Optimization of multi-enzymatic extraction of polysaccharide from Gelidium amansii by response surface methodology
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摘要:
为优化复合酶法[m (木瓜蛋白酶)∶m (纤维素酶) =2∶1]提取石花菜(Gelidium amansii)粗多糖的工艺条件，在单因素实验基础上进行三因素三水平的Box-Benhnken中心组合实验，并根据回归分析确定石花菜粗多糖的复合酶法最佳提取工艺为复合酶添加量2.30%、酶解温度60.43 ℃、料液比1∶32 (g·mL−1)。在此条件下酶解120 min，石花菜粗多糖的提取率可达15.98%。
Abstract:To optimize the multi-enzymatic extraction process of polysaccharides from Gelidium amansii, we designed a three-factor and three-level Box-Benhnken center-united experiment based on single factor test, and conducted a regression analysis. The optimum technological parameters of enzymatic extraction of G. amansii polysaccharide were: enzymes addition 2.30%, enzymatic hydrolysis temperature 60.43 ℃, ratio of material to water 1∶32 (g·mL−1). The extraction yield of polysaccharide was up to 15.98% after 120 min of enzymatic hydrolysis under these conditions.
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Keywords:
- Gelidium amansii /
- polysaccharide /
- multi-enzyme /
- response surface method /
- extraction optimization
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石花菜(Gelidium amansii)别名海冻菜、红丝、凤尾，是中国重要的经济红藻之一，生长于大干潮线附近及以下6~10 m的海岩上，常见于中国黄海、渤海沿岸，浙江、福建以及台湾沿海也有生长[1]。石花菜是一种利用价值极高的药食两用海藻，不仅营养成分丰富，而且具有降血脂、降血糖、清热解暑、清肺化痰等药用功效[2-3]。Kang等[4]对石花菜提取物的抗肥胖生物活性进行了研究，结果表明石花菜提取物的摄入可大幅降低高脂饮食小鼠(Mus musculus)的体质量，其作用机制可抑制脂肪细胞中脂肪原基因的表达，从而减少脂肪生成；另有多项研究表明，饮食中补充石花菜可有效改善高果糖饮食大鼠的胰岛素抵抗及高脂血症，同时还可降低糖尿病大鼠患慢性炎症和心血管疾病的风险[5-6]。在石花菜所含的多种生物活性物质中，多糖的含量高、用途广泛、可利用度高，尤其受到研究者的关注，从石花菜中提取分离得到的多糖类物质已被证实具有抑菌、抗氧化、抗凝血等生物活性[3,7-8]。
藻类多糖的提取方法众多，目前常见的主要有热水浸提法、酸碱浸提法，新型提取技术有酶法、微波辅助提取法、超声辅助提取法等。近年来，酶提法作用条件温和、提取率高，在提取多糖的过程中可较好地保留其生物活性，因而逐渐得到广泛应用[9-10]。酶在制备多糖的过程中主要起2种作用：1)利用酶的催化活性和高选择性，在较为温和的条件下特异地降解细胞壁等阻碍多糖溶出的屏障，加速多糖的释放[11-12]；2)利用酶来降解粗多糖以制备低分子量多糖[13]。海藻细胞壁主要含纤维素，通过纤维素酶处理，可以高效地破坏细胞壁的组织结构，加快海藻多糖的溶出；而木瓜蛋白酶不仅对多糖的提取起到辅助作用，还可促使原料中蛋白质水解，从而脱除部分蛋白，提升溶出液中多糖的纯度[14]。石花菜属中国北方常见红藻，但国内外对其多糖的提取方法的研究有限，目前石花菜多糖的提取仍依赖于传统的水提醇沉方法，此法虽安全简单，但耗时长且温度高，易引起多糖的降解[15]，所提多糖质量远不及酶法等新型提取方法[16-17]。因此，本研究以石花菜为实验材料，确定复合酶配比为m (木瓜蛋白酶)∶m (纤维素酶) =2∶1[18-19]，采用复合酶法提取石花菜粗多糖，在单因素实验的基础上运用响应面法优化复合酶法提取石花菜粗多糖的工艺，以期为石花菜天然食品、药品的综合开发利用提供参考依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
