发达国家患有创伤疾病的人约占总人口的1.5%，其花费占所有医疗费用的2%~4%^[1]。皮肤是动物最大的器官，具有防止水分流失和为人体提供物理与化学保护的双重功能^[2]。导致皮肤损伤的原因很多，包括急性创伤、慢性伤口、外科手术和一些遗传性疾病^[3]。皮肤创伤愈合涉及4个连续且重叠的过程：止血、发炎、增殖和重塑^[4]，而当皮肤愈合过程受到破坏时，将导致慢性伤口的发生、发病率的增加和生活质量显著下降。在美国，受慢性伤口影响的患者有650×10⁴人。据估计，美国每年消耗250×10⁸美元用于治疗慢性伤口^[5]。因此，加速皮肤创伤愈合对身体健康至关重要。传统的创伤愈合活性物质，主要包括生长因子、细胞因子、从植物中获得的化合物，以及其他免疫调节因子，但是，很难将这些转化为临床创伤愈合的疗法^[6]。与高成本且存在安全性和递送问题的药物相比，具有高活性、特异性和稳定性的生物活性肽在相关研究领域引起了研究人员的关注^[7]。

马氏珠母贝(Pinctada martensii)，又称合浦珠母贝，19世纪90年代末在日本首次实现人工珍珠生产工业化^[8]，其因生产优质珍珠的能力而闻名于世，占海水珍珠产量的90%以上^[9]，是中国南方沿海地区培育珍珠的主要贝种^[10]。珍珠主要通过人工“插核手术”，由外套膜的细胞增殖形成珍珠囊，分泌珍珠质而形成，且整个培育过程会伴随贝体的抗炎免疫反应，因此珍珠贝的外套膜在珍珠形成中起着重要的作用^[11]。目前，珍珠贝肉经采珠后多被废弃，导致经济附加值不高，关于其药用和保健价值鲜有报道。珍珠贝外套膜主要营养成分是蛋白质，其中多为胶原蛋白^[12]，因此充分开发利用马氏珠母贝外套膜功能非常必要，本文采用酶法制备马氏珠母贝外套膜酶解产物(enzymatic hydrolysis from mantle of pearl oyster，EHM)进行皮肤创伤愈合功能作用的研究，为进行深入研究提供理论基础和方向。

1.   材料与方法

1.1   材料

马氏珍珠贝肉采自2018年6月湛江雷州市流沙养殖场，取其外套膜。EHM为实验室自制，基本性质为：加酶量为1 000 U·g^–1（原料）蛋白的EHM水解度为23.4%，EHM的蛋白质含量为0.556 6 g·g^–1，其中肽含量占21.81%。云南白药购于云南白药集团；SPF级昆明小鼠体质量(20±2) g，雄性，购于山东省济南朋悦实验动物繁育有限公司，实验单位使用许可证编号SYXK (粤) 2014－0053 (广东海洋大学实验动物室)；中性蛋白酶(30 000 U·g^–1，广西南宁庞博生物工程有限公司)；IL-6 (白介素-6)、IL-10 (白介素-10)、TGF-β1 (转化生长因子β1)、FGF-2 (碱性成纤维细胞生长因子)、EGF (表皮细胞生长因子)、Cyclin D1 (细胞生长周期素D1)和羟脯氨酸测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；抗菌实验所需菌株由课题组林海生老师提供。

Lynx 6000型高速冷冻离心机、Varioskan Flash多功能酶标仪(Thermo公司)；BSA224S-CW型万分之一电子天平[ 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]；FE28型pH计[ 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；DF-101T集热氏恒温加热磁力搅拌器(上海精宏实验设备有限公司)；FDU-1110型冷冻干燥机(上海爱朗仪器有限公司)；SW-CJ-2FD型双人超级操作台(苏州净化设备有限公司)。

1.2   方法

1.2.1   EHM制备工艺

EHM为实验室自制，主要提取工艺参考左光扬等^[13]。蛋白质含量测定采用凯氏定氮法参考GB 5009.5—2016；肽含量测定参考汪志华等^[14]采用双缩脲法。

