Cloning and tissue expression of heat shock transcription factor 1 (HSF1) gene of Sinonovacula constricta
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摘要:
热休克转录因子1 (HSF1) 是一种广泛存在于真核生物中的调控因子，在生物体内具有多种生理功能。为了探究海洋滩涂生物在耐受高温过程中HSF1发挥的作用和分子机制，进一步阐述HSF1的生理功能，文章以缢蛏 (Sinonovacula constricta) 为实验材料，利用RACE技术克隆HSF1基因。结果显示，缢蛏HSF1基因的cDNA全长2 026 bp，开放阅读框 (ORF) 长1 707 bp，编码568个氨基酸，5'非编码区 (UTR) 长196 bp，3' UTR长123 bp。氨基酸序列比对及系统进化树结果显示缢蛏HSF1基因与美洲牡蛎 (Crassostrea virginica) 的亲缘关系最为接近，其系统进化分析与传统的形态学分类相吻合。荧光定量PCR结果显示，HSF1基因在各个组织均有表达，其中在外套膜中的相对表达量最高，其次是鳃、肝胰腺和水管，在斧足和性腺组织的相对表达量较低 (P<0.05)。荧光定量结果显示HSF1基因在急性温度胁迫后第9小时表达量较高。推测HSF1基因参与缢蛏的热应激过程，并起到一定作用。
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关键词:
- 缢蛏 /
- 热休克转录因子1 (HSF1) /
- 荧光定量PCR /
- 组织表达
Abstract:The heat shock transcription factor 1 (HSF1) is a regulatory factor widely present in eukaryotes and has many physiological functions in vivo. In order to explore the role and molecular mechanism of HSF1 in the process of high temperature tolerance, and further elaborate its physiological function, we cloned the HSF1 gene of Sinonovacula constricta by RACE technology. The results show that the full-length cDNA of S. constricta HSF1 gene was 2 026 bp; the open reading frame was 1 707 bp in length, encoding 568 amino acids; the 5' non-coding region was 196 bp in length; the 3' non-coding region was 123 bp in length. Amino acid sequence alignment and phylogenetic tree results show that HSF1 gene was the closest to the Crassostrea virginica, and its phylogenetic analysis was consistent with traditional morphological classification. The results of real-time PCR show that HSF1 gene was expressed in all tissues, and the relative expression of mantle membrane was the highest, followed by sputum, hepatopancreas and water tube, and the relative expressions in axillary and gonadal tissues were low.
