Effect of enzymatic hydrolysis from mantle of pearl oyster on skin wound healing
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摘要:
为进一步拓宽马氏珠母贝(Pinctada martensii)的高值化利用途径，文章探讨了马氏珠母贝外套膜酶解产物体外抗菌活性、促凝血作用以及对小鼠软组织开放性创伤愈合效果。结果表明，珍珠贝外套膜酶解产物具有一定的促凝血作用，但对13种测试菌无抑制作用；涂抹给药6 d后，给药组小鼠的创伤愈合率显著高于阴性对照组(P<0.05)，与阳性对照组无显著差异(P>0.05)；给药组的第14天愈合率达100%，疤痕缩小率显著高于阴性对照组(P<0.05)。生化指标测试结果显示，与2个对照组相比，马氏珠母贝外套膜酶解产物能够抑制炎症因子IL-6生成；与阴性对照组相比，其可极显著促进IL-10分泌；与阴性对照组相比，给药组皮肤组织中FGF-2含量无显著性差异(P>0.05)，阳性对照组EGF含量显著高于其他组(P<0.05)；而TGF-β和CCND1含量均显著高于阴性对照组(P<0.05)。综上，马氏珠母贝外套膜酶解产物具有一定促凝血、抑制炎症作用并促进生长因子分泌，从而加快小鼠软组织开放性创伤愈合，对浅表瘢痕增生具有一定的抑制作用。
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关键词:
- 马氏珠母贝外套膜酶解产物 /
- 抑菌性 /
- 促创伤愈合 /
- 促凝血活性 /
- 抑制炎症
Abstract:In order to promote the high value utilization of pearl oyster (Pinctada martensii), we were determined explore the antibacterial activity and procoagulant activity of enzymatic hydrolysis from its mantle (EHM), and the effects of EHM on open wound healing of skin of mice. Results showed that EHM possessed of procoagulant activity in mice but had no antibacterial activity against 13 tested strains. Compared with the negative control group, the healing rate of wound of mice increased significantly after skin application with EHM for 6 d (P<0.05), but there was no significant difference with comparison with the positive control group (P>0.05). The healing rate was 100% on 14th day for the drug group, and the scar contraction rate was significantly higher than that of the negative control group (P<0.05). Biochemical indicators test indicated that EHM had significant inhibitation effect on inflammatory factor IL-6 (P<0.05); compared with the negative control group, it could promote IL-10 secretion in wound tissues significantly (P<0.05), but there was no significant difference in FGF-2 content in skin tissue of the drug groups (P>0.05), and EGF content in the positive control group was significantly higher than that in the other groups (P<0.05). Howerer, there was no significant difference in the contents of FGF-2 and EGF between the drug groups (P<0.05). In summary, EHM has procoagulant, anti-inflammatory and promotional effects, which can accelerate the open wound healing of soft tissue in mice and has a certain inhibitory effect on superficial scar hyperplasia.