1.2.2   EHM体外抗菌实验

采用微量径向扩散法^[15]验证其抗菌活性。将100 μL 1×10⁸ CFU·mL^–1细菌悬浮液移液到无菌胰蛋白酶解酪蛋白大豆琼脂培养基中，涡旋，倒入培养皿中。然后将5 μL样品移液到2.0 mm直径的孔中，并将培养皿在37 ℃下孵育20 h。测量透明抑制区的直径，精确至0.1 mm。同时，采用半数稀释法^[15]验证其抗菌活性。将100 μL质量浓度为30 mg·mL^–1的EHM稀释液等分试样装入96孔微量培养板中，然后向每个孔中加入50 μL 2×10⁷ CFU·mL^–1菌液和50 mL TSB-3.0%氯化钠(NaCl)。35 ℃温育24 h后通过观察每个孔的浊度记录细菌的生长条件。

1.2.3   EHM体表促凝血实验

用断尾法^[16]，设阴性对照组、阳性对照组(云南白药粉产品)和给药组(EHM冻干粉)，每组5只雄性KM小鼠，剪除距尾尖0.5 cm处，用已称量的无菌滤纸吸取出血量并开始用秒表计时，每30 s换一张滤纸，不出血后进行称质量和记录出血时间。

1.2.4   动物实验

动物分组及造模。将体质量为(20±2) g清洁级KM系雄性小鼠60只，随机分为阴性对照组、云南白药阳性对照组和给药组。腹腔注射10%水合氯醛麻醉小鼠，在其背部脱毛，制造直径约0.8 cm的全皮层创伤模型，并分笼单独饲养。给药组每天涂抹30~35 mg质量浓度为1.43 g·mL^–1膏状EHM (肽含量为2~2.5 mg)，阳性对照组每天涂抹2~3 mg云南白药，阴性对照组不处理。隔天对创面观察，拍照，测量伤口大小，并记录结果。

1.2.5   愈合率

每隔2 d用游标卡尺测量创面直径大小1次，计算伤口愈合率公式为：伤口愈合率=(第0天的伤口测量值−第n天的伤口测量值)/第0天的伤口测量值×100%；瘢痕缩小率=(第0天的伤口测量值−第14天的伤口测量值)/第0天的伤口测量值×100%。

1.2.6   创面组织中炎症因子、生长因子和羟脯氨酸含量检测

小鼠创面组织匀浆液制备^[17]，分装保藏于–80 ℃，分别按试剂盒说明书进行相关指标的测定。

1.2.7   数据统计分析

每组实验至少重复3次，采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。组间比较采用LSD检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2.   结果与分析

2.1   体外抗菌实验

采用微量径向扩散法和半数稀释法对马氏珠母贝生活环境中和创伤感染常见的13种菌[G+菌(6种)有金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、李斯特菌(Listeria monocytogenes)、海豚链球菌(Streptococcus iniae)、格氏乳球菌(Lactococcus garviea)、无乳链球菌(S. agalactiae)、芽孢杆菌(Bacillus)；G−菌(7种)有大肠杆菌(E. coli)、铜绿假单胞菌(P. Aeruginosa) 、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血性弧菌(V. Parahemolyticus)、海藻希瓦氏菌(Shewanellaalga)、哈氏弧菌(V. harveyi)、嗜水气单胞菌(A. hydrophila)]进行体外抗菌实验。结果显示，EHM无抗菌活性，且研究发现只有马氏珠母贝抗菌肽基因^[18]、通过浸泡和注射菌株诱导的方式，以及从外套膜和鳃组织^[19]、血清^[20]中提取获得抗菌肽；现在尚未发现可直接通过酶解马氏珠母贝外套膜的方式获得抗菌物质，这与本研究结果一致。表明其不含抗菌物质，在小鼠皮肤创伤愈合过程中，不能起到抗菌防感染的作用。

