克氏原螯虾 (Procambarus clarkii)，俗称“小龙虾”，属甲壳纲、十足目、蝲蛄科，原产于北美洲，1929年由日本引入中国^[1-2]。近年来，因其肉洁白细嫩，味道鲜美，再加上神奇的加工制作方法而火爆全国，受到广大食客的喜爱和追捧^[3]。对克氏原螯虾的研究多集中于养殖模式、营养学、免疫学等方面^[4-11]，而对其蜕壳特征的报道较少^[12-13]。蜕壳实则是克氏原螯虾生长和发育的生物节律，贯穿于其个体发育的始终，虾须进行周期性蜕壳才能成长。蜕壳过程可持续十几至几十分钟，此时极易受同类或其他敌害生物的侵袭，而通常死亡时间多发生于蜕壳时和蜕壳后两个时期 (图1)。幼体一般4~6 d蜕壳一次，离开母体进入开放水体的幼体每5~8 d蜕壳一次，后期幼体的蜕壳间隔一般为8~20 d，水温高，食物充足，发育阶段早，则蜕壳间隔短^[14]。从幼体到性成熟，虾要进行11次以上的蜕壳。其中蚤状幼体阶段蜕壳2次，有体阶段蜕壳9次以上。在养殖生产中，蜕壳是生与死的考验：1) 易应激死亡；2) 因环境不好，鳃部修复不到位。

图  1  蜕壳死亡的克氏原螯虾 (左) 和蜕壳后的虾皮 (右)

Figure  1.  Molting dead crayfish (left) and molting crayfish shell (right)

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虾蟹类的蜕壳状况直接决定后续的养殖效果，而环境则是影响其蜕壳及生长发育的重要因素^[15]。虾蟹养殖过程中需要从水体吸收大量的钙来满足生长需求^[16]；pH诱导在一定范围内会加速中华绒螯蟹 (Eriocheir sinensis) 的蜕壳^[17]，过高 (pH 10时) 则可能会一定程度抑制其生长；盐度对拟穴青蟹 (Scylla paramamosain) 蜕壳后的存活时间影响较为显著，盐度高于40时青蟹即使可成功蜕壳，其蜕壳后的存活时间与低盐度组相比明显下降^[18]。此外，溶解氧 (DO) 浓度也与甲壳动物蜕壳密切相关^[19]。克氏原螯虾作为底栖穴居性甲壳类，DO对其生命活动有较大影响。当ρ (DO)高于5 mg·L⁻¹时拟穴青蟹蜕壳率高于70%，低于4 mg·L⁻¹则不利于拟穴青蟹的蜕壳^[18]。拟穴青蟹处于即将蜕壳阶段时，需氧量较平时显著增加，供氧量不足会直接导致蜕壳过程受影响，蜕壳成功率降低。

环境因子对甲壳类蜕壳有重要影响。因此，研究各种环境因子对机体蜕壳的影响，不仅具有理论意义，也有实际应用价值。刘其根等^[20]研究发现只有在适宜的蜕壳环境中克氏原螯虾才能正常顺利地蜕壳，如浅水、弱光、安静、水质清新的环境和营养全面的优质适口饵料等，但对克氏原螯虾蜕壳影响因素及预防对策却少见报道。本文通过研究不同环境因子对克氏原螯虾蜕壳的影响，观察分析克氏原螯虾蜕壳死亡原因，探究其预防对策，以期为其生产应用提供理论参考。

1.   材料与方法

实验在中国水产科学研究院南海水产研究所深圳试验基地“农业农村部斑节对虾遗传育种中心”进行，按照克氏原螯虾的规格不同，各随机挑选同一批次的虾作为实验材料。

1.1   钙镁实验

选取同一批次的克氏原螯虾 [体质量为 (0.05±0.01) g] 为实验材料，参考刘存歧等^[21]和岳彩锋^[22]研究结果，设置不同钙 (Ca²⁺)、镁 (Mg²⁺) 质量浓度。A组：ρ (Ca²⁺)、ρ (Mg²⁺) 均为0 mg·L⁻¹；B组：ρ (Ca²⁺) 为30 mg·L⁻¹，ρ (Mg²⁺) 为15 mg·L⁻¹；C组：ρ (Ca²⁺)为60 mg·L⁻¹，ρ (Mg²⁺)为30 mg·L⁻¹；D组：ρ (Ca²⁺)为90 mg·L⁻¹，ρ (Mg²⁺)为45 mg·L⁻¹。每组设3个平行，每个平行放30尾虾，于室内黑桶 (500 L水) 中养殖30 d。实验期间，水温27~31.5 ℃，ρ (DO)为5.6~6.4 mg·L⁻¹，自然采光，24 h充气。每天投喂3次 (8:00、17:00、22:00)，投喂量为虾体质量的2%~3%，投料1 h后观察虾的摄食情况，及时调整投料量，每隔48 h更换新鲜实验用水。

