Study on immunoprotection of eukaryotic expression plasmids of Streptococcus iniae simA and pgmA in Oreochromis niloticus
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摘要:
尼罗罗非鱼 (Oreochromis niloticus) 是世界水产养殖业中的重要经济鱼类，但在养殖生产中易受海豚链球菌 (Streptococcus iniae) 感染而致病致死，使用疫苗是一种相对理想的防感染措施。该研究采用海豚链球菌simA、pgmA基因构建的真核表达载体作为DNA疫苗，肌肉注射罗非鱼评估疫苗保护效果。免疫后在DNA和RNA水平上，在注射鱼体内检测到2个目的基因。首次免疫后第7至第28天，鳃、肝、肾脏、头肾中疫苗组的白介素1 (Interleukin，IL-1β) 与肿瘤坏死因子 (Tumor Necrosis Factor，TNF-α) 表达量高于PBS对照组；疫苗组的抗体滴度、血清抗菌活性显著 (P<0.05) 高于PBS对照组。攻毒后，注射pcDNA3.1-pgmA、pcDNA3.1-simA、pcDNA3.1-pgmA与pcDNA3.1-simA等比例混合疫苗的相对保护率 (Relative percent survival，RPS) 分别为60.7%、49.9%和75.0%。结果表明所制备的疫苗具有免疫保护效果，可作为候选疫苗。
Abstract:Nile tilapia (Oreochromis niloticus) is an important commercial fish in aquaculture in the world. However, it is easy to be infected by Streptococcus iniae in the breeding production. The use of vaccine is a relatively ideal anti infection measure. In this study, eukaryotic expression vectors (DNA vaccine) were constructed by taking the simA and pgmA genes of S. iniae as the target genes. Then protective efficacy was evaluated by intramuscular injection of tilapia. Two target genes were detected in the injected fish at DNA and RNA levels after immunization. Besides, 7−28 d after the first immunization, the expression levels of interleukin-1 (IL-1β) and Tumor Necrosis Factor (TNF-α) in the gill, liver, kidney and head kidney of the vaccinal group were higher to some extent than those in the PBS control group. The antibody titer and antibacterial activity of immunized groups were significantly higher than those of control groups (P<0.05). Two weeks after being challenged with S. iniae, the relative percent survival of mixed vaccines of pcDNA3.1-pgmA, pcDNA3.1-simA and pcDNA3.1-pgmA, with pcDNA3.1-simA were 60.7%, 49.9% and 75.0%, respectively. It is revealed that the vaccine prepared in this paper has immune protection effect and can be used as a candidate vaccine.
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Keywords:
- Nile tilapia /
- Streptococcus iniae /
- DNA vaccine /
