Study on immunoprotection of eukaryotic expression plasmids of Streptococcus iniae simA and pgmA in Oreochromis niloticus
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摘要:
尼罗罗非鱼 (Oreochromis niloticus) 是世界水产养殖业中的重要经济鱼类，但在养殖生产中易受海豚链球菌 (Streptococcus iniae) 感染而致病致死，使用疫苗是一种相对理想的防感染措施。该研究采用海豚链球菌simA、pgmA基因构建的真核表达载体作为DNA疫苗，肌肉注射罗非鱼评估疫苗保护效果。免疫后在DNA和RNA水平上，在注射鱼体内检测到2个目的基因。首次免疫后第7至第28天，鳃、肝、肾脏、头肾中疫苗组的白介素1 (Interleukin，IL-1β) 与肿瘤坏死因子 (Tumor Necrosis Factor，TNF-α) 表达量高于PBS对照组；疫苗组的抗体滴度、血清抗菌活性显著 (P<0.05) 高于PBS对照组。攻毒后，注射pcDNA3.1-pgmA、pcDNA3.1-simA、pcDNA3.1-pgmA与pcDNA3.1-simA等比例混合疫苗的相对保护率 (Relative percent survival，RPS) 分别为60.7%、49.9%和75.0%。结果表明所制备的疫苗具有免疫保护效果，可作为候选疫苗。
Abstract:Nile tilapia (Oreochromis niloticus) is an important commercial fish in aquaculture in the world. However, it is easy to be infected by Streptococcus iniae in the breeding production. The use of vaccine is a relatively ideal anti infection measure. In this study, eukaryotic expression vectors (DNA vaccine) were constructed by taking the simA and pgmA genes of S. iniae as the target genes. Then protective efficacy was evaluated by intramuscular injection of tilapia. Two target genes were detected in the injected fish at DNA and RNA levels after immunization. Besides, 7−28 d after the first immunization, the expression levels of interleukin-1 (IL-1β) and Tumor Necrosis Factor (TNF-α) in the gill, liver, kidney and head kidney of the vaccinal group were higher to some extent than those in the PBS control group. The antibody titer and antibacterial activity of immunized groups were significantly higher than those of control groups (P<0.05). Two weeks after being challenged with S. iniae, the relative percent survival of mixed vaccines of pcDNA3.1-pgmA, pcDNA3.1-simA and pcDNA3.1-pgmA, with pcDNA3.1-simA were 60.7%, 49.9% and 75.0%, respectively. It is revealed that the vaccine prepared in this paper has immune protection effect and can be used as a candidate vaccine.
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Keywords:
- Nile tilapia /
- Streptococcus iniae /
- DNA vaccine /
- simA gene /
- pgmA gene
