Optimization of multi-enzymatic extraction of polysaccharide from Gelidium amansii by response surface methodology
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摘要:
为优化复合酶法[m (木瓜蛋白酶)∶m (纤维素酶) =2∶1]提取石花菜(Gelidium amansii)粗多糖的工艺条件，在单因素实验基础上进行三因素三水平的Box-Benhnken中心组合实验，并根据回归分析确定石花菜粗多糖的复合酶法最佳提取工艺为复合酶添加量2.30%、酶解温度60.43 ℃、料液比1∶32 (g·mL−1)。在此条件下酶解120 min，石花菜粗多糖的提取率可达15.98%。
Abstract:To optimize the multi-enzymatic extraction process of polysaccharides from Gelidium amansii, we designed a three-factor and three-level Box-Benhnken center-united experiment based on single factor test, and conducted a regression analysis. The optimum technological parameters of enzymatic extraction of G. amansii polysaccharide were: enzymes addition 2.30%, enzymatic hydrolysis temperature 60.43 ℃, ratio of material to water 1∶32 (g·mL−1). The extraction yield of polysaccharide was up to 15.98% after 120 min of enzymatic hydrolysis under these conditions.
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Keywords:
- Gelidium amansii /
- polysaccharide /
- multi-enzyme /
- response surface method /
- extraction optimization
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近年来，虾类养殖已成为水产养殖发展较为迅速的产业之一[1]。脊尾白虾 (Exopalaemon carinicauda) 是黄、渤海沿岸主要经济虾类之一，具有广盐、广温性，抗病力和繁殖力较强等优点，已逐渐成为沿海滩涂混合养殖的重要品种；脊尾白虾对低盐耐受性非常强，甚至可以在淡水中生活，是目前低盐混养的重要虾类品种[2-3]。水体是虾类健康养殖的关键因素，水体生态环境的变化会影响虾类的生长和存活。急性低盐胁迫对凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei)、克氏原螯虾 (Procambarus clarkii)、斑节对虾 (Penaeus monodon)、罗氏沼虾 (Macrobrachium rosenbergii) 和东方新糠虾 (Neomysis orientalis) 等的生长和成活率均有显著影响[4-7]。低盐环境下，凡纳滨对虾和克氏原螯虾的肝胰腺均受到损伤，抗氧化能力和免疫酶活力下降，并使凡纳滨对虾卵巢发育相关基因受到抑制[8-10]。免疫相关基因C型凝集素在斑节对虾肝胰腺和肠中的表达量显著上升，酚氧化酶原基因在脊尾白虾血淋巴和鳃组织中表达量显著升高，参与低盐胁迫的应激反应[11-13]。
转录组测序可在各种环境条件下对物种进行高通量测序，通过测序结果进行基因结构分析和基因功能注释，分析特定条件下相关基因的表达情况，以揭示其代谢网络及调控响应机理[14-15]。转录组测序已在临床诊断、农业基因组学和法医学科学等多个领域，发挥着越来越重要的作用，其测序成本也大幅降低[16]。目前高通量转录组测序技术在鱼类、贝类和虾蟹类中均有应用，主要集中在各种胁迫对水产动物生理机制的影响、环境胁迫相关基因筛选、生长发育相关基因筛选、饲料成分对水产动物转录组的影响、微卫星育种标记开发等[17-21]。王日芳[22]进行脊尾白虾转录组测序，开发了33个微卫星标记进行遗传多样性分析，发现3个近交家系的近交程度较高。孙政[23]利用新一代测序技术 (ROCHE454) 对脊尾白虾胚胎发育不同时期以及成虾应对各种病原刺激时的转录组进行测序，发现成虾在应对各种病原刺激时免疫相关基因表达量增加，在胚胎阶段参与外皮发生的基因十分活跃。冯宁宁[24]对脊尾白虾WSSV潜伏组与急性感染组的转录组进行测序，筛选出濒死与对照群体中的差异表达基因。为探索脊尾白虾低盐度人工养殖的可能性，筛选脊尾白虾在自然海水和淡水环境下的差异表达基因，本研究运用第二代Illumina测序技术对脊尾白虾进行了转录组测序，为进一步研究其在低盐环境下的调控机理提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 实验设计
