Effect of enzymatic hydrolysis from mantle of pearl oyster on skin wound healing
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摘要:
为进一步拓宽马氏珠母贝(Pinctada martensii)的高值化利用途径,文章探讨了马氏珠母贝外套膜酶解产物体外抗菌活性、促凝血作用以及对小鼠软组织开放性创伤愈合效果。结果表明,珍珠贝外套膜酶解产物具有一定的促凝血作用,但对13种测试菌无抑制作用;涂抹给药6 d后,给药组小鼠的创伤愈合率显著高于阴性对照组(P<0.05),与阳性对照组无显著差异(P>0.05);给药组的第14天愈合率达100%,疤痕缩小率显著高于阴性对照组(P<0.05)。生化指标测试结果显示,与2个对照组相比,马氏珠母贝外套膜酶解产物能够抑制炎症因子IL-6生成;与阴性对照组相比,其可极显著促进IL-10分泌;与阴性对照组相比,给药组皮肤组织中FGF-2含量无显著性差异(P>0.05),阳性对照组EGF含量显著高于其他组(P<0.05);而TGF-β和CCND1含量均显著高于阴性对照组(P<0.05)。综上,马氏珠母贝外套膜酶解产物具有一定促凝血、抑制炎症作用并促进生长因子分泌,从而加快小鼠软组织开放性创伤愈合,对浅表瘢痕增生具有一定的抑制作用。
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关键词:
- 马氏珠母贝外套膜酶解产物 /
- 抑菌性 /
- 促创伤愈合 /
- 促凝血活性 /
- 抑制炎症
Abstract:In order to promote the high value utilization of pearl oyster (Pinctada martensii), we were determined explore the antibacterial activity and procoagulant activity of enzymatic hydrolysis from its mantle (EHM), and the effects of EHM on open wound healing of skin of mice. Results showed that EHM possessed of procoagulant activity in mice but had no antibacterial activity against 13 tested strains. Compared with the negative control group, the healing rate of wound of mice increased significantly after skin application with EHM for 6 d (P<0.05), but there was no significant difference with comparison with the positive control group (P>0.05). The healing rate was 100% on 14th day for the drug group, and the scar contraction rate was significantly higher than that of the negative control group (P<0.05). Biochemical indicators test indicated that EHM had significant inhibitation effect on inflammatory factor IL-6 (P<0.05); compared with the negative control group, it could promote IL-10 secretion in wound tissues significantly (P<0.05), but there was no significant difference in FGF-2 content in skin tissue of the drug groups (P>0.05), and EGF content in the positive control group was significantly higher than that in the other groups (P<0.05). Howerer, there was no significant difference in the contents of FGF-2 and EGF between the drug groups (P<0.05). In summary, EHM has procoagulant, anti-inflammatory and promotional effects, which can accelerate the open wound healing of soft tissue in mice and has a certain inhibitory effect on superficial scar hyperplasia.
