Study on immunoprotection of eukaryotic expression plasmids of Streptococcus iniae simA and pgmA in Oreochromis niloticus
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摘要:
尼罗罗非鱼 (Oreochromis niloticus) 是世界水产养殖业中的重要经济鱼类，但在养殖生产中易受海豚链球菌 (Streptococcus iniae) 感染而致病致死，使用疫苗是一种相对理想的防感染措施。该研究采用海豚链球菌simA、pgmA基因构建的真核表达载体作为DNA疫苗，肌肉注射罗非鱼评估疫苗保护效果。免疫后在DNA和RNA水平上，在注射鱼体内检测到2个目的基因。首次免疫后第7至第28天，鳃、肝、肾脏、头肾中疫苗组的白介素1 (Interleukin，IL-1β) 与肿瘤坏死因子 (Tumor Necrosis Factor，TNF-α) 表达量高于PBS对照组；疫苗组的抗体滴度、血清抗菌活性显著 (P<0.05) 高于PBS对照组。攻毒后，注射pcDNA3.1-pgmA、pcDNA3.1-simA、pcDNA3.1-pgmA与pcDNA3.1-simA等比例混合疫苗的相对保护率 (Relative percent survival，RPS) 分别为60.7%、49.9%和75.0%。结果表明所制备的疫苗具有免疫保护效果，可作为候选疫苗。
Abstract:Nile tilapia (Oreochromis niloticus) is an important commercial fish in aquaculture in the world. However, it is easy to be infected by Streptococcus iniae in the breeding production. The use of vaccine is a relatively ideal anti infection measure. In this study, eukaryotic expression vectors (DNA vaccine) were constructed by taking the simA and pgmA genes of S. iniae as the target genes. Then protective efficacy was evaluated by intramuscular injection of tilapia. Two target genes were detected in the injected fish at DNA and RNA levels after immunization. Besides, 7−28 d after the first immunization, the expression levels of interleukin-1 (IL-1β) and Tumor Necrosis Factor (TNF-α) in the gill, liver, kidney and head kidney of the vaccinal group were higher to some extent than those in the PBS control group. The antibody titer and antibacterial activity of immunized groups were significantly higher than those of control groups (P<0.05). Two weeks after being challenged with S. iniae, the relative percent survival of mixed vaccines of pcDNA3.1-pgmA, pcDNA3.1-simA and pcDNA3.1-pgmA, with pcDNA3.1-simA were 60.7%, 49.9% and 75.0%, respectively. It is revealed that the vaccine prepared in this paper has immune protection effect and can be used as a candidate vaccine.
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Keywords:
- Nile tilapia /
