Study on immunoprotection of eukaryotic expression plasmids of Streptococcus iniae simA and pgmA in Oreochromis niloticus
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摘要:
尼罗罗非鱼 (Oreochromis niloticus) 是世界水产养殖业中的重要经济鱼类，但在养殖生产中易受海豚链球菌 (Streptococcus iniae) 感染而致病致死，使用疫苗是一种相对理想的防感染措施。该研究采用海豚链球菌simA、pgmA基因构建的真核表达载体作为DNA疫苗，肌肉注射罗非鱼评估疫苗保护效果。免疫后在DNA和RNA水平上，在注射鱼体内检测到2个目的基因。首次免疫后第7至第28天，鳃、肝、肾脏、头肾中疫苗组的白介素1 (Interleukin，IL-1β) 与肿瘤坏死因子 (Tumor Necrosis Factor，TNF-α) 表达量高于PBS对照组；疫苗组的抗体滴度、血清抗菌活性显著 (P<0.05) 高于PBS对照组。攻毒后，注射pcDNA3.1-pgmA、pcDNA3.1-simA、pcDNA3.1-pgmA与pcDNA3.1-simA等比例混合疫苗的相对保护率 (Relative percent survival，RPS) 分别为60.7%、49.9%和75.0%。结果表明所制备的疫苗具有免疫保护效果，可作为候选疫苗。
Abstract:Nile tilapia (Oreochromis niloticus) is an important commercial fish in aquaculture in the world. However, it is easy to be infected by Streptococcus iniae in the breeding production. The use of vaccine is a relatively ideal anti infection measure. In this study, eukaryotic expression vectors (DNA vaccine) were constructed by taking the simA and pgmA genes of S. iniae as the target genes. Then protective efficacy was evaluated by intramuscular injection of tilapia. Two target genes were detected in the injected fish at DNA and RNA levels after immunization. Besides, 7−28 d after the first immunization, the expression levels of interleukin-1 (IL-1β) and Tumor Necrosis Factor (TNF-α) in the gill, liver, kidney and head kidney of the vaccinal group were higher to some extent than those in the PBS control group. The antibody titer and antibacterial activity of immunized groups were significantly higher than those of control groups (P<0.05). Two weeks after being challenged with S. iniae, the relative percent survival of mixed vaccines of pcDNA3.1-pgmA, pcDNA3.1-simA and pcDNA3.1-pgmA, with pcDNA3.1-simA were 60.7%, 49.9% and 75.0%, respectively. It is revealed that the vaccine prepared in this paper has immune protection effect and can be used as a candidate vaccine.
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Keywords:
- Nile tilapia /
- Streptococcus iniae /