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随着现代海洋牧场建设的快速推进，发展海水养殖业已成为践行大食物观的重要举措[1-2]。中国是世界第一大水产养殖国，2022年中国海水养殖产量达2 275.7万t，其中深水网箱养殖产量约39.3万t，相较2011年，增长率高达600%[3-5]。网箱养殖已逐渐成为我国海水鱼类养殖的主要方式[6-7]。自1998年海南省首次从挪威引进柔性抗风浪网箱开始，到2002年我国第一套拥有自主知识产权的高密度聚乙烯 (High density polyethylene, HDPE)升降式深水网箱成功下水，以及2018年“德海1号”成功抵御17级超强台风“山竹”，再到集水产养殖、智慧渔业、休闲渔业、科技研发、科普教育等功能于一体的新型海洋牧场“耕海1号”成功运营，提高网箱装备化、智能化、生产集约化、管理信息化、环境可持续化，推进网箱养殖朝着深远海方向发展是未来海洋渔业转型升级的必然趋势[8-12]。
在深水网箱结构受力计算方面，Yao等[13]基于纳维-斯托克斯方程，提出了一种用于求解流固耦合的混合体积方法，并分析了刚性和柔性网箱在不同流速下承受海流负载的情况。Li等[14-16]基于莫里森方程和浪的衍射和辐射理论，耦合浮架单元梁结构并模拟网衣桁架结构，分析了网箱在海流和波浪下的受力情况。Park等[17]通过3种不同直径的HDPE管材的浸没程度，推导出网箱浮架的阻力系数，计算了网箱浮架在流动载荷作用下的变形和应力分布。杨新华等[18]基于绕射理论和Morison方程，计算了波浪力并建立运动方程，对圆柱形浮式网箱进行受力分析并提出相应的数值计算方法。郭帅等[19]基于势流理论和非线性运动控制方程，建立了一种重力式抗风浪网箱的数值模型，对比分析了其在不同台风工况下与传统网格式网箱系泊缆张力、浮架运动和网箱变形的情况。
为缓解近岸养殖压力、拓宽深海水域养殖，基于中国海域养殖条件，本研究设计了一种可以应对恶劣海况条件的新型复式抗风浪深海养殖网箱，与传统HDPE重力式网箱抗风浪结构不同，所设计的网箱创新采用了超静定抗风浪结构，以双浮筒结构取代传统的浮圈和浮架结构，并对极端海洋条件下网箱可能承受的风、浪、流等环境载荷进行计算和分析，为发展大型抗风浪养殖网箱提供了设计参考。
1. 新型复式抗风浪网箱系统结构设计
1.1 主体结构设计
所设计的新型复式抗风浪养殖网箱，包括浮筒、立体浮框结构、系泊系统、网衣系统 (图1)。与传统单中心的养殖区网箱不同，网箱养殖区域分布在一体式立体浮框两侧，通过安装在养殖区域上方的浮筒提供浮力。浮筒与立体浮框结构之间通过连接结构形成刚性连接，当网箱受到风浪冲击时，两个浮筒随着海浪波动起伏，刚性立体浮框和浮筒相连保持浮筒在海上只做上下运动，使网箱整体在浮动中平衡稳定，减少风浪对网箱的影响。对称式双网箱的设计可以有效减少因刚性连接而发生的中拱和中垂现象，防止网箱框架受损破裂。
1.2 浮筒设计
国内常见的船型、组合式网架型网箱均以浮架提供浮力[20-22]，而对依靠浮筒为网箱整体提供浮力的设计并不多见，特别是双浮筒一体式抗风浪网箱，在国内尚未见类似的报道。图2为筒形结构的浮筒，浮筒不仅为网箱提供漂浮海面的浮力，也是网箱各功能舱室设置的重要地点，从上往下依次为生活层(保证养殖工作人员的饮食起居)、机电设备区和辅助舱室(燃油舱、淡水舱)、饲料储存舱、投喂设备舱和压排载舱。浮筒采用双层壳体结构设计：外层设有金属防腐涂层，以防海水、海风侵蚀，并设有防撞层，以免遭受船舶撞击而发生破损，导致整个网箱出现结构性毁坏。底部压载区用于盛放海水，以达到调节网箱重心位置，使其始终在浮心以下，防止其倾覆。浮筒可根据作业海域的风浪状况调节距离位置，大于一个海域内出现概率多的波长，通过调整间距和压载重量分布，使得纵摇固有周期增加，避开出现概率最高的波浪周期。
1.3 立体浮框结构设计
如图3所示，立体浮框结构由底框、立柱和顶框组成，顶框与底框之间通过立柱连接后形成一体。底框结构由纵梁、横梁及斜撑组成 (图4)，3根横梁和2根纵梁一起围合出两片养殖区，双养殖区设计既可实现多元化养殖，亦可避免网衣破损后，单一养殖区鱼群全部逃逸的情况。同时，一体式立体浮框结构区别于需要连接结构的传统组合网箱，后者的连接点受浪、流载荷较大，极易发生断裂和破坏[23]，而一体式立体浮框结构则通过整体结构设计，使每根柱面受力而非点位受力，将受到的浪、流载荷分散开，从而实现抗风浪功能。
底框的材质选用HDPE浮管，HDPE材料不仅可以提供一定的浮力，有一定的抗拉性，且经济适用性好。顶框在结构设计上和底框相似，由纵梁I、横梁I组成 (图5)。顶框主要用于连接定位，顶框钢管应选择高密度、高强度的合金钢管，特别需要在应力集中部位设置加强结构，整体增加中央钢管的抗剪、抗弯强度[24]。
立体浮框结构是网箱的主体结构，也是网箱设计的关键，其结构强度关系到网箱的结构安全。所设计的立体浮框结构与浮筒组合共同为网箱提供浮力，基础框架和配重一起产生向下的拉力，保证网箱在海上垂直方向上的受力平衡。
1.4 网衣设计