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近年来中国水产品产量增长显著，特别是随着水产养殖和渔业装备技术的发展，水产养殖产量快速增长，2017年中国水产品总产量达到6 445万吨[1]。水产品水分含量较高，常温下极易腐败变质。温度是影响水产品货架期的重要因素，低温保鲜能有效抑制水产品自身的酶活以及微生物生长，且成本相对低廉更符合生产需求[2]。常见的低温保鲜方式主要有冷藏和冷冻，但传统的冷冻技术主要采用空气强制对流冷冻和间接接触冷冻，能耗较高、冷冻效率低、冻结不均匀、易产生干耗，造成产品质地差等问题[3-6]。为追求更好的水产保鲜品质和更高的冷冻效率，开发更高效的新型水产品保鲜方法成为当前的研究热点。研究表明采用低冻结点的高纯度食品级氟利昂、液氮、液态二氧化碳作为载冷剂，冻结温度可低至–70 ℃以下，速冻效果最佳，但受限于回收难、不利于工业化生产等原因普及度不高[7-8]。不断有学者进行液体速冻方式的优化改良[9]，即利用低温液体(冷冻媒介)与食品材料进行热交换，使食品材料快速冻结，该方法具有冻结设备结构简单、操作方便、冻结速率快、低能耗、冻结均匀、干耗小等优点，已成为当下的研究热点。为了更快地实现热交换，需要选择温度更低且更稳定的载冷剂作为冷冻媒介，由于跟食品材料直接接触，这种载冷剂还必须具有安全无毒的特点[9-11]。常见的一元冷冻媒介有液氮、液态二氧化碳，但其缺点是无法循环利用；随后一些学者开始利用盐水或乙醇水溶液或糖类水溶液作为载冷剂，但发现高浓度乙醇易挥发且易燃，而浓盐水则渗透性太强且易腐蚀设备，糖类则存在黏度太高的问题。为克服上述缺陷，三元、四元载冷剂[12-13]被研发出来，即将盐或糖、乙醇和水按一定比例复配组合得到的冻结液，具有降低冻结点的效果，但其冻结物料的温度仍不够低且不能完全克服上述问题。因此开发复合多元载冷剂是正确的改进方向，也是液体速冻技术发展的核心，由于需要选择安全、食用级的组分，并解决多元载冷剂之间的相互影响等问题，所以发展较为缓慢[14-16]；近年韩光赫等[17]、杨贤庆等[18]开发的多元载冷剂可实现–40 ℃左右的冻结。
载冷剂配方是液体速冻的最关键技术，而目前国内外相关研究较少[19-20]。为探索适合浸渍速冻技术的新型多元冻结液，本实验选用食品级乙醇、低聚果糖、柠檬酸及氯化钙组成的水溶液，通过单因素试验探明各载冷剂添加量与冻结点之间的关系和影响，再将起主要作用的载冷剂通过响应面法优化其最佳配比，获得适用于水产品快速冻结的冻结点较低的速冻液配方，从而实现水产品在更短时间内达到较低的中心温度，更好地保持鲜度和品质。
1. 材料与方法
1.1 材料与试剂
乙醇、丙二醇、柠檬酸、低聚果糖、氯化钙等均为食品级，购自广州化学试剂厂。
1.2 仪器与设备
WJ400H液体冻结机(饶平万佳水产有限公司)；Testo 735-2专业型温度仪(德国德图仪器公司)；Forma-725超低温冰箱(艾本德中国有限公司)；NDJ-8s数字黏度计(上海方瑞仪器有限公司)。
1.3 方法
1.3.1 冻结液冻结点的测定
参考杨贤庆等[18]和马晓斌等[21]的方法，测定冻结液的冻结点(图1)。降温曲线在36~38 min出现略微升温现象，可对此升温曲线的温度段求平均值并视为该冻结液的近似冻结点。
1.3.2 冻结液黏度的测定
预实验测得冻结液在常温状态的黏度不超过15 mPa·s，黏度计转子类型选择0号转子，测定黏度更精确。测定方法参考倪明龙[22]，重复测3次取平均值。
1.3.3 单因素试验
在不同添加量下，分别研究所选用的食品级载冷剂组分对溶液冻结点的影响。
乙醇/丙二醇添加量对冻结液冻结点的影响。以冻结液冻结点为指标，分别配制不同质量分数(5%、10%、15%、20%、25%)乙醇溶液和丙二醇溶液进行冻结，记录2组醇溶液冻结曲线；在5%、10%、15%、20%、25%的乙醇溶液中添加丙二醇配置成复合醇溶液，分析不同乙醇添加量对复合醇冻结点的影响。
低聚果糖添加量对冻结液冻结点的影响。以冻结液冻结点为指标，分别配制不同质量分数(4%、6%、8%、10%、12%、14%)的低聚果糖溶液进行冻结，记录其冻结曲线，分析低聚果糖不同添加量对冻结液冻结点的影响。
柠檬酸添加量对冻结液冻结点的影响。分别配制不同质量分数(3%、6%、9%、12%、15%、18%)的柠檬酸溶液进行冻结，记录其冻结曲线，分析柠檬酸不同添加量对溶液冻结点的影响。
氯化钙添加量对冻结液冻结点的影响。分别配制不同质量分数(2%、5%、8%、11%)的氯化钙溶液进行冻结，记录其冻结曲线，分析氯化钙不同添加量对溶液冻结点的影响。