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有害藻华(harmful algal blooms,HABs)主要是由某些浮游生物在一定环境条件下迅速增殖而引起水体变色并对生物和环境产生危害的一种生态异常现象[1]。藻华发生的原因非常复杂,是诸多生物因素及非生物因素共同作用的结果[2]。在海洋中,形成有害藻华的生物可以通过多种方式,如产生毒素、造成物理损伤、改变水体理化性质等危害海洋生物的生存,从而给海洋生态系统、水产养殖以及人类健康等带来严重影响。近几十年来,有害藻华在发生频率和规模上都有上升趋势,其造成的环境影响和经济损失不容忽视。因此,寻求一种有效的有害藻华治理方法显得尤为迫切。目前,国内外主要通过传统的物理法和化学法对有害藻华进行治理[3-5],如使用粘土、凝聚剂和天然矿物等外来添加物。上述方法操作简单,但容易造成环境的二次污染,危害海洋生物生存,而且大范围使用时成本较高[6]。近年来,随着对“藻-菌”关系研究的深入,发现一些海洋细菌在有害藻华的消亡过程中发挥着重要作用[7-9]。某些海洋细菌可直接或间接抑制藻类生长,甚至裂解藻细胞,具有溶藻作用[10-12]。海洋细菌的这一特性为有害藻华的治理提供了一条新思路。目前,国内外对溶藻菌开展了大量的研究,为有害藻华的治理提供了重要的理论依据和实践指导。本文概述了海洋溶藻菌的种类、作用机制以及应用等方面的研究进展,提出了研究存在的问题,展望了海洋溶藻菌领域今后的研究重点和方向。
1. 溶藻菌的种类
细菌是海洋生态系统中生物种群的重要组成部分,对平衡藻类种群动态具有重要的调节作用[13]。迄今为止,已有多个种属的海洋细菌被筛选并鉴定出具有溶藻作用,它们可以通过直接或间接的方式破坏藻的细胞结构、影响细胞生理状态、抑制或促进相关基因或蛋白质的表达,从而达到抑制藻类生长或杀死藻类的效果。近年来,随着对藻华过程研究的深入,越来越多的溶藻菌被分离和研究。研究者通常是从有害藻华爆发海域的水体中分离纯化出溶藻菌,再通过形态观察、理化测定、分子鉴定等步骤对细菌进行鉴定[14-16]。近年来,所发现的大多数溶藻菌隶属于变形菌门,包括:弧菌属(Vibrio sp.)、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas sp.)和交替单包菌属(Alteromonas sp.)等,拟杆菌门和厚壁菌门中也有少量溶藻菌种的报道(表1)。
表 1 溶藻菌、溶藻物质以及溶藻作用方式的主要种类Table 1. Main algicidal bacteria, algicidal substance and algicidal mode门
phylum种属
genus作用藻类
target algae溶藻方式
algicidal mode溶藻物质
algicidal substance参考文献
Reference变形菌门 Proteobacteria 假交替单胞菌属 Pseudoalteromonas sp. 红哈卡藻 直接和间接协同 − [20] 交替单胞菌属 Alteromonas sp. 东海原甲藻 间接方式 − [21] 交替单胞菌属 Alteromonas sp. 骨条藻 间接方式 假定肽 [12] 弧菌属 Vibrio sp. 海洋卡盾藻 间接方式 − [22] 弧菌属 Vibrio sp. 塔玛亚历山大藻 间接方式 胞外蛋白质 [23] 弧菌属 Vibrio sp. 链状亚历山大藻 间接方式 十六碳烯酸 [24] 盐单胞菌属 Halomonas sp. 东海原甲藻 间接方式 − [25] 河氏属 Hahella sp. 球形棕囊藻 间接方式 灵菌红素 [26] 海杆菌属 Marinobacter sp. 中肋骨条藻 直接方式 [27] 拟杆菌门 Bacteroidetes 腐螺旋菌属 Saprospira sp. 硅藻 直接方式 [28] 噬纤维菌属 Cellulophaga sp. 米氏凯伦藻 间接方式 − [29] 厚壁菌门 Firmicutes 芽孢杆菌属 Bacillus sp. 球形棕囊藻 间接方式 − [30-31] 芽孢杆菌属 Bacillus sp. 球形棕囊藻 间接方式 环肽 [32] 芽孢杆菌属 Bacillus sp. 