网衣的主要作用是固定养殖空间，限制养殖鱼群的活动范围，防止鱼群逃逸，同时也可阻挡鲨鱼等捕食。网衣系统由顶网、侧网、底网、基础框架和配重5个部分组成 (图6)。网衣系统根据立体浮框形状来设计，由侧网和底网共同围合成养殖区域，侧网和底网利用基础框架相连接，通过自身和配重的重力在水下张开成固定形状。
网衣材料采用超高分子量聚乙烯纤维 (UHMWPE) 材料，其分子量是普通聚乙烯(PE)的30~50倍，断裂强度约为尼龙复丝的4倍[25]。网衣网目形状为菱形，大小为35 mm×35 mm。由于网衣在自身重力和其他外界施压力的情况下极易变形，造成网衣破损，导致养殖鱼群逃逸，并且在流速较大的情况下，如在深远海，配重系统对网箱网衣变形程度的影响较大[26]，故需要增加配重系统，本网箱设计配重为2 342 kg。
1.5 网箱抗风浪结构设计
本网箱抗风浪功能实现的关键在于垂荡体和立体浮框结构连接形成的超静定结构。超静定结构是指通过浮筒下部锤挡板和空心柱组合形成的垂荡体 (图7) 和立体浮框结构组成“十字形”稳定刚性连接，为网箱垂荡及纵向摇摆运动提供较大阻尼，实现网箱运动幅度与波浪运动形成相对“静止”和稳定。
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图 7 垂荡体和立体浮框的连接结构Fig. 7 Connection structure of dangling body and three-dimensional floating frame垂荡体由浮筒、空心柱和锤挡板组成，上半部分柱状浮筒和空心柱相连部分设计了锥形波浪缓冲区，上半部分空心柱与缓冲、减摇作用的锤挡板直接连接，得益于锤挡板提供的较大垂荡以及纵向摇摆阻尼，因此在海浪较大的情况下，网箱运动幅度也能有效降低。
本网箱纵梁II结构过渡区主要有两种作用：连接浮筒，给浮筒提供一个斜向支撑力，使其在风浪条件下做上下运动；做波浪缓冲带，能够使波浪作用在锥面上缓慢爬升释放波浪能量。与直壁结构不同的是，波浪在直壁结构上爬升得较高 (图8)，这样会增加网箱承受的波浪载荷，而斜向处理可以引导波浪沿斜面破碎，从而显著降低网箱承受的波浪载荷。
2. 抗风浪网箱受海洋载荷的受力计算
计算网箱环境载荷，首先要考虑网箱放置海域的自然条件状况，如海风、海浪、海流等，特别是风暴潮、台风等极端天气，易破坏网箱结构，造成养殖鱼群逃逸、网箱框架损坏等严重后果。因此，设计抗风浪网箱时，对网箱结构所承受的环境载荷进行计算十分必要。
2.1 海流环境载荷
重力式抗风浪网箱的网架结构并不会因海流作用而产生惯性力，而其网衣受水下海流阻力的影响，因此分析海流载荷时，主要是对网衣形变进行计算。鉴于网衣表面结构不规律，故不考虑水通过网目时的绕流作用，而对网线进行分割计算，进而对水阻力进行评估分析。首先明确养殖海域的水流条件：海水密度ρ取1.025×103 kg·m–3，水流速度v取1 m·s–1，网衣的受流面积A为287 m2。
根据莫里森公式、流体动力的一般公式，网衣在水流中的阻力为：
$$ {F}_{\mathrm{D}}{\text{=}}\dfrac{1}{2}{C}_{\mathrm{D}}\rho A{v}^{2} $$ (1) 式中：$ {F}_{\mathrm{D}} $ 为阻力 (N)；$ {C}_{\mathrm{D}} $ 为水阻力系数。
网衣受阻计算的关键在于网衣水阻力系数的选取，本文参考李玉成和桂福坤[27]针对网衣垂直状态下水阻力系数与雷诺数关系的实验结果，在网衣形变程度一定的情况下，总体水动力估算采用正常状态下水阻力系数，网衣水阻系数与雷诺系数的关系可简化成：
$$ {C}_{\mathrm{D}}{\text{=}}1.19({{R}_{\mathrm{e}}^{\lambda }}{)}^{-u0.3\sigma } $$ (2) 式中：$ {{R}_{\mathrm{e}}^{\lambda }} $=$\dfrac{{{R}_{\mathrm{e}}^{d_1}}}{2\alpha }$，$ {R}_{\mathrm{e}} $ 为雷诺数，d1为网线直径，$ \alpha $ 为网箱投影面积系数，$ \lambda $ 为网衣特征长度 (500<$R_{\rm{e}}^\lambda$<4 000)；雷诺数计算：
$$ {R}_{\mathrm{e}}{\text{=}}\dfrac{\rho vd_1}{\mu } $$ (3) 式中：黏性系数 $ \mu $=1.01×10−3，网线直径d1=0.001 8 m，则 $ {R}_{\mathrm{e}} $=1 826.73，可得水阻力系数 $ {C}_{\mathrm{D}} $=0.908 8。网箱受到的水阻力：$ {F}_{\mathrm{D}} $=131 108 (N)=131.108 (kN)。
2.2 波浪环境载荷