1.2   pH和溶解氧实验

选取同一批次的克氏原螯虾[体质量为 (30.12±1.42) g]为实验材料，参考郭春雨等^[23]和岳彩锋^[24]研究结果，设置不同的pH和溶解氧质量浓度。a组：pH为7.82±0.12，ρ (DO)为 (7.00±0.32) mg·L⁻¹；b组：pH为9.23±0.10，ρ (DO)为 (7.00±0.32) mg·L⁻¹；c组：pH为7.82±0.12，ρ (DO)为 (4.50±0.24) mg·L⁻¹。每组设3个平行，每个平行放30尾虾，于室内水泥池 (1.84 m×1.70 m×1.73 m) 养殖30 d。实验期间水温为26~30 ℃，自然采光。每天投喂3次 (8:00、17:00、22:00)，投喂量为虾体质量的2%~3%，投料1 h后观察虾的摄食情况，及时调整投料量，并于每日18:00吸污并补充新鲜淡水。

1.3   盐度实验

选取同一批次的克氏原螯虾体质量为[(1.2±0.34) g]为实验材料，设置不同梯度的盐度，即0 (对照)、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30。每组设3个平行，每个平行放30尾虾，于室内长方形桶 (100 L水) 中观察养殖12 d，后期无死亡情况，养殖持续到30 d为止。实验期间，水温27~31.5 ℃，ρ (DO) 为5.6~6.4 mg·L⁻¹，自然采光，24 h充气。每天投喂3次 (8:00、17:00、22:00)，投喂量为虾体质量的2%~3%，投料1 h后观察虾的摄食情况，及时调整投料量，并每隔48 h更换新鲜实验用水。

1.4   蜕壳虾数的评估测定

通常克氏原螯虾的单次蜕壳个体数是从上一次蜕壳高峰期结束至此次蜕壳高峰期过程出现的虾蜕壳数量，而蜕壳次数是蜕壳高峰期的出现次数。

蜕壳率=单次蜕壳个体数/单次总个体数×100%

蜕壳死亡率=个体蜕壳死亡数/单次总个体蜕壳数×100%

其中蜕壳个体数为计算蜕壳的数量，个体蜕壳死亡数为因蜕壳而死亡的虾的数量。

1.5   统计分析

用Excel 2013和SPSS 21.0软件处理数据，进行单因素方差分析，Duncan's多重比较分析各组间的差异显著性 (P<0.05) 和差异极显著性 (P<0.01)，结果以“平均值±标准差 ($\overline{X}\pm \rm{SD} $)”表示。

2.   结果

2.1   Ca²⁺、Mg²⁺浓度对克氏原螯虾蜕壳的影响

水体中不同Ca²⁺、Mg²⁺浓度对克氏原螯虾蜕壳的影响见表1，各实验组虾的末体质量均显著高于对照组 (P<0.05)。B组和C组的成活率和显著高于对照组和D组 (P<0.05)，而B组和C组差异不显著 (P≥0.05)。就各组蜕壳率而言，B组 (82.22%) 和C组 (78.89%) 显著高于对照组和D组 (P<0.05)，而B组和C组差异不显著 (P≥0.05)；B组和A组的蜕壳率差异最大，相差约25.55个百分点。

表  1  不同钙、镁离子浓度对克氏原螯虾生长及蜕壳的影响

Table  1.  Effects of different Ca²⁺ and Mg²⁺ concentrations on decidua of P. clarkii

指标 Index	A组 Group A	B组 Group B	C组 Group C	D组 Group D
末体质量 Final body mass/g	1.28±0.04b	1.99±0.16a	2.00±0.27a	1.83±0.19a
成活率 Survival rate/%	68.89±3.85b	86.67±3.34a	85.56±5.09a	74.45±3.85b
蜕壳率 Molting rate/%	56.67±3.34b	82.22±1.92a	78.89±1.92a	68.89±1.92b
注：同行数据 (平均值±标准差) 上标字母不同者之间表示存在显著差异 (P<0.05) Note: Values (${\overline{X}\pm \rm{SD} } $) within the same row with different superscript letters are signiifcantly different (P<0.05).