- Streptococcus iniae /
- DNA vaccine /
- simA gene /
- pgmA gene
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斑节对虾 (Penaeus monodon) 适盐度广、生长迅速、出肉率高，是我国和世界三大主要养殖对虾之一[1]。目前我国斑节对虾的养殖模式主要有池塘高密度养殖、虾蟹混养和虾鱼混养等方式[2]。虾蟹混养是一种高空间利用率、高收益的虾类和蟹类2种不同甲壳动物混合养殖的复合生态养殖模式[3]。蟹类主要是锯缘青蟹 (Scylla serrata)，由于蟹类为杂食性，能够摄食病弱或死亡的鱼虾、小型底栖动物等，对于对虾残饵的利用和水质净化有一定作用，可促进养殖塘底层物质循环和能量流动，提高营养物质的利用率[4]。虾蟹混养是一种复合生态养殖模式，因其持续稳定的养殖产量而备受欢迎。
浮游植物是指在水体中生活的微小植物，大小在几微米至几百微米之间，是水生生态系统中最主要的初级生产者，是食物网的基础[5]。浮游植物通过光合作用将水体中无机物转换为有机物，是水体中动物的主要食物来源，并且能够提高养殖水体中溶氧 (DO) 含量、吸收水体中的有毒有害物质、降低氨氮含量，保持养殖水体的稳定，其群落结构的变化对水生生态系统有着重要影响，主要包括能量流动、物质循环和信息传递[6]。浮游植物的生长繁殖极易受到外界环境的影响，其对环境条件的变化能够迅速做出响应，因此被视作水生生态系统的重要指示物[7-8]。
浮游植物作为饵料生物的基础，在池塘养殖过程中发挥了重要作用，与其相关的研究也日益受到重视。李俊伟等[9]研究对虾池塘混养鲻鱼 (Mugil cephalus) 和罗非鱼 (Oreochroms mossambcus) 对水环境及对虾生长的影响，探讨了浮游植物的变化特征；孔谦[10]也对凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 与鲻鱼混养中精养池的理化因子进行了研究。目前有关虾蟹混养的研究较少，特别是针对混养池塘浮游植物群落结构的研究更是鲜见报道，本研究对广州市番禺区3个虾蟹混养池塘进行逐月调查，分析和探讨了养殖过程中浮游植物种类组成及其数量变化状况，旨在摸清虾蟹混养池塘浮游植物种群结构特征及其与环境因子的关系，以期为虾蟹混养的健康发展提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 养殖池塘
在广州市番禺区十六涌选取3个虾蟹混养池塘 (1#、2#、3#)，水深2 m，3月初开始投放虾苗，每20 d投放1次；4月初开始投放蟹苗，每2个月投放1次。虾蟹分别投放4次，6月初开始捕获虾蟹。2018年3—11月对3个混养池塘进行逐月调查，采集池塘水质样品和浮游植物样品，带回实验室测定和鉴定。
1.2 样品的采集、测定和鉴定
1.2.1 水质样品
1) 样品采集和保存。采用容积为5 L的有机玻璃采水器，在每个池塘四角和中央采集表层水，用滤膜现场过滤，用玻璃瓶收集适量过滤水保存，带回实验室测定。2) 样品测定。营养盐的分析测定参照国家标准《海洋调查规范第2部分：海洋水文观测》 (GB/T 12763.2—2007)、《海洋调查规范第4部分：海洋化学要素观测》 (GB/T12763.4—2007) 和《海洋监测规范第4部分：海水分析》 (GB 17378.4—2007)；叶绿素a的分析测定参照《海洋监测规范第7部分：近海污染生态监测和生物监测》 (GB 17378.7—2007) 中规定的方法。
1.2.2 浮游植物样品
1) 样品采集和保存。在每个池塘四角和中央用5 L采水器各采水样一份，经浮游生物网过滤后混合装入1 L采样瓶，并现场加入适量的5%甲醛溶液固定保存，带回实验室[11]。在实验室静置24 h，弃去上清液，浓缩后于高倍镜下鉴定浮游植物种类，并进行数量分析。2018年9月由于突发事件未采集到样品。2) 样品鉴定。采用显微镜鉴定。浮游植物样品定性分析和种类鉴定方法依据《中国淡水藻类》[12]、《中国海藻志》[13]、《中国淡水藻类》[14]、《中国淡水生物图谱》[15]、《环境微生物图谱》[16]。在10×40倍光学显微镜下进行，每次取0.1 mL样品放入浮游植物方格计数板计数，观察计数格，每个样品计数2片，2次求平均值作为最终结果，2片计数结果差异不超过15%，若相差较大，则再取1次计数，然后取数值相差较小的2片取平均值，即为浮游植物细胞密度[17]。
1.3 分析和评价方法
浮游植物物优势度 (Y) 应用以下公式计算：
$$ Y=\dfrac{{{n_i}}}{N}\times{f_i} $$ 式中ni为第i种的个体数；fi是该种在各站中出现的频率；N为所有站每个种出现的总个体数。
