Negative regulation of biological process; 14. Gowth; 15. Locomotion; 16. Immune system process; 17. Behavior; 18. Multi-organism process; 19. Rhythmic process; 20. Cell; 21. Cell part; 22. Membrane; 23. Membrane part; 24. Organelle; 25. Macromolecular complex; 26. Organelle part; 27. Extracellular region; 28. Extracellular region part; 29. Membrane-enclosed lumen; 30. Cell junction; 31. Extracellular matrix; 32. Supramolecular fiber; 33. Synapse; 34. Synapse part; 35. Binding; 36. Catalytic activity; 37. Transporter activity; 38. Molecular function regulation; 39. Signal transducer activity; 40. Structural molecule activity; 41. Molecular transducer activity; 42. Nucleic acid binding transcription factor activity

    下载: 全尺寸图片 幻灯片

    图  3   差异表达基因qPCR验证图

    Figure  3.   Validation of differentially expressed genes by qPCR

    下载: 全尺寸图片 幻灯片

    表  1   样品信息

    Table  1   Information of samples

    样品Sample体质量Body mass/g全长Total length/cm
    实验组Treatment group AEG1 42.27 35.8
    AEG2 44.10 36.5
    AEG3 35.78 34.6
    对照组Control group ACG1 6.30 19.8
    ACG2 6.61 18.9
    ACG3 6.12 20.2
    下载: 导出CSV

    表  2   荧光定量PCR引物信息

    Table  2   Information of primers used for qPCR

    基因GeneqPCR引物序列 (5'–3')Primer sequence of qPCR退火温度Annealing temperature/℃片段大小Fragment size/bp
    col1α1 F:AGTTGTTTGCGGACCGAGAT 60.0 110
    R:GCAATCTGGCATTTCCTCACA 59.2
    nkx6.1 F:GGACAAAGATGGGAAACGAAA 56.7 96
    R:GCCAGGTATTTGGTCTGTTCA 58.2
    nnos F:CTATCAGTCTGGATGCCACAAC 58.8 115
    R:CAGAGCCCAACAGAAACATTAG 57.3
    plexina4 F:TGCTGAGAACCCTGAGTGGATA 60.6 159
    R:TAGCATTTGCGGTTGTCTTCAT 58.9
    pcgf1 F:CAGCCCTTACTCAACCTCAAA 57.9 167
    R:GCATCTGGCACAGCATCTACG 61.7
    igfbp1 F:CAGAGAGCCTTGGAAAAGATTG 57.3 171
    R:CTTGCCGTTCCAGGAGTGT 59.9
    h3.3 F:ATTTTGAGTTGCGGCGATTA 56.4 181
    R:GTAACGATGGGGCTTCTTCAC 59.0
    18S F:GTGGAGCGATTTGTCTGGTTA 57.8 162
    R:CGGACATCTAAGGGCATCAC 57.7
    下载: 导出CSV

    表  3   测序结果统计

    Table  3   Statistics of sequencing results

    样品Sample过滤后ReadsFiltered ReadsQ20/%Q30/%GC含量GC content/%匹配率Matching ratio/%
    对照组Control groupACG14120116898.0394.7546.7875.48
    ACG24104770498.0494.7746.6175.48
    ACG34092654098.0294.7848.1275.98
    实验组Treatment groupAEG14100432498.0994.9646.8774.32
    AEG24098404698.1295.0047.0974.44
    AEG34099936698.0794.8847.3375.21
    下载: 导出CSV

    表  4   生长相关差异表达基因

    Table  4   Growth-related differentially expressed genes

    基因名称Gene name基因IDGene ID差异倍数Fold change所属通路Belonged pathway通路IDPathway ID
    col1α1 109951101 −2.5 利什曼病 Ko05140
    nkx6.1 109952563 −3.3 青少年成熟性糖尿病 Ko04950
    nnos 109959109 4.0 精氨酸和脯氨酸代谢 Ko00330
    plexina4 109959815 3.4 细胞黏附分子 Ko04514
    igfbp1 109961253 2.3 p53信号通路 Ko04115
    pcgf1 109972045 3.3 干细胞潜能调节通路 Ko04550
    h3.3 109974907 2.2 癌症的转录失调 Ko05202
    下载: 导出CSV
    • 参考文献(28)
  • [1] 周秋白, 朱长生, 吴华东, 等. 饲料中不同脂肪源对黄鳝生长和组织中脂肪酸含量的影响[J]. 水生生物学报, 2011, 35(2): 246-255.
    [2]