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缢蛏(Sinonovacula constricta)隶属软体动物门、瓣鳃纲、帘蛤目、竹蛏科[1]，又名蛏子、蜻子，广泛分布于中国沿海各省市地区，是中国主要海产经济贝类之一；因其养殖周期短、生长速度快，深受养殖者喜爱，是一种具有重要营养价值和经济价值的滩涂贝类[2]。之前对缢蛏的研究主要在生长相关性状方面，如以生长性状为目标的家系选育工作等，近年在缢蛏的遗传多样性[3-6]、免疫[7-11]、发育[12-13]也有一些研究报道，但是在功能基因学方面仅限于对生长、免疫等相关基因的克隆，对抗性相关基因克隆的研究报道较少。近年来受全球气温升高影响，海水温度出现上升趋势，水产动物也时常面临热胁迫刺激[14]。缢蛏是一种典型的栖息于潮间带滩涂区域的滤食性贝类，其生活环境决定了它会受到环境的强烈应激影响，尤其是海水退潮的午后，缢蛏长时间埋栖于高温的滩涂中，会出现个体被烫伤和大规模死亡[15]。迄今，对于缢蛏的耐高温适应性机制，无论在传统育种还是分子层面，都少有深入的探究。
热休克因子 (Heat shock factor, HSF) 是真核生物中较早被发现的一种转录因子，在动植物中普遍存在；HSF家族包括HSF1、HSF2、HSF3 和HSF4 共4个成员[16]。本研究的热休克因子1 (HSF1) 是HSF家族中最重要的成员，是主要负责热休克蛋白表达的重要调节因子[17]，研究表明HSF1参与多种疾病的免疫和器官的发育[18-20]。目前对水生生物有关HSF1对HSP70、HSP90等热休克蛋白调节的了解匮乏，研究HSF1可为今后热休克通路验证提供理论依据。研究发现，长牡蛎 (Crassostrea gigas) 中有5个HSP蛋白与HSF1存在相互作用[21]，且在热应激下可能受HSF1的调控[22]。热休克转录因子通过与热休克蛋白基因上的热休克元件 (Heat shock element, HSE) 结合而调控热休克蛋白的表达，其中与体内外环境应激关系最密切的就是HSF1。HSF1有2种结构，一种是单体结构，另一种是三体结构[23]；正常情况下HSF1以单体的形式和HSPs结合；在热应激条件下，HSPs会与变性蛋白结合，而HSF1变成游离的单体结构，随后HSF1进入细胞质中，形成磷酸化的三体结构，与热休克元件结合，促进HSPs的转录。新转录的HSPs又会与HSF1结合，起到反馈抑制作用[24-27]。
随着水生生物技术的快速发展，水生动物重要功能基因已成为研究的焦点，尤其在抗逆基因研究方面，包括基因克隆、蛋白功能分析，已进行了大量与其相关的通路功能研究，可为今后分子辅助育种奠定基础。目前对HSF1基因的研究主要集中于植物[28-33]和陆生动物[34-37]，对海洋无脊椎动物HSF1基因克隆与功能分析的报道尚少。本研究以缢蛏为实验材料，克隆出HSF1基因的cDNA全长，对其氨基酸序列进行同源性分析和各组织荧光定量PCR分析，并通过荧光定量PCR检测HSF1基因在不同温度刺激下不同时间点的表达量变化，进一步阐明在水温骤升时HSF1基因在缢蛏体内热应激过程中承担的功能。实验结果可为今后该基因的其他分子生物学实验提供数据支持，也可为深入研究水生动物耐高温机制和抵御外界热刺激机理及后续的分子辅助育种提供新思路。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
实验所用缢蛏于2019年4月购自上海南汇新城芦潮港水产市场，实验样品置于塑料盆中进行充气暂养，暂养期间每天定时投喂藻液，并及时换水，清除死亡个体，室内温度保持在 (26±0.5) ℃。实验个体体质量约为 (17.68±1.65) g，体长 (6.23±0.54) cm。
1.2 实验方法
1.2.1 RNA的提取和cDNA克隆
实验选取健康、活力良好且体质量和体长接近的缢蛏6只，分别取鳃部位，采用Trizol (TaKaRa，大连) 试剂提取RNA，RNA按试剂盒使用方法提取，用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的5S、18S和28S条带完整性并用Nanodrop 2000 (Thermo Scientific，美国) 检测RNA浓度，ddH2O稀释后保持RNA质量浓度为500~1 000 ng·μL−1。以缢蛏鳃组织中的RNA为模板，用PrimerScriptTM RT试剂盒 (TaKaRa，大连) 反转录为cDNA。
1.2.2 HSF1基因克隆