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水体中不同Ca²⁺、Mg²⁺浓度对虾蜕壳死亡率的影响见图2。对比各组虾的蜕壳死亡率，B组 (1.15%) 和C组 (2.16%) 显著性低于D组 (P<0.05)，极显著性低于A组 (P<0.01)，而B组和C组无显著差异；此外，同样B组和A组的蜕壳死亡率差异最大，相差8.09个百分点。

图  2  不同钙、镁离子浓度对克氏原螯虾蜕壳死亡率的影响

同时期数据中上标不同字母者之间差异显著 (P<0.05)，后图同此

Figure  2.  Effects of different Ca²⁺ and Mg²⁺ concentrations on molting mortality of P. clarkii

Means with different superscript letters are significantly different (P<0.05). The same case in the following figures

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2.2   不同pH和溶解氧对克氏原螯虾蜕壳的影响

水体中不同pH和溶解氧对克氏原螯虾生长及蜕壳的影响见表2。F组和G组虾的末体质量均显著高于对照E组 (P<0.05)。E组的成活率显著高于F组和G组 (P<0.05)，而F组和G组差异不显著 (P≥0.05)。就各组蜕壳率而言，E组 (81.11%) 显著高于F组 (58.89%) 和G组 (44.44%) (P<0.05)，而F组和G组的差异不显著 (P≥0.05)；E组和G组的蜕壳率差异最大，相差36.67个百分点。

表  2  不同pH和溶解氧对克氏原螯虾生长及蜕壳的影响

Table  2.  Effects of different pH values and dissolved oxygen concentrations on decidua of P. clarkii

指标 Index	E组 Group E	F组 Group F	G组 Group G
末体质量 Final body mass/g	42.37±1.10a	35.25±1.31b	33.44±0.99b
成活率 Survival rate/%	85.56±5.09a	73.33±3.34b	71.11±5.09b
蜕壳率 Molting rate/%	81.11±3.84a	58.89±5.09b	44.44±5.09c
注：同行数据 (平均值±标准差) 上标字母不同者之间表示存在显著差异 (P<0.05)Note: Values (${\overline{X}\pm \rm{SD} } $) within the same row with different superscript letters are signiifcantly different (P<0.05).

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水体中不同pH和溶解氧对克氏原螯虾蜕壳死亡率的影响见图3。各实验组虾对比各组虾的蜕壳死亡率，E组 (5.57%) 显著性低于F组 (29.70%) 和G组 (26.37%) (P<0.05)，而F组和G组无显著差异；另外同样F组和E组的蜕壳死亡率差异最大，相差24.13个百分点。

图  3  不同pH和溶解氧对克氏原螯虾蜕壳死亡率的影响

Figure  3.  Effects of different pH values and dissolved oxygen concentrations on molting mortality of P. clarkii

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2.3   不同盐度对克氏原螯虾蜕壳的影响

盐度在15以上的各组虾比12以下的虾早一天出现蜕壳现象，而盐度18以下的各组虾比盐度21以上虾的蜕壳现象早一天结束 (图4)。此外各组虾的蜕壳率随着盐度的增高总体出现上升的趋势。实验各组虾的蜕壳率显著高于对照组 (P<0.05)，其中30组的蜕壳率最高 (24.45%)，也与对照组的蜕壳率差异最大，相差23.34个百分点。

图  4  不同盐度对克氏原螯虾蜕壳率的影响

Figure  4.  Effects of different salinities on molting rate of P. clarkii

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水体中不同盐度对克氏原螯虾死亡率的影响见表3。实验各组虾的死亡率随着时间和盐度的增加呈现上升趋势。实验组的死亡率显著高于对照组 (P<0.05)，而实验组中盐度6组的死亡率最低 (16.67%)，盐度27组和30组的死亡率最高 (100%)，而盐度27组和30组差异不显著 (P≥0.05)。就各组死亡率而言，对照组在第4天后虾开始稳定，停止死亡；而盐度介于3~15的各组虾基本在第8天后开始稳定或死亡率降低，但是18以上盐度组一直出现死亡情况，直至实验结束。两个最高盐度组和对照组的死亡率差异最大，相差97.78个百分点，而6盐度组仅相差14.45个百分点。