    VRTÍLEK M, ŽÁK J, POLAČIK M, et al. Rapid growth and large body size in annual fish populations are compromised by density-dependent regulation[J]. J Fish Biol, 2019, 95(2): 673-678. doi: 10.1111/jfb.14052
    [3]

    GAO Z, LUO W, LIU H, et al. Transcriptome analysis and SSR/SNP markers information of the blunt snout bream (Megalobrama amblycephala)[J]. PLoS One, 2012, 7(8): 1-10.
    [4]

    RIBAS L, ROBLEDO D, GÓMEZTATO A, et al. Comprehensive transcriptomic analysis of the process of gonadal sex differentiation in the turbot (Scophthalmus maximus)[J]. Mol Cell Endocrinol, 2016, 15(422): 132-149.
    [5]

    ROBLEDO D, HERMIDA M, RUBIOLO J A, et al. Integrating genomic resources of flatfish (Pleuronectiformes) to boost aquaculture production[J]. Comp Biochem Phys D, 2016, 3(21): 41-55.
    [6]

    YIN F, GAO Q, TANG B, et al. Transcriptome and analysis on the complement and coagulation cascades pathway of large yellow croaker (Larimichthys crocea) to ciliate ectoparasite Cryptocaryon irritans infection[J]. Fish Shellfish Immun, 2016, 50: 127-141.
    [7]

    DU X, LI Y, LI D, et al. Transcriptome profiling of spleen provides insights into the antiviral mechanism in Schizothorax prenanti, after poly (I: C) challenge[J]. Fish Shellfish Immun, 2017, 62: 13-23.
    [8]

    MCCARTHY I D, CARTER C G, HOULIHAN D F. The effect of feeding hierarchy on individual variability in daily feeding of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum)[J]. J Fish Biol, 1992, 41(2): 257-263. doi: 10.1111/j.1095-8649.1992.tb02655.x
    [9] 杨帆, 张世萍, 韩凯佳, 等. 投喂频率对黄鳝幼鱼摄食、生长及饵料利用效率的影响[J]. 淡水渔业, 2011, 41(3): 50-54. doi: 10.3969/j.issn.1000-6907.2011.03.009
    [10]

    XIAO S, HUANG Q, KUNG A W C. Genetics of osteoporosis in Chinese[J]. Int J Rheum Dis, 2010, 11(4): 359-365.
    [11]

    GUPTA S K, WESOLOWSKA-ANDERSEN A, RINGGAARD A K, et al. NKX6.1, induced pluripotent stem cell reporter lines for isolation and analysis of functionally relevant neuronal and pancreas populations[J]. Stem Cell Res, 2018, 29: 220-231. doi: 10.1016/j.scr.2018.04.010
    [12]

    YU S Y, ZHANG M, LUO J, et al. Curcumin ameliorates memory deficits via neuronal nitric oxide synthase in aged mice[J]. Prog Neuro-Psychoph, 2013, 45(4): 47-53.
    [13] 周立斌, 白茹, 马细兰, 等. 饲料维生素C对美国红鱼 (Sciaenops ocellatus) 组织NO含量、NOS活力和nNOS基因表达的影响[J]. 海洋与湖沼, 2014, 45(5): 1122-1126. doi: 10.11693/hyhz20140700193
    [14]

    GUTEKUNST C A, STEWART E N, FRANZ C K, et al. Plexina4 distribution in the adult rat spinal cord and dorsal root ganglia[J]. J Chem Neuroanat, 2012, 44(1): 1-13. doi: 10.1016/j.jchemneu.2012.03.002
    [15]

    SMOLKIN T, NIR-ZVI I, DUVSHANI N, et al. Complexes of plexin-A4 and plexin-D1 convey semaphorin-3C signals to induce cytoskeletal collapse in the absence of neuropilins[J]. J Cell Sci, 2018, 131(9): 5733-5783.
    [16]

    TAN C, LU N N, WANG C K, et al. Endothelium-derived semaphorin 3G regulates hippocampal synaptic structure and plasticity via neuropilin-2/PlexinA4[J]. Neuron, 2019, 101(5): 920-937. doi: 10.1016/j.neuron.2018.12.036
    [17]

    EMERSON S E, LIGHT S E, EBERT A M. Neuronal expression patterns of the PlexinA family during zebrafish development[J]. Gene Expr Patterns, 2018, 27: 56-66. doi: 10.1016/j.gep.2017.10.007
    [18]

