近年来，海水中以氮 (N)、磷 (P)为代表的污染物浓度呈波动增加的趋势，近岸海域富营养化问题日益突出^[1-3]。N、P等污染物的来源，除陆源地表径流携带输入外，局部海域密集的海水养殖也成为富营养化的重要因素^[4-8]。按照《水产养殖业污染源产排污系数手册》估算，2012年我国沿海水产养殖总氮 (Total nitrogen, TN) 和总磷 (Total phosphorus, TP) 排放量已分别达17 414 t和3 146 t，而同年监测的全国425个直排海污染源 (日排放量>100 m³) 氨氮和TP排放量分别为17 100 t和2 921 t，海水养殖总产量与沿海省份污染负荷总量存在显著的线性相关^[9-10]。海水养殖污染物排放相关的研究表明，高位池海水养殖投喂饲料中仅约20%的N和30%的P转化为蛋白质，大量未经利用的残饵以及养殖排泄物最终进入海洋环境，进一步加剧了富营养化程度并由此引发了藻华等灾害事件^[11-12]。以广东省海洋环境状况为例，海水养殖业分布与劣四类海水的主要分布区高度重叠^[13]。

微藻作为海洋生态系统初级生产力的重要组成部分，对维持生态系统稳定和健康具有不可替代的作用。三角褐指藻 (Phaeodactylum tricornutum)、等鞭金藻 (Isochrysis sp.)、亚心形扁藻 (Platymonas subcordiformis) 等适应能力强，生长迅速的微藻被广泛作为海水养殖的天然饵料。然而，沿海频繁暴发的藻华等灾害也对海上生产、生活带来了极显著的影响。广东省近岸海域藻华记录种达60种以上，其中有毒有害种类主要有亚历山大藻 (Alexandrium sp.)、膝沟藻 (Gonyaulax sp.)、裸甲藻 (Gymnodinium sp.)、夜光藻 (Noctiluca scintillans)、中肋骨条藻 (Skeletonema costatum)、棕囊藻 (Phaeocystis sp.)以及旋沟藻 (Cochlodinium schütt)等。富营养化与藻华暴发之间存在显著的因果关系，但一定浓度的N、P又是微藻生长所必需的营养物质^[14-15]，如何科学利用环境良好型微藻破解富营养化问题和赤潮灾害成为生物操纵领域的研究热点之一。目前，生态化海水养殖模式中对养殖排放N、P等污染物的综合利用途径之一就是培育优良的饵料微藻。一方面通过微藻、细菌等的共同作用，分解转化养殖代谢产物，并将N、P和二氧化碳 (CO₂) 再次同化利用，降低养殖塘中氨氮和磷酸盐的浓度，同时释放出氧气；另一方面通过种间竞争作用，抑制其他有害藻类繁殖，且为自身提供优良饵料，进而改善和维持良好的养殖生态系统^[16-20]。

为筛选适宜海水养殖尾水处理的优良饵料微藻，对比其生长特性和氮、磷营养物质利用效率，选取5种赤潮藻和2种可作为饵料的微藻为研究对象，开展不同生源要素[碳(C)、N、P]浓度对海洋微藻增长实验，氮源形态 (硝酸盐、铵盐和尿素) 对微藻细胞增长的影响实验以及微藻，对氮、磷营养盐的吸收利用特性研究，对比分析经济微藻和赤潮藻的营养盐利用特性，以期筛选出适宜的饵料微藻，开展海水养殖尾水的藻类生物去除，实现养殖尾水的循环利用。

1.   材料与方法

1.1   实验藻种和培养条件

藻华种类微藻包括甲藻类双胞旋沟藻 (Cochlodinium geminatum)、米氏凯伦藻 (Karenia mikimotoi)；硅藻类中肋骨条藻 (Skeletonema costatum)、牟氏角毛藻 (Chaetoceros muelleri)；金藻类球形棕囊藻 (Phaeocystis globosa)。饵料微藻为绿藻类亚心形扁藻 (Platymonas subcordiformis)；金藻类眼点拟微绿球藻 (Nannochloropsis oculata)。上述藻种均取自暨南大学水生生物研究中心 (生态学系)，培养基采用人工海水 [ 不添加碳酸氢钠 (NaHCO₃)]，添加相应的组分配置成f/2培养液^[21-22]。其中碳源 (NaHCO₃)、磷源[ 磷酸二氢钠 (NaH₂PO₄·H₂O)]和氮源 {[ 碳酸铵 (NH)₂CO、氯化铵 (NH₄Cl)、硝酸铵 (NaNO₃)]}浓度分别为2.02、3.63 × 10⁻²和8.83 × 10⁻² mmol·L⁻¹。