实验在江苏海洋大学海水养殖动物病害与生态免疫学实验室进行，实验用脊尾白虾来自连云港南极路水产市场，规格整齐、体质健壮，养殖1周以适应实验室环境，暂养水体温度24~26 ℃、盐度31、pH 8.25、溶解氧质量浓度7.6~8.1 mg·L−1。
实验1开始时随机挑选脊尾白虾120尾，平均湿质量 (4.12±0.56) g，分为自然海水 (盐度31) 和低盐胁迫 (盐度0.2) 2个处理组，每组设3个重复，共6个水族箱，每个水族箱 (水体积约30 L) 放养20尾脊尾白虾，人工充氧。胁迫约5.5 h后虾体开始从尾部变白，约6 h后虾开始侧卧游动，估计此时脊尾白虾处于昏厥状态。为确保样品质量，低盐胁迫组脊尾白虾侧卧约5 min开始取样 (低盐胁迫约6 h)，海水组与低盐胁迫组每个水族箱分别选取5尾，整虾速冻于液氮中，备用于转录组测序。实验2设计同上，随机挑选脊尾白虾120尾，分别在第0、第0.5、第1、第2、第4和第6小时，从每个水族箱取出2尾，解剖出肌肉、鳃和肝胰脏于液氮中速冻保存，备用于实时定量验证实验。
1.2 方法
1.2.1 RNA提取与文库构建
将冻存的实验1低盐胁迫组和海水组样品分别于液氮中全虾研磨混合均匀后进行脊尾白虾总RNA提取，检测RNA样品纯度、浓度和完整性。随后用带有Oligo (dT) 的磁珠富集脊尾白虾mRNA，加入破碎液将mRNA进行随机打断，以mRNA为模板，反转录合成双链cDNA链，利用AMPure XP beads纯化cDNA，纯化的双链cDNA再进行末端修复、加尾并连接测序接头，然后用AMPure XP beads进行片段大小选择，最后通过PCR富集构建cDNA文库，检测文库的浓度和插入片段大小，并通过Q-PCR准确定量有效浓度，以保证文库质量。常规方法提取实验2样品RNA，用实时定量反转录试剂盒制成cDNA备用。
1.2.2 转录组测序与分析
实验1获得的检测合格的cDNA文库送样到北京百迈客生物科技有限公司进行HiSeq2500高通量测序，测序读长为PE125。对原始数据进行过滤，滤掉原始数据中的接头序列和低质量读数，获得高质量的数据后，通过Trinity软件进行序列组装得到脊尾白虾的Unigene库。使用BLAST软件将Unigene序列与NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG和KEGG等多个数据库进行比对得到Unigene注释信息。将低盐胁迫组和海水组高质量的测序数据与组装得到的Unigene库进行序列比对，使用EBSeq进行差异表达分析，将错误发现率FDR (False discovery rate)<0.01且差异倍数FC (Fold change)≥2作为筛选标准，最终得到自然海水组和低盐胁迫组样品间的差异表达基因[25-27]，进行差异表达基因的功能注释和富集分析。利用topGO软件对海水组和低盐胁迫组样品间差异表达基因进行GO富集分析，以有向无环图展示各富集节点在GO体系中的关联，挖掘显著富集节点中的差异表达基因，分析差异表达基因可能行使的分子功能。以差异表达基因钠/唾液酸共转体 (Sodium/sialic acid cotransporter, Sialin) 为例，对所在的溶酶体信号通路进行展示并分析。
1.2.3 差异表达基因的筛选与验证
从转录组分析得到的自然海水组和低盐胁迫组样品间差异表达基因中，挑选生殖蛋白A (Reproductive-related protein A, RPA)、ETS转录因子4 (ETS-related transcription factor 4, Elf 4)、钠/唾液酸共转体、胰蛋白酶 (Tripsin)、Smads蛋白4 (Mothers against decapentaplegic protein 4, SMAD 4)、钙结合蛋白 (Calcium-binding protein, CBP) 和α-葡糖苷酶 (Alpha-glucosidase, AGC) 等7条差异表达基因进行引物设计，以实验2中反转录得到的cDNA为模板，通过RT-PCR方法进行验证，表1为验证引物序列，其中Actin为内参基因。利用SPSS 11.0 软件进行统计分析，P<0.05表示差异显著。
表 1 RT-PCR验证引物Table 1. Primers for real-time quantitative verification引物名称
Primer name引物序列 (5'–3')
Primer sequenceActin F CCGAGACATCAAGGAGAAGC Actin R ATACCGCAAGATTCCATACCC RPA RT F GGAAATGCCAACACCTACGC RPA RT R TCCACGTAGCTTTCCTGAGC Elf 4 RT F ACATTGAGGAGCTGGATCGC Elf 4 RT R AGGCGAACTCTGAATGACGG Sialin RT F TTAGTGCATGGAGGCTGGTATT Sialin RT R ATTGACGGCTACGTGTTGAGGT Tripsin RT F CGTCCTCACTTGTTCTCCTTGA Tripsin RT R TGCCGTTACCTAATGTCTGGTT SMAD 4 RT F CTGTCACGGTTGATGGTTACGT SMAD 4 RT R CTTGCTCGGTCACTCTGCTCT CBP RT F CTCAAGAAGGGCACAGGATTT CBP RT R TACCCTGAGTCATGGAACTGC AGC RT F TCACCTTCTGCCATACTTATACTCT AGC RT R TCAGCACCTCGTAACTTCCTC 注：RPA. 