2.2   体表促凝血实验

EHM对体表创口的出血时间和出血量的影响见表1。云南白药阳性对照组与给药组均显著好于阴性对照组(P<0.05)，其中云南白药阳性对照组促凝血效果最佳。这表明EHM具有一定的促凝血作用，可在后续实验进行深入的机理研究。目前，研究发现白鹤藤^[21]、三七和紫珠草^[22]、藕节^[23]等陆生植物提取物具有促凝血活性，而海洋贝类的相关提取物尚无发现具有促凝血作用，EHM可能会为促凝血研究和相关产品的开发提供新的方向和来源。

表  1  马氏珠母贝外套膜酶解产物对小鼠断尾创口的出血时间和出血量的影响

Table  1.  Effect of EHM on bleeding time and blood loss of tail　　　　　　　　　　　 wound of mice　　　　　　　　$\overline {\mathit{\boldsymbol{X}}} {\bf \pm} {\bf{SD}}$, n=5

组别 group	出血时间/min bleeding time	出血量/g amount of bleeding
阴性对照组 negative control	5.05±0.79c	0.015 2±0.001 9c
阳性对照组 positive control	0.94±0.49b	0.005 4±0.001 7b
给药组 drug group	1.97±0.26a	0.009 6±0.001 8a
注：同列中标有不同小写字母者表示组间有显著性差异 (P<0.05)，标有相同小写字母者表示组间无显著性差异 (P>0.05)，下表、后图同此 Note: Different and same letters within the same row indicate significant (P<0.05) and insignificant different (P>0.05), respectively. The same case in the following tables and figures.

下载: 导出CSV 

| 显示表格

2.3   涂抹EHM对小鼠皮肤创伤愈合作用的影响

2.3.1   创面形态变化观察

各组愈合情况见图1。造模后第2天，各实验组动物皆已结痂，无液体渗出，创面变化明显。第4、第6天，2个对照组创面无液体渗出，结痂逐渐变厚，阳性对照组效果明显。给药组创面开始出现较硬结痂，创面不平整，创面边缘皮肤收缩明显。第8天2个对照组伤口开始缩痂，创面呈暗红色，阳性对照组部分掉痂。给药组创面完全掉痂，呈肉红色新生皮肤。第10天2个对照组伤口结痂部分脱落，阴性对照组疤痕面积变化小，阳性对照组缩痂明显。给药组创面皮肤渐趋于正常皮肤。第12天各组皆已完全掉痂，并进一步缩痂。阳性对照组二次掉痂，给药组愈合处开始长出毛发。第14天对照组的多数伤口直径小于2 mm，给药组伤口直径均为0 mm。2个对照组创面呈现肉红色新生皮肤，新生肉色组织较粗糙。给药组较对照组愈合情况良好，创面新生皮肤光滑，无瘢痕生成，与正常皮肤无异。这表明给药组在掉痂及瘢痕收缩方面效果明显。

图  1  给药组对小鼠创面的影响

Figure  1.  Effect of drug group on wound of mice

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.3.2   愈合率

造模后6 d给药组的创伤愈合率与阴性对照组差异显著(P<0.05，表2)；造模后10 d给药组创伤愈合率较阴性对照组高出50% (P<0.05)；第14天给药组较阴性对照组高20% (P<0.05)，愈合率达100%；给药组瘢痕缩小率较阴性对照组高出21% (P<0.05，图2)。

表  2  马氏珠母贝外套膜酶解产物对小鼠皮肤创伤愈合的影响

Table  2.  Effect of EHM on skin wound healing of mice $\overline {\mathit{\boldsymbol{X}}} {\bf \pm} {\bf{SD;}}\;$ %

组别 group	第0天 Day 0	第6天 Day 6	第10天 Day 10	第14天 Day 14
阴性对照组 negative control	0±0.00	14.17±2.89b	35.86±8.66b	80.42±6.17b
阳性对照组 positive control	0±0.00	35.83±6.88a	56.67±17.02a	92.92±6.41a
给药组 drug group	0±0.00	28.33±6.88a	87.50±11.11a	100.00±0.00a