微藻采用人工气候培养箱 (GXZ-160D，宁波江南仪器厂) 培养，光照强度为约为4 000 lx，光暗比为12 h∶12 h，温度为24 ℃。微藻培养所用器皿和培养基等均经高压蒸汽灭菌 (120 ℃，20 min)，冷却后使用，实验操作均在超净工作台 (SW-CJ-lF型，苏州) 内进行。

1.2   实验方法

1.2.1   碳氮磷生源要素对微藻种群增长的影响

预处理：将指数生长期的实验微藻，分别接种到C、N、P单一要素缺失的f/2培养基中饥饿培养4 d，浓缩收集预培养的微藻进行接种。

生源要素浓度梯度设置采用稀释法，浓度为正常培养基的1/500、1/50、1/5，对照组不添加相应碳/氮/磷。双胞旋沟藻起始密度为3 000个·mL⁻¹，其余6种藻细胞起始密度约5 × 10⁴ 个·mL⁻¹。实验采用50 mL玻璃管，接种培养液20 mL，每组设置3个平行，隔天测定细胞密度，并计算第12天的比生长速率，实验的光照、温度等培养条件同1.1。

1.2.2   微藻对硝酸盐和磷酸盐的吸收

时间序列实验中，藻细胞起始密度均设为3 000 个·mL⁻¹，用100 mL锥形瓶，接种f/2培养液60 mL，分别在第1、第3、第5、第7、第9 天取样测定藻细胞密度和培养液中的硝酸盐、磷酸盐含量。

浓度序列实验中，硝酸盐/磷酸盐浓度设定为正常f/2培养基的1/10、1/20、1/40、1/80、1/160、1/320，双胞旋沟藻细胞起始密度为2 000 个·mL⁻¹，其余微藻细胞密度约为8 × 10³ 个·mL⁻¹，用50 mL玻璃管，接种培养液20 mL，培养时间5 h，实验的光照、温度等培养条件同1.1。

1.3   生长指标测定

1.3.1   藻细胞密度测定

利用酶标仪 (Infinite 200 Pro, Tecan, 瑞典) 测量藻的光密度 (OD₆₈₀)。通过前期实验建立藻细胞密度 (N, 个·mL⁻¹) 和光密度的回归方程计算藻细胞密度。

1.3.2   比生长速率 (μ, d⁻¹) 计算

公式为μ= (lnN_t−lnN₀)/(T_t−T₀)，式中N_t为在时间T_t时刻的细胞数，N₀为接种时的细胞数。

1.3.3   硝酸盐和磷酸盐浓度的测定

藻类样品采集后经0.45 μm滤膜过滤，采用AA3-连续流动元素分析仪 (AutoAnalyzer3，BRAN+LUEBBE，德国) 测定N、P元素含量。

1.4   统计与分析

实验数据采用Origin 8.0整理并制图，采用SPSS 13.0软件包进行统计分析，单因素方差分析 (One-Way ANOVA) 用来检查处理之间的差异性，P<0.05和 P<0.01分别认为差异显著和极其显著。