    WANG J, LI Y C, DENG M, et al. Serum insulin-like growth factor 1 and its binding protein 3 as prognostic factors for the incidence, progression, and outcome of hepatocellular carcinoma: a systematic review and meta-analysis[J]. Oncotarget, 2017, 8(46): 81098-81108.
    [19]

    SHIMIZU M, DICKHOFF W W. Circulating insulin-like growth factor binding proteins in fish: their identities and physiological regulation[J]. Gen Comp Endocr, 2017, 252: 150-161. doi: 10.1016/j.ygcen.2017.08.002
    [20]

    FENG X, LIN J, XING S, et al. Higher IGFBP-1 to IGF-1 serum ratio predicts unfavourable survival in patients with nasopharyngeal carcinoma[J]. BMC Cancer, 2017, 17(1): 90-100. doi: 10.1186/s12885-017-3068-0
    [21]

    YUKIYA Y, AKIHIRO A, NOBUHIKO E. Clarifying the impact of polycomb complex component disruption in human cancers[J]. Mol Cancer Res, 2014, 12(4): 479-484. doi: 10.1158/1541-7786.MCR-13-0596
    [22]

    SHUKLA S, ZHAO Q, YING W, et al. Small molecule inhibitors of ring1B-Bmi1 E3 ligase target polycomb repressive complex 1 activity and regulate cell proliferation[J]. Cancer Res, 2015, 75(15): 3520-3520.
    [23] 关珊丽, 王健, 谢忆, 等. 多梳蛋白CBX家族在哺乳动物中结构与功能多样性的研究进展[J]. 中国科学:生命科学, 2017, 47(8): 847-862.
    [24]

    LIN C J, KOH F, WONG P, et al. Hira-mediated H3.3 incorporation is required for DNA replication and ribosomal RNA transcription in the mouse zygote[J]. Dev Cell, 2014, 30(3): 268-279. doi: 10.1016/j.devcel.2014.06.022
    [25]

    WEN D C, BANASZYNSKI L A, ROSENWAKS Z, et al. H3.3 replacement facilitates epigenetic reprogramming of donor nuclei in somatic cell nuclear transfer embryos[J]. Nucleus, 2014, 5(5): 369-375. doi: 10.4161/nucl.36231
    [26]

    WEN D C, BANASZYNSKI L A, LIU Y, et al. Histone variant H3.3 is an essential maternal factor for oocyte reprogramming[J]. P Natl Acad Sci USA, 2014, 111(20): 7325-7330. doi: 10.1073/pnas.1406389111
    [27]

    DELBARRE E, IVANAUSKIENE K, KUNTZIGER T, et al. DAXX-dependent supply of soluble (H3.3 –H4) dimers to PML bodies pending deposition into chromatin[J]. Genome Res, 2013, 23(3): 440-451. doi: 10.1101/gr.142703.112
    [28] 黄星卫, 程香荣, 王楠, 等. 组蛋白H3变体H3.3及其在细胞重编程中的作用[J]. 遗传, 2018, 40(3): 186-196.
    • 相关文章
    • 施引文献(1)

  • 期刊类型引用(0)

    其他类型引用(1)

    • 资源附件(0)
图(3)  /  表(4)
计量
  • 文章访问数: 
  • HTML全文浏览量: 
  • PDF下载量: 
  • 被引次数: 1
出版历程
  • 收稿日期:  2019-09-08
  • 修回日期:  2019-11-02
  • 网络出版日期:  2019-11-29
  • 刊出日期:  2020-02-04

目录

摘要
HTML全文

  • 1.   材料与方法

  • 1.1   实验原料、试剂与仪器

  • 1.2   实验方法

  • 1.2.1   乌梅水提液样品制备
  • 1.2.2   体外抗哈维氏弧菌活性测定
  • 1.2.3   全组合方法考察乌梅水提液与抗生素间交互作用
  • 1.2.4   CCD和RSM方法考察乌梅水提液与抗生素间交互作用

  • 2.   结果

  • 2.1   标准曲线的绘制

  • 2.2   全组合实验考察乌梅水提液与抗生素之间的交互作用

  • 2.3   响应面法考察乌梅水提液与抗生素间的交互作用

  • 2.4   验证实验

  • 3.   讨论

参考文献(28)
相关文章
施引文献(1)
资源附件(0)

/

返回文章
返回

本系统由北京仁和汇智信息技术有限公司 开发