Preparation and immunogenicity of Lactococcus lactis vaccine expressing Sip-Pgk fusion protein of Streptococcus agalactiae isolated from tilapia
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摘要:
为研制比无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)单个蛋白抗原免疫效果更佳的多蛋白重组罗非鱼 (Oreochromis sp.) 链球菌病口服疫苗，该研究利用同源重组法构建表达无乳链球菌Sip-Pgk融合蛋白的pNZ8148-sip-pgk质粒，通过电转化乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) NZ9000中获得L. lactis NZ9000 pNZ8148-sip-pgk重组乳酸菌，使用nisin诱导表达并进行Western blot鉴定，制备Sip-Pgk融合蛋白乳酸菌口服疫苗，通过不同免疫次数隔周免疫的方式灌胃罗非鱼。ELISA检测免疫后的血清抗体水平，在灌胃免疫结束后的第18天通过腹腔注射无乳链球菌攻毒获得相对免疫保护率。结果显示，构建的重组乳酸菌诱导表达的蛋白大小为92 kD，与目的蛋白大小一致。与2次免疫比较，3次免疫该融合蛋白乳酸菌疫苗能显著提高罗非鱼的血清抗体水平和对无乳链球菌的免疫保护效果。3次免疫Sip-Pgk融合蛋白乳酸菌疫苗的血清水平显著高于单一蛋白组和PBS组，其相对免疫保护率最高(45.56%)。
Abstract:In order to develop a more effective Oreochromis sp. oral vaccine of Streptococcus agalactiae, we constructed a recombinant plasmid pNZ8148-sip-pgk which expressed Sip-Pgk fusion protein of S. agalactiae by using homologous recombination, and Lactococcus lactis NZ9000 pNZ8148-sip-pgk was obtained by electrotransformation of L. lactis NZ9000. The Sip-Pgk fusion protein was induced by nisin and tested by Western blot so that a Sip-Pgk fusion protein Lactobacillus oral vaccine was prepared. The tilapia was vaccinated orally by gavage with recombinant L. lactis NZ9000 pNZ8148-sip-pgk for twice or three times. ELISA was used to detect the level of serum antibody after immunization, and the relative immune protection rate was obtained by intraperitoneal injection of S. agalactis on the 18th day after immunization. The results show that the inducible protein size of the constructed recombinant Lactobacillus was 92 kD, which was consistent with the size of the target protein. Compared with the second immunization, the third immunization with the fusion protein Lactobacillus vaccine could significantly improve the serum antibody level of tilapia and the immune protection against S. agalactiae. The serum level of Lactobacillus vaccine immunized with three times Sip-Pgk fusion protein was significantly higher than that of single protein group and PBS group, with the highest relative immune protection rate of 45.56%.
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Keywords:
- Oreochromis sp. /
- Streptococcus agalactiae /
- Lactococcus lactis vaccine /