生殖蛋白A；Elf 4. ETS转录因子4；Sialin. 钠/唾液酸共转体；SMAD 4. Smads蛋白4；CBP. 钙结合蛋白；AGC. α-葡糖苷酶 Note: RPA. Reproductive-related protein A; Elf 4. ETS-related transcription factor; Sialin. Sodium/sialic acid cotransporter; SMAD 4. Mothers against decapentaplegic protein 4; CBP. Calcium-binding protein; AGC. Alpha-glucosidase 2. 结果
2.1 测序结果及产出质量
运用Illumina HiSeq2500高通量测序共得到13.92 Gb高质量数据，海水组与低盐胁迫组样品Q30碱基百分比不小于87.93% (表2)，质量较高。
表 2 低盐胁迫组与海水组数据产出质量Table 2. Data output quality of freshwater and seawater groups样品
Sample总读数
Read Number总碱基数
Base NumberGC含量
GC Content/%Q30碱基百分比
Q30 base percentage/%低盐胁迫组 (盐度0.2) Low salinity stress group (Salinity 0.2) 25 971 965 6 540 875 181 44.07 88.79 海水组 (盐度31) Seawater group (Salinity 31) 29 309 634 7 381 520 261 44.14 87.93 注：Q30碱基百分比指质量值大于或等于30的碱基所占的百分比，而Q30对应的碱基识别出错的概率为1/1 000 Note: Q30 base percentage refers to the percentage of base with quality score greater than or equal to 30, and the probability of incorrect base call corresponding to Q30 is 1/1 000. 测序数据组装共得到111 618条转录本和72 734条Unigene，转录本与Unigene的N50分别为2 341和1 502。Unigene平均长度为951.16，其中长度在300~500 bp的占比最高 (47.56%)，长度在1 kb以上的占24.93% (表3)。
表 3 组装结果统计Table 3. Assembly results长度范围
Length range/bp转录本
Transcript单基因簇
Unigene300~500 43 156 (38.66%) 34 590 (47.56%) 500~1 000 29 350 (26.30%) 20 011 (27.51%) 1 000~2 000 18 777 (16.82%) 10 181 (14.00%) >2 000 20 335 (18.22%) 7 952 (10.93%) 总数 Total number 111 618 72 734 总长度 Total length 142 324 737 69 181 596 N50长度 N50 length 2 341 1 502 平均长度 Mean length 1 275 11 951.16 2.2 Unigenes功能注释
将Unigene序列与各数据库进行比对，获得Unigene注释信息。脊尾白虾2个样品共有72 734个Unigene，通过筛选最终获得22 879条有注释信息的Unigene，约31.45%，其中有21 931条比对到Nr数据库 (表4)。
表 4 Unigene注释统计表Table 4. Unigene annotation statistics数据库
DatabaseUnigene数量
Number of annotated unigene长度≥300 nt的Unigene数量
Number of Unigene whose length≥300 nt长度≥1 000 nt的Unigene数量
Number of Unigene whose length≥1 000 ntCOG 7 035 7 035 4 381 GO 9 100 9 100 5 046 KEGG 6 645 6 645 4 137 KOG 14 515 14 515 8 732 Pfam 15 403 15 403 9 720 Swiss-Prot 14 940 14 940 9 093 Nr 21 931 21 931 11 913 All 22 879 22 879 12 058 2.2.1 Nr数据库注释