石花菜干品来源于山东省威海市；纤维素酶(酶活性≥30 U·mg−1)、木瓜蛋白酶(酶活性≥2.0×105 U·mg−1)为生物试剂；葡萄糖标准品、无水乙醇、浓硫酸、苯酚、丙酮等均购于广州领驭生物科技有限公司，为分析纯。
EYELA N-1000型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；TDZ5-WS台式低速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；SUNRISE吸光酶标仪(瑞士TECAN公司)；THZ-82回旋水浴恒温振荡器(常州金坛精达仪器制造有限公司)；DHG-9145A型电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司)；Alpha 1-4冷冻干燥仪(德国Christ有限责任公司)；GB204电子天平[瑞士METTLER仪器(中国)有限公司]；79-1磁力加热搅拌器(天津市赛德利斯实验分析仪器制造厂)。
1.2 实验方法
1.2.1 石花菜粗多糖的提取
本实验采用复合酶法对石花菜粗多糖进行提取，具体工艺流程为：石花菜(干品)→反复清洗去杂质→50 ℃烘箱干燥→粉碎过筛(40目)→按一定料液比加水→50 ℃预热10 min→加入适量复合酶[m (木瓜蛋白酶)∶m (纤维素酶) =2∶1]→恒温酶解→沸水浴灭酶15 min→离心(4 000 r·min−1，10 min)→取上清液→测提取率。
1.2.2 石花菜粗多糖的测定
采用苯酚-硫酸法[20]测定石花菜粗多糖提取率(定义为苯酚-硫酸法计算得到的多糖质量占藻粉质量的百分比)。以葡萄糖为标准品，于490 nm处测定吸光度并绘制标准曲线。经线性回归得标准曲线方程A=6.395x+0.009 9，相关系数R²=0.999。式中x为多糖质量浓度(mg·mL−1)，A为吸光度。用下式转化得到石花菜粗多糖溶液中多糖的质量浓度：
$$ {\text{粗多糖提取率}} = \frac{{\left( {A - 0.009\;9} \right) \times V}}{{6.395\;m}} \times 0.9 \times 100{\text{%}} $$ 式中A为苯酚-硫酸法测定的粗多糖溶液吸光度，V为粗多糖溶液体积(mL)，m为石花菜藻粉质量(mg)；转化系数为0.9。
1.2.3 石花菜粗多糖提取单因素实验设计
分别以不同的复合酶添加量、酶解时间、酶解温度和料液比(g·mL–1，下同)进行单因素实验，分析各因素对于酶解提取石花菜粗多糖的影响。
1)复合酶添加量对粗多糖提取率的影响。分别称取1 g石花菜藻粉，置于5个容量为100 mL的锥形瓶中，按照藻粉质量的1%、1.5%、2%、2.5%、3%加入复合酶[m (木瓜蛋白酶)∶m (纤维素酶) =2∶1)，在料液比1∶30、酶解温度60 ℃条件下水浴振荡提取120 min，4 000 r·min−1转速下离心10 min，取上清液测定总糖质量分数。
2)酶解时间对粗多糖提取率的影响。固定复合酶[m (木瓜蛋白酶)∶m (纤维素酶) =2∶1]添加量为藻粉质量2%、料液比1∶30、酶解温度60 ℃，研究不同酶解时间(60、90、120、150和180 min)对粗多糖提取率的影响。
3)酶解温度对粗多糖提取率的影响。固定复合酶[m (木瓜蛋白酶)∶m (纤维素酶) = 2∶1]添加量为藻粉质量的2%、料液比1∶30、酶解时间120 min，研究不同酶解温度(45、50、55、60和65 ℃)对粗多糖提取率的影响。
4)料液比对粗多糖提取率的影响。固定复合酶[m (木瓜蛋白酶)∶m (纤维素酶) =2∶1]添加量为藻粉质量的2%、酶解时间120 min、酶解温度60 ℃，研究不同料液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60)对粗多糖提取率的影响。
1.2.4 Box-Behnken响应面分析