- simA gene /
- pgmA gene
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克氏原螯虾 (Procambarus clarkii)又称小龙虾，于20世纪30年代引入中国，因环境适应能力强、食性广、繁殖快、产量高等特点受到养殖者的青睐，近年来已发展成为我国重要的水产养殖品种。2021年，我国克氏原螯虾产业总值达到4 221.95亿元，经过40年的发展，已形成集繁育养殖、加工出口、物流餐饮、文化节庆为一体的完整产业链，成为我国农业发展的重要支柱产业之一[1]。随着克氏原螯虾大面积养殖的兴起，其品质参差不齐的问题也随之显现。因此，如何采用复合蛋白来源提升其养殖健康和品质[2]，亟须深入研究。
代谢组学技术是研究小分子物质及其在生物体中动态变化的技术[3]，检测方式上可以分为非靶向代谢组学和靶向代谢组学，广泛应用于临床医学[4]、食品科学[5]、环境功能[6]等多个研究领域。代谢组学常结合核磁共振技术 (NMR)[7]、液相色谱-质谱联用技术 (LC-MS)[8]、气相色谱-质谱联用技术 (GC-MS)[9]等检测手段满足不同的实验需求[10]。近年代谢组学也已应用于水产领域，刘慧茹等[11]利用代谢组学技术，结合斑马鱼 (Danio rerio) 评价模型，发现皂苷类成分可能与抗疲劳活性有关；张彦坤等[12]通过代谢组学分析测定剑鱼 (Xiphophorus helleri) 肝脏内源物的变化，探究了饥饿胁迫对水生动物的影响。
饲料不仅应给动物体提充足的营养和能量[13]，还应具有提升养殖功效的活性物质[14]。目前，关于提升水产养殖功效的报道多集中在考察养殖产品的生长、生化指标和肠道微生物检测等方面[15-16]。近些年针对不同日粮下动物肌肉中代谢产物变化的研究逐渐增多，认为肌肉中氨基酸、脂类和功能物质等代谢产物的变化直接影响了肌肉品质[17-18]，并结合代谢组分析更加全面准确地把握营养代谢乃至相关基因调控等方面的信息[19-20]。但目前关于克氏原螯虾代谢组学相关的研究报道较少。针对以上问题，本文利用非靶向代谢组学技术结合超高效液相色谱-质谱技术 (UHPLC-MS)，通过多元统计分析进行差异代谢物筛选，并对差异代谢物进行 KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 通路分析，对比两种日粮模式下克氏原螯虾肌肉代谢组的差异及主要特征标志物，探究不同日粮下克氏原螯虾肌肉代谢产物的变化，以为提升克氏原螯虾养殖品质提供参考。
1. 材料与方法
1.1 实验设计与样品采集
挑选附肢健全、活力较好的克氏原螯虾于2022年6月养于安徽省农业科学院水产研究所基地的克氏原螯虾虾塘。选择临近塘口，保持水源相同，虾塘面积为0.200~0.267 hm2，放养虾苗体质量为5~10 g，放养密度为10尾·m2，养殖周期为60 d，分别投喂蛋白质质量分数为32%的常规饲料和发酵饲料，饲料配方和基本组成见表1。每日07:00和18:00各投饲１次，日投喂量约为虾体质量的4%。养殖期结束后，分别从不同组塘口各取5尾虾共混合5.0 g样品冷冻待测备用，每个处理均取3份作为重复。
表 1 基础饲料组成及营养水平 (干物质基础)Table 1. Composition and nutrient levels of basal diet (Dry matter basis) %项目
Item发酵饲料
Fermented diet常规饲料
General diet原料 Ingredient 鱼粉 Fish meal 6 16 豆粕 Soybean meal 50 12 菜籽粕 Rapeseed meal 12 15 亚麻粕 Flaxseed meal 8 0 玉米淀粉 Corn starch 8 28 小麦粉 Wheat flour 8 19 鱼油 Fish oil 5 3 豆油 Soybean oil 0 4 磷酸二氢钙 Ca(H2PO4)2 1.4 1.4 维生素① Vitamin 0.5 0.5 矿物质① Mineral 1 1 防霉剂 Mould inhibitor 0.1 0.1 合计 Total 100 100 营养水平 Nutrient Level 粗蛋白 Crude protein 32.00 32.00 粗脂肪 Crude fat 6 6 灰分 Ash 12 18 粗纤维 Crude fiber 14 8 赖氨酸 Lys 1.5 1.5 水分 Moisture 18 10 注：① 维生素和矿物质均为预混料，维生素主要含 VC、VE、VB、VD等，其他成分及含量保密。 Note: ① Vitamins and minerals are premixes, and vitamins mainly contain VC, VE, VB, VD, etc.. Other components and contents are confidential. 克氏原螯虾的体质量增长率 (WGR) 和特定生长率 (SGR) 指标按以下公式计算：
