Calcium ion binding ability of tilapia skin hydrolysate and its antioxidant activity
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摘要:
该研究利用中性蛋白酶、Protamex1.5L和碱性蛋白酶酶解罗非鱼 (Oreochromis mossambicus) 鱼皮，研究了各种酶解产物对钙离子 (Ca2+) 的结合能力，比较了酶解物结合Ca2+后的抗氧化能力，并分析了结合物的傅里叶红外光谱 (FT-IR)。结果显示，Protamex1.5L水解罗非鱼皮2 h的酶解产物具有最高的Ca2+结合率 (87.79%)；3种罗非鱼皮酶解产物均存在抗氧化性，其中Protamex1.5L酶解罗非鱼皮产物的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除率、·OH自由基清除率和还原力最高分别为51.46%、17.26%和0.09；罗非鱼皮酶解物 (TSH) 结合Ca2+后，钙离子结合物 (TSH-Ca) 的DPPH自由基清除率和羟基自由基清除率减弱，还原力增强；FT-IR分析结果表明了Ca2+与TSH中氨基氮原子和羰基氧原子发生了结合。
Abstract:By digesting tilapia (Oreochromis mossambicus) skin with neutral protease, Protamex1.5L and alkaline protease, we studied the binding ability of different enzymatic products to calcium ions (Ca2+), compared the antioxidant capacity of enzymatic hydrolysates and their combinations, and analyzed the Fourier infrared spectrum of the conjugate. The results show that the enzymatic hydrolysate of Protamex1.5L hydrolyzed tilapia skin had the highest calcium ion binding rate of 87.79%. All the three tilapia skins hydrolysates had antibacterial properties, and the DPPH free radical scavenging rate, OH radical scavenging rate and reducing power of the products of Protamex1.5L enzymatically tilapia skin were 51.46%, 17.26% and 0.09, respectively. After the tilapia skin hydrolysate (TSH) was combined with calcium ions, the DPPH free radical scavenging rate and hydroxyl radical scavenging rate of calcium ion chelate (TSH-Ca) decreased, but the reducing power was enhanced. Fourier transform infrared spectroscopy reveals that calcium ion had combined with amino nitrogen atom and carbonyl oxygen atom in TSH.
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Keywords:
- tilapia skin /
- enzymatic hydrolysis /
- calcium ion combination /
- antioxidant activity
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鱼类运动轨迹监测技术主要有视觉监测技术和声波监测技术。视觉监测技术以视频、图片观察和手工记录为主[1-7]，可以在鱼类不受干扰的情况下较好地对其行为进行观察、记录和分析，但后期数据处理难度较大、误差大且监测数据连续性差。早期的研究主要是对鱼类的行为特征进行观察和描述，基本处于“定性”分析阶段，很难得到鱼类运动行为响应的量化指标。声波监测技术分为被动声学法和主动声学法两种[8]：被动声学法是通过鱼类发出的声波特征进行探测和识别[9]；主动声学法是通过声波设备接收鱼类的回波信号并进行分析和识别，具有受水域环境影响小、应用范围广泛等优势，是当今国内外研究和应用最为广泛的一种方法[10]。目前，声波监测技术应用最广泛的有鱼探仪，采用鱼探仪对水域鱼类资源的丰度[11-16]、时空分布情况 [17-21]和活动规律[22-23]等方面的研究已取得了很多成果，但该技术仅对鱼群的种类、大小和距离进行探测，无法准确定位到鱼类的位置及其运动轨迹。