蚤状溞 (Daphnia pulex) 的同源序列最多，2 143条，占注释序列总数的9.77%；其次为赤拟谷盗 (Tribolium castaneum) 1 157条，文昌鱼 (Branchiostoma floridae) 987条，紫色球海胆 (Strongylocentrotus purpuratus) 927条，虱子 (Pediculus humanus) 755条，小头虫 (Capitella teleta) 693条，囊舌虫 (Saccoglossus kowalevskii) 618条，牡蛎 (Crassostrea gigas) 569条，丽蝇蛹集金小蜂 (Nasonia vitripennis) 562条，海兔 (Aplysia californica) 550条和其他物种12 813条。
2.2.2 GO功能分类
GO功能注释结果见图1，共有9 100条Unigenes被注释分类，从细胞组分可细分为15类，占比最多的是细胞组成 (31.50%)，其次为细胞 (31.12%)。从分子功能细分为16类，催化活性类包含Unigenes最多 (49.45%)，结合次之 (45.13%)。依据其参与的生物学过程可细分为22类，代谢过程类包含Unigenes最多 (55.59%)，细胞过程类次之 (49.26%)。
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2.2.3 COG功能分类
通过与COG数据库进行比对，22 879条Unigenes中有7 035条 (30.75%) 比对到了同源序列，共包含9 379条功能注释信息，分布于25个大类 (图2)。其中功能预测类共有2 430条注释信息，占比最大 (25.91%)，其次为复制、重组和修复，808条注释信息 (8.61%)。
2.2.4 Unigene的KEGG代谢途径分析
KEGG分析显示，共有6 645条Unigenes被注释，分布于216个已知途径中，其中前12个代谢途径见表5，注释基因数占总量的31.12%。前5个途径分别是核糖体 (ko03010) 312条、溶酶体 (ko04142) 225条、内质网中的蛋白质加工 (ko04141) 223条、RNA转运 (ko03013) 221条和剪接体 (ko03040) 171条。
表 5 前12个代谢途径Table 5. First 12 metabolic pathways代谢通路
Pathway代谢通路
名称
Pathway ID基因数量
Gene number核糖体 Ribosome ko03010 312 溶酶体 Lysosome ko04142 225 内质网中的蛋白质加工
Protein processing in endoplasmic reticulumko04141 223 RNA转运 RNA transport ko03013 221 剪接 Spliceosome ko03040 171 嘌呤代谢 Purine metabolism ko00230 149 泛素-蛋白酶体
Ubiquitin mediated proteolysisko04120 147 吞噬体 Phagosome ko04145 141 内噬作用 Endocytosis ko04144 140 氧化磷酸化 Oxidative phosphorylation ko00190 125 mRNA监测途径
mRNA surveillance pathwayko03015 108 过氧物酶体 Peroxisome ko04146 106 2.3 差异表达基因功能注释及富集分析
低盐胁迫产生1 492条差异表达基因，有829条显著上调，663条显著下调。共810条差异表达基因得到注释，其中252条注释到GO数据库，165条注释到KEGG数据库，222条注释到COG数据库。
2.3.1 差异表达基因GO功能富集
差异表达基因GO分类注释图，其横坐标为三大分类下的二级节点，纵坐标为该节点中被注释基因的数量和百分比 (图3)。分析得出，差异表达基因主要注释到细胞组成、催化活性和代谢过程中。而百分比明显大于所有基因占比的节点为转运活性和色素沉着，富集显著性较高，但色素沉着的注释百分比较低。
利用topGO对海水组和低盐胁迫组的差异表达基因进行功能富集，得到的有向无环图 (分子功能)，可以清晰地显示出各富集节点的层级关系，分子功能越具体层级越低 (图4)。最显著的10个节点在图中用方框表示。各节点的富集显著性以颜色区分，由高到低为红色>橘色>黄色。
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图 4 差异表达基因GO富集有向无环图 (分子功能)Figure 4. Directed acyclic map of GO enrichment of differentially expressed genes (Molecular function)将最显著的8个节点按富集显著性排序，各节点的详细信息见表6。GO:0003824富集程度最高，该节点中表达量上调幅度最大的Unigene为α-己二酸氨基转移酶，log2FC数值为3.73；下调幅度最大的为磷脂酶，log2FC数值为−2.73 (图4)。
表 6 差异表达基因topGO富集结果示意表 (分子功能)Table 6. Schematic diagram of topGO enrichment results of differential expression gene (Molecular function)节点编号
GO ID节点名称
GO term总基因数
Total gene numberDEG基因数
DEG gene number期望值