Shannon-Weaver多样性指数的计算公式为：
$$H' = - \sum\limits_{i = 1}^S {{P_i}{{\log }_2}{P_i}} $$ 式中H′为种类多样性指数，S为样品中的种类总数，Pi为第i种的个体数与总个体数的比值。
数据分析、处理以及图表的制作使用Excel 2016、Origin 2017、Canoco 5等软件。
2. 结果
2.1 种类组成
浮游植物调查结果见附录1 (详见http://dx.doi.org/10.12131/20190233的资源附件)。共鉴定出浮游植物5门29种，其中硅藻种类最多 (19种)，占浮游植物种类数的65.5%；其次是蓝藻，共5种，占浮游植物种类数17.2%；甲藻3种，绿藻和裸藻各1种。每次采样中各塘浮游植物出现频次最多的有2门5种，其中硅藻门4种，分别为尖布纹藻 (Gyrosigma acuminatum)、新月菱形藻 (Nitzschia closterium)、柔弱菱形藻 (N. delicatissima) 和直舟形藻 (Navicula directa)，出现的频率分别为10、10、22和9；蓝藻门1种，为小颤藻 (Oscillatoria tenuis)，出现的频率为10 (图1-a)。
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图 1 各塘不同月份浮游植物种类组成 (a) 和密度百分比 (b)Figure 1. Species composition (a) and percentage of cell density (b) of phytoplankton in each pond in different months各池塘的浮游植物种类在时间上的差异不明显，基本呈先波动下降后小幅度增加的趋势，1#塘浮游植物种类数波动较大。各池塘出现种类数最多的月份各不相同 (图2-a)。其中1#塘出现种类数最多的为5月 (10种)；2#和3#塘种类数最大值均出现在养殖初期 (分别为6种和8种)。各月份均以硅藻门种类数最多，其次为蓝藻门和甲藻门，绿藻门和裸藻门的种类仅在养殖后期出现。
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图 2 各塘浮游植物种类数 (a)、细胞密度 (b) 和多样性指数 (c) 的变化趋势Figure 2. Monthly variation of species (a), cell density (b) and biodiversity index (c) of phytoplankton in each pond![]()
图 3 养殖池塘浮游植物与环境因子冗余排序图Figure 3. RDA ordination biplot of phytoplankton species and environmental variables in pond2.2 细胞密度
各池塘浮游植物细胞密度的变化趋势见图2-b。浮游植物细胞密度介于2.56×103~189.2×103个·m−3，最大值出现在养殖前期的3—4月，最小值在7—8月。1#塘4月细胞密度最大 (124.8×103个·m−3)，其次是5月 (52.92×103个·m−3)，7月最低 (6.0×103个·m−3)；2#塘3月细胞密度最大 (189.2×103个·m−3)，其次是4月 (119.6×103个·m−3)，8月最低 (2.56×103个·m−3)；3#塘3月细胞密度最大 (118.8×103个·m−3)，其次是4月 (82.13×103个·m−3)，10月最低 (7.2×103个·m−3)。整个调查期间，3个池塘浮游植物细胞密度的最高值或次高值均出现在3—4月，而较低值均出现在7—8月 (图2-b)。
各次调查浮游植物细胞密度的组成中均以硅藻门占较高的比例，其他4门藻类所占比例相对较低；各养殖池塘各门浮游植物细胞密度所占百分比变化波动不大，同一月份不同养殖塘浮游植物细胞密度存在较大差异 (图 1-b)。
2.3 优势种组成
各次调查中浮游植物出现的优势种见表1。其中以7月和11月2次调查出现的优势种最多 (均为6种)；3月和5月出现的优势种最少 (均为3种)。调查期间各混养池塘出现的优势种有硅藻门的奇异菱形藻、直舟形藻、柔弱菱形藻和尖布纹藻等；甲藻门的大角角藻；蓝藻门的小颤藻。其中柔弱菱形藻在8次调查中均为优势种，尖布纹藻、新月菱形藻和小颤藻在4次调查中为优势种，奇直舟形藻均在3次调查中为优势种，其他优势种在1~2次调查中为当次调查的优势种。由此可知，养殖初期优势种主要为硅藻门的种类，养殖中后期蓝藻门的种类优势度逐渐增加，成为优势种。
表 1 混养池塘浮游植物优势种Table 1. Dominant species of phytoplankton in polyculture pond优势种