- DNA vaccine /
- simA gene /
- pgmA gene
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尼罗罗非鱼 (Oreochromis niloticus) 是在世界范围内被大量养殖的重要经济鱼类，但在养殖过程中易受海豚链球菌 (Streptococcus iniae) 感染引起脑膜脑炎，症状为嗜睡、背部僵硬和游泳失衡，最终导致死亡[1]。此外，该细菌可致人畜共患，易感染免疫力低下的人，引起败血症、中毒性休克综合症、皮肤炎症等疾病[2]。目前，在工厂化养殖罗非鱼的过程中，防治海豚链球菌以抗生素为主[3]。然而，滥用抗生素会带来各种副作用。疫苗的开发对预防该细菌提供了一种安全可靠的新思路。
DNA疫苗是一种新型疫苗，具有诸多优点：1) 制备简单，成本低廉；2) 便于改造而产生更多功效；3) 易保存运输[4]。研究发现，肌肉注射质粒后，外源质粒整合到宿主DNA中的概率低到可以忽略不计[5]，证实了DNA疫苗的安全性。
葡萄糖磷酸变位酶 (Phosphoglucomutase, PGM) 对于维持海豚链球菌毒力必不可少，它在维持细胞壁形态、荚膜表达和抗免疫清除中起重要作用[6]，由pgmA基因编码。PGM亚单位疫苗免疫牙鲆 (Paralichthys olivaceus)，可诱导sIg+淋巴细胞、血清IgM、ACP和POD活性显著升高，攻毒后产生64%的相对保护率(Relative percent survival，RPS)，表明PGM可以作为疫苗候选物[7]。
M蛋白是在A族链球菌表面发现的研究最广泛的毒力因子之一，它与宿主结合体相互作用可帮助细菌逃避宿主的免疫应答反应[8]。海豚链球菌的M蛋白为SiM (S. iniae M-like protein, SiM)，由simA或simB基因编码[9]。表达simA基因的乳酸菌免疫牙鲆，3个月后用腹腔注射和浸泡两种方式攻毒，RPS分别为84%和82%[10]。以海豚链球菌类M蛋白基因突变株BY-1ΔsimA为减毒活疫苗免疫昆明鼠，攻毒后RPS为77.8%，与灭活疫苗组的RPS (55.5%) 之间差异无统计学意义。结果表明，海豚链球菌突变株BY-1ΔsimA可以有效保护昆明鼠免受该菌感染，是一种较为理想的减毒活疫苗候选物[11]。
综上，本研究选择海豚链球菌的毒力基因simA、pgmA构建真核表达载体，通过免疫罗非鱼检测其免疫保护效果，为海豚链球菌DNA疫苗商业化做铺垫，为后续的研究提供可靠的理论基础和实验数据，以减少罗非鱼养殖中受到海豚链球菌感染而带来的巨大损失。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
尼罗罗非鱼购自广东省广州市宝岗水产养殖有限公司，体质量为 (30±5) g，按照30尾·100 L−1的密度饲养于水族缸，水温28 ℃，24 h充气，饲养用水为过滤后的循环水，每天换水1次，吸排泄物1次，早晚各按照体质量的4%的饲料质量喂食。
sn03株海豚链球菌由中国水产科学研究院珠江水产研究所卢迈新研究员馈赠，培养于BHI (脑心浸液肉汤37.5 g于1 000 mL ddH2O) 培养基。
1.2 毒力基因simA、pgmA的克隆及生物信息学分析
按GenBank中查到的simA、pgmA基因序列 (登录号EU287919、AY846302) 设计引物，引物中加入BamH I和Xho I酶切位点，序列为：simA-F: CGGGATCCATTTGTATAAGGAGGTAAGC；simA-R: CCCTCGAGAGTGAATTACTTTGGAGCTG；pgmA-F: CGGGATCCATGACTTATACAGAAAATTATC；pgmA-R: CCCTCGAGCTAATTCACAAAAGTGTTGATTTC。
使用细菌DNA提取试剂盒 (天根，Tiangen) 提取海豚链球菌基因组DNA作为模板，PCR扩增目的基因，体系为：蒸馏水32 μL，10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5 μL，2 mmol·L−1 dNTPs 5 μL，25 mmol·L−1 MgSO4 3 μL，正向引物1.5 μL，反向引物1.5 μL，模板 DNA 1 μL，KOD 1 μL；程序为：94 ℃ 2 min，98 ℃ 10 s，Tm 30 s，68 ℃ 2 min，68 ℃ 5 min，重复40个循环 (simA, pgmA的Tm值分别为55 ℃, 48 ℃)。PCR后回收扩增产物，与pGEM-T Easy载体连接转化入感受态细胞，通过菌液PCR、双酶切、测序等确定最终序列。
用NCBI BlastX将核苷酸序列翻译为氨基酸序列，ExPASy的Protparam程序预测氨基酸数目、蛋白质分子量、等电点。用NCBI CD Search分析基因的保守结构域，Mega 7软件构建进化树。