在单因素实验的基础上，选取酶添加量(A)、酶解温度(B)、料液比(C) 3个主导因素，每个因素设3个水平，以石花菜粗多糖提取率为响应值，采用Design-Expert 10软件进行三因素三水平Box-Behnken实验设计，通过响应面分析对复合酶法提取石花菜粗多糖的工艺进行优化[21-23]。实验因素及水平见表1。
表 1 响应面分析因素水平表Table 1. Factors and levels used in response surface analysis水平
level因素 factor 酶添加量 (A) /%
enzyme addition酶解温度 (B) /℃
enzymatic hydrolysis temperature料液比 (C) /
(g·mL−1)
solid-liquid ratio−1 1 55 1∶20 0 2 60 1∶30 1 3 65 1∶40 1.3 数据分析统计
通过软件Microsoft Excel 2010和IBM SPSS Statistics 23进行实验数据的统计分析以及响应面曲面模型的回归方程和显著性统计分析。采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)进行多重比较，P<0.05为差异显著。
2. 结果与分析
2.1 单因素实验
2.1.1 复合酶添加量对粗多糖提取率的影响
复合酶添加量为1%~2%时，粗多糖提取率随着酶量的增加而提高，并在酶量大于2%时呈下降趋势(图1-a)，这与吴金松等[24]研究的甘蔗(Saccharum officinarum)渣中水溶粗多糖的酶法提取最佳工艺中所得结论一致。复合酶作用于石花菜细胞壁结构，使其降解，从而加速了细胞内容物的释放。随着复合酶添加量的增加，酶和底物接触的机会也随之增加，在相同时间内释放出的粗多糖含量也因此升高。此后若进一步增加酶量，由于酶分子已达饱和状态，部分复合酶不能再与底物结合，不仅不会增加粗多糖的提取率，还会造成复合酶的浪费。因此，选取复合酶添加量为2%。
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图 1 不同因素对粗多糖提取率的影响Figure 1. Effect of different factors on extraction yield of polysaccharide2.1.2 酶解时间对粗多糖提取率的影响
酶解的前120 min，随着反应时间的延长，石花菜粗多糖的提取率呈上升趋势，并在120 min时达到最高(图1-b)，此时酶和底物得到充分反应；但在酶解120 min后，随着时间延长粗多糖的提取率下降，可能是由于提出来的粗多糖再次分解导致提取量降低(图1-b)，这可能和复合酶发挥作用的最适反应时间及最适反应温度有关，说明不一定酶解时间越长越能发挥复合酶的活力。陈胜军等[25]通过响应面实验对胰蛋白酶提取鲍鱼(Haliotis sp.)内脏多糖的工艺进行优化，单因素实验中发现酶解时间为1~2 h时多糖提取率逐渐增加，超过2 h后多糖提取率反而下降，推测可能是在酶解2 h时多糖得到最大程度的溶出，而酶解时间过长酶解液易变质，从而导致多糖提取率下降。综上，最佳的石花菜酶解时间为120 min。
2.1.3 酶解温度对粗多糖提取率的影响
当温度低于60 ℃时，随着温度的升高，石花菜粗多糖的提取率不断升高，尤其在60 ℃前提取率升高最为明显(图1-c)，该温度可能是木瓜蛋白酶与纤维素酶在实验条件下的最适温度；温度大于60 ℃后，石花菜粗多糖的提取率大幅度下降，可能是温度过高引起了复合酶活力的下降，从而使得提取率也随之降低。刘焕燕等[26]在利用复合酶提取毛竹笋(Phyllostachys heterocycla)多糖时也得出了相似的结论，其发现在酶解温度为30~50 ℃时多糖的提取率逐渐上升，温度高于50 ℃时多糖得率出现下降，分析可能是由于温度过高导致酶失活。因此，选择石花菜粗多糖的酶解温度为60 ℃。
2.1.4 料液比对粗多糖提取率的影响
石花菜粗多糖的提取率随料液比的增加呈先升高后降低的趋势，且在料液比为1∶30时达到最大(图1-d)。最初提取率的升高可能是因溶剂增多扩大了反应体系中复合酶与石花菜藻粉接触的面积，增加了石花菜粗多糖的浓度梯度从而使得更多的多糖被溶出；后期随着溶剂的进一步增加，反应体系中的酶浓度受到较大影响，可能导致提取率的降低。此外，料液比过高还会导致后续工艺的操作负担[27-28]。雍成文等[29]在复合酶法提取黄秋葵(Abelmoschus esculentus)多糖的研究中发现，在料液比为1∶30时黄秋葵多糖达到最大提取率，超过或低于此比率，多糖的提取率均会有所下降，主要原因在于多糖从植物细胞壁溶出到溶剂中的过程取决于质量浓度差的推动，溶剂越多则质量浓度差越大，因而推动力增强，但溶剂量若超过一定范围，则会引起复合酶质量浓度的降低，进而降低了复合酶的催化效率。综上，最佳料液比确定为1∶30。