Dominant species3月
Mar.4月
Apr.5月
May6月
Jun.7月
Jul.8月
Aug.10月
Oct.11月
Nov.奇异菱形藻 Nitzschia paradoxa 0.411 0.079 直舟形藻 Navicula directa 0.336 0.216 0.06 柔弱菱形藻 Nitzschia delicatissima 0.180 0.528 0.628 0.056 0.221 0.108 0.400 0.085 近缘斜纹藻 Pleurosigma affine 0.037 大角角藻 Ceratium macroceros 0.145 尖布纹藻 Gyrosigma acuminatum 0.445 0.197 0.028 0.026 小颤藻 Oscillatoria tenuis 0.060 0.134 0.386 0.307 寒带菱形藻 Nitzschia frigida 0.032 新月菱形藻 Nitzschia closterium 0.021 0.081 0.101 0.053 二形栅藻 Scenedesmus dimorphus 0.081 0.127 梭形裸藻 Euglena acus 0.020 银灰平裂藻 Merismopedia glauca 0.020 琼氏圆筛藻 Coscinodiscus jonesianus 0.035 平滑双眉藻 Amphora lavis 0.028 伏氏海毛藻 Thalassiothrix frauenfeldii 0.222 大颤藻 Oscillatoria maxima 0.047 2.4 Shannon-Weaver多样性指数
各混养池塘浮游植物多样性指数的变化趋势见图2-c。调查期间1#塘多样性指数介于0.802~2.140，在5月达到最高值，其次是3月，最低出现在6月；2#塘多样性指数介于0.998~2.247，在11月达到最高值，其次是7月，最低出现在8月；3#塘多样性指数介于0.468~2.597，在4月达到最高值，其次是5月，最低出现在6月。
各池塘多样性指数的变化趋势各不相同，1#塘4—6月的多样性指数呈先上升后下降的趋势；2#塘3—6月的多样性指数变化幅度较小，7—11月则呈先上升后下降再上升的趋势；3#塘4—11月的多样性指数呈先下降后上升的趋势。
各养殖塘内浮游植物多样性指数总体上表现为养殖前期低养殖后期高。根据马建新等[18]的浮游植物多样性指数评价标准，1#和2#塘全年的生物多样性都处于较好的范围内，3#塘养殖后期生物多样性水平较差 (图2-c)。
2.5 浮游植物与主要环境因子的关系
通过对浮游植物数据去趋势分析 (DCA)，发现排序轴长为2.561，小于3，浮游植物群落分布更接近线性模型，根据之前学者的研究内容[19-20]，本研究选取水温、pH、DO、总氮 (TN)、盐度、亚硝酸盐 (NO2 −-N)、硝酸盐 (NO3 −-N)、磷酸盐 (PO4 3−)和铵盐 (NH4 +) 9种环境因子和主要浮游植物优势种的细胞密度进行冗余分析 (RDA)，浮游植物代码和环境因子分见表2和表3。养殖池塘浮游植物和环境因子关系的RDA排序图结果见图3。轴1和轴2特征值分别为0.263和0.18，前2个环境因子与物种轴之间的相关系数分别为0.939和0.922，拟合度较好，排序轴可以较好地反映浮游植物优势种和环境因子之间的关系；物种-环境累计百分比分别为36.1%和60.9% (表4)。养殖塘中浮游植物细胞密度主要受到营养盐、盐度和pH的影响，不同藻类受到环境因子的影响差异显著 (图3)。本次调查中，B1 (小颤藻) 作为蓝藻门的主要优势种，其细胞密度与水温、pH和DO成显著正相关，水温和pH的影响较大；A2 (柔弱菱形藻)、A4 (奇异菱形藻)、A3 (直舟形藻) 和A5 (近缘斜纹藻) 的细胞密度和NO2 −-N、NH4 +、PO4 3−、NO3 −-N、TN和盐度呈显著正相关，NO3 −-N和盐度对硅藻门影响较大C1 (大角角藻) 细胞密度与水温和PO4 3−呈显著正相关。
表 2 冗余分析中浮游植物代码种类Table 2. Phytoplankton species codes for redundancy analysis代码
Code种类
Species代码
Code种类
SpeciesA1 尖布纹藻
Gyrosigma acuminatumA6 中肋骨条藻
Skeletonema costatumA2 柔弱菱形藻
Nitzschia delicatissimaA7 洛伦菱形藻
Nitzschia lorenzianaA3 直舟形藻
Navicula directaB1 小颤藻
Oscillatoria tenuisA4 奇异菱形藻
Nitzschia paradoxaC1 大角角藻