1.3 真核重组质粒构建及提取
将含目的序列的细菌扩大培养，用Plasmid Mini Kit I (Omega)提取simA-T、pgmA-T重组质粒，提取物及pcDNA3.1 (+) 质粒用TaKaRa QuickCut双切酶。酶切后连接，产物分别命名为pcDNA3.1-simA和pcDNA3.1-pgmA，之后进行转化、测序。扩大培养含正确序列的细菌，使用无内毒素质粒大规模提取试剂盒 (天根) 提取pcDNA3.1-simA、pcDNA3.1-pgmA和pcDNA3.1 (+)质粒。
1.4 免疫
罗非鱼暂养2周稳定后，检测其有无海豚链球菌感染：1) 取血清与海豚链球菌进行凝集试验；2) 蘸取肝、脾、头肾黏液接种于BHI培养基，观察有无细菌生长。检测质粒安全性：1) 质粒涂布于BHI培养基观察有无细菌生长；2) 质粒预先注射一部分罗非鱼，观察2周内其摄食、行动与死亡情况。随机选约45 g的罗非鱼背部肌肉注射质粒，共设5组：3个疫苗组分别注射pcDNA3.1-simA、pcDNA3.1-pgmA、混合疫苗，2个对照组分别注射pcDNA3.1(+)和PBS，每组90尾鱼，分为3个平行组，注射质量浓度0.5 μg·μL−1，体积100 μL，其中混合疫苗为pcDNA3.1-simA和pcDNA3.1-pgmA等浓度等体积混合物。2周后进行加强免疫，质量浓度0.5 μg·μL−1，体积100 μL，以达到鱼类DNA疫苗注射的最佳剂量。
每组随机选9尾鱼在首次免疫前1天、免疫后第7、第14、第21、第28天，取鳃、肝、脾、肾、头肾及血清。每尾采血0.7~1 mL，室温静置2~4 h后4 ℃、7 500 r·min−1离心15 min，小心吸出血清，分装后−80 ℃保存。取组织后迅速浸入RNA Keeper中，4 ℃过夜后转移至−20 ℃。
测得该细菌的LD50为3.4×107，首次免疫28 d后用100 μL、8.9×108 CFU·mL−1的海豚链球菌攻毒，保持水温 (31±1) ℃，每天换水2次，记录2周内各组鱼的死亡情况，计算RPS。
$$ {\rm{RPS}}= [1-({\text{疫苗组死亡率}}/{\text{对照组死亡率}})] \times 100{\text{%}} $$ 1.5 DNA及RNA水平检测基因的分布
参照天根海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取肝、脾、头肾的基因组DNA，PCR检测simA和pgmA在DNA水平的分布；用RNA提取试剂 (Biomiga) 提取总RNA，cDNA合成试剂盒 (TOYOBO) 逆转录成cDNA后，PCR检测基因在RNA水平的分布。分别以海豚链球菌DNA和H2O作为模板设置阳性对照和阴性对照。
1.6 微量凝集实验测定罗非鱼血清抗体滴度
取血清，参照Anderson[12]的微量凝集实验方法，以海豚链球菌sn03为抗原测定抗体滴度。
1.7 血清抗菌活力 (Ua) 的测定
取血清，参照王雷等[13]、Boman等[14]和徐增辉[15]的方法改进后用酶标仪测定血清抗菌活力。
1.8 实时定量荧光PCR分析检测免疫相关基因的表达
合成IL-1β、TNF-α基因引物，以β-actin作为内参基因 (序列见表1)；用TOYOBO试剂盒逆转录1 μg从鳃、肝、肾脏、头肾中提取的RNA；所得cDNA稀释5倍，参照SYBR Green Realtime PCR Master Mix plus kit (TOYOBO) 在冰上配制反应液，4 ℃、3 000×g离心3 min，放入Roche Light 480 II，设置程序为：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，40个循环。反应完后分析溶解曲线和数据：定量仪自带的软件导出CT值，按照2−△△Ct法计算结果，以β-actin的mRNA表达量进行校正[16]。以PBS组为对照，设其mRNA表达量为1。
表 1 免疫相关基因定量引物Table 1. Immune genes' primers for real-time PCR名称
Name序列
SequenceIL-1β-F CAGGTGGTGGAAGTGTGTCA IL-1β-R GGTCAAACTGGAGCGCAAAC TNF-α-F CCTGCTGTTTGCCTGGTACT TNF-α-R GCTTTGCTGCTGATCCGTTT β-actin-F TCAGCAAGCAGGAGTACGATG β-actin-R AGCTGAAGTTGTTGGGCGTT 1.9 数据分析
用Excel 2010双尾t检验分析组间差异，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著，P>0.05表示差异不显著。