2.   结果

2.1   微藻在不同C、N、P浓度下的生长

7种微藻在不同C、P浓度下培养11 d后，藻细胞比生长速率变化情况见图1。碳源浓度增加对双胞旋沟藻、米氏凯伦藻、中肋骨条藻、亚心形扁藻和眼点拟微绿球藻的生长速率表现出促进作用，与不添加C、P的对照组相比，最大比生长速率分别提高了35%、7%、19%、9%和19%，双胞旋沟藻比生长速率的增加比例高于其他种类微藻。磷源浓度增加对7种微藻比生长速率的最大促进作用范围介于25.01%~446.60%，且与对照组相比，其对7种微藻的生长速度均表现出显著的促进作用，最大促进作用在7种微藻间的大小顺序是双胞旋沟藻<中肋骨条藻<眼点拟微绿球藻<球形棕囊藻<米氏凯伦藻<亚心形扁藻<牟氏角毛藻。从7种微藻在磷处理对照组的比生长速率情况看，磷饥饿处理对角毛藻生长的抑制效应显著高于其他微藻，另外，米氏凯伦藻比生长速率在0.064 μmol·L⁻¹磷处理组即表现出了显著的促进作用。

图  1  不同碳、磷起始浓度培养11 d 后7种微藻的生长速率

*. 表示处理组与对照组有显著差异 (P<0.05) ，后图同此

Figure  1.  Specific growth rate of algae under different concentrations of bio-carbonate and phosphate after 11 days of culture

*. Significant difference between treatments and control (P<0.05); the same case in the following figures

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3种形态的氮源培养，7种微藻比生长速率均随氮浓度增加而升高 (图2)。与不添加氮源的对照组相比，7种微藻最大比生长速率在硝酸盐处理组增加了16.54%~77.52%；在铵盐处理组增加了15.79%~88.82%；在尿素处理组增加了25.16%~71.43%。3种氮源含量增加，米氏凯伦藻最大比生长速率增加量最高，其次为牟氏角毛藻，球形棕囊藻细胞净增加量最低。从7种微藻空白对照组比生长速率情况来看，双胞旋沟藻、米氏凯伦藻、牟氏角毛藻对照组仍受到氮饥饿处理影响，抑制效应显著，但随着氮浓度增加，细胞生长速率迅速增加；球形棕囊藻对照组仍保持较高的比生长速率，也反映出在前期的氮饥饿处理后细胞内仍残留部分的氮源，也表明球形棕囊藻具有转化储存多余氮源的细胞调节机制。中肋骨条藻、亚心形扁藻和眼点拟微绿球藻对照组也表现出了较高水平的比生长速率，且随着浓度增加，比生长速率均表现出显著增加趋势，显示出较强的氮源竞争能力。

图  2  氮源形态和浓度对微藻比生长速率的影响

Figure  2.  Specific growth rate of algae under different concentrations of nitrate, ammonium and urea

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双胞旋沟藻最大比生长速率在硝酸盐和尿素处理组无显著差异，但显著高于铵盐处理组(P<0.05)。米氏凯伦藻、亚心形扁藻和眼点拟微绿球藻的最大比生长速率为铵盐>硝酸盐>尿素，前者在铵盐和硝酸盐处理组的最大比生长速率无显著差异 (P>0.05)，后者在硝酸盐和尿素处理组无显著差异 (P>0.05)。牟氏角毛藻最大比生长速率为硝酸盐>铵盐>尿素；球形棕囊藻和中肋骨条藻最大比生长速率在3种氮源下无显著差异 (P>0.05)。

2.2   微藻对培养液中N、P的吸收利用

相同细胞起始密度下培养9 d后，7种微藻的种群增长曲线和比生长速率见图3。比生长速率大小顺序为眼点拟微绿球藻>球形棕囊藻>牟氏角毛藻>中肋骨条藻>亚心形扁藻>米氏凯伦藻>双胞旋沟藻。7种微藻细胞增长的规律，从细胞大小看，细胞体积小的种类显著高于细胞体积大的。这一趋势在同一门类的微藻中也能观察到，细胞体积越小，比生长速率越高。

图  3  相同细胞起始密度培养9 d后微藻种群增长曲线和比生长速率

不同字母表示处理组间有显著差异 (P<0.05)，后图同此

Figure  3.  Population growth curve and specific growth rate of same algae cell after 9 days of culture

Values with different letters indicate significant difference at P=0.05 level. The same cases in the following figures