$$ \begin{gathered} R_{\mathrm{WG}}=\left[\left(m_t-m_0\right) / m_0\right] \times 100 {\text{%}} \end{gathered} $$ (1) $$ R_{\mathrm{SG}}=\left[\left(\ln m_t-\ln m_0\right) / t\right] \times 100 {\text{%}} $$ (2) 式中：RWG为体质量增长率(%)；RSG为特定生长率(%·d−1)；m0为养殖初始体质量 (g)；mt为养殖末体质量 (g)；t为饲喂时间 (d)。
1.2 仪器与材料
低温高速离心机 (Eppendorf 5430R)；超声破碎仪 (宁波新芝 JY92-II)；MP Fastprep-24 匀浆仪 (MP Biomedicals)；质谱仪AB Triple TOF 6600；超高压液相色谱仪Vanquish UHPLC、色谱柱：Waters，ACQUITY UPLC BEH Amide (1.7 μm, 2.1 mm×100 mm)。甲醇、醋酸铵、甲酸、乙腈、乙酸铵等购于美国CNW Technologies科技公司，均为色谱纯；常规饲料和发酵饲料均购于安徽万士生物制药有限公司。
1.3 样本提取
克氏原螯虾肌肉样品室温下解冻后，称取100 mg到1.5 mL EP管中，加入钢珠和500 µL 提取液[V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(水)=2∶2∶1]，−20 ℃低温预冷2 min，经研磨处理4 min，使用匀浆仪混匀，低温超声萃取30 min，重复2次，置于−20 ℃下60 min，然后 4 ℃离心15 min (13 000 r·min−1)，取上清液150 μL (分装管900 μL)。使用0.22 μm的有机相针孔过滤器过滤后，转移到进样小瓶，−80 ℃下保存。质控样本 (Quality control, QC) 由所有样本的提取液等体积混合制备而成，每个QC的体积与样本相同。
1.4 UHPLC-MS分析条件
UHPLC条件：样品采用超高效液相色谱系统进行分离；柱温25 ℃；流速0.5 mL·min−1；进样量2 μL；流动相组成A：水+25 mmol·L−1乙酸铵+25 mmol·L−1氨水，B：乙腈。梯度洗脱程序：0~0.5 min，95%B；0.5~7 min，B下降至65%；7~8 min，B下降至40%；8~9 min，B维持40%；9~9.1 min，B上升至95%；9.1~12 min，B维持95%。整个分析过程中样品置于4 ℃自动进样器中。为避免仪器检测信号波动而造成的影响，采用随机顺序进行样本的连续分析。样本队列中插入QC样品，用于监测和评价系统的稳定性及实验数据的可靠性。
质谱条件：分别采用电喷雾电离 (ESI) 正离子和负离子模式进行检测。离子源温度：600 ℃，喷雾电压 (ISVF)±5 500 V (正负两种模式)；其他参数正负离子模式下相同，毛细管温度为320 ℃；辅助气体加热温度420 ℃；鞘气体流量40 arb；辅助气体流量为20 arb；去簇电压 (DP)：±60 V (正负两种模式)，碰撞能量：(35±15) eV。
1.5 数据分析
生长性能数据采用SPSS 21.0软件统计分析，数据均以“平均值±标准差 (
$\overline { x}\pm { {s}} $ )”表示。采用ANOVA过程进行单因子方差分析，显著性水平为P<0.05。代谢组数据使用ProteoWizard软件，将二级质谱原始数据转成mzXML格式，再使用XCMS进行峰对齐，做保留时间矫正和峰识面积提取等工作，同时使用自撰写R程序包和自建二级质谱数据库对峰进行物质鉴定。采用R软件对鉴定的代谢产物进行主成分分析和正交偏最小二乘法判别分析。根据变量重要性投影评分，将VIP>1且P<0.05的代谢物定义为差异代谢物 (Significant changed metabolites, SCMs)，将得到的差异代谢物通过代谢通路数据进行注释解析，并通过富集分析法分析发酵饲料组与常规饲料组的变化，筛选关键代谢通路。
2. 结果
2.1 不同饲料对克氏原螯虾生长性能的影响
由表2可知，采用两种不同饲料饲喂克氏原螯虾，养殖期第60天结束时，两组间克氏原螯虾的体质量增长率和特定生长率无显著性差异 (P>0.05)。
表 2 不同饲料对克氏原螯虾生长性能的影响Table 2. Effect of different feeds on growth performance of crayfish指标
Index发酵饲料组