从转录组数据库中筛选出一条热休克转录因子1氨基酸序列，在NCBI进行BLAST比对。利用Primer Premier 5.0在开放阅读框 (ORF) 内设计片段验证引物HSF1-F1、HSF1-R1 (表1)，扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，并用试剂盒对目的条带进行割胶回收，用pGEM-TEasy vector (Promega，美国) 进行连接转化，经LB平板蓝白斑筛选阳性克隆，选取白斑菌落，经菌液PCR反应检测后，挑取与目的片段大小一致的菌液送上海生工公司测序。
表 1 实验所用的引物序列Table 1. Sequences of primers used in this study引物名称
Primer name引物序列
Primer sequence (5'–3')用途
UsageHSF1-F GATTTCTGTAATCGTGGGCG 片段验证引物 HSF1-R GCCCAGACAAGTCTACCTAC 片段验证引物 HSF1-5'RACE CCTTGCGGAACCCATACA 5'RACE特异性引物 HSF1-3'RACE CAGAGCACGGTTTGGAGC 5'RACE特异性引物 HSF1-F ATGGGTTCCGCAAGGTGGTG 荧光定量引物 HSF1-R CCTGCCCACTTGGCTTGCGT 荧光定量引物 18S-F TCGGTTCTATTGCGTTGGTTTT 内参基因引物 18S-R CAGTTGGCATCGTTTATGGTCA 内参基因引物 根据测序所得的HSF1基因序列，利用Primer Premier 5.0设计3'和5'RACE特异性引物，进行反转录合成cDNA，扩增后的PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，选取预计目的条带经过割胶回收试剂盒 (天根生化科技，北京) 回收目的条带，并与pGEM-TEasy vector (Promega，美国) 进行连接转化，16 ℃孵育过夜后转化到感受态 DH5α大肠杆菌细胞，将其涂布于含有氨苄的选择性培养基上，37 ℃培养24 h后进行蓝白斑筛选，挑取白斑菌落，进行菌液PCR反应检测，挑取与目的片段一致的菌液送上海生工公司测序。经测序所得3'和5'RACE扩增序列利用BioEdit软件进行拼接，获得HSF1基因的cDNA全长。
1.2.3 基因序列分析
分别利用在线ORF Finder、ProtParam、NetPhos 2.0 Server、NetNGlyc 1.0Server、TMHMM services 2.0、Phyre2程序和SMART查找开放阅读框 (ORF)、预测编码蛋白的理化性质、预测蛋白质磷酸化位点、预测糖基化位点、预测蛋白质的跨膜结构域、预测蛋白质的三级结构和分析蛋白质的功能结构域。利用Cell-PLoc 2.0进行亚细胞定位，DNAMAN软件进行氨基酸序列多重比对，利用MEGA 6.0构建进化树。
1.2.4 实时荧光定量PCR
实验前取9只健康，体质量、大小相似且无损伤的缢蛏，分别取其斧足、水管、外套膜、腮、性腺、肝胰腺共6个组织，将3只个体做成一个混样，共3个样品实验组，用Trizol试剂提取总 RNA，并将其反转录成cDNA，−20 ℃保存备用。根据HSF1基因序列设计荧光定量引物，利用网站软件 (https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-tagman-primer-tool) 设计引物HSF1-RT-F和HSF1-RT-R (表1)。以缢蛏18S rRNA为内参，实时荧光定量PCR使用试剂盒为SYBR® Green PCR，在ABI Q6仪器上进行。采用相对定量算法2−ΔΔCT法计算HSF1基因在各个组织的相对表达量。基因相对表达量以“平均值±标准误 (
$\overline X \pm {\rm{SE}} $ )”表示，使用 SPSS 22.0进行单因素方差分析 (One-way ANOVA)，P<0.05 表示具有显著性差异。1.2.5 急性温度刺激下，不同时间点HSF1基因在外套膜的相对表达量
选取90个壳表面完整、体质量和体长相似的缢蛏置于水箱 (150 cm×80 cm×60 cm) 中进行暂养，控制水温在 (27±0.5) ℃，并进行藻液投喂。实验时将缢蛏分别放入6个水盆中 (实验组、对照组各3个重复)，利用恒温加热棒对实验组进行33 ℃控温，对照组温度为室温27 ℃，连续刺激缢蛏48 h，实验期间一天投喂2次藻液，分别在第0、第3、第6、第9、第12、第24和第48小时取样。每个时间点每个重复组取3只，剪取外套膜部位保存于液氮中，采用Trizol法每个重复组3个缢蛏混样提取RNA，并将其反转录成cDNA，−20 ℃保存。实时荧光定量PCR检测HSF1基因在不同时间点的表达量。相对表达量用“平均值±标准偏差 (