2. 结果
2.1 毒力基因克隆及生物信息学分析
2个目的基因的生物信息学分析结果见表2。
表 2 simA、pgmA基因生物信息学分析Table 2. Bioinformatics analysis of simA and pgmA genes分析项目
Analysis itemsimA基因
simA genepgmA基因
pgmA geneORF区长度
Length of ORF1 566个 碱基 1 716个 碱基 GC碱基含量
GC base content36.59% 38.69% 编码氨基酸的数目
Number of coding amino acids521 571 蛋白分子量预测
Molecular weight of protein57.5 kD 62.4 kD 蛋白分子式预测
Protein molecular formulaC2481H4159N705O827S12 C2804H4352N714O876S10 等电点
Isoelectric point5.78 4.68 保守性
Conservatism与QMA0248株相似度为99% 与DGX07株相似度为100%；与QMA0248株相似度为99% 2.2 进化树分析
1) 进化树分析显示，sn03株SiM蛋白与海豚链球菌其他菌株的该蛋白相似度最高，与IUSA1株假设性M蛋白聚为一类。与细胞壁锚定结构域蛋白亲缘关系较相近，聚为一大类。与其他链球菌，如乳房链球菌 (S. uberis) 细胞壁锚定结构域蛋白以及该细菌的乳铁蛋白结合蛋白等亲缘关系较远，与副乳房链球菌 (S. parauberis)、停乳链球菌 (S. dysgalactiae)、狗链球菌 (S. canis)的M蛋白亲缘关系更远，除此之外与之具有亲缘关系的蛋白还有纤维蛋白原和免疫球蛋白结合蛋白、Mrp蛋白、YSIRK型信号肽蛋白、Spa蛋白等 (图1)。
2) 与PGM蛋白具有亲缘关系的是链球菌属的葡萄糖磷酸变位酶，sn03株PGM蛋白与海豚链球菌其他菌株的PGM蛋白亲缘关系最为密切，聚为一类，与乳房链球菌PGM蛋白聚为一大类。与马链球菌(S. equi)、狗链球菌、停乳链球菌、肺炎链球菌 (S. pneumoniae)、牛链球菌 (S. bovimastitidis)、猪链球菌 (S. porcinus)、对虾链球菌 (S. penaeicida) 等其他链球菌的PGM蛋白亲缘关系较远(图2)。
2.3 基因在DNA及RNA水平的肝、脾、头肾组织中的分布
首次免疫后7~28 d，在DNA及RNA水平上，simA、pgmA基因分别在pcDNA3.1-simA、pcDNA3.1-pgmA疫苗组以及混合疫苗组的肝、脾、头肾中有分布，在2个对照组未检测到；第28天分布结果见图3和图4。
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图 3 首次免疫后28 d目的基因在DNA水平上的组织分布a-1、a-2、a-3分别为肝、脾、头肾simA分布；M. Marker 3；1. pcDNA3.1-simA组；2. 混合疫苗组；3、4分别为PBS组、pcDNA3.1 (+)组；5. 阳性对照；6. 阴性对照b-1、b-2、b-3分别为肝、脾、头肾pgmA分布；M. DS2000；1. 阳性对照；2. 阴性对照；3、4分别为pcDNA3.1−pgmA组及混合疫苗组；5. PBS组；6. pcDNA3.1 (+)组Figure 3. Tissue distribution of target gene at DNA level at 28 d after first immunizationa-1, a-2, a-3. Expression maps of liver, spleen and head kidney, respectively; M. Marker3; 1. pcDNA3.1-simA group; 2 Mixture vaccine group; 3–4. PBS group and pcDNA3.1(+) group, respectively; 5. Positive control; 6. Negative control b-1, b-2, b-3. Expression maps of liver, spleen and head kidney, respectively; M. DS2000; 1. Positive control; 2. Negative control; 3–4. pcDNA3.1-pgmA and mixture vaccine group respectively; 5. PBS group; 6. pcDNA3.1 (+) group![]()