Expected显著性
KSGO:0003824 催化活性 Catalytic activity 4 507 125 120.43 3.1×10−9 GO:0042302 表皮结构成分 Structural constituent of cuticle 29 5 0.77 0.000 22 GO:0070011 肽酶活性 Peptidase activity 224 5 5.99 0.002 85 GO:0016787 水解酶活性 Hydrolase activity 1 754 48 46.87 0.003 26 GO:0004879 配体激活序列特异性 DNALigand-activated sequence-specific DNA 12 0 0.32 0.004 06 GO:0005230 细胞外配体门控离子通道 Extracellular ligand-gated ion channel 37 0 0.99 0.004 17 GO:0005319 脂质转运蛋白活性 Lipid transporter activity 23 8 0.61 0.004 38 GO:0022857 跨膜转运蛋白活性 Transmembrane transporter activity 453 18 12.1 0.005 09 注：DEG指差异表达基因 Note: DEG is differentially expressed gene. 2.3.2 差异表达基因KEGG注释
根据KEGG数据库注释结果，分析代谢通路中差异基因表达情况，通过通路探索差异的根源。为了识别差异表达基因参与的代谢途径，对差异表达基因KEGG的注释结果按照通路类型进行分类，发现注释到溶酶体信号通路的基因最多 (13条)，其次为赖氨酸降解信号通路 (7条)，光转导和色氨酸代谢信号通路分别有5条 (图5)。
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图 5 差异表达基因KEGG分类图1. 遗传信息处理；2—6. 有机系统；7—9. 细胞过程；10—15. 环境信息处理；16. 人类疾病；17—44. 代谢Figure 5. KEGG classification of differential expression gene1. Genetic information processing; 2–6. Organismal systems; 7–9. Cellular processes; 10–15. Environmental information processing; 16. Human diseases; 17–44. Metabolism2.3.3 KEGG通路富集分析
通路的富集程度由富集因子体现，值越小富集水平越显著；而Q值 (多重假设检验校正后的P值) 越大富集显著性越可靠。筛选出20条差异表达基因显著富集的代谢通路，其中富集程度最显著的8个代谢通路是光转导、赖氨酸降解、赖氨酸生物合成、溶酶体、血管内皮生长因子信号途径、叶酸生物合成、色氨酸代谢和血管平滑肌收缩 (表7)。
表 7 KEGG富集部分结果Table 7. Partial results of KEGG enrichment代谢通路
Metabolic pathwayKEGG通路编号
KO pathway No.富集因子
Enrichment factorQ 光转导 Phototransduction-fly ko04745 0.13 3.412 2×10−2 赖氨酸降解 Lysine degradation ko00310 0.24 1.095 9×10−1 赖氨酸生物合成 Lysine biosynthesis ko00300 0.10 2.608 2×10−1 溶酶体 Lysosome ko04142 0.43 2.947 3×10−1 血管内皮生长因子信号途径 VEGF signaling pathway ko04370 0.05 3.363 9×10−1 叶酸生物合成 Folate biosynthesis ko00790 0.18 5.565 8×10−1 色氨酸代谢 Tryptophan metabolism ko00380 0.24 5.799 3×10−1 血管平滑肌收缩 Vascular smooth muscle contraction ko04270 0.07 8.143 4×10−1 对溶酶体信号通路进行展示，可以看出溶酶体信号通路中的溶酶体酸性水解酶包括蛋白酶、糖苷酶和鞘磷脂酶等 (图6，表8)。低盐胁迫条件下，组织蛋白酶L显著上调，log2FC数值为2.48，而组织蛋白酶A和B显著下调，log2FC数值分别为−2.46、−1.28和−1.38；相对而言，葡糖脑苷脂酶、鞘磷脂磷酸二酯酶和鞘磷脂磷酸二酯酶2均显著下调，log2FC数值分别为−1.26、−1.89和−1.31。溶酶体信号通路主要溶酶体膜蛋白 (Major lysosomal membrane proteins) 中，溶酶体膜蛋白2在低盐胁迫条件下显著下调，log2FC数值为−1.64；次要溶酶体膜蛋白 (Minor lysosomal membrane proteins) 中，NPC细胞内胆固醇转运体1和2在低盐胁迫条件下均下调，log2FC数值分别为−1.16和−2.11，而钠/唾液酸共转体为混合调节，log2FC数值分别为3.02、1.35和−2.01。