2.2 响应面实验结果分析
2.2.1 石花菜粗多糖提取率的二次多项回归方程
根据单因素实验结果，选取复合酶添加量、酶解温度及料液比这3个主导因素进行三因素三水平的响应面实验分析，响应面实验设计方案及结果见表2。
表 2 响应面实验设计方案及结果Table 2. Program and test results of RSM编号
No.因素 factor 粗多糖提取率 (Y) /%
extraction yield of polysaccharide酶添加量 (A) /%
enzymes addition酶解温度 (B) /℃
enzymatic hydrolysis temperature料液比 (C) /(g·mL−1)
solid-liquid ratio1 2 60 1∶30 15.50 2 1 60 1∶40 12.18 3 3 60 1∶20 11.94 4 1 55 1∶30 8.97 5 2 60 1∶30 15.27 6 2 60 1∶30 15.79 7 2 60 1∶30 16.57 8 2 60 1∶30 15.76 9 2 65 1∶40 10.40 10 3 65 1∶30 11.37 11 3 60 1∶40 13.94 12 3 55 1∶30 9.20 13 2 65 1∶20 8.28 14 1 65 1∶30 9.01 15 2 55 1∶20 7.20 16 2 55 1∶40 8.52 17 1 60 1∶20 11.34 以复合酶添加量、酶解温度和料液比作为研究对象条件，以石花菜粗多糖的提取率为响应值，共得到17个实验点(表2)。利用Design-Expert 10软件对表2中的数据进行多元回归拟合，最终得到石花菜粗多糖提取率(Y)对复合酶添加量(A)、酶解温度(B)、料液比(C)三因素的二次多项回归模型为Y=15.78+0.617A+0.647B+0.785C+0.533AB+0.288AC+0.199BC−1.195A2−4.943B2−2.235C2。
2.2.2 响应面模型的方差分析
对复合酶法提取石花菜粗多糖的响应面数学模型进行方差分析(表3)。结果显示，该实验模型极显著(P<0.000 1)，失拟项不显著(P>0.05)，表明模型可用；模型的相关系数R2=0.993 0，
$ {R}_{\rm adj}^2$ =0.984 0，说明该回归模型可对99.3%的结果值变化规律做出解释，基本可用于复合酶提取石花菜粗多糖的分析和预测[30-31]。此外，在此模型中A、B、AB项均显著(P<0.05)，C、A2、B2、C2项均为极显著(P<0.01，表3)，分析可知所选3个因素对石花菜粗多糖提取率影响的主次为C (料液比)>B (酶解温度)>A (复合酶添加量)。表 3 模型回归方程方差分析Table 3. ANOVA of regression equation方差来源
source平方和
SS自由度
df均方
MSF P 显著性
significance模型 model 152.86 9 16.98 110.34 < 0.000 1 *** A 3.04 1 3.04 19.77 0.003 ** B 3.34 1 3.34 21.73 0.002 3 ** C 4.92 1 4.92 31.99 0.000 7 *** AB 1.14 1 1.14 7.38 0.029 9 * AC 0.33 1 0.33 2.15 0.185 9 BC 0.16 1 0.16 1.03 0.343 2 A2 6.01 1 6.01 39.05 0.000 4 *** B2 102.88 1 102.88 668.41 < 0.000 1 *** C2 21.02 1 21.02 136.59 < 0.000 1 *** 残差 residual 1.08 7 0.15 失拟项 lack of fit 0.12 3 0.04 0.17 0.913 5 绝对误差 pure error 0.96 4 0.24 总误差 total error 153.93 16 注：*. 差异显著(P<0.05)；**. 差异极显著(P<0.01)；***. 差异极极显著(P<0.001) Note: *. significant difference (P<0.05); **. very significant difference (P<0.01); ***. extremely significant difference (P<0.001) 2.2.3 因素交互作用分析与提取条件优化