网箱结构受波浪载荷分为网衣和浮架结构两部分，本文主要针对网箱主体浮架结构，利用莫里森公式分别计算网箱横、纵向框架柱的受力。选取蒲福氏风级表中8级大风下的波浪参数：波高H=8 m，水深D=50 m，周期T=8 s，波长L=99.5 m。故波数k=2π·L–1，波频ω=2π·T–1，阻力系数CD=1.2，惯性力系数Cm=2，水流速度v=1 m·s–1。
2.2.1 纵向框架柱的受力计算
考虑到单个纵向框架柱所受波浪载荷包括速度力和惯性力，先进行计算单位长度下的速度力极值：
$$ {f}_{{r}{d},\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}{\text{=}}{C}_{\mathrm{D}}\dfrac{\gamma d_2k{H}^{2}}{4}\dfrac{{\rm{cosh}}\; 2k(z{\text{+}}h)}{{\rm{sinh}} \;2kD} $$ (4) 积分得：
$$ {F}_{{r}{d},\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}{\text{=}}\dfrac{1}{16}\gamma {C}_{D}d_2H^2(1{\text{+}}\dfrac{2kD}{\mathrm{s}\mathrm{i}\mathrm{n}{\rm{h}}\; 2kD}) $$ (5) 根据现有标准和设计尺寸：附加质量系数γ=1.2，管直径 d2=0.6 m，则单个垂直框架圆柱上受到的速度力极值为：
$$\begin{array}{c} {F}_{{r}{d},\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}{\text{=}}\dfrac{1}{16}\gamma {C}_{\mathrm{D}}d_2H^2\left(1{\text{+}}\dfrac{2kD}{\mathrm{s}\mathrm{i}\mathrm{n}\mathrm{h}\;2kD}\right){\text{=}} 888.31\left(\mathrm{N}\right) \end{array}$$ 单位长度下的惯性力极值：
$$ {f}_{xt,\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}{\text{=}}{C}_{m}\dfrac{\gamma \pi {d}_2^{2}kH}{8}\dfrac{\mathrm{c}\mathrm{o}\mathrm{s}{\rm{h}}\;k(z{\text{+}}h)}{{\rm{cosh}} \;kD} $$ (6) 积分得：
$$ {F}_{xt,\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}{\text{=}}\dfrac{1}{8}\gamma d_2^{2}H{C}_{m}\dfrac{{\rm{sinh}}\; kD}{{\rm{cosh}}\; kD} $$ (7) 则单个垂直框架圆柱上受到惯性力极值为：
$$\begin{array}{c} {F}_{xt,\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}{\text{=}}\dfrac{1}{8}\gamma \pi {D}^{2}H{C}_{m}\dfrac{{\rm{sinh}}\; kD}{{\rm{cosh}}\; kD}{\text{=}}2\mathrm{ }828.67\left(\mathrm{N}\right) \end{array}$$ 则单个垂直框架圆柱所受的波浪力：
$$ F{\text{=}}{F}_{rd,\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}{\text{+}}{F}_{xt,\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}} {\text{=}} 888.31{\text{+}}2\mathrm{ }828.67{\text{=}}3\mathrm{ }716.98\left(\mathrm{N}\right) $$ 所有垂直框架圆柱所受波浪力：
$ {F}_{\mathrm{垂}\mathrm{直}\mathrm{总}} $=30$ \times 3\mathrm{ }716.98 $=111.509 4 (kN)
2.2.2 横向框架柱的受力计算
采用修改后的莫里森公式计算水平圆管上的波浪力，即作用在单位长度上的水平圆管上的力：
$$ {F}_{h}{\text{=}}{C}_{M}\rho v\dfrac{\partial {U}_{h}}{\partial t}{\text{+}}\dfrac{1}{2}{C}_{{\rm{D}}}\rho A\left|W\right|{U}_{h} $$ (8) 引用线性波浪理论，时间t处位置 (x,z) 的波浪方程：