链状亚历山大藻 间接方式 − [33] 注:−. 未知的溶藻物质 Note: −. unknown algicidal substances 研究表明,溶藻菌对藻类的抑制或杀灭作用通常具有较强的种属特异性。郝建云等[17]在研究溶藻菌A3对4种微藻的溶藻效果时发现,菌株A3对锥状斯氏藻(Scrippsiella trochoidea)具有显著的溶藻作用,对条纹小环藻(Cyclotella striata)具有较弱的溶藻作用,而对蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)与四尾栅藻(Scenedesmus quadricauda)无溶藻作用。此外,一些溶藻菌因为可分泌多种特定的溶藻物质,对多种微藻表现出溶藻作用,宿主范围较广。由于有害藻华的发生通常不只由单一藻种引起,溶藻菌的这种特性可以更加高效地控制有害藻华。Hou等[18]首次报道对4种门类的微藻均表现出良好的溶藻活性的溶藻菌B1,研究发现其可以分泌L-组氨酸、O-酪氨酸、N-乙酰组胺和尿酸4种溶藻物质。Zhang等[19]发现副球菌属(Paracoccus sp.)溶藻菌Y42不仅能够溶解东海原甲藻 (Prorocentrum donghaiense)、亚历山大藻 (Alexandrium tamarense)以及锥状斯氏藻等甲藻,对中肋骨条藻 (Skeletonema costatum)等硅藻也具有较好的溶藻活性。
2. 溶藻菌的溶藻机理
2.1 溶藻菌的溶藻作用方式
溶藻菌的溶藻作用方式主要包括直接溶藻和间接溶藻。
直接溶藻,即溶藻菌直接进攻藻细胞,与藻细胞表面直接接触,甚至侵入藻细胞内而引起藻细胞裂解死亡。这类细菌的菌体通常具有某些特殊结构,可使细菌快速靠近藻细胞而吸附于细胞表面或侵入藻体细胞内部,如腐螺旋菌属依靠纤毛的摆动向藻体靠近[34]。溶藻菌LY03依靠鞭毛附着在硅藻细胞上,溶解细胞壁使其死亡[10]。日本学者在超薄电子显微照片中发现细菌Saprospira sp. SS98-5可以通过类微管结构主动靠近角毛藻 (Chaetoceros ceratossporum)细胞而侵入藻细胞内部发挥杀藻作用[28]。Caiola等[35]分离到一株蛭弧菌(Bdellovibrio),该菌可通过一种由纤维多糖蛋白质复合体形成的桥状结构,侵入到铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)细胞壁和细胞质膜之间而溶解藻细胞。
间接溶藻,主要包括细菌同藻类竞争有限营养或通过分泌胞外代谢物质抑制或溶解藻细胞。这其中通过分泌胞外溶藻物质进行杀藻是大多数溶藻菌的溶藻作用方式。常见的此类细菌有假单胞菌(Pseudomonas)[36]、假交替单胞菌[37]、弧菌[38]和芽孢杆菌[39]等。这些溶藻菌分泌的溶藻活性物质主要有蛋白质、生物碱、环肽、脂肪酸等(表1)。此外,也有一些具有较好环境稳定性的溶藻物质,如芽孢杆菌分泌的溶藻物质,其对链状亚历山大藻的溶藻活性在酸、碱、高温和反复冻融条件下均不受影响[26],可以适应复杂多变的海洋环境,在控制有害藻华领域具有广泛的应用潜力。近年来,有研究表明细菌可通过群体感应调控溶藻菌的溶藻作用。Harvey等[40]报道群体感应信号分子前体可诱导赫氏圆石藻 (Emiliania huxleyi)死亡,其机制为Pseudoalteromonas piscida通过分泌群体感应信号分子前体改变菌藻互作关系,从而引起浮游植物种群动态变化。Nakashima等[41]和Guo等[42]研究了溶藻活性物质产生的机理,结果表明,细菌是通过分泌群体感应分子N-酰基高丝氨酸内酯化合物,由该物质介导群体感应从而调控溶藻物质的产生,发挥溶藻作用。Paul和Pohnert[43]的研究也表明溶藻蛋白质是依赖于高丝氨酸内酯介导的群体感应机制产生。除此之外,少数溶藻菌可通过与藻类竞争有限营养物质来抑制或杀死藻细胞。瞿建宏和刘韶斌[44]研究了芽孢杆菌和微囊藻在氮、磷为主要限制因子的条件下各自生长速率的变化,结果发现,当氮、磷比升高时,溶藻菌对营养物质的吸收率显著高于藻类,进而导致微藻的生长受到抑制。