声学标签系统 (Acoustic Tag System，ATS) 是声波监测技术的一种被动声学法，根据鱼类个体大小和研究周期选择合适的声学标签 (Acoustic tag，也称声学信号发射器) 类型和参数对鱼类运动轨迹进行监测[24]，已逐步成为鱼类行为学研究最主要的手段。目前，国外对声学标签系统的应用研究成果主要有鱼类资源的丰度评估[25]、鱼类的游泳模式[26]、栖息地特征评价[27-29]、鱼类的产卵场地[30]、鱼类的生存情况[31]、鱼类的行为差异[32]、鱼类行为模型[33]等。我国仅有环境变化对鱼类行为的影响[34-35]和水利工程建设对鱼类洄游能力[36-37]等相关方向的研究成果报道。
声学标签系统主要用于江河湖库、海洋、大坝、河口海岸、船闸码头等的鱼类运动轨迹监测，并通过鱼类运动行为响应情况评估鱼类的丰度、种群结构、生理行为、迁徙及栖息地变化等，但应用在水生态环境对鱼类行为产生影响等方面的研究成果相对较少。因此，可将声学标签监测技术在鱼类运动行为学的应用与养殖、生态学、声学、数学模型以及计算机仿真技术等学科相结合，进行多学科的交叉利用与研究。
1. 声学标签监测技术
1.1 声学标签系统的组成
声学标签系统由硬件和软件2个部分组成。硬件部分由声学标签信号接收器、水听器、标签激活器、标签、标签检测器和电脑组成，软件部分包括Tag Programmer (用于激活及休眠标签)、Acoustic Tag (用于原始数据收集及存储) 和Mark Tags (用于原始数据文件中的环境噪音和标签回声信息处理) 3个模块。
1.2 声学标签系统的工作原理
声学标签系统采用4个水听器 (Hydrophone，简写为H1、H2、H3和H4) 接收移植或捆绑于鱼类身上的声学标签发射出来的声波，通过数据线传输到信号终端处理器进行信号处理，最后经计算机终端去噪处理后即可得到鱼类的二维、三维行为轨迹坐标。
1.3 声学标签系统的操作方法
声学标签系统的具体操作方法为：
1) 水听器布设。将水听器下端固定于2个不同平面 (图1)，并设置水听器底部的三维坐标及相关参数。水听器的坐标可根据监测目的选择大地坐标或相对坐标进行设置。4个水听器监测的水域范围一般为0.5 km。如监测范围为河流等线状水域可进行多个水听器线状布设；如监测范围为大水域可根据水域情况布设多个水听器，最多可布设16个，或将水听器固定于监测船进行监测，如果监测船更换位置需要重新设置水听器坐标。
2) 采用标签激活器对声学标签进行唯一编码 (即发射频率) 激活，并用标签检测器检测是否激活成功。编码根据声波信号的发射频率进行设置，设置范围一般为1 000～6 000 Hz。可根据实际情况需要选择编码大小，如设置的发射频率为3 000 Hz即每3 s可获得1个声波信号，1个信号代表1个轨迹点。每1 h为一组数据计，一组数据有1 200个轨迹点，一年可监测到的轨迹点约1 051.2 × 104个。
3) 将已激活的声学标签捆绑或移植于试验鱼身上，水听器将接收到声学标签发射出来的声波信号并通过信号线传输至信号处理器，在PC终端便可实时监控鱼类的二维、三维运动轨迹 (图2)。
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图 2 实时监测的鱼类三维 (a)、二维 (b) 运动轨迹Figure 2. 3D (a) and 2D (b) motion trajectories of fish in real-time4) 采用数据处理软件Mark Tags模块对采集的原始信号进行去噪处理即可获得鱼类二维、三维运动轨迹坐标。
2. 鱼类运动轨迹数据处理方法
在数据监测过程中，除了接收到这些具有特定发射频率的标签发射的声波信号之外，还会接收到其他噪声的声波信号 (图3)，或者接收的信号不连续，这些信号数据通常被称为“异常数据”。由于异常数据的存在导致监测到的原始轨迹数据杂乱无序 (图2)，很难从这些庞大的试验数据中获取隐藏于其中的信息和数据变化规律。如果对这些原始数据直接进行分析，得到的结果将是不准确甚至是错误的。因此，在数据分析，首先要对这些杂乱无序的大数据进行处理，对原始的运动轨迹数据进行去噪、清洗，转换成简洁、高效的鱼类二维、三维行为轨迹数据 (图4)，最后加载到数据库中。