$$ \eta \left(t\right){\text{=}}\dfrac{H}{2}{\rm{sin}}\dfrac{2\pi }{T}t $$ (9) 速度势：
$$ \phi {\text{=}}{\text{−}}\dfrac{Ag}{\omega }\dfrac{\mathrm{cosh}\;k\left(z{\text{+}}D\right)}{\mathrm{cosh}\;kD}\mathrm{s}\mathrm{i}\mathrm{n}(kx{\text{−}}\omega t) $$ (10) 水平速度：
$$ {u}_{x}{\text{=}}\dfrac{Agk}{\omega }\dfrac{\mathrm{cosh}\;k(z{\text{+}}D)}{\mathrm{cosh}\;kD}\mathrm{c}\mathrm{o}\mathrm{s}(kx{\text{+}}\omega t) $$ (11) $$ \dfrac{\partial {u}_{x}}{\partial t}{\text{=}}Agk\dfrac{\mathrm{cosh}\;k(z{\text{+}}D)}{\mathrm{cosh}\;kD}\mathrm{c}\mathrm{o}\mathrm{s}(kx{\text{−}}\omega t) $$ (12) $$ w{\text{=}}\dfrac{Agk}{\omega }\dfrac{\mathrm{cosh}\;k(z{\text{+}}D)}{\mathrm{cosh}\;kD}\mathrm{s}\mathrm{i}\mathrm{n}(kx{\text{−}}\omega t) $$ (13) 所有水平框架圆柱所受波浪力：
$ {F}_{\mathrm{水}\mathrm{平}\mathrm{总}} $=233.314 (kN)
则浮架总受力为：
${{F}_{\mathrm{总}}{\text{=}}F}_{\mathrm{垂}\mathrm{直}\mathrm{总}}{\text{+}}{F}_{\mathrm{水}\mathrm{平}\mathrm{总}}{\text{=}}$344.818 9 (kN)
2.3 海风环境载荷
因所设计的抗风浪网箱主体结构均在水下，仅浮筒和穿梭走廊受到的海上风载荷，考虑到我国频发台风海域的台风风级以及目前材料、制造水平，极限风速取12级台风最大值37 m·s–1。
对作用在网箱表面的风载荷采用伯努利方程，计算海风作用在浮筒上的动压：
$$ {W}_{\mathrm{p}}=0.5\cdot {r}_{\mathrm{u}}\cdot {V}^{2} $$ (14) 式中：$ {W}_{\mathrm{p}} $为风压 (kN·m–2)；$ {r}_{\mathrm{u}} $为空气密度 (kg·m–3)。
将空气密度 ($ {r}_{\mathrm{u}} $) 替换成重度 (r)，其表达公式为：$ r={r}_{\mathrm{u}}\cdot g $，代入式 (14)，得：
$$ {W}_{\mathrm{p}}=0.5\cdot r\cdot \dfrac{{V}^{2}}{g} $$ (15) 设在海面标准大气压101 325 Pa、温度15 ℃的标准状态下，空气重度 $ r=\dfrac{0.012\mathrm{ }25}{{m}^{3}} $，重力加速度g取9.8 m·s–2，代入式 (15) 得：
$$ {W}_{\mathrm{p}}=\dfrac{{V}^{2}}{1\;600} $$ (16) 由此可得网箱所受风载荷为：
$$ F={V}^{2}\cdot \dfrac{A}{1\mathrm{ }600} $$ (17) 式中：A表示垂直风速方向作用下网箱的受风面积 (m2)，而网箱阻力风向主要来源于水平风向，故得出网箱结构的受风面积A=309.3 (m2)。
将深水网箱作业环境极值风速与网箱受风面积代入式 (17)，得到风荷载F=264.645 (kN)。
2.4 环境载荷计算对比分析
根据计算结果并对比传统HDPE重力式网箱，以黄小华等[28] 针对沿海地区常用的40~80 m周长的深水网箱计算结果作为参考标准，在波高5 m、周期8 s、流速0.75 m·s−1条件下，周长80 m网箱所受的波浪力最大为85 kN，远小于新型复式抗风浪网箱设计承受的波浪载荷。海流载荷计算选取聂雪军等[29]和黄小华等[30]对重力式网箱在水流作用下受力计算的结果作为参考标准，二者在计算时均只考虑水流对网衣的作用，在流速1 m·s−1、网衣受流向面积210 m2的条件下，网箱受流阻力均值为109.4 kN，与新型复式抗风浪网箱设计承受载荷相近。风载荷的计算则以吴常文等[31]在舟山海区进行的HDPE深水网箱抗风浪试验结果作为参考标准，当风速大于35 m·s−1时，周长48 m网箱所受风载荷最大为21.923 kN，远小于新型复式抗风浪网箱设计承受的风载荷。基于以上对比，可见本研究所设计的网箱相较于传统HDPE网箱能承受更大的风浪载荷。