各因素以及因素之间的交互作用对响应值的影响见图2。在等高线图中圆形等高线表示相应变量之间的交互作用不显著，而椭圆形或马鞍形等形状则表明因素之间有较为显著的交互作用[32]。
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图 2 两因素交互作用对多糖提取率的响应面图和等高线图Y. 粗多糖提取率；A. 酶添加量；B. 酶解温度；C. 料液比Figure 2. Response surface and contour plots of variable parameters on extraction yield of polysaccharideY. extraction yield of polysaccharide; A. enzyme addition; B. enzymatic hydrolysis temperature; C. solid-liquid ratio通过比较响应曲面图的陡峭程度可发现，料液比对粗多糖得率的影响最大，其次是酶解温度，这与方差分析结果吻合。复合酶添加量(A)和酶解温度(B)交互影响显著(P<0.05，图2)。在复合酶添加量一定的情况下，随着酶解温度的升高，石花菜粗多糖的提取率呈先增加后下降的趋势，这可能是最初随着酶解温度升高，反应体系的温度逐渐接近复合酶的最适反应温度，酶促反应速度不断加快，因而提取率不断升高；当酶解温度继续升高，高温可能会引起酶蛋白的变性失活，酶活力降低致使提取率下降。当酶解温度一定时，随复合酶添加量的增加，粗多糖提取率亦先不断增加后略有下降，这是因为在底物浓度一定的情况下，随着复合酶添加量的增加，复合酶和石花菜细胞壁的接触机会增加，酶解作用得到加强，使得提取率有所升高；当溶液中复合酶浓度过大时，酶蛋白自身发生水解，反而使提取率有所下降。复合酶添加量与料液比、酶解温度与料液比之间交互影响不显著。
利用Design-Expert 10软件进行分析，得到石花菜粗多糖的最佳复合酶辅助提取条件为复合酶添加量2.30%、酶解温度60.43 ℃、料液比1∶32。在此条件下，石花菜粗多糖的提取率最高，预测为15.98%。考虑实际操作条件，对此优化后工艺参数进行修正，修正后为复合酶添加量2.30%、酶解温度60.5 ℃、料液比1∶32。以此结果为条件做3组平行实验进行验证，发现该条件下石花菜粗多糖提取率为16.18%，与预测值基本一致，充分证明了该响应面法优化所得的工艺条件准确可靠，说明所得模型具有实用价值。
3. 结论
本实验以石花菜为原料，运用响应面实验设计及分析方法，对复合酶[m (木瓜蛋白酶)∶m (纤维素酶) =2∶1]法提取石花菜粗多糖的工艺参数进行优化，得出复合酶法提取石花菜粗多糖的最佳工艺条件为复合酶添加量2.30%、酶解温度60.43 ℃、料液比1∶32、酶解时间120 min。在此条件下石花菜粗多糖的提取率约为15.98%。
除酶法提取外，目前藻类多糖较常用的提取方法还有热水浸提法及超声波辅助提取法等，许瑞波等[33]对石花菜多糖的热水浸提方法进行了优化，结果显示在其最佳提取工艺条件下石花菜多糖的提取率为30.17%，该提取率虽高于复合酶提取法，但需重复提取3次，每次2 h，耗时长且工艺繁琐；刘言炜等[34]采用超声波辅助冻融法提取蓝藻多糖，通过响应面实验确定最佳提取工艺为超声波功率487.20 W、超声温度66.52 ℃、液料比24.72∶1，在此条件下蓝藻多糖提取率为6.17%，此法引入的杂质少、操作简单，但提取率较低。
综合各种因素分析来看，复合酶法提取石花菜粗多糖可在提取过程中有效破除石花菜细胞壁，在相对温和的提取条件下促使多糖的溶出；同时，木瓜蛋白酶的加入可将部分结合蛋白水解，起到初步的脱蛋白作用，为后续分离纯化提供方便，所得多糖质量高，具有实用价值。经过复合酶提取得到的粗多糖中含有部分非多糖杂质，在后续的实验中将对石花菜粗多糖进行进一步的分离纯化，以及对纯化后的多糖进行相关生物活性研究，以期为制备具有良好生物活性的天然多糖提供资源准备。
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图 1 不同因素对粗多糖提取率的影响
Figure 1. Effect of different factors on extraction yield of polysaccharide