此外,某些溶藻菌的溶藻方式为直接溶藻和间接溶藻协同方式。Sun等[45]报道了假交替单胞菌S1的滤液和菌体对血红哈卡藻 (Akashiwo sanguinea)均具有溶藻效果。洪桂云等[46]在研究溶藻菌WJ6对铜绿微囊藻的溶藻特性时发现,该菌株的溶藻方式以分泌胞外物质为主,直接溶藻为辅。
2.2 细胞水平的溶藻作用
溶藻菌的溶藻过程最直观的表现为对藻细胞结构及亚细胞结构的破坏,主要体现为细胞膜和细胞核的完整性,叶绿体、类囊体和线粒体等细胞器的形态变化。细胞的完整性是维持细胞正常生理活动的基础,在维持细胞内环境稳定上起着重要的作用。有报道表明海旋菌可通过分泌苯甲酸在96 h内破坏米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)细胞膜的完整性,导致内容物质流出,最终导致藻细胞裂解死亡[47]。溶藻菌DH-e代谢产物能够破坏东海原甲藻的细胞完整性,改变细胞内部结构,从而影响细胞的正常生理活动[25]。胡晓丽[48]发现活性物质P-3可使球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)细胞内部结构发生变化,细胞膜被降解,核酸被严重污染,叶绿体片层结构变得稀疏,类囊体排列不整齐,细胞受到不同程度的破坏。
2.3 生理学水平的溶藻作用
溶藻菌在溶藻过程中,除了会对藻细胞结构产生影响,还可通过影响藻细胞的正常生理状态抑制藻类生长。
活性氧(reactive oxygen species,ROS)是细胞内一类氧的单电子还原产物,在细胞生长、增殖、发育分化、衰老和凋亡等生理过程中发挥着重要作用[49]。正常情况下,细胞内ROS的产生与清除处于一种动态平衡状态,过量的ROS会对细胞内核酸、蛋白质等产生氧化损伤作用[50]。在溶藻菌的胁迫下,藻细胞通常会产生过量的ROS,ROS的累积会诱导细胞发生脂质过氧化反应,导致氧化与非氧化失衡,从而造成细胞损伤,甚至死亡。据Liu等[51]报道,添加抗生素后,中肋骨条藻细胞内产生过量ROS,破坏细胞膜的完整性与通透性,导致细胞内pH增加,细胞膨胀破裂死亡。此外,藻细胞中过量的ROS也会胁迫抗氧化系统中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)等酶活性的变化。吴培枫等[52]研究发现在溶藻菌DH-e作用下,东海原甲藻ROS含量随无菌滤液浓度的升高而增加,且藻细胞内SOD和CAT活性显著升高,表明溶藻物质的加入导致藻细胞处于氧化应激状态,启动了抗氧化系统来清除过量的ROS。但有研究表明,当溶藻物质二酮哌嗪达到一定浓度,球状褐藻细胞内ROS过量积累,进而导致抗氧化系统崩溃[32]。
海洋溶藻菌除了能引起细胞膜的氧化损伤,也可通过影响藻细胞的光合作用而抑制藻细胞的正常生长。在溶藻物质灵菌红素作用下,球形棕囊藻细胞叶绿素a含量显著降低,光合能量传递受阻[26]。同样在灵菌红素作用下,铜绿微囊藻细胞最大光合潜力(Fv/Fm)显著下降,表明该溶藻物质可损伤光合系统,导致藻细胞无法进行正常的光合作用[53]。
有报道称,溶藻物质可能会诱导藻细胞出现一系列类似细胞程序性死亡现象:天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白水解酶(Caspase-3)活性升高、DNA降解以及出现凋亡小体[50]等。研究表明,ROS可能作为信号分子介导藻细胞凋亡过程。Pokrzywinski等[53]报道在溶藻菌160AA作用下,3种有害双鞭毛藻细胞内ROS含量增加,DNA降解,Caspase-3活性增强,表明藻细胞发生细胞凋亡。球形棕囊藻受到希瓦氏菌(Shewanella) TS-6溶藻物质胁迫时,胞内ROS含量增加,且磷脂酰丝氨酸外翻,Caspase-3活性增强,DNA出现片段化,也出现细胞凋亡现象[54]。
2.4 分子水平的溶藻作用