3. 小结
针对传统网箱结构简单，无法承受海洋中风、浪、流等环境载荷造成的压力冲击情况[32-33]， 本研究基于海上实际作业工况，设计了一款面向深海养殖的复式抗风浪网箱，分别采用莫里森公式和伯努利方程对网箱承受风、浪、流等环境载荷进行受力计算并与传统HDPE网箱进行对比，总结如下：
1) 新型复式抗风浪网箱创新采用双浮筒的设计，能为网箱提供更大的浮力，并与立体浮框结构连接组成超静定抗风浪结构。该设计区别于传统HDPE网箱抗风浪结构，网箱上部承受波浪载荷的变化不明显，当网箱上部载荷变化时，整体不会出现较大倾斜而影响功能性的使用，故网箱上部位置可以储备大量物资，增大了甲板使用面积。
2) 新型复式抗风浪网箱可通过调节两浮筒的间距来改变浮筒下方垂荡体的距离，使其大于工作海域极限波长，通过垂荡体的垂荡和减摇作用，给网箱提供较大的阻尼，从而实现控制网箱运动幅度，保证网箱的结构安全。
3) 立体浮框结构是承受波浪载荷的主要载体，其特征尺度简化为横杆和纵杆，受到速度力和惯性力的叠加，在海上8级大风条件下所承受的极值负载约为344.82 kN。网箱因采用双浮筒结构，受风面积大，且选取12级大风极值风速，其极值负载约为264.65 kN。网箱承受海流载荷的计算是通过网衣水下受流阻力计算而得，其极值负载约为131.11 kN。在近似计算条件下，所设计的网箱承受海洋环境载荷均高于传统HDPE网箱，为后续研究开发与生产提供了参考。
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图 3 首次免疫后28 d目的基因在DNA水平上的组织分布
a-1、a-2、a-3分别为肝、脾、头肾simA分布；M. Marker 3；1. pcDNA3.1-simA组；2. 混合疫苗组；3、4分别为PBS组、pcDNA3.1 (+)组；5. 阳性对照；6. 阴性对照b-1、b-2、b-3分别为肝、脾、头肾pgmA分布；M. DS2000；1. 阳性对照；2. 阴性对照；3、4分别为pcDNA3.1−pgmA组及混合疫苗组；5. PBS组；6. pcDNA3.1 (+)组
Figure 3. Tissue distribution of target gene at DNA level at 28 d after first immunization
a-1, a-2, a-3. Expression maps of liver, spleen and head kidney, respectively; M. Marker3; 1. pcDNA3.1-simA group; 2 Mixture vaccine group; 3–4. PBS group and pcDNA3.1(+) group, respectively; 5. Positive control; 6. Negative control b-1, b-2, b-3. Expression maps of liver, spleen and head kidney, respectively; M. DS2000; 1. Positive control; 2. Negative control; 3–4. pcDNA3.1-pgmA and mixture vaccine group respectively; 5. PBS group; 6. pcDNA3.1 (+) group
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图 4 首次免疫后28 d目的基因在RNA水平上的组织分布
a-1、a-2、a-3分别为肝、脾、头肾simA分布；M. Marker 3；1. 阴性对照；2. 阳性对照；3. PBS组；4. pcDNA3.1 (+)组；5、6分别为混合疫苗组、pcDNA3.1 (+)-simA组 b-1、b-2、b-3分别为肝、脾、头肾pgmA分布；M. Marker 3；1. pcDNA3.1-pgmA组；2. 混合疫苗组；3. PBS组；4. pcDNA3.1 (+)组；5、6分别为阳性对照、阴性对照组
Figure 4. Tissue distribution of target gene at RNA level at 28 d after first immunization
a-1, a-2, a-3. Expression maps of liver, spleen and head kidney, respectively; M. Marker3; 1. Positive control; 2. Negative control; 3. Mixture vaccine group; 4. pcDNA3.1-simA group; 5–6. PBS group and pcDNA3.1 (+) group, respectively;b-1, b-2, b-3. Expression maps of liver, spleen and head kidney, respectively; M. Marker 3; 1. pcDNA3.1-pgmA group; 2. Mixture vaccine group; 3. PBS group; 4. pcDNA3.1 (+) group; 5–6. Positive control and negative control, respectively