1.3.4 配方的响应面试验设计
在1.3.3单因素试验结果基础上，对冻结点影响较大的主要因素，进行Box-Behnken响应面试验，自变量为乙醇(A)、低聚果糖(B)、柠檬酸(C)、氯化钙(D)的质量分数，响应值为冻结点的绝对值和黏度，设计的试验因素水平表见表1。
表 1 载冷剂配比的响应面试验因素水平表Table 1. Response surface factors level of refrigerants ratio因素
factor水平 level –1 0 1 乙醇质量分数/% (A)
ethanol mass fraction10 15 20 低聚果糖质量分数/% (B)
fructooligosaccharide content8 10 12 柠檬酸质量分数/% (C)
mass fraction of citric acid/%3 4 5 氯化钙质量分数/% (D)
mass fraction of calcium chloride3 5 7 2. 结果与分析
2.1 醇类溶液添加量对速冻液冻结点的影响
醇类是速冻液中常用的载冷剂，现有的含醇类速冻液中醇类用量较大，也因此造成速冻液不稳定、挥发性大、黏度大等问题，为达到降低冻结点的同时减少速冻液粘性的目的，必须合理调整和选择乙醇和丙二醇的含量[23]。乙醇和丙二醇均随质量分数的增加，冻结点温度不断下降，且乙醇的冻结点温度一直低于丙二醇(图2)。而多元组分液体冻结点往往低于单一组分液体，所以为了提高速冻液的效能即增强抗结晶能力、降低冻结点，可以通过组合搭配两种醇类的比例来改进冻结性能。本研究以10%丙二醇[15]为基础，添加不同质量分数的乙醇形成复合醇，并保持复合醇在速冻液中总含量不超过30%。随着乙醇质量分数的增加，冻结点温度不断降低，乙醇添加量为15%时，达到最低，而后温度处于较平稳状态(图3)。丙二醇不易挥发，但黏度较高，因此选择其质量分数为10%，而乙醇的添加量宜在15%左右，合理调整乙醇、丙二醇组分比例可减少载冷剂的损失量[24]。
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图 2 乙醇和丙二醇不同添加量溶液冻结点变化规律图Figure 2. Variation rule of freezing point with different addition amounts of ethanol or propylene glycol![]()
图 3 乙醇添加到丙二醇中溶液冻结点变化Figure 3. Variation of freezing point of solution of ethanol added to propylene glycol2.2 低聚果糖添加量对速冻液冻结点的影响
糖类具有包埋蛋白质分子中结合水的能力，能抑制蛋白质在冷冻时发生变性，所以常作为抗冻剂应用于水产品中[25-26]。低聚果糖具有高溶解度、高保水性和良好的抗结晶性，有助于降低冷冻液的冻结点温度并提高冷冻液稳定性。随着低聚果糖添加量的增大，冻结点逐渐降低，较低浓度时其冻结点温度随其浓度变化不明显(图4)。出于冻结液黏度及复配考虑，低聚果糖的质量分数梯度采用8%、10%、12%。
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图 4 低聚果糖不同添加量溶液冻结点变化规律图Figure 4. Variation rule of freezing point with different addition amounts of oligofructose2.3 柠檬酸添加量对速冻液冻结点的影响
本研究首次考虑将柠檬酸应用于冻结液中，柠檬酸有很好的降低冻结点的功能，能有效抑制液体结冰的速率，使液体在低温下保持较好的稳定性；此外，柠檬酸也是一种优良的螯合剂、掩蔽剂，与其他组分一起配制时能提高载冷剂性能(图5)。随着柠檬酸添加量的增加，溶液冻结点逐渐降低，其降幅大于低聚果糖溶液。柠檬酸溶液偏弱酸性对食品原来的品质和口感稍有影响，但如果水产品包装之后再进行速冻液冻结，就不会对其品质和口感造成影响。研究表明柠檬酸浓度大于3%后，其pH随浓度增加无显著变化，故柠檬酸的质量分数阈值可选3%~5%为宜。
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图 5 柠檬酸不同添加量溶液冻结点变化规律图Figure 5. Variation rule of freezing point with different addition amounts of citric acid2.4 氯化钙添加量对速冻液冻结点的影响