- fusion protein /
- immunity
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中华绒螯蟹 (Eriocheir sinensis) 简称河蟹，属于甲壳纲、十足目、方蟹科、绒螯蟹属，主要分布于东亚地区[1]。由于其味道鲜美、营养均衡，广受消费者喜爱[2-3]。近几年，中国年养殖总产量近80×104 t，产值超过500×108元[4]。然而，产业高速发展也导致一系列问题出现，例如水系之间的盲目引种和随意杂交，亲本规格的降低和近亲交配，养殖密度的不断增加和病害的频发等，造成长江水系部分中华绒螯蟹养殖群体种质退化[5]。遗传选育是一种重要的种质改良方案。现有的5个中华绒螯蟹新品种[6] (长江1号、长江2号、江海21号、光合1号和诺亚1号) 和长荡湖1号等新品系[7]均主要是以生长速度和规格为指标进行群体选育而产生的，在一定程度上推动了中华绒螯蟹养殖产业的可持续发展。然而，越来越多的消费者开始追求差异化的特色产品，现有的种质资源尚不能满足中华绒螯蟹养殖产业对良种经济性状多样化的需求。
壳色是甲壳动物重要的经济性状，直接影响着消费者的喜好和市场价格[8]。本课题组于2017年以壳色为指标，在国际上首次选育出一种白壳色中华绒螯蟹新品系，暂定为“海大玉蟹”，迄今已经繁育至G3代。现有研究表明，白壳新品系营养均衡且具有生长速度快的优势 (另文发表)，对其进行规模化人工繁育和种质推广可能具有重要意义。生殖性能和胚胎质量评估是开展虾蟹类遗传选育工作的首要步骤，生殖性能评估主要包括亲本抱卵速度、抱卵率、亲本成活率等，而胚胎质量主要为卵径、卵质量、色泽、类胡萝卜素含量以及生化组成等指标[9-12]。以往对中华绒螯蟹生殖性能和胚胎质量的研究主要集中在不同亲本水系来源[10-11]、不同亲本饲料添加[13-14]、亲本营养强化[15-16]、亲本成熟时间[17]和亲本规格[18]，有关壳色的研究仅见于紫壳中华绒螯蟹[19] (色泽不可遗传)。研究表明，紫壳雌蟹亲本的成活率明显高于绿壳雌蟹，虽然紫壳亲本抱卵率略低，但其胚胎中花生四烯酸 (C20:4 n-6, ARA) 和二十二碳五烯酸(C22:5 n-3, EPA) 含量显著高于绿壳[19]。中华绒螯蟹白色壳品系的生殖性能与正常绿壳亲本间是否存在一定差异，至今尚不清楚，这在一定程度上，阻碍了白壳新品系中华绒螯蟹的种质资源开发和推广。鉴于此，本研究测定了中华绒螯蟹白壳新品系和绿壳品系亲本生殖性能与卵质量、常规生化、脂肪酸和类胡萝卜素组成，以期为河蟹基于壳色的多样化育种提供理论基础和实践参考。
1. 材料与方法
1.1 亲本蟹的来源
中华绒螯蟹白壳品系为本课题组2017年初通过家系选育获得。2020年11月初，从上海海洋大学崇明蟹类育种基地室外同一土池中挑选完成生殖蜕壳、体质量相近、肢体完整和体质健壮的白壳奇数年G2代品系和正常绿壳品系 (雌蟹各50只和雄蟹各20只，白壳和绿壳品系雌体亲本的外观照片见图1)。将两种壳色蟹在崇明基地室内循环水槽中按照雌雄分开原则进行暂养，每日17:00投喂适量的冰冻杂鱼和鲜活缢蛏 (Sinonovacula constricta)。
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图 1 中华绒螯蟹白壳 (a) 和绿壳 (b) 品系亲本雌体外观照片Figure 1. Photos of white (a) and green (b) carapace stains of female E. sinensis broodstock1.2 亲本交配
2020年1月14日，在上海海洋大学崇明蟹类育种基地的室内循环水系统中实施亲本交配。白壳和绿壳组各用3个规格和尺寸一致的黑色PVC桶 (Φ108×H120 cm) 养殖，每个桶底部铺设一层约10 cm的细沙供蟹抱卵，同时投放4片PVC塑料瓦片作为遮蔽物。每个桶投放雌蟹10只和雄蟹3只 (生物学指数见表1，同一性别两种壳色各指标间无显著差异)。海水为人工配置的半咸水，盐度17，水深80 cm。每日17:00对室内所有亲本蟹投喂适量冰冻杂鱼和鲜活缢蛏，每日9:00和21:00记录室内交配桶内水温并检查抱卵蟹抱卵和死亡情况。交配7~10 d后剔除雄蟹以防影响雌蟹抱卵。雌体亲本的成活率 (Survival rate, RS, %) 和抱卵率 (Ovigerous rate, RO, %) 计算公式为：
表 1 白壳和绿壳雌体和雄体亲本的生物学性状Table 1. Biological characteristics of white and green carapace strains of E. sinensis broodstock类目 Item 雌体 Female (N=30) 雄体 Male (N=9) 白壳 White carapace 绿壳 Green carapace 白壳 White carapace 绿壳 Green carapace 体质量
Body mass/g161.85±12.39 152.45±10.13 222.57±3.31 215.65±12.09 甲壳长
Carapace length/cm62.12±1.44 60.52±0.70 67.34±0.56 66.63±0.96 甲壳宽