近年来,随着测序技术的快速发展,在溶藻菌中已有溶藻物质合成相关的基因被成功鉴定。吴寒华等[27]在新型海杆菌YWL01基因组中发现多个与溶藻相关的基因,如可编码参与细菌溶藻活动的蛋白质LuxR同系物、溶血素同系物、RTX同系物和外膜蛋白TolC基因等。而在藻细胞方面,有研究发现,在溶藻菌LY01提取物的胁迫下,亚历山大藻中与CO2固定相关的rbcS基因、增殖细胞核抗原基因PCNA均受到抑制,而热休克蛋白基因hsp则显著上调,这些结果表明该菌株能通过抑制光合作用、DNA合成和细胞分裂等方式抑制藻细胞的正常生长[55]。在溶藻物质作用下,球状褐藻细胞PS II中光反应中心蛋白D1的编码基因psbA、中心蛋白D2编码基因psbD以及CO2固定相关的rbcL基因表达量均显著降低,表明D1和D2蛋白质合成受阻,细胞光合作用中电子传递能力受到严重影响,细胞碳固定能力受到抑制,最终导致藻细胞死亡[32]。
与基因层面的研究相比,从蛋白质层面对溶藻机理的研究尚处于起步阶段。原雅纬等[56]运用基于双向凝胶的蛋白质组学技术,研究了塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)在溶藻前后蛋白质的差异表达情况,发现其中12个功能蛋白与2个结构蛋白存在显著差异,为揭示假交替单胞菌对塔玛亚历山大藻的作用机制奠定了基础。Yang等[57]运用基于质谱的定量蛋白质组学技术研究了溶藻菌Hahella sp. KA22对铜绿微囊藻溶藻机理,通过分析溶藻作用下的差异表达蛋白功能后发现,溶藻物质灵菌红素可通过ABC转运蛋白跨膜进入细胞内,刺激藻细胞产生过量的ROS引起氧化损伤,最终导致细胞膜及类囊体膜完整性被破坏,光合系统功能失调,此外,该溶藻物质还作用于核糖体,干扰蛋白质的合成,最终导致藻细胞裂解死亡。
3. 溶藻菌的应用
国内外对溶藻菌开展的大量理论研究,为溶藻菌的实际应用奠定了基础。近年来,已陆续开展了对溶藻菌应用的研究,并取得了一定成果。如将溶藻菌投入动态膜反应器中固定化,从而达到快速消除藻华的效果。但此方法只能在限定空间内作用于目标藻,并且溶藻菌在生物反应器内难以长期持留[58]。另外,利用溶藻菌制备生物杀藻剂也是开展实际应用的主要手段之一。根据制备方式的不同,生物杀藻剂可分为单一菌剂、复合菌剂[59]、溶藻菌与载体结合[60]、溶藻活性物质与粘土耦合[61]等类型。朱杰等[62]、曹煜成等[63]分别采用固体发酵法和液体-固体复合发酵法获得单一菌剂,将其大规模的应用于虾池塘养殖中,均表现出良好的溶藻效果。但是,目前该类型杀藻菌剂在开放海域的实际应用还鲜有报道。由于有害藻华的发生通常不只是由单一藻种引起,因此,单一菌剂难以达到有效控制藻华的目的,制备复合菌剂更具有重要的应用研究价值[64]。有研究表明,与直接投加富含溶藻菌的菌剂相比,将溶藻活性物质与黏土联合使用,具有快速且长效的溶藻效果,其安全性更高[65]。但是,目前杀藻菌剂制备的研究仍处于探索性阶段,大多仅在实验室水平取得良好效果,还未推广应用到实际水体中,若要在复杂的海洋环境中应用,未来需进一步在溶藻菌的筛选、富集、制备方式及安全性评价等方面开展杀藻剂的应用研究。
4. 展望
近年来,海洋生态系统的稳定以及海洋生物资源的可持续开发利用使得藻华的防治成为一个研究热点。目前,以菌治藻已逐渐成为最具前景的藻华防治手段之一,但其中的许多理论及技术研究还不够全面,加之海洋环境的复杂性,溶藻菌在有害藻华控制的实际应用方面仍受到诸多限制。对此,在未来的研究当中,在以下几个方面仍需开展大量的研究工作。
1) 溶藻物质分离纯化方法需要进一步探索。由于溶藻物质种类较多,多为高极性物质,含量较低且容易在分离纯化过程中丢失,所以溶藻物质的分离纯化仍存在较大难度,这也限制了对溶藻物质及溶藻机理的进一步研究。未来需要提高分离分析技术水平,以期分离纯化到高纯度的溶藻物质并对其结构性质等进行研究,为溶藻制剂的开发与应用奠定基础。
2) 溶藻菌的溶藻机理还不够深入、全面。现今溶藻作用机理的研究主要集中在细胞及生理水平,在分子水平上的认识较少。未来应结合基因组学、蛋白质组学、代谢组学等多组学技术手段,全面深入地对溶藻机理进行探讨。
3) 开展利用溶藻菌治理有害藻华的实际应用研究。目前,对海洋溶藻菌的研究大多处于实验室水平,环境因素单一且实验条件易控制。而在复杂的海洋环境下,如何保证溶藻菌较好地发挥其溶藻效果仍需大量的室外研究工作。此外,对溶藻菌实际应用后海区的生态安全评价也是必须关注的一大问题。
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表 1 马氏珠母贝外套膜酶解产物对小鼠断尾创口的出血时间和出血量的影响