表 8 溶酶体信号通路包含Unigenes序列信息Table 8. Lysosome signaling pathway containing Unigenes sequence information基因描述
Gene description海水组FPKM值
FPKM in seawater group低盐胁迫组FPKM值
FPKM in low salinity stress group差异倍数对数值
log2FC上调/下调
Up/Down钠/唾液酸共转体
Sodium/sialic acid cotransporter, Sialin0.72 6.87 3.02 上调 钠/唾液酸共转体
Sodium/sialic acid cotransporter, Sialin3.70 10.83 1.35 上调 钠/唾液酸共转体
Sodium/sialic acid cotransporter, Sialin4.10 1.14 −2.01 下调 组织蛋白酶A Cathepsin A 0.23 1.63 −2.46 下调 组织蛋白酶B Cathepsin B 0.92 0.16 −1.28 下调 组织蛋白酶B Cathepsin B 66.66 31.23 −1.38 下调 组织蛋白酶L Cathepsin L 60.39 26.51 2.48 上调 鞘磷脂磷酸二酯酶
Sphingomyelin phosphodiesterase, SMPD15.50 1.67 −1.89 下调 鞘磷脂磷酸二酯酶2
Sphingomyelin phosphodiesterase 2, SMPD116.44 7.57 −1.31 下调 NPC细胞内胆固醇转运体1
NPC intracellular cholesterol transporter 1, NPC147.00 38.91 −1.16 下调 NPC细胞内胆固醇转运体2
NPC intracellular cholesterol transporter 2, NPC26.45 13.48 −2.11 下调 溶酶体膜蛋白2
Lysosome membrane protein 2, LIMP1.70 0.60 −1.64 下调 葡糖脑苷脂酶
Glucocerebrosidase, GBA14.69 6.97 −1.26 下调 2.4 差异表达基因的验证
运用RT-PCR测得差异表达基因在脊尾白虾不同部位 (鳃、肝胰腺和肌肉) 中的表达量，并得到差异倍数对数值 (log2FC) 随时间的变化。图7参考值为转录组测序数据中该差异表达基因，根据log2转换后的差异倍数对数值 (log2FC)，详细信息见表9。生殖蛋白A基因在肝胰腺中表达量显著升高，第6小时log2FC为4.23，与转录组分析结果较为一致；但在鳃和肌肉中表达下调 (图7-A)。ETS转录因子4基因表达量在鳃中呈先下降再上升的趋势，第4、第6小时log2FC约为2.58，与转录组分析结果较为一致，而在肝胰腺和肌肉中呈波动变化 (图7-B)。钠/唾液酸共转体基因在鳃、肝胰腺和肌肉中差异表达均不显著 (图7-C)。胰蛋白酶基因在鳃和肌肉中表达下调，与转录组分析结果较为一致；但在肝胰腺中表达上调，呈先升后降的趋势 (图7-D)。Smads蛋白4基因在鳃和肌肉中表达下调，与转录组分析结果较为一致，而在肝胰腺中呈波动变化 (图7-E)。钙结合蛋白基因表达量在鳃、肝胰腺和肌肉3个检测组织下调幅度均较转录组分析结果大 (图7-F)。α-葡糖苷酶基因在鳃中表达上调，而在肝胰腺和肌肉中表达下调 (图7-G)。
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图 7 低盐胁迫对脊尾白虾log2FC的影响log2FC. 差异倍数对数值Figure 7. Effects of low salinity stress on log2FC of E. carinicaudalog2FC. The pair value of fold change表 9 验证的Unigenes序列信息Table 9. Sequence information of verified unigenes基因描述
Gene description海水组FPKM值
FPKM in seawater group低盐胁迫组FPKM值
FPKM in low salinity stress group差异倍数对数值
log2FC上调/下调
Up/Down生殖蛋白A Reproductive-related protein A, RPA 8.01 190.85 4.37 上调 ETS转录因子4 ETS-related transcription factor 4, Elf 4 0.45 4.34 2.97 上调 钠/唾液酸共转体 Sodium/sialic acid cotransporter, Sialin 0.72 6.87 3.02 上调 胰蛋白酶 Tripsin 8.07 0.88 −3.20 下调 Smads蛋白4 Mothers against decapentaplegic protein 4, SMAD 4 1.589 0.56 −1.36 下调 钙结合蛋白 Calcium-binding protein, CBP 0.502 0.451 −0.13 下调 α-葡糖苷酶 Alpha-glucosidase, AGC 3.538 5.228 0.55 上调 3. 讨论