Carapace width/cm68.51±1.45 67.52±1.14 74.79±1.79 75.07±1.16 $$ R_{\mathrm{S}}=\left(S_{\mathrm{i}} / S_{\mathrm{t}}\right) \times 100 {\text{%}} $$ (1) $$ R_{\mathrm{O}}=\left(O_{\mathrm{i}} / O_{\mathrm{t}}\right) \times 100 {\text{%}}$$ (2) 式中：Si和St分别为存活雌体亲本个体数和投放雌体亲本总数；Oi和Ot分别为雌体抱卵蟹数量和交配后雌体存活总亲本数量。
1.3 亲本生殖性能测定
当胚胎发育至原肠胚期，从白壳和绿壳组各取6只抱卵蟹 (每个桶各取2只)，参照李清清等[10]方法测定亲本生殖性能，具体操作为用干毛巾将体表擦干并用镊子将腹部卵块全部取出，剔除携卵的刚毛和绒毛。用海水清洗卵块并用纸巾吸干卵块水分，对吸干后的卵块和去卵后的抱卵蟹精确称质量。每个样品取10 mg胚胎装入称量杯中，采用百万分之一电子天平 (赛多利斯CPA225D，0.001 mg，德国) 精确称质量并用计数器计数，据此计算单卵湿质量。每个蟹卵块随机测定3次，取平均值为该蟹单卵湿质量。随后将卵块装袋密封后置于−80 ℃冰箱保存。计算抱卵量 (Egg production, EP, 104 粒·只−1)、生殖力 (Fecundity, F, 粒·g −1) 和生殖指数 (Reproductive effort, RE, %)，计算公式为：
$$ \mathrm{EP}=W_{\mathrm{e}} / W_{\mathrm{i}} $$ (3) $$ F=\mathrm{EP} / W_{0} $$ (4) $$ \mathrm{RE}=W_{\mathrm{e}} / W_{\mathrm{t}} $$ (5) 式中：We和Wi分别表示卵块质量 (g) 和单卵湿质量 (g)；W0为抱卵蟹净体质量 (去卵后质量，g)；Wt为抱卵蟹体质量 (g)。
1.4 卵径、单卵湿质量和干质量测定
采用ToupView显微图像测量分析软件在显微镜下测定单个卵的卵径，每个抱卵蟹随机测定60粒卵，取平均值为该蟹的卵径。参考李清清等[10]方法进行单卵湿质量和干质量测定，其中，单卵湿质量与生殖性能中测定方法一致；单卵干质量具体操作为取称质量后的湿卵，用计数器精确计数后放入锡箔称量杯中，用百万分之一天平准确称量总质量，然后放置于65 ℃烘箱中烘至恒质量，再对烘干后的卵块和锡箔纸总质量准确称量以计算单卵干质量。每只抱卵蟹随机取样3次进行测定，最终取平均值为该抱卵蟹的单卵干质量。
1.5 胚胎的色泽和类胡萝卜素测定
每个抱卵蟹取少量鲜卵装入透明自封袋，用Lovibond-RT200色差仪测定鲜卵色泽。干卵色泽测定之前，将冻干后的蟹卵粉碎过60目筛，随机取样倒入小培养皿 (直径50 mm) 中，用色差仪测量表面层色度。每个抱卵蟹胚胎鲜样和冻干样均随机取6个点测量，平均值为该蟹卵的最终色泽参数，具体参数为亮度 (L*)、红度 (a*) 和黄度 (b*)，具体参考李清清等[10]的方法。
每个抱卵蟹取0.3~0.4 g冻干后的卵进行总类胡萝卜素的提取和测定，主要参考孙秋凤等[11]方法：采用80%丙酮对样品进行首次提取，用超声波在遮光环境下浸提15~20 min，离心取出上清液，剩余样品继续加入100%丙酮 (C3H6O)，反复提取3~4次，直至提取的上清液基本无色，将提取液用100%丙酮定容至15 mL后，使用分光光度计在474 nm波长下测定上清液的光密度 (OD)。采用100%丙酮稀释虾青素标准品至不同浓度梯度并测定对应梯度吸光值，制备标准曲线，计算各样品中总类胡萝卜素含量。样品经 0.22 μm过滤器过滤后进行高效液相色谱分析。采用安捷伦1260高效液相色谱系统 (配备YMC™类胡萝卜素C30柱，4.6×150 mm，包装直径=3 μm，YMC) 对提取液进行主要类胡萝卜素含量测定和分析。参数设置为流速1.0 mL·min−1，柱温30 ℃，进样量20 μL。样品中类胡萝卜素种类的鉴定依据虾青素、叶黄素、玉米黄素、角黄素和β-胡萝卜素5种商业标准品出峰时间，样品中类胡萝卜素含量根据5种标准品制备的标准曲线和样品出峰面积计算。
1.6 胚胎的常规生化和脂肪酸测定
称量0.2 g左右湿胚胎于105 ℃烘干至恒质量测定水分，按照AOAC[20]标准方法即凯氏定氮法测定冻干后胚胎中粗蛋白，总脂测定采用经典的氯仿/甲醇 (V/V=2/1) 抽提方法[21]。脂肪酸的测定参考Wu等[22]的方法，采用三氟化硼-甲醇法对提取的总脂进行甲酯化，用正己烷溶解装入2 mL的棕色进样瓶，使用安捷伦 (GC-7890B, MS-5977A) 气相色谱仪 (色谱柱为Omegawax-320毛细管柱，30 m×0.25 mm，美国Supelco公司) 进行脂肪酸测定和分析。脂肪酸质量分数的计算采用面积百分比法。
1.7 数据分析
数据以“平均值±标准误 (
$\overline { X}\pm { \rm {SE}} $ )”表示，统计分析采用SPSS 19.0软件，作图采用Excel 2019软件，通过Levene法对实验数据进行方差齐性检验，两组数据之间采用独立样本t检验进行显著性分析，P<0.05为差异显著。2. 结果
2.1 生殖性能