冷盐水保鲜是最早应用于渔船冷冻保存水产品的有效、方便且廉价的方法，盐类也是最常用的液体冷冻液组分之一，研究表明多元冷冻液中加少量盐类可有效地降低溶液的冻结点，不过其具有很高的渗透性，易对物料原有风味和质量产生影响，且对设备腐蚀性较强[18, 27]。由不同质量分数氯化钙溶液冻结点的变化可知(图6)，随着氯化钙添加量的增加，溶液冻结点逐渐降低，其冻结点比氯化钠还低[18]，氯化钙作为食品添加剂与柠檬酸一起应用于水产品中以提高水产品在冷藏过程中的品质。研究表明[24]氯化钙含量超过7%冷却过程会出现盐析现象，考虑到冻结液的冻结效果和稳定性及其对食材影响[28]，氯化钙的添加量不宜超过7%。
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图 6 氯化钙不同添加量溶液冻结点变化规律图Figure 6. Variation rule of freezing point with different addition amounts of calcium chloride2.5 响应面法优化冻结液配方
2.5.1 响应面试验结果及分析[29-30]
根据BOX-Behnken中心设计原理，在上述单因素实验基础上，以影响速冻液冻结点的明显因素，乙醇(A)、低聚果糖(B)、柠檬酸(C)和氯化钙(D)为自变量，以冻结点绝对值和黏度为响应值，按表1进行响应面试验，实验结果见表2。
表 2 响应面法优化实验结果Table 2. Experimental results of BOX-Behnken design序号
serial No.A B C D 冻结点绝对值/℃
absolute value of freezing point黏度/mPa·s
viscosity1 –1 –1 0 0 40.8 6.19 2 1 –1 0 0 60.2 4.71 3 –1 1 0 0 46.3 5.96 4 1 1 0 0 47.9 5.66 5 0 0 –1 –1 43.8 5.32 6 0 0 1 –1 43.5 5.60 7 0 0 –1 1 48.1 5.15 8 0 0 1 1 44.3 7.80 9 –1 0 0 –1 37.8 5.05 10 1 0 0 –1 54.3 4.65 11 –1 0 0 1 44.7 6.51 12 1 0 0 1 56.5 5.58 13 0 –1 –1 0 51.8 5.77 14 0 1 –1 0 45.7 5.40 15 0 –1 1 0 44.9 6.20 16 0 1 1 0 42.1 7.14 17 –1 0 –1 0 35.4 4.95 18 1 0 –1 0 63.5 4.62 19 –1 0 1 0 45.6 6.50 20 1 0 1 0 40.8 5.35 21 0 –1 0 –1 49.2 5.46 22 0 1 0 –1 39.0 5.70 23 0 –1 0 1 45.7 6.30 24 0 1 0 1 49.5 6.62 25 0 0 0 0 43.6 6.10 26 0 0 0 0 44.6 5.90 27 0 0 0 0 45.8 6.31 28 0 0 0 0 45.3 6.00 29 0 0 0 0 45.1 6.45 对冻结点绝对值的结果(表2)，通过Design Expert软件进行多元拟合回归分析，冻结点回归方程为：
$$ \begin{array}{l} {Y_1} = 44.88 + 6.05A - 1.84B - 2.26C + 1.77D - 4.45AB- \\ \;\;\;\;\; 8.22AC - 1.18AD + 0.82BC + 3.50BD-0.88CD+ \\ \;\;\;\;\; 2.56{A^2} + 1.22B^2 - 0.48{C^2} + 0.39{D^2} \end{array} $$ (1) 对速冻液冻结点结果的回归方程进行方差分析和显著性检验 (表3)。整体模型的显著性水平P<0.000 1，表明模型达到很高的显著水平，是确定最佳冻结液配方的有效参考项。由失拟项(P＝0.115 7>0.05)不显著，相关系数(R2)为0.974 1，说明影响残差的主要因素是随机误差，该模型能较好地反映冻结点与乙醇、柠檬酸、低聚果糖、氯化钙添加量之间的关系。乙醇添加量和柠檬酸添加量均为P<0.000 1，说明乙醇和柠檬酸添加量对冻结点影响最显著(表3)。回归方程中，根据F值大小，各因素对冻结点的影响顺序为A>C>B>D。
表 3 冻结点绝对值回归与方差分析结果Table 3. Analysis of variance fitted regression model of absolute value of freezing point来源
source平方和
SS自由度
df均方和
MSF P 显著性