Fermented diet (T)常规饲料组
General diet (CK)初始体质量 IBM/g 5.95±0.42a 6.15±0.51a 终末体质量 FBM/g 28.29±2.86a 28.44±2.69a 体质量增长率 WGR/% 375.46±9.21a 362.40±8.88a 特定生长率 SGR/(%·d−1) 2.59±0.12a 2.55±0.19a 注：同行数据不同小写字母表示差异显著 (P<0.05)。 Note: Values with different letters within the same row are significantly different (P<0.05). 2.2 代谢物总览
本研究在正离子和负离子模式下分别筛选出581和495个化合物。通过与数据库匹配，正离子和负离子模式下分别注释到269和273个化合物 (Human Metabolome Database, HMDB)。将所有的代谢化合物进行分类分析，被分为15个一级类别，其中主要为有机酸及其衍生物，其次是脂质和类脂分子，以及有机杂环化合物、核苷酸类等。
2.3 多元统计分析结果
2.3.1 主成分分析 (Principal components analysis, PCA) 结果
由PCA分析图 (图1) 所示，每个散点表示一个样本，样本全部处于95%置信区间，对照组与实验组的检测结果说明代谢产物虽存在一定差异，可被区分，但也有部分相似；这可能是由于蛋白质、脂肪等物质产生的水解产物如肽类、氨基酸、脂肪酸等有一定程度的相似。
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图 1 发酵饲料组和常规饲料组代谢物的 PCA 分析图Figure 1. PCA plots of metabolites in fermented feed group and general feed group2.3.2 正交偏最小二乘法判别分析 (OPLS-DA) 结果
OPLS-DA模型分析结果见图2和图3，可见两组样本明显分离，表明两组数据存在显著性差异。正离子模式下模型R2 Y=0.993、Q2=0.965，负离子模式下模型R2 Y=0.991、Q2=0.927。随着置换保留度逐渐降低，随机模型的R2和Q2均逐渐下降，说明两种模式下原模型不存在过拟合现象，模型稳定性良好。
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图 2 发酵饲料组和常规饲料组代谢物的 OPLS-DA 分析图Figure 2. OPLS-DA plots of metabolites in fermented diet group and general diet group![]()
图 3 差异代谢物的OPLS-DA置换检验结果Figure 3. OPLS-DA model replacement test results of differential metabolites2.3.3 差异代谢物火山图
利用t检验和变异系数法比较两组之间的代谢产物差异，设立筛选条件，对正、负离子模式下检测到的所有代谢物 (含未被鉴定的代谢物) 进行差异分析，采用火山图进行可视化展示 (图4)，T 和 CK 组在正离子和负离子模式下共筛选出差异表达代谢物分别为581和495个，其中正离子代谢产物上调314个、下调267个，负离子代谢产物上调258个、下调237个。
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图 4 发酵饲料组对比常规饲料组的差异代谢物筛选Figure 4. Differential metabolite screening volcano maps of fermented diet group (T) and general diet group (CK)2.3.4 差异代谢物中显著差异代谢物筛选结果
根据差异代谢物做筛选，结果如表3所示。在正离子和负离子模式下分别筛选出17和10种显著差异代谢物。其中VIP表示变量投影重要度；FC表示差异倍数，FC>1表示该代谢物上调，FC<1表示该代谢物下调；m/z表示质荷比；显著性分析P值越小，表示差异越显著；RT代表代谢物在色谱上的保留时间，即出峰时间(s)。
表 3 发酵饲料组和常规饲料组的显著差异代谢物列表Table 3. List of significant different metabolites of fermented diet group and general diet group模式
Mode差异代谢物
Differential metabolite变量投影
重要度
VIP差异倍数
FC质荷比
m/z显著性分析
P value保留时间