白壳和绿壳品系雌体亲本交配后第4天均出现抱卵蟹，交配后4~16 d，白壳雌体的抱卵率均显著高于绿壳雌体 (P<0.05，图2)，这说明白壳品系交配后抱卵速度较快，两品系雌体的最终抱卵率无显著性差异 (P>0.05)。抱卵蟹养殖期间，白壳品系雌体的成活率为93.33%，绿壳为86.67%，但差异不显著 (P>0.05，表2)。白壳品系雌体的抱卵量、生殖力和生殖指数与绿壳品系较为接近，两者无显著性差异 (P>0.05)。白壳和绿壳胚胎卵径几乎一致，分别为369.99和370.04 μm，无显著性差异 (P>0.05，表3)。白壳组单卵湿质量为45.41 μg，绿壳组为42.92 μg，白壳组略高于绿壳组，但差异不显著 (P>0.05)。白壳组单卵干质量为12.06 μg，绿壳组为11.42 μg，白壳组也略高于绿壳组，但差异不显著 (P>0.05)。
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图 2 白壳和绿壳中华绒螯蟹雌蟹抱卵率及水温变化Figure 2. Ovigerous rate and water temperature of white and green carapace strains of E. sinensis broodstock表 2 中华绒螯蟹白壳和绿壳品系雌蟹亲本成活率、抱卵率和生殖性能比较Table 2. Survival rate, ovigerous and reproductive performance of white and green carapace strains of E. sinensis broodstock类目
Item样本数
Sample number白壳
White carapace绿壳
Green carapace成活率 survival rate/% 30 93.33±6.67 86.67±8.82 抱卵率 Ovigerous rate/% 30 92.50±3.82 83.74±6.18 抱卵量 Egg production/(104 粒·只−1) 6 43.33±8.38 44.88±3.73 生殖力 Fecundity/(粒·g−1) 6 3 083.68±429.67 3 361.96±150.18 生殖指数 Reproductive effort/% 6 11.71±1.12 12.57±0.40 表 3 中华绒螯蟹白壳和绿壳品系卵径和单卵质量比较 (N=6)Table 3. Comparison of egg diameter and egg mass of white and green carapace strains of E. sinensis broodstock类目
Item白壳
White carapace绿壳
Green carapace卵径 Egg diameter/μm 369.99±3.82 370.04±2.76 单卵湿质量 Egg wet mass/μg 45.41±1.65 42.92±1.10 单卵干质量 Egg dry mass/μg 12.06±0.67 11.42±0.35 2.2 胚胎色泽和类胡萝卜素质量分数
白壳组胚胎鲜样a*显著高于绿壳组 (P<0.05)，L*和b*也高于绿壳组，但差异不显著(P>0.05，表4)；而干样色泽参数中，白壳组L*略高于绿壳组，a*和b*略低于绿壳组，但差异均不显著 (P>0.05)，与外观肉眼观察结果类似 (图3)。两组壳色胚胎胡萝卜素组成中，白壳组虾青素和叶黄素质量分数显著低于绿壳组 (P<0.05)，但两组间总类胡萝卜素、玉米黄素、角黄素以及β-胡萝卜素质量分数无显著性差异 (P>0.05)。
表 4 中华绒螯蟹白壳和绿壳品系雌体胚胎色泽参数和总类胡萝卜素质量分数比较 (湿质量，N=6)Table 4. Color parameters and carotenoids content of eggs produced by white and green carapace strains of E. sinensis broodstock (wet mass, N=6) mg·g−1类目
Item白壳
White carapace绿壳
Green carapace湿样 Fresh 亮度 L* 33.17±0.91 30.69±0.83 红度 a* 5.14±0.36a 3.67±0.42b 黄度 b* 5.72±0.77 4.07±0.47 干样 Dried 亮度 L* 53.79±1.19 52.19±0.88 红度 a* 14.96±0.84 16.80±1.20 黄度 b* 18.63±1.04 19.81±1.61 总类胡萝卜素 Total carotenoids 291.41±40.45 400.47±60.36 虾青素 Astaxanthin 11.78±1.45a 19.29±2.19b 叶黄素 Lutein 16.53±2.21a 30.05±4.77b 玉米黄素 Zeaxanthin 3.43±0.60 3.61±0.98 角黄素 Canthaxanthin 3.02±0.15 2.71±0.22 β-胡萝卜素 β-carotene 22.56±4.10 44.55±9.77 注：同行标有不同小写字母表示组间差异显著 (P<0.05)，表5同此。 Note: Values with different small letters within the same row have significant difference (P<0.05). The same case in the Table 5. ![]()