significance模型 model 1 042.95 14 74.5 37.67 < 0.000 1 ** A 439.23 1 439.23 222.11 < 0.000 1 ** B 40.7 1 40.7 20.58 0.000 5 ** C 61.2 1 61.2 30.95 < 0.000 1 ** D 37.45 1 37.45 18.94 0.000 7 ** AB 79.21 1 79.21 40.05 < 0.000 1 ** AC 270.6 1 270.6 136.84 < 0.000 1 ** AD 5.52 1 5.52 2.79 0.116 9 BC 2.72 1 2.72 1.38 0.260 2 BD 49 1 49 24.78 0.000 2 ** CD 3.06 1 3.06 1.55 0.233 8 A2 42.51 1 42.51 21.5 0.000 4 ** B2 9.69 1 9.69 4.9 0.043 9 * C2 1.48 1 1.48 0.75 0.401 7 D2 0.96 1 0.96 0.49 0.497 残差 residual 27.69 14 1.98 失拟 lack of fit 24.9 10 2.49 3.57 0.115 7 纯误差 pure error 2.79 4 0.7 总和 cor total 1 070.64 28 0.974 1 注：*. 差异显著(P<0.05)；**. 差异极显著(P<0.01)；下表同此 Note: *. significant difference (P<0.05); **. very significant difference (P<0.01). The same case in the following table. Design Expert软件拟合实验结果，得出冻结点的最佳冷冻液配方为乙醇添加量19.89%、低聚果糖添加量9.56%、柠檬酸添加量3.02%，氯化钙添加量为5.41%，其冻结点理论值为–64.617 7 ℃。
对表2速冻液黏度的结果，通过Design Expert软件进行多元拟合回归分析，速冻液黏度回归方程如下：
$$ \begin{array}{l} {Y_2} = 6.15 - 0.38A + 0.15B + 0.61C + 0.52D + 0.30AB - \\ \;\;\;\;\;\;\;0.21AC - 0.13AD + 0.33BC + 0.020BD +0.59CD - \\ \;\;\;\;\;\;\; 0.62{A^2} + 0.055{B^2} - 0.11{C^2} - 0.12{D^2} \end{array} $$ (2) 对速冻液黏度的回归方程进行方差分析和显著性检验结果见表4。模型整体显著性水平P<0.000 1，表明模型显著性水平极高，失拟项不显著(P=0.864 8>0.05)，表明实验结果和模型拟合良好，该模型可较好地描述各因素与黏度值之间的真实关系，可从黏度的角度来预测速冻液配方。R2=0.972 0和校正决定系数(RAdj 2 =0.944 1)可以验证模型的拟合度，表明该模型能较好地反映速冻液的黏度与乙醇、低聚果糖、柠檬酸和氯化钙添加量之间的关系。乙醇、柠檬酸和氯化钙添加量均为P<0.000 1，说明三者添加量对响应值有显著性影响(表4)。根据F值大小，各因素对速冻液的黏度影响顺序为：C>D>A>B。Design Expert软件拟合实验结果，得出黏度的最佳速冻液配方为乙醇添加量19.96%、低聚果糖添加量9.86%、柠檬酸添加量3.03%，氯化钙添加量为5.54%，其黏度理论值为4.590 05 mPa·s。
表 4 黏度回归与方差分析结果Table 4. Analysis of variance fitted regression model of viscosity来源
source平方和
SS自由度
df均方和
MSF P 显著性
significance模型 model 14.86 14 1.06 34.76 < 0.000 1 ** A 1.76 1 1.76 57.47 < 0.000 1 ** B 0.29 1 0.29 9.34 0.008 6 ** C 4.54 1 4.54 148.58 < 0.000 1 ** D 3.18 1 3.18 104.19 < 0.000 1 ** AB 0.35 1 0.35 11.4 0.004 5 ** AC 0.17 1 0.17 5.5 0.034 2 * AD 0.07 1 0.07 2.3 0.151 7 BC 0.43 1 0.43 14.04 0.002 2 ** BD 1.60E-03 1 1.60E-03 0.052 0.822 3 CD 1.4 1 1.4 45.97 < 0.000 1 ** A2 2.47 1 2.47 81.01 < 0.000 1 ** B2 0.02 1 0.02 0.64 0.437 6 C2 0.077 1 0.077 2.52 0.134 8 D2 0.088 1 0.088 2.88 0.111 9 残差 residual 0.43 14 0.031 失拟 lack of fit 0.22 10 0.022 0.44 0.865 3 纯误差 pure error 0.2 4 0.051 总和 cor total 15.29 28 2.5.2 响应曲面交互作用分析与优化