图 4 首次免疫后28 d目的基因在RNA水平上的组织分布a-1、a-2、a-3分别为肝、脾、头肾simA分布；M. Marker 3；1. 阴性对照；2. 阳性对照；3. PBS组；4. pcDNA3.1 (+)组；5、6分别为混合疫苗组、pcDNA3.1 (+)-simA组 b-1、b-2、b-3分别为肝、脾、头肾pgmA分布；M. Marker 3；1. pcDNA3.1-pgmA组；2. 混合疫苗组；3. PBS组；4. pcDNA3.1 (+)组；5、6分别为阳性对照、阴性对照组Figure 4. Tissue distribution of target gene at RNA level at 28 d after first immunizationa-1, a-2, a-3. Expression maps of liver, spleen and head kidney, respectively; M. Marker3; 1. Positive control; 2. Negative control; 3. Mixture vaccine group; 4. pcDNA3.1-simA group; 5–6. PBS group and pcDNA3.1 (+) group, respectively;b-1, b-2, b-3. Expression maps of liver, spleen and head kidney, respectively; M. Marker 3; 1. pcDNA3.1-pgmA group; 2. Mixture vaccine group; 3. PBS group; 4. pcDNA3.1 (+) group; 5–6. Positive control and negative control, respectively2.4 血清抗体滴度
注射疫苗后疫苗组抗体滴度都有升高，混合疫苗组抗体滴度最高达到1∶2 056。疫苗组的滴度显著高于PBS对照组 (图5-a)。
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图 5 血清抗体滴度和抗菌活性n=3; *. 差异显著 (P<0.05，独立样本t检验)；后图同此Figure 5. Antibody titer and antibacterial activity in serumn=3; *. Significant difference (P<0.05, Inndependent t-test); the same case in the following figures2.5 血清抗菌活性
注射疫苗后1~4周疫苗组的血清抗菌活力均升高，第2周后疫苗组的抗菌活力显著高于PBS对照组 (图5-b)。
2.6 免疫相关基因IL-1β基因、TNF-α基因的表达量
2.6.1 鳃
IL-1β、TNF-α基因在3个疫苗组的表达量高于PBS组，混合疫苗组IL-1β基因表达显著高于PBS组，其余各组与PBS组差异不显著 (图6-a)。
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图 6 首次免疫28 d后鳃 (a)、肝 (b)、肾脏 (c) 和头肾 (d) 中免疫相关基因相对表达水平**. 差异极显著 (P<0.01)Figure 6. Relative expression of immune genes in parotid (a), liver (b), kidney (c) and head kidney (d) at 28 d after first immunization**. Very significant difference (P<0.01)2.6.2 肝脏
IL-1β基因表达在3个疫苗组和pcDNA3.1空载对照组高于PBS组，pcDNA3.1-simA、混合疫苗组的表达量极显著高于PBS组。TNF-α基因在3个疫苗组表达量高于对照组，混合疫苗组与对照组有极显著差异，在pcDNA3.1组的表达有轻微下调 (图6-b)。
2.6.3 肾脏
IL-1β基因在3个疫苗组表达量高于对照组，混合疫苗组的表达量极显著高于对照组。TNF-α基因表达量在3个疫苗组和空载对照组出现不同程度的上调 (高于对照组)，在混合疫苗组有显著性差异 (图6-c)。
2.6.4 头肾
IL-1β基因在3个疫苗组和空载对照组表达量上调，在混合疫苗组的表达量极显著高于PBS组。TNF-α基因表达量在3个疫苗组和空载对照组均出现不同程度的上调，pcDNA3.1-simA组和pcDNA3.1-pgmA组显著高于PBS组，混合疫苗组表达量极显著高于PBS组 (图6-d)。
2.7 免疫保护率