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相同细胞起始密度下，微藻培养液中的N、P含量随培养时间延长呈显著降低的趋势(图4、图5)。根据第9天的细胞密度增量以及培养液中N、P含量计算出7种微藻对单位氮原子的利用效率为：眼点拟微绿球藻>球形棕囊藻>牟氏角毛藻>中肋骨条藻>米氏凯伦藻>亚心形扁藻>双胞旋沟藻；7种微藻对单位磷原子的利用效率为：眼点拟微绿球藻>球形棕囊藻>牟氏角毛藻>中肋骨条藻>亚心形扁藻>米氏凯伦藻>双胞旋沟藻。7种微藻在单位N、P原子下的种群增长与细胞体积呈一定的负相关关系。

图  4  相同细胞起始密度下培养液中氮含量变化和单位藻细胞的氮元素利用效率

Figure  4.  Variation of nitrogen concentrations in culture medium and nitrogen utilization efficiency at same algae cell density after 9 days of culture

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图  5  相同细胞起始密度下培养液中磷含量变化和单位藻细胞的磷元素利用效率

Figure  5.  Variation of phosphorus concentrations in culture medium and phosphorus utilization efficiency at same algae cell density

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培养液中N、P原子质量比变化情况见表1。7种微藻培养液中氮磷比范围介于1.10~19.56，硅藻、绿藻和金藻种类培养液中氮磷比变化情况显著高于甲藻，中肋骨条藻在第9天时培养液中氮磷比最大；7种微藻培养液中氮磷比均呈由小到大的增加趋势，这一现象主要与微藻对P的吸收速率相对较高有关。

表  1  微藻培养液中氮磷比变化

Table  1.  Variations of N/P ratio in culture medium

培养时间/d Culture time	双胞旋沟藻 C. geminatum	米氏凯伦藻 K. mikimotoi	球形棕囊藻 P. globosa	中肋骨条藻 S. costatum	牟氏角毛藻 C. mulleri	亚心形扁藻 P. subcordiformis	眼点拟微绿球藻 N. oculata
0	1.10	1.10	1.10	1.10	1.10	1.10	1.10
1	2.84	4.04	4.12	10.98	6.09	9.88	5.95
3	3.01	4.83	4.97	11.72	7.07	11.60	6.86
5	3.19	5.59	5.52	11.45	7.11	11.81	7.58
7	3.52	6.51	6.92	12.81	8.69	11.68	7.20
9	2.98	6.95	10.20	19.56	9.35	13.73	12.47

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微藻对不同起始浓度N、P的吸收速率见图6、图7。7种微藻对不同起始浓度的N、P吸收速率存在一定的差异。双胞旋沟藻对N、P的吸收表现出饱和现象，最大吸收率分别为5%和4%，主要受起始细胞密度较低的限制。其余6种微藻对不同浓度N的吸收率均高于90%；米氏凯伦藻对磷的吸收率为60%，其余5种微藻对P的吸收率均达到90%。从单位细胞密度的氮磷吸收效率上看，7种微藻的N吸收效率顺序为亚心形扁藻>米氏凯伦藻>双胞旋沟藻>球形棕囊藻>中肋骨条藻>牟氏角毛藻>眼点拟微绿球藻；7种微藻P吸收效率顺序为亚心形扁藻>双胞旋沟藻>米氏凯伦藻>球形棕囊藻>中肋骨条藻>牟氏角毛藻>眼点拟微绿球藻。7种海洋微藻单位细胞密度的氮磷吸收效率在细胞体积较大的种类中高于细胞体积小的种类；而从微藻所属门类上看，绿藻门>甲藻门>金藻门>硅藻门。

图  6  不同氮起始浓度下培养5 h藻细胞氮吸收量和单位细胞吸收速率

Figure  6.  Nitrogen absorption of seven algae under different initial concentrations of nitrate after culture of 5 h

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图  7  不同磷起始浓度下培养5 h的藻细胞磷吸收量和单位细胞吸收效率

Figure  7.  Phosphorus absorption of seven algae under different initial concentrations of phosphate after culture of 5 h