表  3  不同盐度对克氏原螯虾死亡率的影响

Table  3.  Effects of different salinities on mortality rate of P. clarkii %

盐度 Salnity	1天 1 d	2天 2 d	4天 4 d	6天 6 d	8天 8 d	10天 10 d	12天 12 d
0	0.00±0.00	1.11±1.11CD	2.22±1.11F	2.22±1.11E	2.22±1.11F	2.22±1.11H	2.22±1.11H
3	0.00±0.00c	1.11±1.11cCD	5.56±2.94cEF	13.33±1.93bD	23.33±1.95aCD	25.57±2.94aF	25.57±2.94aF
6	0.00±0.00c	0.00±0.00cD	8.89±1.11bDE	8.89±1.11bD	16.67±3.34aE	16.67±1.93aG	16.67±1.93aG
9	0.00±0.00d	0.00±0.00dD	3.33±1.93cdEF	7.78±1.11cDE	20.00±3.33cDE	26.67±1.93aF	26.67±1.94aEF
12	0.00±0.00d	0.00±0.00dD	2.22±1.11dF	8.89±1.11cD	25.56±1.11bCD	31.11±1.11aEF	31.11±1.11aDE
15	0.00±0.00c	0.00±0.00cD	4.44±1.11cEF	12.22±3.85bD	25.56±2.94aCD	30.00±1.92aEF	30.00±1.92aDEF
18	0.00±0.00e	1.11±1.11deCD	4.44±1.11dEF	12.22±3.85cD	20.00±1.92bDE	34.44±1.11aDE	34.44±1.11aCD
21	0.00±0.00f	7.78±1.11eAB	17.78±1.11dC	20.00±3.33dC	30.00±1.92cC	40.00±1.92bC	50.00±1.92aB
24	0.00±0.00e	5.57±2.94eB	13.33±1.93dCD	21.11±5.09cC	28.89±1.11bC	36.67±1.93aCD	36.67±1.93aC
27	0.00±0.00g	11.11±1.11fA	24.44±1.11eB	38.89±1.92dB	54.44±1.11cB	90.00±1.92bB	100.00±0.00aA
30	1.11±1.11e	4.44±1.11eBC	35.56±2.94bA	68.89±5.09cA	86.67±3.85bA	100.00±0.00aA	100.00±0.00aA
注：上标小写字母不同者表示同行数据 (平均值±标准差) 之间存在显著差异 (P<0.05)，上标大写字母不同者表示同列数据 (平均值±标准差) 之间存在显著差异 (P<0.05)Note: Values (${\overline{X}\pm \rm{SD} } $) with different lowercase letters within the same row are signiifcantly different (P<0.05), while those with different uppercase letters within the same column are signiifcantly different (P<0.05).

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不同盐度对克氏原螯虾实验末期蜕壳死亡率的影响见图5。随着盐度升高，蜕壳死亡率呈现先上升后下降趋势。盐度3组和盐度6组并未出现因蜕壳而造成死亡的虾，两组差异不显著(P≥0.05)，而盐度9组开始虾出现蜕壳死亡情况。此外，15~30盐度组的蜕壳死亡率均显著高于0~12盐度组(P<0.05)，其中盐度21组的蜕壳死亡率最高(P<0.05)，达到49.18%。

图  5  不同盐度对克氏原螯虾实验末期的蜕壳死亡率的影响

Figure  5.  Effects of different salinities on molting mortality rate of P. clarkii at end of experiment

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3.   讨论

3.1   水体中Ca²⁺、Mg²⁺、pH和DO对克氏原螯虾蜕壳的影响

Ca²⁺浓度、盐度等水环境因子对克氏原螯虾的蜕壳有显著影响^[25]。慕峰^[25]指出水体中缺乏Ca²⁺会显著影响幼虾的生长、存活及蜕壳状况。本实验中，水体中ρ (Ca²⁺)为30 mg·L⁻¹、ρ (Mg²⁺)为15 mg·L⁻¹时，克氏原螯虾的成活率最高，蜕壳率最高，而蜕壳死亡率最低。

克氏原螯虾在蜕壳过程中，将老壳中的钙质吸收转移至贲门胃前侧壁内，累积形成一对“胃石”，蜕壳后胃石分解，再积淀到新壳中使新壳变硬^[14]。因为克氏原螯虾在蜕壳前生长过程中缺乏摄食钙磷等微量元素，会使虾在蜕壳时丧失大量的钙、磷等微量元素，虾无力而使头胸甲或螯部外壳无法蜕出，即使有些虾勉强蜕壳后又无法立即大量补充钙、磷等微量元素，使虾体内正常生理机能被打破而死亡。因此，水体中及时补充适量的Ca²⁺、Mg²⁺不仅有促进虾生长发育，还可以促进蜕壳，降低蜕壳死亡率，提高产量，对克氏原螯虾生产应用具有重要意义。

本实验用不同梯度pH及DO养殖克氏原螯虾成虾，结果显示当水体中pH为9.23时，虾的成活率会显著降低，蜕壳比例减少，蜕壳中虾的死亡率增高，这与陶易凡等^[26]的研究结果一致。其原因可能是水体中pH过高会对克氏原螯虾的代谢产生影响，同时导致氧化应激，并对鳃和肝胰腺的组织结构造成损伤，影响其生物学功能；再者，由于虾池内水质突然恶化，特别是底质变酸，水体pH过高或有害气体增加等会导致蜕壳后的软壳虾无法适应此种环境，因其通体柔软又无快速迁移能力而中毒死亡。