RT/s正离子 Positive ion 肌酸苷 Creatinine 3.41 0.32 114.06 0.0007 161.13 正离子 Positive ion 肌酸 Creatine 15.31 0.24 132.08 0.006 334.67 正离子 Positive ion 甲基组胺 Methyl-histamine 3.58 2.83 126.10 0.011 380.87 正离子 Positive ion 苦马豆素 Swainsonine 1.17 0.20 156.10 0.012 352.39 正离子 Positive ion 组氨酸 L-Histidine 7.81 0.39 156.08 0.015 441.29 正离子 Positive ion 精氨酸-谷氨酸 Arg-Glu 2.08 2.16 304.16 0.016 474.58 正离子 Positive ion 4-氨基吡啶 4-aminopyridine 2.78 2.94 95.06 0.024 377.41 正离子 Positive ion 腺苷酸琥珀酸 Adenylosuccinic acid 2.00 3.21 464.08 0.024 483.46 正离子 Positive ion 精氨酸 Arginine 24.77 0.74 175.12 0.027 507.05 正离子 Positive ion 磷脂酰胆碱 Lpc 16:0 6.96 2.01 496.34 0.029 183.71 正离子 Positive ion 戊二醛 Glutaraldehyde 1.82 0.58 83.06 0.029 350.75 正离子 Positive ion 鞘氨醇磷酰胆碱
N-oleoyl-d-erythro-sphingosylphosphorylcholine3.68 1.82 729.59 0.030 168.18 正离子 Positive ion 1-乙基-1,3-二氢-2H-苯并咪唑-2-酮
2h-benzimidazol-2-one,1-ethyl-1,3-dihydro-1.52 3.13 163.09 0.048 61.25 正离子 Positive ion 组氨-丝氨酸 His-Ser 1.83 2.12 243.11 0.044 330.91 正离子 Positive ion 肌氨酸 Sarcosine 1.89 2.49 134.01 0.044 338.91 正离子 Positive ion 3'-岩藻糖基乳糖 3'-fucosyllactose 1.62 17.32 114.06 0.048 391.17 正离子 Positive ion 辅酶 I Coenzyme I 2.22 0.61 664.11 0.049 423.70 负离子 Negative ion 3,4-二氯酚 3,4-dichlorophenol 1.11 1.43 160.94 0.014 315.87 负离子 Negative ion 奎尼酸 Quinate 1.39 14.33 191.05 0.019 330.78 负离子 Negative ion 丁基磷酸 Butylphosphonic acid 1.36 2.38 275.09 0.023 448.38 负离子 Negative ion 苹果酸 Malate 6.21 1.59 133.01 0.028 394.31 负离子 Negative ion 谷氨酸 L-Glutamate 1.01 1.80 168.03 0.029 385.65 负离子 Negative ion N-乙酰蛋氨酸 N-acetyl-l-methionine 1.45 2.49 190.05 0.029 187.41 负离子 Negative ion 磷酸丝氨酸 Phosphoserine 1.71 2.15 369.02 0.042 436.39 负离子 Negative ion 补骨脂定 Psoralidin 1.03 2.15 335.08 0.043 384.21 负离子Negative ion 东革内酯 Eurycomalactone 3.80 5.22 347.17 0.047 26.15 负离子 Negative ion 亚麻木酚素 Secoisolariciresinol 1.95 5.63 361.18 0.049 25.53 2.3.5 差异代谢物的层次聚类分析
图5为显著差异代谢物 (VIP>1, P<0.05) 的层次聚类分析结果，横轴表示发酵饲料组与常规组，纵轴表示相应的差异代谢物，红色代表显著性上调，蓝色代表显著性下调，颜色深浅表示上、下调的程度。由图可见同组的样本聚在同一簇内，说明同组样本之间的相似度高于组间。筛选出的27种差异显著的代谢物，发酵饲料组有19种代谢物发生上调，8种代谢物发生下调。正离子模式下发酵饲料组中腺苷酸基琥珀酸、鞘氨醇磷酰胆碱、岩藻糖基乳糖、磷酯酰胆碱等高表达，负离子模式下发酵饲料组中苹果酸、补骨脂素、磷酯酰丝氨酸、谷氨酸等高表达。