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图 4 去噪处理后鱼类三维 (a)、二维 (b) 运动轨迹Figure 4. 3D (a) and 2D (b) motion trajectories of fish after denoising监测到的异常数据类型主要有4类：噪声值、缺失值、异常值 (离群值) 和重复值。数据清洗过程通常是将重复和多余的数据筛选后清除、将缺失的数据补充完整、将错误的数据纠正或删除，最后整理可用的数据库，为数据挖掘和分析的准确性奠定基础。以下是根据不同异常数据类型采用不同的数据清洗方法。
2.1 噪声值
在采集声学标签声波信号的同时也会接收到其他噪声声波的信号 (图5)，通过数据处理软件Mark Tags模块设置相关的去噪参数，或者添加噪声过滤器即可对采集到的原始信号进行去噪和过滤处理，得到声学标签的声波信号 (图6)。
2.2 缺失值
缺失值的清洗方法有删除法、均值插补法、热卡填补法、最近距离决定填补法、回归填补法、多重填补方法、K-最近邻法、有序最近邻法和基于贝叶斯的方法等。根据数据的缺失程度选择不同的清洗方法，其中删除法方法适用于数据比较多且缺失值的数量占整个数据的比例相对较小的情况，可以直接将缺失值删除掉，是一种最简单有效的方法。
在鱼类运动轨迹数据采集过程中，会出现由于环境客观条件造成信号无法获取而导致轨迹缺失的情况，可通过均值插补法进行插补 (图7)，但某个时间段的缺失值较多则不再进行插补。如设置的声波信号发射频率为3 s，若信号中断时间超过10 s时将不再进行插补 (图8)。采用数据处理软件的Mark Tags模块过程中即可实现缺失值的自动插补。
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图 7 对缺失值进行均值插补后鱼类运动轨迹Figure 7. Fish trajectories after mean interpolation of missing values2.3 异常值 (离群点)
异常值清洗方法主要有统计分析法、3∂原则、箱型图分析等，其中统计分析法是一种常用的简单方法。对数据库进行简单的筛选和统计，分别对鱼类运动轨迹三维坐标的x、y、z值进行排序，取数据的最大值和最小值来判断是否超出取值范围，若超出该范围则作删除处理。鱼类运动轨迹坐标应出现在水域内如a点，如果轨迹点如b点出现在水域外则显然不合常理，此为异常值，b点坐标应被删除 (图9)。
2.4 重复值
对于数据重复值的判断主要采用排序与合并的方法。重复值的检测方法主要有2个步骤：首先将数据库的数据按一定规律排序，然后通过比较相邻数据的相似情况来检测数据是否重复。对鱼类的三维运动轨迹重复值进行统计，通过判断鱼类在某处的重现性来获得鱼类的运动行为规律以及对栖息场所的偏好等信息。
要从这些庞大的数据中获得鱼类重现频率较高的轨迹坐标，需要采用数据查询语言对数据进行查询以获取有用的数据信息。数据查询语言Frequency函数是统计各区间段数值频率的一个函数，其结构为Frequency (Data_array和bins_array)，其中Data_array是用于判断的数组或者数据区域，而bins_array是用于输出结果数据的分割点。其查询步骤为：输入函数Frequency→设定参数data_array和bins_array→选择输出结果的单元格区域→按F2键输入函数公式→按“Ctrl+Shift+Enter”可返回一个数组。
为获得鱼类的运动轨迹分布情况，可将轨迹坐标分别投影在xy平面和xz平面上即可得到轨迹散点图。散点图在大数据分析中的作用尤为明显，其可以展示数据的分布和聚合情况。通过散点图中散点的疏密程度和变化趋势来获得鱼类运动行为规律，轨迹越密集说明鱼类出现的频率越高。
3. 声学标签系统的应用实例
实测水域为某高校校园的景观湖，水域面积为5.3 × 103 m2，水深为1.6～2.5 m，湖内修建有景观亭 (图10)。湖内水源的主要补给来源为天然降水和校内污水处理站的中水补给，湖中有鲤 (Cyprinus carpio)、鲫 (Carassius auratus) 等湖泊常见鱼种。景观湖为封闭水域，自净能力较差，水中的氮 (N)、磷 (P) 营养元素长期积累容易导致水体的富营养化，尤其是在夏季，气温高容易导致水质恶化，严重影响景观湖的生态功能和景观效果。
由于春、夏季水域生态环境变化较大，因此对鱼类在春、夏季的运动行为轨迹进行了监测。发现春、夏两季鱼类的运动轨迹变化明显 (图11，图12)：春季到夏季，在水平方向上鱼类离污染源的距离越大，垂直方向上鱼类由底层往表层迁移。引起鱼类运动行为发生变化的主要原因除了水温外，还与水中溶解氧 (Dissolved oxygen, DO) 含量和藻类死亡释放的毒素如微囊藻毒素的分布有关。夏季水温高，日照充足，加上N、P营养物质的不断输入，湖内藻类及其他浮游生物迅速繁殖并消耗水中大量的氧气 (O2) 导致水中DO含量不断下降，且得不到及时补充，致使O2收支不平衡，藻类死亡并释放衍生污染物。说明鱼类运动行为发生改变主要与水环境因子有关，通过评价鱼类运动行为与水环境因子的相关性，可为养殖水质及水生态健康评价等提供参考依据。