高通量转录组测序技术在水产养殖中已得到广泛应用，刘九美[28]研究开发出脊尾白虾多态性微卫星位点及SNP位点，以揭示其回交家系的优良性状。通过转录组测序及后续分析，利用RACE技术可克隆得出脊尾白虾全长基因[29-30]。王传聪等[31]进行罗氏沼虾肝胰腺组织转录组测序，获得33 450条Unigenes。孙健[32]用Illumina Hiseq 4000测序平台，对氨氮胁迫后日本沼虾 (M. nipponense) 的肝胰腺进行转录组测序，共获得75 742条转录本，63 453条Unigenes，注释率100%。陈雪峰等[33]采用Illumina HiSeqTM4000高通量测序平台，对罗氏沼虾卵巢发育4个时期的卵巢组织进行转录组测序，共获得95 379条Unigenes，注释率54.55%。董丽君等[34]进行凡纳滨对虾肝胰腺组织Illumina HiSeq 2500测序，筛选低温胁迫下的差异表达基因，共获得50 921条Unigenes，平均长度为828 bp，N50为1 589 bp，其中37.28%得到注释。本研究运用Illumina HiSeq2500测序平台，对脊尾白虾进行转录组测序，共获得13.92 Gb高质量数据，海水组与低盐胁迫组样品共获得72 734条Unigenes，平均长度为951.16 bp，N50为1 502 bp，其中22 879条得到注释，占31.45%。注释率较低，可能是由于相近物种的基因注释信息在数据库中收录较少，且脊尾白虾自身转录组测序研究较少。
陈科[35]对凡纳滨对虾低盐度胁迫转录组jin'x测序，发现最显著变化的GO通路为催化活性、组蛋白H4乙酰化和表皮结构成分等；显著变化的KEGG通路有鞘糖脂生物合成、赖氨酸降解和糖胺聚糖生物合成信号通路等。本研究通过差异表达基因GO功能富集分析，发现低盐胁迫对脊尾白虾催化活性、表皮结构成分、肽酶活性、水解酶活性、配体激活序列特异性、脂质转运蛋白活性、跨膜转运蛋白活性等影响显著。KEGG通路富集分析结果显示，主要富集到的8个代谢通路，分别为光转导、赖氨酸降解、赖氨酸生物合成、溶酶体、血管内皮生长因子信号通路、叶酸生物合成、色氨酸代谢、血管平滑肌收缩，其中注释到溶酶体信号通路的差异表达基因最多。
溶酶体是细胞内具有降解、胞外分泌和信号传递功能的一类细胞器，包括溶酶体外膜和溶酶体内腔[36]。细胞受到胁迫时激活自噬功能，可通过溶酶体降解来达到代谢平衡[37]。溶酶体中含有很多蛋白，半胱氨酸蛋白酶是其中含量较多的一种组织蛋白酶，可降解并消化溶酶体内腔中的生物大分子[36]。神经酰胺是细胞凋亡的第二信使，而葡萄糖神经酰胺合成酶催化其糖基化，使之无细胞毒性，促进鞘糖脂合成[38]。对溶酶体信号通路挖掘发现，低盐度胁迫条件下，注释到该信号通路的13个差异表达基因中，钠/唾液酸共转体为混合调节，组织蛋白酶L显著上调，而其他基因均显著下调，推测低盐度胁迫影响了溶酶体对胆固醇的清除和转运，可能通过调控神经酰胺相关酶的活性，影响细胞的生长和信号传导，并在一定程度上影响了溶酶体的降解功能。
ETS转录调控因子家族参与调节造血细胞、神经细胞和血管内皮细胞等的分化，ETS转录因子4是ETS家族重要成员，参与细胞多种生理或病理过程[39-41]。Smads蛋白4是SMADs家族中公共介体性SMAD (Common mediator SMAD) 的一种，具有保持SMAD复合物转录活性的作用，参与转化生长因子β的细胞内信号转导，与组织纤维化有一定关系[42-43]。钙结合蛋白能与钙离子形成复合物，维护细胞内的钙稳态；钙离子通过钙结合蛋白在生物体内发挥作用，是肌肉纤维运动的主要调控信号，影响肌肉纤维的收缩性能[44]。胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，它不仅起到消化酶的作用，还起到活化作用，激活其他蛋白酶类，对胶原纤维结构有一定破坏作用，可能参与了海参自溶[45-46]。正常情况下胰蛋白酶活性被适当抑制，少量胰蛋白酶原转化为活性胰蛋白酶，被胰蛋白酶抑制剂灭活，防止细胞受损。胰蛋白酶的激活超过胰蛋白酶抑制剂的能力，会导致损伤细胞的各种蛋白酶的激活，这是胰腺炎发病的主要原因[47]。α-葡糖苷酶参与淀粉等糖原的代谢，具有水解和转糖苷的双重作用，抑制其活性可减缓葡萄糖的生成，同时调节体内的脂肪水平[48]。本研究转录组数据分析发现，低盐胁迫显著提高α-葡糖苷酶和ETS转录因子4基因的表达，而Smads蛋白4、钙结合蛋白和胰蛋白酶表达显著降低，推测脊尾白虾可能通过促进ETS转录因子4产生，提高α-葡糖苷酶活性以维持机体的正常生理功能，抑制胰蛋白酶活性以维持脊尾白虾低盐应激反应的稳态；而钙结合蛋白的表达下调表明低盐胁迫影响了脊尾白虾肌肉的纤维收缩能力。实时定量PCR结果显示，基因在鳃、肝胰腺和肌肉中的表达情况不尽相同，并且随时间变化，基因的表达量也有所波动，可能与转录组测序的时间点只有一个临界时间点，而且是全虾整体混合测序，而实时定量验证所用模板为脊尾白虾的各个组织，且覆盖了低盐胁迫过程中的各个阶段有关。
然而，图7验证试验中生殖蛋白A、ETS转录因子4、钠/唾液酸共转体、胰蛋白酶、Smads蛋白4、钙结合蛋白和α-葡糖苷酶等7条差异表达基因偏差较大，可能有2个原因：1) 脊尾白虾低盐胁迫实验结果可能受采样操作过程和自身盐度耐受差异等因素的影响，造成一定偏差；2) 可能与使用的分析软件有关，本文所用的分析软件优点是通过输入RT-PCR测定数值，可以直接算出log2转换后的差异倍数对数值 (log2FC)，基因上调和下调趋势一目了然，弥补了先前使用2−△△CT方法对下调基因展示的不足，但也带来了标准偏差较大的问题。