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图 5 发酵饲料组和常规饲料组 的层次聚类分析热力图Figure 5. Hierarchical cluster analysis heat maps of fermented diet group (T) and general diet group (CK)2.3.6 差异代谢物的代谢通路分析
代谢通路分析的结果以气泡图展示 (图6)。通过KEGG注释分析找到所有差异代谢物参与的通路，本实验根据P值选择显著性最高的前20条代谢通路，包含氨基酸生物合成、组氨酸代谢、碳酸氢盐回收循环、丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢、蛋白质消化和吸收、精氨酸合成、氨酰tRNA的生物合成、精氨酸-脯氨酸代谢、氨基酸生物合成等。气泡越大影响因子越大；颜色越深代表P值越小，富集程度越显著。结果显示组氨酸代谢通路、蛋白质消化和吸收代谢通路、精氨酸-脯氨酸代谢通路、氨酰-tRNA合成这４个差异代谢影响因子最大；精氨酸-脯氨酸代谢通路、蛋白质消化和吸收代谢通路和氨酰-tRNA合成通路的富集程度最显著。
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图 6 发酵饲料组对常规饲料组的通路分析气泡图Figure 6. Path analysis bubble chart of fermented diet group and general diet group3. 讨论
本研究对来自不同日粮环境下的两组克氏原螯虾肌肉样本的代谢组进行了比较分析，结果显示两组样本在正离子和负离子模式下，其代谢物均有显著性差异。代谢物主要包括有机酸、氨基酸、脂类和类脂及其衍生物等。显著差异代谢物主要涉及精氨酸-脯氨酸、组氨酸代谢以及蛋白质消化吸收等相关通路。
奎尼酸是一种氨基酸前体物质，在生物体内主要参与脂肪酸代谢过程，有助于维持身体的健康状态，可以帮助将脂肪酸转化为能量[21]。岩藻糖基乳糖是一种多糖类物质，在生物体内可以清除自由基、减轻氧化应激，具有抗氧化、抗炎和免疫调节等作用。亚麻木酚素具有促进血液循环增强机体免疫力的功能[22]。这几种功能物质通常以化合物的形式存在于植物体中，而本研究中，奎尼酸、岩藻糖基乳糖和亚麻木酚素在发酵饲料饲喂环境下在肌肉中的含量均提高了5倍以上，表明克氏原螯虾利用发酵饲料中的植物成分参与了这几种物质的生成和代谢。
本实验中发酵饲料组增幅种类最多的是磷脂类 (包括磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、鞘磷脂等)，此类物质对大脑和血管各种功能起到重要的调节作用[23]，能影响生物细胞膜的流动性、通透性，并激活多种酶类的代谢和合成。磷脂酰丝氨酸由丝氨酸合成产生，可改善神经细胞功能，是促神经发育重要营养元素[24]。鞘磷脂对人类肠道和肝脏具有保护和修复的生理功能。此类物质常见于大豆的副产物，而发酵饲料主要成分为豆粕，这类物质的提高可以推断克氏原螯虾通过摄食豆类增加了此类物质的合成。饲料的组成显著影响了克氏原螯虾的肌肉代谢，并使其更具营养[25]。这些肌肉代谢物的增加，说明可以利用投喂发酵饲料实现克氏原螯虾肉中磷脂含量的增加[26]。
代谢物中还存在一些其他具有生理调节功能的物质，例如补骨脂定和苹果酸等。补骨脂定有抗氧化、调节细胞凋亡等作用[27]。可以治疗动脉粥样硬化、心脏病以及心肌损伤[28]。苹果酸作为能量代谢中间体参与生物体内三羧酸循环，可以增加线粒体苹果酸脱氢酶的活性，提高氨基酸的合成效率，机体ATP的合成效率也可以得到提高[29]。这些物质影响生物的活动能力，因此推断其在肌肉中含量的升高有利于提升克氏原螯虾的运动能力。
显著差异代谢物中还有一部分氨基酸类物质，发酵饲料组相对常规饲料组发生谷氨酸、精-谷氨酸、N-乙酰蛋氨酸组-丝氨酸和甲基甘氨酸等代谢物显著上调。谷氨酸、精氨酸、脯氨酸和谷氨酰胺在动物机体内可相互转化，并发挥重要作用[30]。有研究表明，日粮中添加谷氨酸可以帮助动物减轻肠道氧化损伤[31]，增强肌纤维强度[32]。精氨酸有抗胁迫能力，影响生物体的性腺发育速度与非特异性免疫调节的功能[33-34]。表明发酵饲料的丰富氨基酸组成，影响克氏原螯虾新陈代谢和营养物质的吸收转化。