Ceratium macrocerosA5 近缘斜纹藻
Pleurosigma affine表 3 养殖池塘浮游植物优势种冗余统计分析信息Table 3. Summary statistic for axes of RDA performed on dominant species in pond指标 Factors 轴 Axe 总方差
Total variance1 2 3 4 特征值 Eigenvalues 0.263 0.180 0.141 0.063 1.000 种类环境相关性 Species-environment correlations 0.939 0.922 0.963 0.632 累计变量百分比 Cumulative percentage variance 种类数据 Species data 26.3 44.3 58.4 64.6 种类环境相关 Species-environment relation 36.1 60.9 80.3 88.9 总特征值 Sum of all eigenvalues 1.000 所有典范特征值 Sum of all canonical eigenvalues 0.727 3. 讨论
3.1 浮游植物细胞密度的变化
本研究表明，养殖塘水体浮游植物细胞密度整体变化规律呈养殖前期较高，中后期较低的趋势，这与养殖塘水体营养盐含量的变化趋势一致 (图4)。营养盐，尤其是N、P含量是影响浮游植物密度的重要因子[21]，摄食行为[22]和恶劣天气[23]也会对浮游植物细胞密度产生影响。Teeling等[24]研究表明，浮游植物细胞密度与水体内N、P含量成正相关关系，在一定范围内且其他影响因子一致的情况下，N、P含量越高，浮游植物细胞密度越高，这与本研究结果相一致。Burford和Williams[25]研究表明，水体中有机氮的主要来源是过剩的饵料和虾类排泄物，大量的有机氮在养殖水体内富集，影响水质情况进而影响对虾正常生长。养殖中后期，浮游植物细胞密度的变化可能与蟹类摄食病弱或死亡的对虾、粪便和残饵有关，蟹类的摄食行为会降低水体内有机氮的含量。李志斐等[26]研究发现鲮 (Cirrhinus molitorella) 和凡纳滨对虾混养后水体内的浮游植物细胞密度也呈降低趋势，富营养化程度得到缓解。在虾苗投放前，养殖池塘水体环境相对稳定，浮游植物群落自然演替，藻类群落结构具有相对稳定性。虾苗投放后，塘内的理化因子和浮游生物种群均受到影响，从而导致浮游植物细胞密度改变。对虾通过摄食一定数量的浮游动物，间接地影响了浮游植物的群落结构，幼虾还会滤食部分浮游植物，直接影响浮游植物群落[23]。养殖前期，对虾主要以天然饵料如硅藻浮游动物等为主要食物来源，养殖后期人工投放饵料占据虾食的98%[27]。本研究结果显示，养殖后期3个养殖塘浮游植物数量变化基本趋于平缓。查广才和周昌清[28]研究发现台风、暴雨、持续高温等恶劣天气会导致养殖水环境不稳定，导致浮游植物细胞密度发生较大波动。本研究中7—8月浮游植物细胞密度处于较低水平，这可能与华南地区7—8月强降水和台风等恶劣天气有关。
3.2 浮游植物种类的变化
本次研究发现，斑节对虾与锯缘青蟹混养养殖塘浮游植物种类共鉴定出5门29种，硅藻和蓝藻所占比重较大，其他藻类较少。郭永坚等[29]在凡纳滨对虾-鲻混养池塘的研究中鉴定出浮游植物7门65种，李志斐等[26]在鲮和凡纳滨对虾混养养殖塘研究中鉴定出浮游植物6门44种，不同水体浮游植物种类数的差异可能跟研究水域及采样时间差异有关[30-32]。本次调查结果显示，不同季节浮游植物种类呈现春秋季>夏季的规律，不同养殖阶段浮游植物优势种不同，养殖初期主要优势种以硅藻为主，养殖中后期优势种逐渐出现了蓝藻门。这可能与养殖后期盐度下降和pH升高有关。盐度是调节浮游植物群落结构的重要因子，养殖初期盐度较高，优势种以硅藻门为主，如柔弱菱形藻和直舟行藻等；养殖后期盐度下降，蓝藻门种类较多并成为优势种。这与吴斌和廖思明[33]在广西北海凡纳滨对虾养殖池塘浮游植物群落结构的研究结果一致，盐度较高的池塘优势种往往是绿藻门和硅藻门，盐度较低的池塘优势种是蓝藻门和甲藻门。谢立民等[34]也指出盐度是影响浮游植物群落结构的重要因子，蓝藻门在盐度较低的虾塘中为主要优势种，当盐度较高时，舟行藻等硅藻门为主要优势种。本次调查结果显示，pH介于7.78~9.21，水体一直处于弱碱性，而浮游植物的最适生长范围为7.75~8.75，过高或过低都会导致浮游植物生物量的减少。pH是由水体内理化因子、浮游生物和养殖物种综合作用的结果，周晴等[35]研究表明，pH高的水体中，蓝藻大量生长繁殖。养殖后期水体内pH上升，蓝藻成为虾塘优势种。浮游植物Shannon-Weaver多样指数介于0.802~2.140，不同季节多样性指数变化差异较大，春秋两季处于较高水平，夏季处于较低水平。养殖中后期，蓝藻大量繁殖成为优势种，因此降低了夏季浮游植物的多样性水平，武秀国等[36]和宋庆洋等[37]的研究中也揭示了这一规律。