通过Design Expert软件进一步对实验结果进行曲面图分析。曲面图中各因素的曲线陡峭程度能反映其对响应值的影响大小，越陡影响越大；而图中等高线形状能直观表明2个因素间的交互作用大小，等高线接近圆形说明交互作用弱，接近椭圆形则表明交互作用强[31-32]。当乙醇添加量不变时，冻结点随着低聚果糖添加量的增加而缓慢降低；当低聚果糖添加量不变时，冻结点随着乙醇添加量的增加而快速降低，说明乙醇对冻结点的影响较低聚果糖显著，曲线较陡(图7-a)。同样乙醇对冻结点的影响较柠檬酸影响大(图7-b)；图7-c也显示乙醇对冻结点的影响比氯化钙大。而图7-d柠檬酸对冻结点的影响较低聚果糖显著，图7-e表明低聚果糖与氯化钙对冻结点的影响类似，图7-f则是柠檬酸对冻结点的影响较氯化钙显著。这与表3各影响因素对冻结点影响大小的顺序一致，即乙醇>柠檬酸>低聚果糖>氯化钙。
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图 7 乙醇、柠檬酸、低聚果糖和氯化钙各因素交互作用对速冻液冻结点影响的响应面图Figure 7. Response surface diagram of the interaction of ethanol, citric acid, oligofructose and calcium chloride on freezing point of quick freezing liquid图8-a曲面图中曲线较平缓，说明乙醇和低聚果糖对速冻液黏度影响较小；图8-b显示柠檬酸添加量不变时，黏度随着乙醇添加量的增加变化缓慢，但当乙醇添加量不变时，黏度随着柠檬酸添加量的增加而快速增大，说明柠檬酸对黏度的影响较乙醇显著，曲线表现较陡。图8-d也表明柠檬酸较低聚果糖对速冻液的黏度影响较大；图8-c、e则表明氯化钙对速冻液黏度的影响较乙醇和低聚果糖大，图8-f中曲线越陡峭，说明柠檬酸和氯化钙对速冻液黏度的影响都较显著。这与表4各影响因素对速冻液黏度影响大小的顺序一致，即柠檬酸>氯化钙>乙醇>低聚果糖。
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图 8 乙醇、柠檬酸、低聚果糖和氯化钙各因素交互作用对速冻液黏度影响的响应面图Figure 8. Response surface diagram of the interaction of ethanol, citric acid, oligofructose and calcium chloride on viscosity of frozen liquid2.5.3 模型验证
根据前面分析分别得到冻结点和黏度的最佳速冻液配方，结合生产实际及节约成本原则，综合考虑之后确定液体快速冻结的冻结液最佳配方为19.9%乙醇、9.5%低聚果糖、3%柠檬酸和5%氯化钙组成的冻结液。为了检验模型预测的准确性，在此条件下重复3次，测得最佳冻液配方冻结点为–63.5 ℃，黏度为4.64 mPa·s，较接近模型预测值，表明实验模型可以用于预测实际值。
本研究成功获得了比同类冷冻液配方研究[18, 20, 24]冻结点更低、黏度更小的冷冻液配方，而且配方中所用到的几种添加剂价格便宜，成本较低。本研究是在之前研究基础上对新高度的探索，验证了乙醇、丙二醇、低聚果糖、柠檬酸、氯化钙组分在冷冻液复配中的作用，同时采用响应面模型拟合最佳配方，较好地反映出4个因素对冻结点和黏度的影响关系，为探索更高效的速冻液配方提供研究思路。目前本研究所得配方仅在实验和中验证有效，在实际生产用途中并未得到验证，对于其在实际生产中的局限性及缺陷仍未可知。
3. 结论
近年来，液体速冻因操作方便、节能、成本较低、设备小巧而备受关注，也越来越受到水产行业的重视，利用其快速冻结水产品，可以在较短时间内达到锁鲜的目的。而液体速冻技术的关键就是冻结液，开发一种冻结温度低的速冻液是当前行业迫切需要解决的问题。
本研究选择食用级冷媒剂，在单因素实验研究各成分最低冻结点范围的基础上，通过Box-Behnken响应面法对主要组成的添加量进行优化，得到速冻液载冷剂最佳配比为19.9%乙醇、9.5%低聚果糖、3%柠檬酸、5%氯化钙、10%丙二醇。该配方配制的速冻液不仅冻结温度低，冻结点可达–63.50 ℃，且黏度较小(4.64 mPa·s)，应用于水产品如鱼类或虾、贝类的快速冻结，可实现在较短时间内使其所需冻结温度，进而较好地保持其品质和鲜度；此外，该配方还兼具成本低、操作方便等优势。
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图 2 第14天马氏珠母贝外套膜酶解产物对小鼠皮肤创伤瘢痕生成的影响
Figure 2. Effect of EHM on scar formation of skin wounds of mice on Day 14
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图 3 马氏珠母贝外套膜酶解产物对创伤皮肤组织中炎症因子的影响