经KEGG通路分析发现，差异通路主要涉及氨基酸代谢和神经传导等方面，在组氨酸代谢、氨酰-tRNA生物合成、精氨酸-脯氨酸代谢以及蛋白质消化与吸收这几条通路上差异最显著。本研究中上调的谷氨酸和下调的组氨酸，被富集到氨酰-tRNA生物合成代谢通路和组氨酸代谢上。氨酰-tRNA合成，受特定的酶催化氨基酸与相应tRNA氨酰化，增强生物体遗传信息翻译准确性。谷氨酸可以由组氨酸代谢而来，并且是谷氨酰胺前体，可以在蛋白质合成阶段的后期以谷氨酰尾的形式修饰添加，对肌肉生成有促进作用[35]。表明在发酵饲料饲喂的环境下，克氏原螯虾机体组织相应调整了谷氨酸代谢能力，促进了肌肉的氨酰化反应以及ATP的激活，提升运动能力。下调表达的组氨酸和精氨酸则被富集到精氨酸-脯氨酸代谢和蛋白质消化与吸收通路中，表明在发酵饲料环境下，谷氨酸向精氨酸和脯氨酸的转化受到抑制，克氏原螯虾为适应不同的日粮环境可能相应地降低了部分蛋白质的翻译。
4. 结论
本研究通过代谢组学结合LC-MS的方法，研究了两种日粮模式下克氏原螯虾肌肉代谢产物的变化。结果表明，投喂发酵饲料一方面促进了克氏原螯虾肌肉中多种生理功能物质的合成，推测克氏原螯虾通过摄食获得运动能力和增强免疫；另一方面促进了肌肉中多种磷脂类物质的合成，提升了克氏原螯虾的食用价值。对差异代谢产物进行了KEGG通路富集分析，发现发酵饲料显著影响了组氨酸代谢、精氨酸-脯氨酸、蛋白质消化吸收和氨酰-tRNA合成这几条代谢通路。表明日粮能显著影响克氏原螯虾机体氨基酸代谢，推测发酵饲料在促进克氏原螯虾肌肉中特定蛋白质合成、调节代谢和辅助合成氨酰-tRNA酶类等方面发挥积极作用。
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图 3 首次免疫后28 d目的基因在DNA水平上的组织分布
a-1、a-2、a-3分别为肝、脾、头肾simA分布；M. Marker 3；1. pcDNA3.1-simA组；2. 混合疫苗组；3、4分别为PBS组、pcDNA3.1 (+)组；5. 阳性对照；6. 阴性对照b-1、b-2、b-3分别为肝、脾、头肾pgmA分布；M. DS2000；1. 阳性对照；2. 阴性对照；3、4分别为pcDNA3.1−pgmA组及混合疫苗组；5. PBS组；6. pcDNA3.1 (+)组
Figure 3. Tissue distribution of target gene at DNA level at 28 d after first immunization
a-1, a-2, a-3. Expression maps of liver, spleen and head kidney, respectively; M. Marker3; 1. pcDNA3.1-simA group; 2 Mixture vaccine group; 3–4. PBS group and pcDNA3.1(+) group, respectively; 5. Positive control; 6. Negative control b-1, b-2, b-3. Expression maps of liver, spleen and head kidney, respectively; M. DS2000; 1. Positive control; 2. Negative control; 3–4. pcDNA3.1-pgmA and mixture vaccine group respectively; 5. PBS group; 6. pcDNA3.1 (+) group
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图 4 首次免疫后28 d目的基因在RNA水平上的组织分布
a-1、a-2、a-3分别为肝、脾、头肾simA分布；M. Marker 3；1. 阴性对照；2. 阳性对照；3. PBS组；4. pcDNA3.1 (+)组；5、6分别为混合疫苗组、pcDNA3.1 (+)-simA组 b-1、b-2、b-3分别为肝、脾、头肾pgmA分布；M. Marker 3；1. pcDNA3.1-pgmA组；2. 混合疫苗组；3. PBS组；4. pcDNA3.1 (+)组；5、6分别为阳性对照、阴性对照组
Figure 4. Tissue distribution of target gene at RNA level at 28 d after first immunization
a-1, a-2, a-3. Expression maps of liver, spleen and head kidney, respectively; M. Marker3; 1. Positive control; 2. Negative control; 3. Mixture vaccine group; 4. pcDNA3.1-simA group; 5–6. PBS group and pcDNA3.1 (+) group, respectively;b-1, b-2, b-3. Expression maps of liver, spleen and head kidney, respectively; M. Marker 3; 1. pcDNA3.1-pgmA group; 2. Mixture vaccine group; 3. PBS group; 4. pcDNA3.1 (+) group; 5–6. Positive control and negative control, respectively