1) 通过计算成活率绘制成活率曲线图，可以直观显示罗非鱼攻毒后的死亡趋势 (图7)。每组成活率在攻毒后1~5 d内均下降，之后趋于稳定，第14天成活率最低、最高组分别是PBS组、混合疫苗组。
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图 7 罗非鱼免疫攻毒后存活状况 (n=30)Figure 7. Survival status of tilapia after injection with S. iniae2) 疫苗效果见表3。混合疫苗的保护效果最好，RPS为75.0%；pcDNA3.1-pgmA和pcDNA3.1-simA疫苗RPS分别为60.7%和49.9%；质粒载体pcDNA3.1本身也具有一定的免疫保护效果，RPS为10.7%。
表 3 DNA疫苗对罗非鱼的相对保护率Table 3. Relative protection rate of DNA vaccine against tilapia组别
Group前处理
Pre-processing总尾数
Total死亡尾数
Death number死亡率
Mortality/%相对保护率
RPS/%1 PBS 30 28 93.3 − 2 pcDNA3.1-simA 30 14 46.7 49.9 3 pcDNA3.1-pgmA 30 11 36.7 60.7 4 混合疫苗 30 7 23.3 75.0 5 pcDNA3.1(+) 30 25 83.3 10.7 3. 讨论
海豚链球菌是罗非鱼养殖中的一种常见致病菌，已给养殖业造成了严重的经济损失；人类也可能受其感染，从而威胁人类生命安全。本文选择海豚链球菌两大毒力基因simA和pgmA构建了DNA疫苗，旨在保护罗非鱼抵抗海豚链球菌的感染。
PCR和RT-PCR检测DNA疫苗的抗原基因在体内的分布已有报道，在大西洋鲑 (Salmo salar) 肌肉注射DNA质粒后，在鱼体内能检测到质粒的分布[17]，Seternes等[18]给大西洋鳕 (Gadus morhua)注射质粒后，发现部分质粒在注射部位被核酸酶消化掉，另一些跟随血液运输分布到不同组织，在此过程中，质粒也会有局部降解。给小鼠注射DNA疫苗，免疫后1~2个月皆能检测到抗原基因相应条带[19]。王蓓等[20]构建了无乳链球菌DNA疫苗，免疫罗非鱼后第7、第28天在肌肉、头肾、鳃、肝脏和脾脏中检测到了目的基因的分布。上述研究结果说明根据抗原基因在被免疫动物体内的分布情况，可以推断疫苗的吸收和转录。本文的实验结果与上述报道相似，通过PCR定性检测到simA和pgmA基因在肝脏、脾脏和头肾中均有分布，表明所注射的质粒已被罗非鱼肌肉吸收，通过血液循环等运输到了肝、脾、头肾这些免疫器官内，RT-PCR的检测结果说明质粒利用机体的DNA转录系统在鱼体内进行了转录。
抗体滴度是代表生物体产生抗体数量最直接的数据。肌肉注射是鱼类接种DNA疫苗最常见的方式，比腹腔注射保护效果好，产生的抗体水平更高[21]，本文用灵敏度较高的90° V型血凝板测定抗体滴度[22]，疫苗组与对照组抗体水平的显著性差异，证明构建的真核重组质粒能利用罗非鱼的蛋白质表达系统表达出相应的抗体；注射pcDNA3.1(+) 后也产生了微量的抗体，推测该质粒也具有免疫保护作用。
血清抗菌活性是体液免疫和细胞免疫共同作用的结果，是非特异性免疫指标之一，可间接反映疫苗保护效果[23]。本研究中抗菌活力随时间升高，推测是DNA疫苗在体内转化成的抗体蛋白刺激机体产生抗菌物质，该物质具体是抗菌肽、溶菌酶、抗体还是凝集素尚不能确定。
DNA疫苗进入体内后被抗原提呈细胞 (APC) 摄取，转录翻译成免疫原性蛋白，通过与主要组织相容性复合物MHC I和MHC II结合被加工成肽段，被T细胞受体 (TCR) 识别后，通过CD8+T、CD4+T细胞刺激B细胞和T细胞启动细胞和体液免疫反应[24]，IL-1β和TNF-α在上述过程中起着重要作用[25]。本研究中pcDNA3.1-simA和pcDNA3.1-pgmA组的IL-1β的表达比对照组表达量高约3~4倍，而混合疫苗组的表达量更高，说明疫苗的注射激活了机体的免疫反应，刺激了巨噬细胞产生白介素，在免疫应答过程中介导免疫细胞的活化与增殖，TNF-α在疫苗组的表达量均有升高，说明疫苗的注射激活了细胞免疫过程。Ma等[26]构建了阳离子PLGA微球负载的sip基因DNA疫苗，按照低、中、高剂量免疫罗非鱼，低、中剂量疫苗组IL-Iβ、TNF-ɑ的表达量均高于对照组，高剂量疫苗组IL-Iβ几乎没有表达，而TNF-ɑ的表达量为对照组的70倍左右，该结果与本研究结果相差较大，推测原因可能是PLGA材料包裹DNA疫苗后，药物吸收度增加[27−28]，疫苗的有效性提高。