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图 5 血清抗体滴度和抗菌活性
n=3; *. 差异显著 (P<0.05，独立样本t检验)；后图同此
Figure 5. Antibody titer and antibacterial activity in serum
n=3; *. Significant difference (P<0.05, Inndependent t-test); the same case in the following figures
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图 6 首次免疫28 d后鳃 (a)、肝 (b)、肾脏 (c) 和头肾 (d) 中免疫相关基因相对表达水平
**. 差异极显著 (P<0.01)
Figure 6. Relative expression of immune genes in parotid (a), liver (b), kidney (c) and head kidney (d) at 28 d after first immunization
**. Very significant difference (P<0.01)
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图 7 罗非鱼免疫攻毒后存活状况 (n=30)
Figure 7. Survival status of tilapia after injection with S. iniae
表 1 免疫相关基因定量引物
Table 1 Immune genes' primers for real-time PCR
名称
Name序列
SequenceIL-1β-F CAGGTGGTGGAAGTGTGTCA IL-1β-R GGTCAAACTGGAGCGCAAAC TNF-α-F CCTGCTGTTTGCCTGGTACT TNF-α-R GCTTTGCTGCTGATCCGTTT β-actin-F TCAGCAAGCAGGAGTACGATG β-actin-R AGCTGAAGTTGTTGGGCGTT 
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表 2 simA、pgmA基因生物信息学分析
Table 2 Bioinformatics analysis of simA and pgmA genes
分析项目
Analysis itemsimA基因
simA genepgmA基因
pgmA geneORF区长度
Length of ORF1 566个 碱基 1 716个 碱基 GC碱基含量
GC base content36.59% 38.69% 编码氨基酸的数目
Number of coding amino acids521 571 蛋白分子量预测
Molecular weight of protein57.5 kD 62.4 kD 蛋白分子式预测
Protein molecular formulaC2481H4159N705O827S12 C2804H4352N714O876S10 等电点
Isoelectric point5.78 4.68 保守性
Conservatism与QMA0248株相似度为99% 与DGX07株相似度为100%；与QMA0248株相似度为99%
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表 3 DNA疫苗对罗非鱼的相对保护率
Table 3 Relative protection rate of DNA vaccine against tilapia
组别
Group前处理
Pre-processing总尾数
Total死亡尾数
Death number死亡率
Mortality/%相对保护率
RPS/%1 PBS 30 28 93.3 − 2 pcDNA3.1-simA 30 14 46.7 49.9 3 pcDNA3.1-pgmA 30 11 36.7 60.7 4 混合疫苗 30 7 23.3 75.0 5 pcDNA3.1(+) 30 25 83.3 10.7
下载: 导出CSV
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