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图 5 血清抗体滴度和抗菌活性
n=3; *. 差异显著 (P<0.05，独立样本t检验)；后图同此
Figure 5. Antibody titer and antibacterial activity in serum
n=3; *. Significant difference (P<0.05, Inndependent t-test); the same case in the following figures
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图 6 首次免疫28 d后鳃 (a)、肝 (b)、肾脏 (c) 和头肾 (d) 中免疫相关基因相对表达水平
**. 差异极显著 (P<0.01)
Figure 6. Relative expression of immune genes in parotid (a), liver (b), kidney (c) and head kidney (d) at 28 d after first immunization
**. Very significant difference (P<0.01)
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图 7 罗非鱼免疫攻毒后存活状况 (n=30)
Figure 7. Survival status of tilapia after injection with S. iniae
表 1 免疫相关基因定量引物
Table 1 Immune genes' primers for real-time PCR
名称
Name序列
SequenceIL-1β-F CAGGTGGTGGAAGTGTGTCA IL-1β-R GGTCAAACTGGAGCGCAAAC TNF-α-F CCTGCTGTTTGCCTGGTACT TNF-α-R GCTTTGCTGCTGATCCGTTT β-actin-F TCAGCAAGCAGGAGTACGATG β-actin-R AGCTGAAGTTGTTGGGCGTT 
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表 2 simA、pgmA基因生物信息学分析
Table 2 Bioinformatics analysis of simA and pgmA genes
分析项目
Analysis itemsimA基因
simA genepgmA基因
pgmA geneORF区长度
Length of ORF1 566个 碱基 1 716个 碱基 GC碱基含量
GC base content36.59% 38.69% 编码氨基酸的数目
Number of coding amino acids521 571 蛋白分子量预测
Molecular weight of protein57.5 kD 62.4 kD 蛋白分子式预测
Protein molecular formulaC2481H4159N705O827S12 C2804H4352N714O876S10 等电点
Isoelectric point5.78 4.68 保守性
Conservatism与QMA0248株相似度为99% 与DGX07株相似度为100%；与QMA0248株相似度为99%
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表 3 DNA疫苗对罗非鱼的相对保护率
Table 3 Relative protection rate of DNA vaccine against tilapia
组别
Group前处理
Pre-processing总尾数
Total死亡尾数
Death number死亡率
Mortality/%相对保护率
RPS/%1 PBS 30 28 93.3 − 2 pcDNA3.1-simA 30 14 46.7 49.9 3 pcDNA3.1-pgmA 30 11 36.7 60.7 4 混合疫苗 30 7 23.3 75.0 5 pcDNA3.1(+) 30 25 83.3 10.7
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