图 3 白壳和绿壳中华绒螯蟹原肠胚期蟹卵冻干后比较Figure 3. Comparison of dried egg in gastrula stage produced by white and green carapace strains of E. sinensis broodstock2.3 胚胎中常规生化和脂肪酸组成
就常规生化而言，白壳和绿壳组胚胎中水分质量分数无显著性差异 (P>0.05，表5)；白壳组胚胎的粗脂肪质量分数 (5.58%) 和绿壳组 (5.66%) 接近，无显著性差异 (P>0.05)；白壳组粗蛋白质量分数 (6.24%) 略高于绿壳组 (5.96%)，但无显著性差异 (P>0.05)。就脂肪酸而言，白壳和绿壳组胚胎中的总饱和脂肪酸 (ΣSFA) 和总单不饱和脂肪酸 (ΣMUFA) 以及总多不饱和脂肪酸 (ΣPUFA) 质量分数无显著差异 (P>0.05，表5)，但是白壳组顺-9-十八碳一烯酸 (C18:1 n-9) 质量分数显著高于绿壳组 (P<0.05)。虽然白壳组中ARA略高于绿壳组，EPA 和二十二碳六烯酸 (C22:6 n-3, DHA) 略低于绿壳组，但差异均不显著 (P>0.05)。白壳组和绿壳组n-3长链多不饱和脂肪酸/n-6长链多不饱和脂肪酸 (n-3/n-6) 比例分别为1.18和1.49，无显著性差异 (P>0.05)。
表 5 中华绒螯蟹白壳和绿壳品系雌体卵常规生化和脂肪酸组成比较 (湿质量)Table 5. Proximate composition and fatty acid composition of eggs produced by white and green E. sinensis broodstock (wet mass) %类目
Item白壳
White carapace绿壳
Green carapace类目
Item白壳
White carapace绿壳
Green carapace水分 Moisture 74.88±0.46 76.45±0.52 总单饱和脂肪酸 ΣMUFA 30.33±1.40 29.67±0.79 脂肪 Lipid 5.58±0.15 5.66±0.18 亚油酸 C18:2 n-6 14.21±1.56 12.18±2.00 蛋白 Protein 6.24±0.08 5.96±0.15 α-亚麻酸 C18:3 n-3 4.21±0.54 4.38±0.30 肉豆蔻酸 C14:0 0.69±0.05 0.96±0.16 二十碳二烯酸 C20:2 n-6 2.26±0.20 1.81±0.18 十五碳酸 C15:0 0.43±0.04 0.5±0.02 花生四烯酸 C20:4 n-6 3.85±0.46 3.45±0.29 棕榈酸 C16:0 10.12±0.22 10.01±0.11 二十碳三烯酸 C20:3 n-3 0.28±0.02 0.41±0.05 珠光脂酸 C17:0 0.73±0.05 0.91±0.07 二十碳五烯酸 C20:5 n-3 (EPA) 7.05±0.44 7.74±0.64 硬脂酸 C18:0 8.03±0.72 8.24±0.43 二十二碳五烯酸 C22:5 n-3 0.82±0.04 0.75±0.04 花生酸 C20:0 0.49±0.02 0.44±0.12 二十二碳六烯酸 C22:6 n-3 (DHA) 8.50±1.51 9.33±1.52 总饱和脂肪酸 ΣSFA 20.48±0.69 21.05±0.23 总多不饱和脂肪酸 ΣPUFA 41.18±0.90 40.05±0.67 肉豆蔻烯酸 C14:1 n-5 0.08±0.01 0.09±0.01 总长链多不饱和脂肪酸 ΣLC-PUFA 22.76±1.39 23.50±1.84 棕榈油酸 C16:1 n-7 6.24±0.84 6.39±0.59 总n-3长链多不饱和脂肪酸 Σn-3 PUFA 21.14±1.34 23.02±1.88 十七碳一烯酸 C17:1 n-7 0.93±0.07 1.09±0.02 总n-6长链多不饱和脂肪酸 Σn-6 PUFA 20.32±2.09 17.44±2.37 顺-9-十八碳一烯酸 C18:1 n-9 18.57±0.51a 16.28±0.55b n-3长链多不饱和脂肪酸/n-6长链
多不饱和脂肪酸 n-3/n-61.18±0.28 1.49±0.31 顺-7-十八碳一烯酸 C18:1 n-7 2.26±0.50 2.07±0.54 n-3长链多不饱和脂肪酸/n-6长链
多不饱和脂肪酸 n-3/n-61.18±0.28 1.49±0.31 二十碳一烯酸 C20:1 n-9 1.70±0.13 2.12±0.26 二十二碳六烯酸/二十碳五烯酸
DHA/EPA1.20±0.17 1.18±0.11 芥酸 C22:1 n-9 0.54±0.13 1.05±0.20 3. 讨论
3.1 两种壳色品系河蟹的生殖性能和胚胎质量