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图 11 春季 (a) 和夏季 (b) 鱼类运动轨迹在水平面的分布情况Figure 11. Distribution of fish motion trajectories in horizontal direction in spring (a) and summer (b)![]()
图 12 春季 (a) 和夏季 (b) 鱼类运动轨迹在水深方向的分布情况Figure 12. Distribution of fish motion trajectories in vertical direction in spring (a) and summer (b)4. 应用前景
目前，鱼类声学标签监测技术多应用于江河湖库和海洋等鱼类丰度、种群结构等方面的研究。采用该技术对自然水域环境中鱼类的运动行为轨迹进行实时监测，可为研究水利工程建设对鱼类洄游能力、产卵以及栖息地的影响，鱼类在生境变化过程的行为响应，鱼类毒理性行为响应，鱼类行为水质监测系统建设，水生态环境健康评价以及水生态修复效果评价等提供科学的依据，是一种实时有效、快速的先进技术。
此外，根据鱼类对不同养殖水质环境的行为响应可为水产养殖提供重要的指导信息[38-39]。目前，该声学标签监测技术在水产养殖业的应用较少，具有广泛的应用前景。如通过研究鱼类的运动轨迹变化规律，掌握鱼类的栖息场所，指导人工繁殖和幼鱼培育，可以提高幼鱼的成活率和质量；此外，鱼食投放和污染物的排入会引起水质的改变，鱼类如果表现出逃避行为，且大多数都集中在洁净水的一端，表明水质遭受到污染。因此，通过连续测定鱼类的运动轨迹，对比鱼类当前运动轨迹与历史运动轨迹的变化，可实现渔业养殖水质环境的实时在线监测和预警，为提高水产养殖的产量和质量提供可靠的科学依据。
利用声学标签监测技术对鱼类运动行为轨迹进行24 h监测，获得鱼类的实时三维运动轨迹坐标并进行相关的数据分析及应用，是一种先进的技术手段。与其他监测技术相比，声学标签监测技术具有原位观察、数据处理方法简单、可24 h实时监控鱼类的二维、三维运动轨迹等优势。但该技术是通过接收鱼类身上声学标签发送的声波信号来确定鱼类的位置，在数据监测过程中可能会出现鱼类死亡、声学标签丢失和标签电量不足等情况，因此需要技术人员及时对监测数据进行实时监控和数据处理分析，以保证监测数据的连续性和准确性。
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图 1 不同酶解时间水解度和钙离子结合能力的比较
Figure 1. Comparison of degree of hydrolysate and calcium ion binding ability of hydrolysates at different hydrolysis time
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图 2 不同罗非鱼皮酶解物的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除率的比较
Figure 2. Comparison of DPPH free radical scavenging rate of different TSH
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图 3 Protamex1.5L不同时间的罗非鱼鱼皮酶解物和钙离子结合物的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除率、·OH自由基清除率和还原力的比较
Figure 3. Comparison of DPPH· scavenging activity, ·OH scavenging rates and reducing power activity between TSH and TSH-Ca at different time in Protamex1.5L
表 1 最优的酶解条件
Table 1 Optimal enzymatic conditions
种类
type酶活力
enzyme activitypH 温度/℃
temperature加酶量/(U·g−1)
enzyme amount中性蛋白酶
neutral protease1×105 U·g−1 7.0 50 4 000 Protamex 1.5L 1.5 AU·g−1 7.0 50 4 000 碱性蛋白酶
alkaline protease2×105 U·g−1 8.5 50 4 000 
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