* . 组间有极显著差异(P<0.01)
Figure 3. Effect of EHM on inflammatory factors in wound skin tissue
*. very significant difference among groups (P<0.01)
表 1 马氏珠母贝外套膜酶解产物对小鼠断尾创口的出血时间和出血量的影响
Table 1 Effect of EHM on bleeding time and blood loss of tail wound of mice
$\overline {\mathit{\boldsymbol{X}}} {\bf \pm} {\bf{SD}}$ , n=5组别
group出血时间/min
bleeding time出血量/g
amount of bleeding阴性对照组
negative control5.05±0.79c 0.015 2±0.001 9c 阳性对照组
positive control0.94±0.49b 0.005 4±0.001 7b 给药组
drug group1.97±0.26a 0.009 6±0.001 8a 注：同列中标有不同小写字母者表示组间有显著性差异 (P<0.05)，标有相同小写字母者表示组间无显著性差异 (P>0.05)，下表、后图同此 Note: Different and same letters within the same row indicate significant (P<0.05) and insignificant different (P>0.05), respectively. The same case in the following tables and figures. 
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表 2 马氏珠母贝外套膜酶解产物对小鼠皮肤创伤愈合的影响
Table 2 Effect of EHM on skin wound healing of mice
$\overline {\mathit{\boldsymbol{X}}} {\bf \pm} {\bf{SD;}}\;$ %组别
group第0天
Day 0第6天
Day 6第10天
Day 10第14天
Day 14阴性对照组 negative control 0±0.00 14.17±2.89b 35.86±8.66b 80.42±6.17b 阳性对照组 positive control 0±0.00 35.83±6.88a 56.67±17.02a 92.92±6.41a 给药组 drug group 0±0.00 28.33±6.88a 87.50±11.11a 100.00±0.00a
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表 3 马氏珠母贝外套膜酶解产物对创伤皮肤组织中生长因子的影响
Table 3 Effect of EHM on growth factors in wound skin tissue on Day 7
$\overline {\mathit{\boldsymbol{X}}} {\bf \pm} {\bf{SD}}$ ; μg·mL–1组别
group成纤维细胞生长因子2
FGF-2转化生长因子β
TGF-β细胞生长周期素1
CCND1表皮生长因子
EGF阴性对照组 negative control 36.58±2.65a 0.44±0.04b 1.67±0.50a 131.37±59.51a 阳性对照组 positive control 28.72±5.65a 1.55±0.11a 2.74±1.21a 1 674.34±913.78b 给药组 drug group 32.60±5.00a 2.09±0.89a 6.60±1.63b 660.59±376.41a
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表 4 马氏珠母贝外套膜酶解产物对创伤皮肤组织中羟脯氨酸的影响
Table 4 Effect of EHM on hydroxyproline in wound skin tissue
$\overline {\mathit{\boldsymbol{X}}} {\bf \pm} {\bf{SD}} $ ; μg·mL–1组别
group造模后时间/d post-moulding time 7 14 阴性对照组 negative control 7.58±0.00ab 13.10±2.11b 阳性对照组 positive control 4.60±0.99a 23.86±2.73b 给药组 drug group 4.10±0.89ac 10.28±1.12a
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