甲壳动物亲本的生殖性能主要受到亲本营养状况、交配环境、遗传选育和抱卵频次等影响[23-26]。本研究中，亲本均来自于室外同一养殖池塘，亲本营养状况接近，暂养和交配环境也相似，且均为第一次抱卵。所以排除了亲本营养状况、配对环境和抱卵次数因素，一定程度可以反映不同壳色与生殖性能之间的关系。本研究中白壳组亲本成活率和抱卵率明显高于绿壳组，但差异不显著，在其他条件基本一致的前提下，这种差异很可能是遗传因素导致的[27-28]。Li等[19]研究发现，紫壳与绿壳抱卵蟹的成活率和抱卵率也存在一定差异，但不显著，结合本研究结果可说明壳色对抱卵蟹的成活率和抱卵率存在一定影响。抱卵量是评估甲壳动物生殖性能的重要指标之一，中华绒螯蟹的抱卵量随着规格的增大而增加[18]。本研究中，白壳组亲本平均体质量略高于绿壳组，白壳品系的平均抱卵量反而略低于绿壳组，这可能是由于白壳品系雌体的抱卵量差异较大造成的。本研究中白壳品系亲本的生殖力和生殖指数略低于绿壳组，可能是因为白壳品系雌体平均体质量略大于绿壳品系。有研究表明，中华绒螯蟹的生殖力和生殖指数均随着雌体体质量的增加而下降[18]。本研究中不同壳色品系的胚胎卵径、单卵湿质量和干质量均无显著差异，这说明壳色品系对其胚胎参数影响较小；也有研究表明，中华绒螯蟹胚胎的卵径和单卵质量相对稳定，受亲本营养状况、色泽和亲本规格的影响较小[15,18-19]。值得一提的是，本研究发现白壳蟹抱卵速度明显优于绿壳蟹，笔者推测可能是绿壳蟹在黑色养殖桶中更容易伪装，而白壳外观呈鲜亮的白色与黑色养殖桶存在强烈的颜色反差，使得白壳蟹在水中更容易被异性发现且相遇，从而交配机会更大且频次更多，所以抱卵速度会更快。甲壳动物的体表颜色对交配机会的影响在椰子蟹 (Birgus latro)[29]、招潮蟹 (Austruca mjoebergi)[30]、相手蟹 (Parasesarma peninsulare)[31]和蓝蟹 (Callinectes sapidus)[32]中均有相关报道，不同物种影响程度也存在一定差异。
3.2 两种壳色品系河蟹的胚胎色泽和类胡萝卜素含量
类胡萝卜素有利于甲壳动物胚胎发育、幼虫早期色素沉积和眼柄发育[33-34]。有研究表明，中华绒螯蟹卵巢、肝胰腺和蟹壳中，a*与虾青素含量高度相关[35]。本研究中，白壳组胚胎干样中a*和b*明显低于绿壳组，这主要是因为其胚胎中总类胡萝卜素、虾青素、叶黄素以及玉米黄素含量也低于绿壳组，尤其虾青素和叶黄素含量显著低于绿壳组。推测白壳和绿壳组胚胎中虾青素和叶黄素含量存在显著差异可能有2个原因。1) 甲壳动物由于缺乏从头合成类胡萝卜素的能力，所以其体内的类胡萝卜素主要从食物中获取[34,36]。本研究中白壳和绿壳亲本来自同一室外养殖池塘，白壳和绿壳亲本可能对饵料中类胡萝卜素的吸收和保留效率不同，从而导致胚胎中类胡萝卜素含量存在差异。2) 尽管甲壳动物自身缺乏从头合成类胡萝卜素的能力，但具有一定的将体内β-胡萝卜素转化为虾青素的能力，不同物种和品系的这种转化能力可能存在一定差异[37-38]。本课题组的研究表明，白壳品系的体色具有可遗传性，且其蟹壳中的虾青素含量显著低于绿壳品系 (另文发表)；本研究结果表明白壳品系胚胎中的虾青素含量也低于绿壳品系，这暗示白壳品系将β-胡萝卜素转化为虾青素的能力可能弱于绿壳品系。
3.3 两种壳色品系河蟹的胚胎常规生化和脂肪酸组成
脂类和蛋白质是甲壳动物胚胎发育过程中重要的能源物质[39-40]。因此，对胚胎生化组成的研究有利于了解个体或组织对能源物质的储存和利用情况[40-41]。研究表明，甲壳动物胚胎中的营养物质主要来自亲本成熟卵母细胞，因此亲本的营养状况直接影响着胚胎中的生化组成[41]。本研究中，白壳和绿壳品系胚胎中水分、脂肪和蛋白含量无显著性差异，说明他们胚胎中积累的常规营养成分含量接近。Li等[19]研究表明，中华绒螯蟹紫壳和绿壳品系胚胎中水分质量分数约为61.11%~63.33%，脂肪质量分数约为10.95%~11.08%，蛋白质量分数约为18.20%~18.56%；本研究中白壳和绿壳品系胚胎中的水分质量分数高于前者，但是脂肪和蛋白质量分数低于前者，这主要因为本研究中的胚胎样品处于原肠胚期，而Li等[19]研究中的胚胎样品处于囊胚期。甲壳动物胚胎发育过程中，胚胎中水分含量一般呈逐渐上升趋势，而脂肪和蛋白呈下降趋势[40,42-44]。
脂肪酸在甲壳动物胚胎发育中扮演着重要角色，饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸是重要的能量型脂肪酸，高度不饱和脂肪酸 (HUFA) 主要影响甲壳动物繁殖性能、胚胎发育和幼体质量[14,45-47]。本研究中，白壳组中C18:1 n-9百分含量显著高于绿壳组 (P<0.05)，说明白壳组亲本中可能积累更多的C18:1 n-9，造成这一差异的具体原因有待进一步研究，可能与其胚胎中的类胡萝卜素含量不同有关。有研究发现亲本饵料和卵中的HUFA质量分数与卵的孵化率、胚胎发育速度和初孵幼体质量相关，在适宜质量分数条件下，胚胎中的HUFA含量越高，胚胎质量越好[45-46]。也有研究发现，亲本饲料中HUFA质量分数在一定范围内 (0.14%、0.65%、1.15%、1.64%和2.07%) 对亲本繁殖性能影响不显著[48]。本研究中，白壳和绿壳胚胎中HUFA组成和质量分数无显著差异，这提示白壳和绿壳组胚胎孵化率和初孵幼体质量可能接近。
综上所述，中华绒螯蟹白壳品系和常规绿壳品系具有比较相似的生殖性能和胚胎质量，但白壳品系交配后的抱卵速度显著高于常规绿壳品系。白壳品系胚胎中的虾青素和叶黄素含量显著低于绿壳品系，但其C18:1 n-9含量显著高于绿壳品系。这些研究结果可为白壳品系中华绒螯蟹的遗传选育、生殖性能评价和推广应用提供基础资料。
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图 1 sip和pgk扩增电泳结果
M. DNA标记；后图同此
Figure 1. Amplification of sip and pgk genes