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3.   讨论

一定浓度范围内，生源要素 (C、N、P) 含量的增加能够显著促进海洋微藻的生长，而浓度过高或过低时又成为某些海洋微藻种群增长的限制因子。与温室效应、富营养化相伴而生的海洋赤潮或有害藻类水华已成为我国近岸海域主要的环境问题之一^{[2, 15, 23-24]}。米氏凯伦藻、球形棕囊藻、中肋骨条藻、牟氏角毛藻是南海海域常见的藻华种，而双胞旋沟藻在2006—2013年间的间断性暴发成为南海近岸海域新的环境热点问题^[25-26]。海水养殖等生产活动直接排放的氮磷等营养物质逐渐成为赤潮灾害的重要诱发因素^{[4, 8, 11-13, 24]}。

Wang等^[27]的研究表明，海洋藻类Rubisco的K_m (CO₂) 约为40~60 μmol·L⁻¹，但实际海水中CO₂浓度约为10 μmol·L⁻¹ (pH 8.0, 20 ℃)，因此海水中低溶解态的CO₂也可能成为某些海洋微藻光合固碳的限制因子。本研究显示，在C浓度0~400 μmol·L⁻¹条件下，双胞旋沟藻、眼点拟微绿球藻、中肋骨条藻比生长速率表现出显著的促进作用，最大增加量为35% (双胞旋沟藻)，其他微藻比生长速率未表现出显著增加，这一现象可能与藻细胞自身调整CCM (CO₂ concentrating mechanism, CCM) 对CO₂的亲和力有关^[28]。本研究发现，在其他营养盐充足的条件下，碳源浓度增加，对双胞旋沟藻、中肋骨条藻的种群增长表现出一定的促进作用，但碳源浓度增加对7种微藻种群增长的总体促进作用影响较小，类似的研究结果在聚球藻 (Synechococcus sp.) 中也得到证实。聚球藻从高无机碳浓度培养条件转移到低浓度培养时，其胞外碳酸酐酶在4~6 h内即可恢复高CO₂亲和力^[29]。因此，温室效应导致的海洋溶解无机碳增加并非是有害藻类赤潮频发的关键诱导因素。

近岸海域藻华种微藻种类日益增多的现状，除部分种类随船舶压舱排放直接引发藻华外，大多数藻华种类微藻已逐步适应并呈现固定季节暴发的趋势^[30]。因此，近岸海域氮、磷富营养化被认定为各类藻华暴发的基础。根据近几年的《中国近岸海域环境质量公报》，我国近岸海域四大海区的平均无机氮浓度已达11~35 μmol·L⁻¹，平均活性磷酸盐浓度为0.6~1.8 μmol·L⁻¹。本研究设定的N (0~176 μmol·L⁻¹)、P (0~6.4 μmol·L⁻¹) 浓度涵盖了我国绝大多数海域的水质状况，P浓度对照组比生长速率与最大浓度 (6.4 μmol·L⁻¹)组相比下降了20%~81.71%。从门类上看，甲藻 (双胞旋沟藻、米氏凯伦藻)、硅藻 (中肋骨条藻、牟氏角毛藻)、金藻 (球形棕囊藻) 的平均比生长速率分别下降了28.58%、52.71%和35.66%。2种饵料微藻 (亚心形扁藻、眼点拟微绿球藻) 在设定的P浓度范围内，比生长速率仅明显低于球形棕囊藻，与其他藻华种的比生长速率相比无显著差别。微藻对磷源的的利用差异，在其他研究中也有证实，微藻对磷源的利用特性不仅与磷源形态 (正磷酸盐、有机磷等) 有关，而且受藻细胞磷酸酶活性的影响显著^{[15, 23-24, 31]}。卵圆卡盾藻 (Chattonella ovate) 在无机磷源缺乏的条件下可以利用有机磷源，中肋骨条藻和东海原甲藻 (Prorocentrum donghaiense) 无机磷利用效率低于有机磷源^[32]。