4. 结论
在虾蟹混养养殖塘调查中，共发现浮游植物29种，其中硅藻门种类占绝对优势，其次是蓝藻门，甲藻门、绿藻门和裸藻门的种类数相对较少，浮游植物多样性存在较大的季节差异。浮游植物种类数总体为养殖初期较多，养殖中后期较少。浮游植物细胞密度在养殖初期 (3—5月) 较高，养殖中后期 (6—11月) 较低。
浮游植物主要的优势种主要为直舟形藻、奇异菱形藻、柔弱菱形藻、尖布纹藻、大角角藻和小颤藻等。浮游植物多样性指数均处于较高水平，由此可见其浮游植物群落结构较为稳定。
营养盐、盐度和pH是影响池塘浮游植物群落结构的主要环境因子。浮游植物的细胞密度、种类及分布都与环境因子的动态变化密切相关，环境因子的变动可能会改变养殖塘内浮游植物的群落结构。通过调控环境因子来改善浮游植物的群落结构，从而达到优化养殖环境，保持虾塘内生态系统平衡，增强抗干扰能力，进而提高产量和增加收益的目标。
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图 3 首次免疫后28 d目的基因在DNA水平上的组织分布
a-1、a-2、a-3分别为肝、脾、头肾simA分布；M. Marker 3；1. pcDNA3.1-simA组；2. 混合疫苗组；3、4分别为PBS组、pcDNA3.1 (+)组；5. 阳性对照；6. 阴性对照b-1、b-2、b-3分别为肝、脾、头肾pgmA分布；M. DS2000；1. 阳性对照；2. 阴性对照；3、4分别为pcDNA3.1−pgmA组及混合疫苗组；5. PBS组；6. pcDNA3.1 (+)组
Figure 3. Tissue distribution of target gene at DNA level at 28 d after first immunization
a-1, a-2, a-3. Expression maps of liver, spleen and head kidney, respectively; M. Marker3; 1. pcDNA3.1-simA group; 2 Mixture vaccine group; 3–4. PBS group and pcDNA3.1(+) group, respectively; 5. Positive control; 6. Negative control b-1, b-2, b-3. Expression maps of liver, spleen and head kidney, respectively; M. DS2000; 1. Positive control; 2. Negative control; 3–4. pcDNA3.1-pgmA and mixture vaccine group respectively; 5. PBS group; 6. pcDNA3.1 (+) group
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图 4 首次免疫后28 d目的基因在RNA水平上的组织分布
a-1、a-2、a-3分别为肝、脾、头肾simA分布；M. Marker 3；1. 阴性对照；2. 阳性对照；3. PBS组；4. pcDNA3.1 (+)组；5、6分别为混合疫苗组、pcDNA3.1 (+)-simA组 b-1、b-2、b-3分别为肝、脾、头肾pgmA分布；M. Marker 3；1. pcDNA3.1-pgmA组；2. 混合疫苗组；3. PBS组；4. pcDNA3.1 (+)组；5、6分别为阳性对照、阴性对照组
Figure 4. Tissue distribution of target gene at RNA level at 28 d after first immunization
a-1, a-2, a-3. Expression maps of liver, spleen and head kidney, respectively; M. Marker3; 1. Positive control; 2. Negative control; 3. Mixture vaccine group; 4. pcDNA3.1-simA group; 5–6. PBS group and pcDNA3.1 (+) group, respectively;b-1, b-2, b-3. Expression maps of liver, spleen and head kidney, respectively; M. Marker 3; 1. pcDNA3.1-pgmA group; 2. Mixture vaccine group; 3. PBS group; 4. pcDNA3.1 (+) group; 5–6. Positive control and negative control, respectively