M. DNA maker; the same case in the following figures
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图 3 pNZ8148 NcoI和HindIII双酶切电泳结果
Figure 3. NcoI and HindIII digestion of plasmid pNZ8148
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图 4 重组质粒pNZ8148-sip、pNZ8148、pNZ8148-pgk、pNZ8148-sip-pgk PCR扩增鉴定
1. 重组质粒pNZ8148-sip；2. pNZ8148-sip的阳性对照；3, 4. 空白对照；5. 重组质粒pNZ8148；6. pNZ8148的阳性对照；7. 重组质粒pNZ8148-pgk；8. pNZ8148-pgk阳性对照；9. 重组质粒pNZ8148-sip-pgk；10. pNZ8148-sip-pgk阳性对照
Figure 4. PCR identification of recombinant plasmid pNZ8148-sip, pNZ8148, pNZ8148-pgk and pNZ8148-sip-pgk
1. recombinant plasmid pNZ8124-sip; 2. positive control of pNZ8148-sip; 3 and 4. blank control; 5. recombinant plasmid pNZ8124; 6. positive control of pNZ8148-sip; 7. recombinant plasmid pNZ8124-pgk; 8. positive control of pNZ8148-pgk; 9. recombinant plasmid pNZ8124-sip-pgk; 10. positive control of pNZ8148-sip-pgk
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图 5 重组质粒pNZ8148-sip-pgk、pNZ8148-sip、pNZ8148、pNZ8148-pgk的HindIII酶切鉴定
1. HindIII酶单切过的载体 pNZ8148-sip-pgk；2. pNZ8148-sip-pgk质粒；3. HindIII酶单切过的载体pNZ8148-sip；4. pNZ8148-sip质粒；5. HindIII酶单切过的载体pNZ8148；6. pNZ8148质粒；7. pNZ8148-pgk质粒；8. HindIII酶单切过的载体pNZ8148-pgk
Figure 5. pNZ8148-sip-pgk, pNZ8148-sip, pNZ8148 and pNZ8148-pgk digested by HindIII
1. plasmid of pNZ8148-sip-pgk digested by HindIII; 2. plasmid of pNZ8148-sip-pgk; 3. plasmid of pNZ8148-sip digested by HindIII; 4. plasmid of pNZ8148-sip-pgk; 5. plasmid of pNZ8148 digested by HindIII; 6. plasmid of pNZ8148; 7. plasmid of pNZ8148-pgk digested by HindIII; 8. plasmid of pNZ8148-pgk
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图 6 诱导表达蛋白Sip、Pgk、Sip-Pgk的Western blot检测分析
M. protein标记；1. 未诱导的L. lactis NZ9000 pNZ8148-sip蛋白；2，3. 诱导的L. lactis NZ9000 pNZ8148-sip 蛋白上清和沉淀；4. 未诱导的L. lactis NZ9000 pNZ8148-pgk；5，6. 诱导的L. lactis NZ9000 pNZ8148-pgk蛋白上清和沉淀；7. 未诱导的L. lactis NZ9000 pNZ8148-sip-pgk；8，9. 诱导的 L. lactis NZ9000 pNZ8148-sip-pgk蛋白上清和沉淀；10. 诱导的L. lactis NZ9000 pNZ8148；11. L. lactis NZ9000
Figure 6. Western blot detection and analysis of expression products of recombinant Sip, Pgk and Sip-Pgk