氮源浓度和形态对微藻细胞增长和生理生化组分的影响研究已有广泛开展，如东海原甲藻、多环旋沟藻 (Cochlodinium polykrikoides)、海洋卡盾藻 (C. marina)、赤潮异弯藻 (Heterosigma akashiwo)等^{[15, 23-24, 26, 33]}。本研究设置的3种氮源形态培养下，硝酸盐对照组比生长速率与最大浓度组相比下降了16.54%~77.52%，甲藻 (双胞旋沟藻、米氏凯伦藻)、硅藻(中肋骨条藻、牟氏角毛藻)、金藻(球形棕囊藻)的平均抑制率分别为47.03%、58.13%、30.59%；铵盐对照组比生长速率与最大浓度组相比下降了15.79%~87.82%，甲藻 (双胞旋沟藻、米氏凯伦藻)、硅藻 (中肋骨条藻、牟氏角毛藻)、金藻 (球形棕囊藻)的平均抑制率分别为81.45%、43.96%、15.79；尿素对照组比生长速率与最大浓度组相比下降了25.16%~71.43%，甲藻 (双胞旋沟藻、米氏凯伦藻)、硅藻 (中肋骨条藻、牟氏角毛藻)、金藻 (球形棕囊藻) 的平均抑制率分别为69.31%、53.98%和29.55%。2种饵料微藻 (亚心形扁藻、眼点拟微绿球藻) 在3种氮源下的最大比生长速率仅明显低于球形棕囊藻，处于较高水平，也进一步表明，受试饵料微藻在氮源利用效率上具有较高水平。

对比3种氮源形态下藻华种类微藻的种群增长，甲藻 (双胞旋沟藻、米氏凯伦藻) 对铵盐和尿素限制最敏感；硅藻 (中肋骨条藻、牟氏角毛藻) 对硝酸盐和尿素限制敏感性更高；金藻 (球形棕囊藻) 对氮源限制敏感性最弱。上述结果在一定程度上解释了近岸海域藻华演变先硅藻后甲藻的趋势，在营养盐丰富的条件下，硅藻种群增长迅速；随着营养盐消耗，硅藻种群增长更易受到磷源限制而表现出抑制效应。同时，硝酸盐的大量消耗也进一步限制了硅藻门微藻的种群增长。而甲藻门种类可在低浓度硝酸盐和磷酸盐条件下维持较高的种群增长速率，并因此获得种间竞争优势。金藻门球形棕囊藻受到氮、磷限制的响应最低，也证实其种群增长具有明显的营养盐利用优势，这一优势有利于其在低浓度营养盐条件下快速增长并长时间维持高种群密度。甲藻门 (裸甲藻) 在低磷条件下仍能维持较高的种群增长，且与硅藻门 (假微型海链藻) 的种间竞争实验结果均呈现先硅藻后甲藻的群落演替规律^[34]。然而，也有研究表明，受试微藻种类的不同导致其对氮、磷限制的响应也存在差异，甲藻 (赤潮异弯藻) 对磷限制的敏感性显著高于氮限制，而同属针胞藻纲的海洋卡盾藻却对相同条件下的氮、磷限制响应无显著差异^[33]。本研究发现金藻 (球形棕囊藻) 和非赤潮藻亚心形扁藻、眼点拟微绿球藻在低氮、磷浓度下均保持较高水平的生长速率，这一特性在一定程度上为经济藻类处理利用养殖废水，并维持相对的种间竞争优势提供了生物学基础。

微藻在不同氮、磷浓度下的生长情况，受其对氮、磷吸收利用效率的影响。本研究发现，微藻比生长速率与细胞体积呈一定的负相关关系，而单位细胞密度的氮、磷营养盐吸收速率却与细胞体积呈正相关。从本研究采用的受试微藻门类上看，硅藻 (中肋骨条藻、牟氏角毛藻) 生长速率显著高于甲藻 (双胞旋沟藻、米氏凯伦藻)，研究结果与近岸海域浮游植物群落演替的调查结果相符合^[25]，金藻 (球形棕囊藻) 细胞增长和氮、磷营养盐吸收利用均高于上述甲藻和硅藻，进一步揭示了富营养条件下球形棕囊藻种群暴发赤潮的潜在生理学基础。本研究选取的亚心形扁藻、眼点拟微绿球藻在生源要素的吸收利用以及细胞生长速率上均能够达到甚至超过部分典型藻华种，表现出较好的营养盐吸收利用特性，能够作为养殖尾水氮、磷去除的优良藻株，后续拟综合其他环境因素 (光照、温度、pH等) 构建微藻混合培养，进一步探索亚心形扁藻和眼点拟微绿球藻作为养殖尾水的原位生物处理能效。