本研究的两个目的基因ORF区过长，无法将两个基因构建到同一载体上形成嵌合基因。因此借鉴常用的二价灭活疫苗的思路，通过混合质粒构建二价疫苗。关于混合质粒构建核酸疫苗的方法在小鼠和犬中已有相关研究，杨爱琼和谢勇恩[29]通过混合VR1020-85A、VR1020-E6和VR1020-P10质粒构建了结核杆菌重组质粒，免疫小鼠后能产生一定程度的免疫保护效应。郑颖[30]根据犬瘟热病毒的H基因、犬细小病毒的VP1基因、犬2型腺病毒F基因的核苷酸序列，分别构建了pIRCDV-H、pIRESVP1和pcCAV-F 3个真核表达质粒，混合后免疫犬，攻毒结果显示接种混合质粒的犬在一定程度上可以抵抗强毒病毒的攻击。本文虽然未对两种毒力基因进行融合，但是混合疫苗的效果仍优于单基因疫苗。
鱼类DNA疫苗尚处于实验室研究阶段，使用疫苗后的相对成活率为50%~93%[31-33]，本研究构建的3种疫苗均具有免疫保护作用，但其保护效果并不是非常理想，今后的研究可以通过下述方法增强疫苗的免疫保护效果：使用合适的包裹材料提高疫苗的利用率、筛选合适的毒力因子构建多价疫苗、改造质粒增强免疫效果等。
综上所述，本研究结果表明，以海豚链球菌毒力基因simA、pgmA为目的基因构建的DNA疫苗对罗非鱼具有一定的免疫保护效果，本文构建的疫苗可以作为海豚链球菌的候选疫苗。
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图 3 首次免疫后28 d目的基因在DNA水平上的组织分布
a-1、a-2、a-3分别为肝、脾、头肾simA分布；M. Marker 3；1. pcDNA3.1-simA组；2. 混合疫苗组；3、4分别为PBS组、pcDNA3.1 (+)组；5. 阳性对照；6. 阴性对照b-1、b-2、b-3分别为肝、脾、头肾pgmA分布；M. DS2000；1. 阳性对照；2. 阴性对照；3、4分别为pcDNA3.1−pgmA组及混合疫苗组；5. PBS组；6. pcDNA3.1 (+)组
Figure 3. Tissue distribution of target gene at DNA level at 28 d after first immunization
a-1, a-2, a-3. Expression maps of liver, spleen and head kidney, respectively; M. Marker3; 1. pcDNA3.1-simA group; 2 Mixture vaccine group; 3–4. PBS group and pcDNA3.1(+) group, respectively; 5. Positive control; 6. Negative control b-1, b-2, b-3. Expression maps of liver, spleen and head kidney, respectively; M. DS2000; 1. Positive control; 2. Negative control; 3–4. pcDNA3.1-pgmA and mixture vaccine group respectively; 5. PBS group; 6. pcDNA3.1 (+) group
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图 4 首次免疫后28 d目的基因在RNA水平上的组织分布
a-1、a-2、a-3分别为肝、脾、头肾simA分布；M. Marker 3；1. 阴性对照；2. 阳性对照；3. PBS组；4. pcDNA3.1 (+)组；5、6分别为混合疫苗组、pcDNA3.1 (+)-simA组 b-1、b-2、b-3分别为肝、脾、头肾pgmA分布；M. Marker 3；1. pcDNA3.1-pgmA组；2. 混合疫苗组；3. PBS组；4. pcDNA3.1 (+)组；5、6分别为阳性对照、阴性对照组
Figure 4. Tissue distribution of target gene at RNA level at 28 d after first immunization
a-1, a-2, a-3. Expression maps of liver, spleen and head kidney, respectively; M. Marker3; 1. Positive control; 2. Negative control; 3. Mixture vaccine group; 4. pcDNA3.1-simA group; 5–6. PBS group and pcDNA3.1 (+) group, respectively;b-1, b-2, b-3. Expression maps of liver, spleen and head kidney, respectively; M. Marker 3; 1. pcDNA3.1-pgmA group; 2. Mixture vaccine group; 3. PBS group; 4. pcDNA3.1 (+) group; 5–6. Positive control and negative control, respectively