下载: 导出CSV 

| 显示表格

图  2  第14天马氏珠母贝外套膜酶解产物对小鼠皮肤创伤瘢痕生成的影响

Figure  2.  Effect of EHM on scar formation of skin wounds of mice on Day 14

下载: 全尺寸图片 幻灯片

云南白药粉由名贵药材制成，具有化瘀止血、活血止痛、解毒消肿之功效，可通过加快止血，促进血液循环以实现促进创伤愈合^[24]。创伤愈合后期(8~14 d)即重塑期，胶原蛋白起主要作用^[17]。EHM也具有一定促凝血效果，从而有利于加快创伤愈合，这与愈合率结果一致。阳性对照组与给药组创伤愈合速率逐渐无显著性差异，但给药组伤口全部愈合，瘢痕较小，几乎达到无痕状态。这说明EHM更具有一定的愈合、抑制浅表瘢痕增生的优势。目前，鸭胚蛋酶解物^[25]、海参胶原低聚肽^[26]和罗非鱼皮胶原蛋白肽^[27]已被证明可提高愈合率，从而促进创伤愈合，而马氏珠母贝外套膜主要由蛋白质组成，且其胶原蛋白所占比例最高，类型是与鱼皮、陆源胶原蛋白所不同的类V型，具有不同的功能活性^[12]。如EHM的基本性质结果所示，其主要成分也是蛋白质，且其中小分子肽含量高，使其具有膜透过性好、激活细胞活性、修复人体变性细胞等生物活性^[28]，推测EHM具有相关功能活性肽起主要作用，从而有利于皮肤创伤愈合及瘢痕缩小。

2.3.3   炎症因子测定

炎症是可溶性因子和细胞之间复杂的相互作用的结果，在损伤后，组织驻留的巨噬细胞会立即引发局部炎症反应^[29]。在炎症阶段结束时会减少中性粒细胞和相关分子模式，导致组织微环境发生改变。炎性巨噬细胞表型在下一愈合阶段时会变成主要的抗炎细胞类型，促纤维化的表型并分泌TGF-β和肿瘤坏死因子等，这些生长因子将刺激增生阶段的开始，其中将发生纤维组织形成、基质沉积、血管生成和再上皮化过程^[30]。炎症的消退对于防止慢性愈合过程的发展至关重要，慢性愈合过程最终可导致肥厚性瘢痕和瘢痕疙瘩形成。

已经获得了广泛的表面标记且具有超过20年研究基础的巨噬细胞可被分为两大子集：M1和M2型巨噬细胞^[30]。由M1型巨噬细胞分泌的IL-6属于促炎症因子；由M2型巨噬细胞分泌的IL-10属于抑制炎症因子^[31]。EHM具有显著抑制IL-6分泌的作用(P<0.05)；第5、第7天，给药组与2个对照组相比，IL-10含量呈现极显著差异(P<0.01，图3)。结果表明，EHM具有抑制炎症的作用。研究表明，砂仁叶油^[32]、蜂蜜及蜂蜜中酚酸^[33]、姜黄素^[34]等陆生动植物提取物可通过抑制炎症反应，加快创伤愈合并提高愈合效果，这与愈合率和瘢痕缩小率结果一致。因此，EHM通过抑制炎症因子分泌，更有利于促进皮肤创伤愈合，缩短愈合时间，提高愈合质量。

图  3  马氏珠母贝外套膜酶解产物对创伤皮肤组织中炎症因子的影响

* . 组间有极显著差异(P<0.01)

Figure  3.  Effect of EHM on inflammatory factors in wound skin tissue

*. very significant difference among groups (P<0.01)

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.3.4   生长因子测定

生长因子是生物活性多肽，参与愈合过程的所有阶段^[35]。各实验组FGF-2含量无显著差异(P>0.05，表3)；与阴性对照组TGF-β含量相比，给药组皆呈现显著差异(P<0.05)；给药组CCND1含量显著高于其他实验组(P<0.05)；给药组EGF含量较阴性对照组无显著性差异(P>0.05)。