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图 5 血清抗体滴度和抗菌活性
n=3; *. 差异显著 (P<0.05，独立样本t检验)；后图同此
Figure 5. Antibody titer and antibacterial activity in serum
n=3; *. Significant difference (P<0.05, Inndependent t-test); the same case in the following figures
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图 6 首次免疫28 d后鳃 (a)、肝 (b)、肾脏 (c) 和头肾 (d) 中免疫相关基因相对表达水平
**. 差异极显著 (P<0.01)
Figure 6. Relative expression of immune genes in parotid (a), liver (b), kidney (c) and head kidney (d) at 28 d after first immunization
**. Very significant difference (P<0.01)
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图 7 罗非鱼免疫攻毒后存活状况 (n=30)
Figure 7. Survival status of tilapia after injection with S. iniae
表 1 免疫相关基因定量引物
Table 1 Immune genes' primers for real-time PCR
名称
Name序列
SequenceIL-1β-F CAGGTGGTGGAAGTGTGTCA IL-1β-R GGTCAAACTGGAGCGCAAAC TNF-α-F CCTGCTGTTTGCCTGGTACT TNF-α-R GCTTTGCTGCTGATCCGTTT β-actin-F TCAGCAAGCAGGAGTACGATG β-actin-R AGCTGAAGTTGTTGGGCGTT 
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表 2 simA、pgmA基因生物信息学分析
Table 2 Bioinformatics analysis of simA and pgmA genes
分析项目
Analysis itemsimA基因
simA genepgmA基因
pgmA geneORF区长度
Length of ORF1 566个 碱基 1 716个 碱基 GC碱基含量
GC base content36.59% 38.69% 编码氨基酸的数目
Number of coding amino acids521 571 蛋白分子量预测
Molecular weight of protein57.5 kD 62.4 kD 蛋白分子式预测
Protein molecular formulaC2481H4159N705O827S12 C2804H4352N714O876S10 等电点
Isoelectric point5.78 4.68 保守性
Conservatism与QMA0248株相似度为99% 与DGX07株相似度为100%；与QMA0248株相似度为99%
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表 3 DNA疫苗对罗非鱼的相对保护率
Table 3 Relative protection rate of DNA vaccine against tilapia
组别
Group前处理
Pre-processing总尾数
Total死亡尾数
Death number死亡率
Mortality/%相对保护率
RPS/%1 PBS 30 28 93.3 − 2 pcDNA3.1-simA 30 14 46.7 49.9 3 pcDNA3.1-pgmA 30 11 36.7 60.7 4 混合疫苗 30 7 23.3 75.0 5 pcDNA3.1(+) 30 25 83.3 10.7
下载: 导出CSV
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