${\overline {X}} {\pm} {\rm{SD}} $ )”表示，使用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析，P<0.05 表示差异显著。2. 结果
2.1 HSF1 cDNA的全长序列
缢蛏HSF1基因的cDNA全长为2 026 bp (GenBank 登录号：MN149905)，包括1 707 bp的ORF，5'非编码区 (UTR) 共196 bp，3'UTR 共123 bp。3'UTR区含有多聚糖核苷酸的加尾信号序列AATAAA和Poly (A) 尾巴 (图1)。在进行NCBI Blast比对时，结果显示该序列与美洲牡蛎的HSF1有95%的相似性。
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图 1 缢蛏HSF1基因的cDNA序列和氨基酸序列第一个字符框内表示起始密码子，第二个字符框内表示终止密码子，基因编码区用用单下划线表示，非编码区用波浪线表示Figure 1. cDNA sequence and amino acid sequence of HSF1 gene of S. constrictaThe starting codon is represented in the first character box; the ending codon is represented in the second character box; the genetic coding area is represented by single underscore, and the non-coding area is represented by wavy line.2.2 HSF1的结构特征
经各种软件预测，结果显示该基因序列共编码568个氨基酸，分子量约为62 786.59 ku，理论等电点4.95，原子总量8 779，分子式为C2735H4376N752O895S21；从氨基酸组分分析中得出丝氨酸 (Ser) 含量最高，为12%；亮氨酸 (Leu) 和异亮氨酸 (Ile) 的含量也较高，分别为9.9%和7.4%；半胱氨酸 (Cys) 和色氨酸 (Trp) 的含量最少，均为0.5% (表2)。带正电荷氨基酸残基47个，带负电荷氨基酸残基73个。亚细胞定位分析在细胞质。脂肪族氨基酸指数86.16，平均疏水指数−0.426，不稳定指数57.2。
表 2 缢蛏HSF1多肽链的氨基酸组分Table 2. Amino acid composition of HSF1 polypeptide chain in S. constricta氨基酸
Amino acid数量
Amount百分比
Percentage/%氨基酸
Amino acid数量
Amount百分比
Percentage/%丙氨酸 Ala (A) 26 4.6 亮氨酸 Leu (L) 56 9.9 精氨酸 Arg (R) 19 3.3 赖氨酸 Lys (K) 28 4.9 天冬酰胺 Asn (N) 40 7.0 甲硫氨酸 Met (M) 18 3.2 天冬氨酸 Asp (D) 41 7.2 苯丙氨酸 Phe (F) 16 2.8 半胱氨酸 Cys (C) 3 0.5 脯氨酸 Pro (P) 39 6.9 谷氨酰胺 Gln (Q) 26 4.6 丝氨酸 Ser (S) 68 12.0 谷氨酸 Glu (E) 32 5.6 苏氨酸 Thr (T) 38 6.7 甘氨酸 Gly (G) 22 3.9 色氨酸 Trp (W) 3 0.5 组氨酸 His (H) 15 2.6 酪氨酸 Tyr (Y) 8 1.4 异亮氨酸 Ile (I) 42 7.4 缬氨酸 Val (V) 28 4.9 磷酸化位点分析显示，该基因编码的蛋白质磷酸化位点有68个，分别为50个Ser、14个苏氨酸（Thr）和4个酪氨酸（Tyr）；糖基化位点分析显示有5个N糖基化位点；信号肽预测结果为氨基酸序列中无信号肽存在。跨膜结构预测软件显示该基因无跨膜结构域，说明其为胞内产物。功能结构域预测软件SMART显示HSF1基因含有1个HSF结构域 (14~117 aa)。Phyre2分析得出三级结构预测（图2）。
2.3 同源性分析