任信林等^[27]指出当水中DO过低时，虾易出现浮头或中毒现象，影响其生长发育及蜕壳等。本实验中，当水体ρ (DO)为4.5 mg·L⁻¹时，虾的成活率显著降低，蜕壳比例减少，蜕壳中虾的死亡率增高，该结果与任信林等^[27]的结果一致。其原因可能是水体中一系列的氧化还原反应都需有氧气参与^[28]，一旦水体供氧不足，会造成虾生长缓慢，生命活动迟缓。此外，克氏原螯虾在头部蜕壳时有1~2 s是缺氧的，鳃被壳全部封闭，若虾池水中DO低，蜕壳时易造成虾窒息死亡。即使蜕壳后的软壳虾同样无法适应此种环境，因其通体柔软又无快速恢复能力而缺氧死亡。

3.2   盐度对克氏原螯虾蜕壳的影响

克氏原螯虾生活于淡水环境下^[29]，如果受到高盐度刺激，虾体内渗透压会失衡，部分蜕壳或体质较差的虾会应激死亡。盐度变化 (0~20) 对克氏原螯虾血淋巴渗透压、鳃丝Na⁺-K⁺-ATPase活力和生物胺等影响显著^[30]。

本实验用不同梯度盐度急性胁迫克氏原螯虾，结果表明盐度变化会影响虾的蜕壳率和蜕壳死亡率，盐度上升两者出现一定程度的升高趋势。而虾在盐度介于0~6的蜕壳死亡率为零，这与李庭古^[31]的研究结果一致，其原因可能是仔虾对盐度6以下具有较强的适应性的结果^[32]。当盐度超过此范围时，随着盐度增加，幼虾的成活率下降，生长变慢^[31]。盐碱地养殖克氏原螯虾易造成大面积死亡，有些种类即使能存活，但生长差，产量较低而且不稳定^[33]。

盐度的急性变化会影响虾的蜕壳，一方面环境不适应，虾不会蜕壳，或者延长蜕壳时间，另一方面虾在外在因素刺激下又容易发生蜕壳现象。本实验中当水体中盐度为21时，虾的蜕壳死亡率最高，而虾的死亡率却低于盐度27组和盐度30组，说明高盐度超出了虾的耐受性，而蜕壳后的虾自身的免疫力较低，加上机体调节能力严重削弱，最终导致死亡^[34]。

3.3   克氏原螯虾因蜕壳死亡的预防对策

克氏原螯虾在养殖过程中，经常出现蜕壳期死亡现象，造成养殖产量降低，使养殖户蒙受经济损失。在克氏原螯虾的人工养殖中，为预防虾因蜕壳造成死亡现象的发生，笔者提出以下对策：

1) 及时补充Ca²⁺、Mg²⁺等元素，保证水体中ρ (Ca²⁺)为30 mg·L⁻¹、ρ (Mg²⁺)为15 mg·L⁻¹，以促进虾的蜕壳生长；

2) 定期排加水，保持水体pH值稳定在7.82左右，ρ (DO)稳定在7.00 mg·L⁻¹左右，降低有害气体在养殖水中的毒副作用，以便蜕壳后软壳虾能生存；

3) 水体盐度最好保持在6以下，超过此范围，幼虾的成活率会下降，生长也会变慢；

4) 定期检测水体各项指标，及时做好防护措施，为克氏原螯虾顺利渡过蜕壳期做好准备工作。

4.   结论

本研究初步探讨了克氏原螯虾在蜕壳期的几点死亡原因及相应的预防对策，发现水体中适当的Ca²⁺、Mg²⁺浓度不仅可以促进虾生长发育，还可以促进蜕壳，降低蜕壳死亡率；当水体中pH为9.23，或者ρ (DO)为4.5 mg·L⁻¹时，虾的成活率显著降低，蜕壳比例减少，蜕壳中虾的死亡率增高；此外克氏原螯虾仔虾对低盐度有较强的适应性，过高盐度易影响虾的正常蜕壳，也极易引起死亡，而当盐度为21时虾的蜕壳死亡率最高。该结果对克氏原螯虾生产应用、提高产量具有重要意义。但是目前尚不清楚环境因子的交互作用对克氏原螯虾蜕壳的机制、机理影响，因此在多重对比实验及分子水平、蛋白水平等层面对蜕壳机制机理的研究有待开展，这也是下一步研究的重要方向。