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图 2 两因素交互作用对多糖提取率的响应面图和等高线图
Y. 粗多糖提取率；A. 酶添加量；B. 酶解温度；C. 料液比
Figure 2. Response surface and contour plots of variable parameters on extraction yield of polysaccharide
Y. extraction yield of polysaccharide; A. enzyme addition; B. enzymatic hydrolysis temperature; C. solid-liquid ratio
表 1 响应面分析因素水平表
Table 1 Factors and levels used in response surface analysis
水平
level因素 factor 酶添加量 (A) /%
enzyme addition酶解温度 (B) /℃
enzymatic hydrolysis temperature料液比 (C) /
(g·mL−1)
solid-liquid ratio−1 1 55 1∶20 0 2 60 1∶30 1 3 65 1∶40 
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表 2 响应面实验设计方案及结果
Table 2 Program and test results of RSM
编号
No.因素 factor 粗多糖提取率 (Y) /%
extraction yield of polysaccharide酶添加量 (A) /%
enzymes addition酶解温度 (B) /℃
enzymatic hydrolysis temperature料液比 (C) /(g·mL−1)
solid-liquid ratio1 2 60 1∶30 15.50 2 1 60 1∶40 12.18 3 3 60 1∶20 11.94 4 1 55 1∶30 8.97 5 2 60 1∶30 15.27 6 2 60 1∶30 15.79 7 2 60 1∶30 16.57 8 2 60 1∶30 15.76 9 2 65 1∶40 10.40 10 3 65 1∶30 11.37 11 3 60 1∶40 13.94 12 3 55 1∶30 9.20 13 2 65 1∶20 8.28 14 1 65 1∶30 9.01 15 2 55 1∶20 7.20 16 2 55 1∶40 8.52 17 1 60 1∶20 11.34
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表 3 模型回归方程方差分析
Table 3 ANOVA of regression equation
方差来源
source平方和
SS自由度
df均方
MSF P 显著性
significance模型 model 152.86 9 16.98 110.34 < 0.000 1 *** A 3.04 1 3.04 19.77 0.003 ** B 3.34 1 3.34 21.73 0.002 3 ** C 4.92 1 4.92 31.99 0.000 7 *** AB 1.14 1 1.14 7.38 0.029 9 * AC 0.33 1 0.33 2.15 0.185 9 BC 0.16 1 0.16 1.03 0.343 2 A2 6.01 1 6.01 39.05 0.000 4 *** B2 102.88 1 102.88 668.41 < 0.000 1 *** C2 21.02 1 21.02 136.59 < 0.000 1 *** 残差 residual 1.08 7 0.15 失拟项 lack of fit 0.12 3 0.04 0.17 0.913 5 绝对误差 pure error 0.96 4 0.24 总误差 total error 153.93 16 注：*. 差异显著(P<0.05)；**. 差异极显著(P<0.01)；***. 差异极极显著(P<0.001) Note: *. significant difference (P<0.05); **. very significant difference (P<0.01); ***. extremely significant difference (P<0.001)
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