为分析缢蛏HSF1的进化地位，根据缢蛏HSF1的氨基酸序列，选取了包括缢蛏在内18个物种的18条氨基酸序列，利用MEGA 6.0构建系统进化树 (图3)。进化树结果显示缢蛏与美洲牡蛎和长牡蛎的进化地位最接近，接着与虾夷扇贝聚为一个分支，隶属于双壳纲。并对缢蛏HSF1的氨基酸序列与其他动物的HSF1氨基酸序列进行多重比对 (图4)。
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图 3 缢蛏HSF1氨基酸序列与其他物种的氨基酸序列的系统进化树利用MEGA 6.0中的邻接法构建，设定1 000次自主重复，其他参数使用默认值Figure 3. Phylogenetic tree of amino acid sequences of HSF1 of S. constricta and other speciesThe tree is established based on the Neighbor-Joining Method in MEGA 6.0 which is evaluated by 1 000 boots trapping replications, and the other parameters are default values.![]()
图 4 缢蛏HSF1和其他贝类物种HSF1氨基酸序列的多重比对高度保守的氨基酸序列用黑色表示，相似的氨基酸序列用粉色表示Figure 4. Multiple alignment of amino acid sequences of HSF1 of S. constricta and other shellfish speciesThe high conserved cysteine residues are indicated in black and similar residues were shown in pink.2.4 不同组织表达差异分析
本实验用18S rRNA作为内参基因，利用RT-PCR方法检测缢蛏HSF1基因在斧足、水管、外套膜、腮、性腺、肝胰腺6个组织中的表达；结果显示，HSF1基因在6个组织中均有表达，并且在外套膜中表达量最高，其次是鳃、肝胰腺和水管，在斧足和性腺中的表达量相对较低，且与其他组织差异显著 (P<0.05，图5)。
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图 5 HSF1基因在缢蛏不同组织的表达情况1. 水管; 2. 鳃; 3. 外套膜; 4. 斧足; 5. 性腺; 6. 肝胰腺; 不同字母表示差异显著 (P<0.05)Figure 5. Expression of HSF1 gene in different tissues of S. constricta1. Water pipe; 2. Gill; 3. Mantle; 4. Abdominal foot; 5. Gonad; 6. Liver; different letters indicate significant difference (P<0.05).2.5 qRT-PCR检测HSF1基因在外套膜中急性高温刺激下不同时间点的表达量
以缢蛏18S基因为内参基因，实验温度设置以夏季高温期间潮间带滩涂表面温度为参考[15]。荧光定量PCR检测HSF1基因在外套膜中33 ℃急性升温刺激下分别在第3、第6、第9、第12、第24和第48小时的表达量，显著性分析是在同一温度下对不同时间点进行单因素方差分析 (图6)。图6显示在温度33 ℃刺激下，第9 小时HSF1基因在外套膜中的表达量最高，显著高于其他时间段的表达量 (P<0.05)。在温度刺激下HSF1基因表达量随温度增加呈先升后降的趋势，且在第9小时表达量最高，其次为在第6和第12小时。
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图 6 不同温度刺激下不同时间点HSF1基因在缢蛏外套膜表达量同一温度下不同字母表示HSF1基因表达量有显著差异 (P<0.05)，相同字母表示无显著差异 (P>0.05)Figure 6. HSF1 gene expression in coat membrane of S. constricta at different time under different temperature stimulationsDifferent letters indicate significant difference in HSF1 gene expression at the same temperature (P<0.05), while the same letters indicate no significant difference (P>0.05).3. 讨论