Table 1 Effect of EHM on bleeding time and blood loss of tail wound of mice
$\overline {\mathit{\boldsymbol{X}}} {\bf \pm} {\bf{SD}}$ , n=5组别
group出血时间/min
bleeding time出血量/g
amount of bleeding阴性对照组
negative control5.05±0.79c 0.015 2±0.001 9c 阳性对照组
positive control0.94±0.49b 0.005 4±0.001 7b 给药组
drug group1.97±0.26a 0.009 6±0.001 8a 注:同列中标有不同小写字母者表示组间有显著性差异 (P<0.05),标有相同小写字母者表示组间无显著性差异 (P>0.05),下表、后图同此 Note: Different and same letters within the same row indicate significant (P<0.05) and insignificant different (P>0.05), respectively. The same case in the following tables and figures. 表 2 马氏珠母贝外套膜酶解产物对小鼠皮肤创伤愈合的影响
Table 2 Effect of EHM on skin wound healing of mice
$\overline {\mathit{\boldsymbol{X}}} {\bf \pm} {\bf{SD;}}\;$ %组别
group第0天
Day 0第6天
Day 6第10天
Day 10第14天
Day 14阴性对照组 negative control 0±0.00 14.17±2.89b 35.86±8.66b 80.42±6.17b 阳性对照组 positive control 0±0.00 35.83±6.88a 56.67±17.02a 92.92±6.41a 给药组 drug group 0±0.00 28.33±6.88a 87.50±11.11a 100.00±0.00a 表 3 马氏珠母贝外套膜酶解产物对创伤皮肤组织中生长因子的影响
Table 3 Effect of EHM on growth factors in wound skin tissue on Day 7
$\overline {\mathit{\boldsymbol{X}}} {\bf \pm} {\bf{SD}}$ ; μg·mL–1组别
group成纤维细胞生长因子2
FGF-2转化生长因子β
TGF-β细胞生长周期素1
CCND1表皮生长因子
EGF阴性对照组 negative control 36.58±2.65a 0.44±0.04b 1.67±0.50a 131.37±59.51a 阳性对照组 positive control 28.72±5.65a 1.55±0.11a 2.74±1.21a 1 674.34±913.78b 给药组 drug group 32.60±5.00a 2.09±0.89a 6.60±1.63b 660.59±376.41a 表 4 马氏珠母贝外套膜酶解产物对创伤皮肤组织中羟脯氨酸的影响
Table 4 Effect of EHM on hydroxyproline in wound skin tissue
$\overline {\mathit{\boldsymbol{X}}} {\bf \pm} {\bf{SD}} $ ; μg·mL–1组别
group造模后时间/d post-moulding time 7 14 阴性对照组 negative control 7.58±0.00ab 13.10±2.11b 阳性对照组 positive control 4.60±0.99a 23.86±2.73b 给药组 drug group 4.10±0.89ac 10.28±1.12a -
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