本研究挖掘了脊尾白虾低盐环境下的相关信号通路及差异表达基因数据，为脊尾白虾分子生物学研究提供了丰富的基因资源，也可为今后进行脊尾白虾低盐胁迫生理机制的探讨和关键差异表达基因的深入挖掘提供技术支撑。
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图 1 不同因素对粗多糖提取率的影响
Figure 1. Effect of different factors on extraction yield of polysaccharide
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图 2 两因素交互作用对多糖提取率的响应面图和等高线图
Y. 粗多糖提取率；A. 酶添加量；B. 酶解温度；C. 料液比
Figure 2. Response surface and contour plots of variable parameters on extraction yield of polysaccharide
Y. extraction yield of polysaccharide; A. enzyme addition; B. enzymatic hydrolysis temperature; C. solid-liquid ratio
表 1 响应面分析因素水平表
Table 1 Factors and levels used in response surface analysis
水平
level因素 factor 酶添加量 (A) /%
enzyme addition酶解温度 (B) /℃
enzymatic hydrolysis temperature料液比 (C) /
(g·mL−1)
solid-liquid ratio−1 1 55 1∶20 0 2 60 1∶30 1 3 65 1∶40 
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表 2 响应面实验设计方案及结果
Table 2 Program and test results of RSM
编号
No.因素 factor 粗多糖提取率 (Y) /%
extraction yield of polysaccharide酶添加量 (A) /%
enzymes addition酶解温度 (B) /℃
enzymatic hydrolysis temperature料液比 (C) /(g·mL−1)
solid-liquid ratio1 2 60 1∶30 15.50 2 1 60 1∶40 12.18 3 3 60 1∶20 11.94 4 1 55 1∶30 8.97 5 2 60 1∶30 15.27 6 2 60 1∶30 15.79 7 2 60 1∶30 16.57 8 2 60 1∶30 15.76 9 2 65 1∶40 10.40 10 3 65 1∶30 11.37 11 3 60 1∶40 13.94 12 3 55 1∶30 9.20 13 2 65 1∶20 8.28 14 1 65 1∶30 9.01 15 2 55 1∶20 7.20 16 2 55 1∶40 8.52 17 1 60 1∶20 11.34
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表 3 模型回归方程方差分析
Table 3 ANOVA of regression equation
方差来源
source平方和
SS自由度
df均方
MSF P 显著性
significance模型 model 152.86 9 16.98 110.34 < 0.000 1 *** A 3.04 1 3.04 19.77 0.003 ** B 3.34 1 3.34 21.73 0.002 3 ** C 4.92 1 4.92 31.99 0.000 7 *** AB 1.14 1 1.14 7.38 0.029 9 * AC 0.33 1 0.33 2.15 0.185 9 BC 0.16 1 0.16 1.03 0.343 2 A2 6.01 1 6.01 39.05 0.000 4 *** B2 102.88 1 102.88 668.41 < 0.000 1 *** C2 21.02 1 21.02 136.59 < 0.000 1 *** 残差 residual 1.08 7 0.15 失拟项 lack of fit 0.12 3 0.04 0.17 0.913 5 绝对误差 pure error 0.96 4 0.24 总误差 total error 153.93 16 注：*. 差异显著(P<0.05)；**. 差异极显著(P<0.01)；***. 差异极极显著(P<0.001) Note: *. significant difference (P<0.05); **. very significant difference (P<0.01); ***. extremely significant difference (P<0.001)
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