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图 5 血清抗体滴度和抗菌活性
n=3; *. 差异显著 (P<0.05，独立样本t检验)；后图同此
Figure 5. Antibody titer and antibacterial activity in serum
n=3; *. Significant difference (P<0.05, Inndependent t-test); the same case in the following figures
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图 6 首次免疫28 d后鳃 (a)、肝 (b)、肾脏 (c) 和头肾 (d) 中免疫相关基因相对表达水平
**. 差异极显著 (P<0.01)
Figure 6. Relative expression of immune genes in parotid (a), liver (b), kidney (c) and head kidney (d) at 28 d after first immunization
**. Very significant difference (P<0.01)
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图 7 罗非鱼免疫攻毒后存活状况 (n=30)
Figure 7. Survival status of tilapia after injection with S. iniae
表 1 免疫相关基因定量引物
Table 1 Immune genes' primers for real-time PCR
名称
Name序列
SequenceIL-1β-F CAGGTGGTGGAAGTGTGTCA IL-1β-R GGTCAAACTGGAGCGCAAAC TNF-α-F CCTGCTGTTTGCCTGGTACT TNF-α-R GCTTTGCTGCTGATCCGTTT β-actin-F TCAGCAAGCAGGAGTACGATG β-actin-R AGCTGAAGTTGTTGGGCGTT 
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表 2 simA、pgmA基因生物信息学分析
Table 2 Bioinformatics analysis of simA and pgmA genes
分析项目
Analysis itemsimA基因
simA genepgmA基因
pgmA geneORF区长度
Length of ORF1 566个 碱基 1 716个 碱基 GC碱基含量
GC base content36.59% 38.69% 编码氨基酸的数目
Number of coding amino acids521 571 蛋白分子量预测
Molecular weight of protein57.5 kD 62.4 kD 蛋白分子式预测
Protein molecular formulaC2481H4159N705O827S12 C2804H4352N714O876S10 等电点
Isoelectric point5.78 4.68 保守性
Conservatism与QMA0248株相似度为99% 与DGX07株相似度为100%；与QMA0248株相似度为99%
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表 3 DNA疫苗对罗非鱼的相对保护率
Table 3 Relative protection rate of DNA vaccine against tilapia
组别
Group前处理
Pre-processing总尾数
Total死亡尾数
Death number死亡率
Mortality/%相对保护率
RPS/%1 PBS 30 28 93.3 − 2 pcDNA3.1-simA 30 14 46.7 49.9 3 pcDNA3.1-pgmA 30 11 36.7 60.7 4 混合疫苗 30 7 23.3 75.0 5 pcDNA3.1(+) 30 25 83.3 10.7
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