表  3  马氏珠母贝外套膜酶解产物对创伤皮肤组织中生长因子的影响

Table  3.  Effect of EHM on growth factors in wound skin tissue on Day 7 $\overline {\mathit{\boldsymbol{X}}} {\bf \pm} {\bf{SD}}$; μg·mL^–1

组别 group	成纤维细胞生长因子2 FGF-2	转化生长因子β TGF-β	细胞生长周期素1 CCND1	表皮生长因子 EGF
阴性对照组 negative control	36.58±2.65a	0.44±0.04b	1.67±0.50a	131.37±59.51a
阳性对照组 positive control	28.72±5.65a	1.55±0.11a	2.74±1.21a	1 674.34±913.78b
给药组 drug group	32.60±5.00a	2.09±0.89a	6.60±1.63b	660.59±376.41a

下载: 导出CSV 

| 显示表格

FGF-2对成纤维细胞的生长和分化以及血管平滑肌细胞、内皮细胞的增殖，细胞外基质代谢、生长和中胚层来源细胞的运动具有刺激作用。它能够增加肉芽组织形成的速度和程度，并刺激愈合过程^[36]。EGF与皮肤及其附属物的形成、成熟、再生和修复密切相关，并促进血管生成，促进伤口修复，在创伤修复的各个阶段发挥积极的生物学作用^[37]。但结果显示，与阴性对照组相比，涂抹EHM对FGF-2和EGF分泌无显著性促进作用，这表明连续涂抹给药后第7天，对这2种生长因子作用尚不明显。TGF-β帮助单核细胞转化为巨噬细胞，然后加速肉芽组织的重塑并促进创伤愈合生长因子的释放，促进细胞外基质(ECM)合成和伤口收缩^[38]。CCND1主要功能是促进细胞增殖^[39]。由此可推测，涂抹EHM促进创面愈合的过程中可通过加速细胞因子TGF-β的分泌促进纤维细胞分泌胶原、增加胞外基质沉积、新血管形成。且Muthukumar等^[40]研究发现TGF-β表达在第4天最多并且持续到第8天，这与本研究结果一致。同时也通过加速细胞周期调控蛋白CCND1的表达促进成纤维细胞等细胞周期向分裂期转化从而加速细胞的有丝分裂^[41]，实现同愈合率结果一致的创伤愈合效果。

2.3.5   羟脯氨酸含量测定

伤口愈合后重塑阶段持续时间很长。在该阶段，基质细胞协调伤口中细胞外分子的更新，导致组织强度增加，胶原蛋白的沉积在伤口重塑中起重要作用^[42]，可通过测定羟脯氨酸含量来反映胶原蛋白含量的变化情况。造模后14 d给药组较阴性对照组有显著差异(P<0.05)，但含量较低(表4)。结果表明，涂抹EHM不能显著促进胶原蛋白的分泌、沉积及交联的作用，而这与照片、愈合率及瘢痕缩小率结果不相符，需要后续实验通过将测定指标调整为Masson染色等手段，进行结果验证和原因解释。

表  4  马氏珠母贝外套膜酶解产物对创伤皮肤组织中羟脯氨酸的影响

Table  4.  Effect of EHM on hydroxyproline in wound skin tissue　　　　　　　　　　　　　 $\overline {\mathit{\boldsymbol{X}}} {\bf \pm} {\bf{SD}} $; μg·mL^–1

组别 group	造模后时间/d post-moulding time
	7	14
阴性对照组 negative control	7.58±0.00ab	13.10±2.11b
阳性对照组 positive control	4.60±0.99a	23.86±2.73b
给药组 drug group	4.10±0.89ac	10.28±1.12a

下载: 导出CSV 

| 显示表格

3.   结论

通过涂抹给药EHM研究表明，其具有一定促凝血、抑制炎症作用并促进生长因子分泌，从而加快小鼠软组织开放性创伤愈合，对浅表瘢痕增生具有一定的抑制作用。这为进一步分离纯化EHM，进行其作用机理的研究和阐释提供了理论依据和研究基础。