HSF1基因广泛存在于真核生物不同组织中，RT-PCR结果显示缢蛏HSF1基因在外套膜中的表达量最高。外套膜是缢蛏感知外界环境变化的敏感器官，HSF1基因在缢蛏外套膜中的高表达，显示该基因可能在缢蛏产生热应激过程中起关键作用。目前尚未见有关缢蛏耐热机理的研究报道，随着对热休克因子基因研究的深入，对水生生物的耐热机理的了解也将会更加透彻，有助于从分子水平方面了解热休克因子基因表达的机制。
系统发育树显示缢蛏的HSF1与虾夷扇贝、长牡蛎、美洲牡蛎聚为一支，表明缢蛏的热休克因子HSF1可能与其他贝类有相同的功能。qRT-PCR结果表明HSF1基因在缢蛏所测6个组织中均有表达且表达水平不同，推测HSF1在不同组织中有不同的作用。外套膜中高表达推测其可能参与热应激调节，但缢蛏HSF1基因是如何参与热应激，其具体的分子机制和作用还有待进一步探究。急性高温刺激下各时间点荧光定量结果显示实验组中的HSF1基因在高温应激下表达量均发生上调。这与杂交鲍中HSF1基因受高温胁迫后表达量上升的现象一致[38]。有研究表明热应激能够加速蛋白变性，并干扰动物的生命活动[39-40]，同时高温等其他因子也会导致HSF1蛋白结构改变从而产生细胞转录应激[41]。由实验结果推测，HSF1在热休克应答反应中具有重要作用，但其如何调控HSP表达还有待研究。
HSF1基因主要是在转录前对热休克蛋白家族基因进行调控，从而参与生物体的各种生命活动。热休克反应是由热休克因子1驱动的转录反应，热应激可触发HSP70、HSP90等热休克基因的表达，从而保护机体；然而缢蛏中 HSP和HSF1之间的调控关系尚不清楚。目前在海洋双壳类研究中发现，长牡蛎体内存在HSF1对HSP的调控关系，因此，笔者猜测在缢蛏体内也存在类似的调控关系。
缢蛏生活的滩涂是介于海陆之间的潮间带区域受潮汐影响，生活在潮间带的生物经常遭遇雨水、干露、太阳曝晒等恶劣环境影响。缢蛏作为一种滩涂埋栖性贝类，当受到高温刺激时，可能会通过生理代谢使自身得到暂时适应，但如果长时间处于极端高温环境下，在群体层面会出现生物适应性进化。由于HSF1特殊的分子功能，对它的研究不仅可为水生动物环境适应性进化提供理论依据，也为生物机体感知外界环境变量因素提供了分子基础。
目前，新品种 (系) 的培育手段仍以选择育种和杂交育种为主，但由于技术落后且繁育周期长，无法实现行业对抗逆良种的迫切需求；近几年在海洋经济贝类功能基因研究方面已获得一些成果，大量功能基因被成功克隆，但缢蛏研究主要集中于生长和免疫方面，对抗逆性基因的研究鲜有报道。本实验在分子层面对缢蛏的抗逆性进行了探究，为缢蛏在高温刺激下的抗逆机制研究提供了初步的分子生物学数据，有利于缢蛏养殖产业的健康可持续发展，也可为后续筛选和定位缢蛏热应激关键基因提供参考。
4. 结论
本实验利用RACE技术克隆出HSF1基因cDNA全长，qRT-PCR的结果表明HSF1基因在所测组织中均有表达，但主要高表达于外套膜部位，推测其可能参与缢蛏体内热应激的调节。急性温度胁迫33 ℃连续刺激48 h，发现HSF1基因在外套膜的表达量出现先升高后下降的趋势，推测缢蛏HSF1基因参与了热应激。这为探索缢蛏耐热机制提供重要参考，也为进一步培育抗逆 (热) 性优良新品系奠定了良好的分子生物学基础。
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图 1 缢蛏HSF1基因的cDNA序列和氨基酸序列
第一个字符框内表示起始密码子，第二个字符框内表示终止密码子，基因编码区用用单下划线表示，非编码区用波浪线表示
Figure 1. cDNA sequence and amino acid sequence of HSF1 gene of S. constricta
The starting codon is represented in the first character box; the ending codon is represented in the second character box; the genetic coding area is represented by single underscore, and the non-coding area is represented by wavy line.