M. protein marker; 1. protein of uninduced L. lactis NZ9000 pNZ8148-sip; 2 and 3. supernatant protein and precipitated protein of induced L. lactis NZ9000 pNZ8148-sip; 4. protein of uninduced L. lactis NZ9000 pNZ8148-pgk; 5 and 6. supernatant protein and precipitated protein of induced L. lactis NZ9000 pNZ8148-pgk; 7. protein of uninduced L. lactis NZ9000 pNZ8148-sip-pgk; 8 and 9. supernatant protein and precipitated protein of induced L. lactis NZ9000 pNZ8148-sip-pgk; 10. protein of induced L. lactis NZ9000 pNZ8148; 11. protein of uninduced L. lactis NZ9000 pNZ8148
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图 7 重组乳酸乳球菌口服疫苗免疫的相对免疫保护率
数值为平均值±标准差；各组上方不同字母表示相同免疫时间组间差异显著(P<0.05)
Figure 7. Relative percent survivals of recombinant L. lactis NZ9000 pNZ8148-sip, pNZ8148, pNZ8148-pgk and pNZ8148-sip-pgk
The data are shown as $ \overline X \pm {\rm{SD}}$; different letters above columns represent significant difference among those groups at the same immune time (P<0.05).
表 1 引物信息
Table 1 Primers used in this study
引物名称
primer name引物序列
primer sequence序列名称
sequence name扩增大小/bp
lengthsip-F GAGGCACTCACCATGAAAATGAATAAAAAGGTACTATTGACATCGACAAT sip 1 349 sip-R GGTTCAAAGAAAGCTTAATGGTGATGGTGATGATGTTTGTTAAATGATACGTG pgk-F GAGGCACTCACCATGGCTAAATTGACTGTTAAAGACGTTGATTTGAAA pgk 1 242 pgk-R GGTTCAAAGAAAGCTTAATGGTGATGGTGATGATGTTTTTCAGTCAATGCT sip-F2 GAGGCACTCACCATGAAAATGAATAAAAAGGTACTATTG sip-2 1 314 sip-R2 TTTGTTAAATGATACTACGTGAACGTGGTCATAGTGGTTGGC pgk-F2 GTATCATTTAACAAAGCTAAATTGACTGTTAAAGACGTTGATTTGAAAGG pgk-2 1 245 pgk-R2 GGTTCAAAGAAAGCTTAATGGTGATGGTGATGATGTTATTTTTCAGTCAATGCT pNZ8148-F TGTCGATAACGCGAGCATAATAAAC pNZ8148-R CAGTAATTGCTTTATCAACTGCTGC 注：斜体部分为载体同源的15 bp 碱基序列；横线为6×His 标签的碱基序列 Note: The italic part is the 15 bp base sequence of homologous carrier, and the horizontal lines indicate the base sequence of 6×His tag. 
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表 2 罗非鱼血清ELISA抗体检测结果
Table 2 Detection of ELISA antibody level of immunized tilapia
组别
group光密度 OD450 2次免疫 3次免疫 L. lactis NZ9000 pNZ8148-pgk 0.102 2±0.001 9** 0.113 6±0.000 7** L. lactis NZ9000 pNZ8148-sip 0.151 8±0.001 9** 0.161 4±0.001 1** L. lactis NZ9000 pNZ8148-sip-pgk 0.200 9±0.000 8** 0.240 7±0.000 6** L. lactis NZ9000 pNZ8148 0.086 7±0.000 6 0.088 5±0.002 8 L. lactis NZ9000 0.085 1±0.000 7 0.085 5±0.002 4 PBS 0.082 5±0.001 6 0.082 7±0.000 4 注：**. 相同免疫时间各组与PBS对照组之间存在极显著性差异(P<0.01) Note: **. Very significant difference exists between those groups and PBS control group at the same immune time (P<0.01).
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