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图 3 缢蛏HSF1氨基酸序列与其他物种的氨基酸序列的系统进化树
利用MEGA 6.0中的邻接法构建，设定1 000次自主重复，其他参数使用默认值
Figure 3. Phylogenetic tree of amino acid sequences of HSF1 of S. constricta and other species
The tree is established based on the Neighbor-Joining Method in MEGA 6.0 which is evaluated by 1 000 boots trapping replications, and the other parameters are default values.
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图 4 缢蛏HSF1和其他贝类物种HSF1氨基酸序列的多重比对
高度保守的氨基酸序列用黑色表示，相似的氨基酸序列用粉色表示
Figure 4. Multiple alignment of amino acid sequences of HSF1 of S. constricta and other shellfish species
The high conserved cysteine residues are indicated in black and similar residues were shown in pink.
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图 5 HSF1基因在缢蛏不同组织的表达情况
1. 水管; 2. 鳃; 3. 外套膜; 4. 斧足; 5. 性腺; 6. 肝胰腺; 不同字母表示差异显著 (P<0.05)
Figure 5. Expression of HSF1 gene in different tissues of S. constricta
1. Water pipe; 2. Gill; 3. Mantle; 4. Abdominal foot; 5. Gonad; 6. Liver; different letters indicate significant difference (P<0.05).
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图 6 不同温度刺激下不同时间点HSF1基因在缢蛏外套膜表达量
同一温度下不同字母表示HSF1基因表达量有显著差异 (P<0.05)，相同字母表示无显著差异 (P>0.05)
Figure 6. HSF1 gene expression in coat membrane of S. constricta at different time under different temperature stimulations
Different letters indicate significant difference in HSF1 gene expression at the same temperature (P<0.05), while the same letters indicate no significant difference (P>0.05).
表 1 实验所用的引物序列
Table 1 Sequences of primers used in this study
引物名称
Primer name引物序列
Primer sequence (5'–3')用途
UsageHSF1-F GATTTCTGTAATCGTGGGCG 片段验证引物 HSF1-R GCCCAGACAAGTCTACCTAC 片段验证引物 HSF1-5'RACE CCTTGCGGAACCCATACA 5'RACE特异性引物 HSF1-3'RACE CAGAGCACGGTTTGGAGC 5'RACE特异性引物 HSF1-F ATGGGTTCCGCAAGGTGGTG 荧光定量引物 HSF1-R CCTGCCCACTTGGCTTGCGT 荧光定量引物 18S-F TCGGTTCTATTGCGTTGGTTTT 内参基因引物 18S-R CAGTTGGCATCGTTTATGGTCA 内参基因引物 
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表 2 缢蛏HSF1多肽链的氨基酸组分
Table 2 Amino acid composition of HSF1 polypeptide chain in S. constricta
氨基酸
Amino acid数量
Amount百分比
Percentage/%氨基酸
Amino acid数量
Amount百分比
Percentage/%丙氨酸 Ala (A) 26 4.6 亮氨酸 Leu (L) 56 9.9 精氨酸 Arg (R) 19 3.3 赖氨酸 Lys (K) 28 4.9 天冬酰胺 Asn (N) 40 7.0 甲硫氨酸 Met (M) 18 3.2 天冬氨酸 Asp (D) 41 7.2 苯丙氨酸 Phe (F) 16 2.8 半胱氨酸 Cys (C) 3 0.5 脯氨酸 Pro (P) 39 6.9 谷氨酰胺 Gln (Q) 26 4.6 丝氨酸 Ser (S) 68 12.0 谷氨酸 Glu (E) 32 5.6 苏氨酸 Thr (T) 38 6.7 甘氨酸 Gly (G) 22 3.9 色氨酸 Trp (W) 3 0.5 组氨酸 His (H) 15 2.6 酪氨酸 Tyr (Y) 8 1.4 异亮氨酸 Ile (I) 42 7.4 缬氨酸 Val (V) 28 4.9
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